Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

Canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein sindirimi ölçümü için protokolleri açıklıyoruz. Çift florofor oranmetrik mikroskopiye ve nüfusa dayalı tekniklere göre sunduğu avantajlara vurgu yapılır.

Abstract

Son yıllarda makropinositoz alanı hızla artmıştır. Makropinositoz, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin organizma homeostaz ve bağışıklığı koruduğu merkezi bir mekanizma olarak ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda ve homeostatik rolünün aksine, kanser ve viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli patolojileri de yönlendirebilir. Diğer endositoz modlarının aksine, makropinozomların olgunlaşmasını incelemek için geliştirilen araçlar az gelişmiş kalır. Burada protokol, erken ve olgunlaşan makropinozomların lümen içindeki redoks ortamını incelemek için yeni geliştirilen araçları açıklar. pH'ın değerlendirilmesinde ratiometrik floresan mikroskopisi, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomların lümeni içindeki bozunma kapasitesi için metodolojiler açıklanmıştır. Tek organel ölçümler, genellikle nüfusa dayalı yaklaşımlarla kaybedilen mekansal heterojenliği ortaya çıkarma avantajı sunar. Prob seçimi, enstrümantasyon, kalibrasyon ve tek hücreli ve popülasyon tabanlı yöntemler de dahil olmak üzere çift florofor oranmetrik mikroskopinin temel ilkelerine vurgu yapılır.

Introduction

Makropinositoz, makropinozomlar1,2adı verilen membran bağlı sitoplazmik organellere büyük miktarlarda hücre dışı sıvı alımını ifade eder. Amip Diktyostelium sppgibi serbest yaşayan tek hücreli organizmalar tarafından gerçekleştirilen son derece korunmuş bir süreçtir. 3, yanı sıra antozooans4 ve metazoans2. Çoğu hücrede makropinositoz indüklenen bir olaydır. Hücre yüzeyi reseptörlerinin ligasyonu, fırfırlar olarak adlandırılan aktin tahrikli plazma membran uzantılarının çıkıntısını teşvik eder. Bu fırfırların bir kısmı, bazı kötü anlaşılmış mekanizma tarafından, makropinozom oluşturmak için distal uçlarını mühürler (bu yöntem kağıdının kapsamının ötesinde, makropinositoz mekaniği hakkında ayrıntılı incelemeler için, lütfen 1,2 ,5,6,7referanslarına bakın). Makropinositozu indükleyen hücre dışı uyaran en sık çözünür bir büyüme faktörüdür5,8. Buna göre, makropinositik olay, hücrenin büyümeyi kolaylaştırmak için yararlı metabolitler türetebileceği hücre dışı malzeme bolusunun yutulmasını sağlar. Ne yazık ki, besin dağıtımı için bu yol patolojiyi de yönlendirebilir. Bazı kanser hücreleri, sürekli veya konssitütif makropinositoz ile sonuçlanan mutasyonları barındırır. Besinlerin sürekli verilmesi kanser hücrelerinin kontrolsüz çoğalmasını kolaylaştırır ve özellikle agresif tümörler9, 10,11,12,13ile bağlantılıdır. Benzer şekilde, virüsler konak hücrelere erişmek için makropinositozu teşvik edebilir, böylece viral patolojiyi yönlendirebilir14.

Makropinositoz ayrıca patojenlere karşı bağışıklığın korunmasında da işlev gösterir. Makrofajlar ve dendritik hücreler gibi bazı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, makropinositoz 6,15,16yoluyla hücre dışı sıvının constitutive ve agresif örneklemesine girer. Bu makropinositoz modu inanılmaz derecede aktiftir ve tek bir dendritik hücre, her saat kendi ağırlığına eşdeğer bir hücre dışı sıvı hacmi ile kendini engorge edebilir17. Bu konsitültasyonel örneklemeye rağmen, makrofajlar ve dendritik hücreler tümör hücreleri gibi kontrolsüz bir şekilde çoğalmazlar, bunun yerine hücre dışı materyali potansiyel tehditlerin varlığını veya gerçekten yokluğunu bildirmek için bilgi çıkarılacak şekilde işliyor gibi görünürler. Bilgiler i) hücre içi patojen tanıma reseptörleri tarafından okunabilen patojen ilişkili moleküler desenler ve ii) uyarlanabilir bağışıklık sisteminin hücreleri tarafından taranmaya hazır başlıca histocompatibility moleküllerine yüklenebilen kısa amino asit esnemeleri16,18,19olarak çıkarılır. Patojenlerin bağışıklık hücreleri tarafından bilgi işleme için bu yolu altüst edip etmediği şu anda belirsizdir.

Makropinositoz için hem bağışıklık hem de homeostazın sürdürülmesinde ve daha yaygın olarak çalışılan diğer endositoz modlarının aksine, makropinozomların iç (luminal) çalışmalarının çok azı bilinmektedir. Makropinozomların armatür biyokimyasını incelemek için standartlaştırılmış protokoller ve araçlar geliştirmek, sadece benzersiz biyolojilerini daha iyi anlamamıza yardımcı olmakla kalmayacak, aynı zamanda ilaç dağıtımı da dahil olmak üzere yeni terapötik stratejiler için yararlanabilecek içgörü sağlayacaktır20. Bu yöntem el yazması, makropinozomların luminal biyokimyasının çeşitli yönlerini tek organel düzeyde parçalamak için yakın zamanda geliştirilen araçlara odaklanacaktır.

Floroforlar, i) tercihen ilgi alanına bölünürlerse ve/veya ii) ilgi parametresine yanıt olarak spektral değişikliklere uğrarlarsa organellerin spesifik biyokimyalarını ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, pH durumunda, acridine portakal, cresyl violet ve LysoTracker boyaları gibi floresan zayıf bazlar tercihen asidik organellerde birikir. Bu nedenle, göreceli yoğunlukları etiketli organellerin asidik olduğunun kaba bir göstergesidir. Floresan, pHrodo ve cypHer5e gibi diğer pH duyarlı floroforlar protonlara bağlanınca spektral değişikliklere uğrar (Şekil 1A-C). Bu nedenle pH'a duyarlı floroforların floresan emisyonundaki değişiklikler pH'ın yararlı bir yaklaşık örneğini sağlayabilir. Bununla birlikte, tek floroforların kullanımı bir dizi dezavantaj sunar. Örneğin, odak düzleminde yapılan değişiklikler, fotobleaching ve makropinozomlarda yaygın bir olay olan tek organellerin hacmindeki değişiklikler21, tek floroforların floresan yoğunluğunda değişikliklere neden olabilir ve bu22için kolayca düzeltilemez. Tek dalga boyu değerlendirmeleri, asidik bölmeleri görselleştirmek için yararlı olsa da, bu nedenle tamamen niteldir.

Daha nicel bir yaklaşım, parametreye duyarlı floroforu ve ilgi organeline bir referans floroforu hedeflemektir. Referans florofor, organel içindeki biyokimyasal değişikliklere karşı ideal olarak duyarsızdır (Şekil 1D-F) ve bu nedenle odak düzleminde, organeller hacimde ve bir dereceye kadar fotobleaching23'teki değişiklikleri düzeltmek için kullanılabilir. Çift florofor ratiometrik floresan olarak adlandırılan bu yaklaşım kullanılarak, parametreye duyarlı floroforun floresan emisyonunun referans florofora oranı oluşturularak düzeltme sağlanabilir.

Burada protokol, makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein bozulmasını ölçmek için çift florofor oranımetrik görüntüleme prensibini kullanacaktır. Her durumda, ilgi parametresine duyarlı bir florofor ve bir referans florofor seçilecektir. Floroforları özellikle makropinozomlara hedeflemek için, tercihen makropinoomlara dahil edilen 70 kDa dektran ile eşçekimli olarak birleştirilecektir24. Tüm tahliller Raw264.7 hücrelerinde yapılacaktır ancak diğer hücre tiplerine uyarlanabilir. Mümkün olduğunda, floresan oranları mutlak değerler kazanmak için bir referans eğriye göre kalibre edilecektir. Daha da önemlisi, makropinozomların ışıklı ortamının dinamik ve nicel değerlendirilmesi için tüm ölçümler canlı hücrelerde yapılacaktır.

pH'a duyarlı floroforlar seçilirken, bir dizi dikkat edilmesi gereken husus tartılmalıdır. Birincisi, probun en hassas olacağı pH değerleri aralığını gösteren floroforun pK a'dır. Oluşumdan kısa bir süre sonra, makropinozomun pH'ının hücre dışı ortamınkine (~pH 7.2) yakın olacağı ve geç endozomlar ve lizozomlarla (~pH 5.0) etkileşimler yoluyla aşamalı olarak asitleşeceği varsayılırsa, bu aralıkta hassas olan pK a içerenbir prob seçilmelidir (Şekil 2C). pK'ı 6.4 olan florofor floresan, bu aralıkta en hassas olanıdır. Fagozomlar gibi diğer benzer organelleri ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır ve bu yazıda tercih edilen florofor olacaktır22,25. Referans florofor olarak, pH'a duyarsız olan tetrametilrhodamin kullanılacaktır (Şekil 1E). pHrodo ve cypHer5e gibi diğer floresanlar, floresanın spektral özelliklerinin diğer deneysel değişkenlerle eşleştiği floresan yerine geçebilir. pHrodo ve cypHer5e için önerilen bazı referans floroforları Şekil 1'de gösterilmiştir.

İkinci bir husus, iki floroforun özellikle makropinozomlara hedeflenecekleri yöntemdir. Kabaca 7 nm hidrodinamik yarıçapı olan 70 kDa büyüklüğündeki dektran, hücrelere özel olmayan yapışmaz ve makropinoomlara dahil edilir, ancak clathrin kaplı çukurlara veya caveolae'ye dahil değildir ve bu nedenle makropinozomları işaretler (Şekil 2A ve Şekil 3A,B)16,24,26. Bu protokolde pH'a duyarlı ve referans problar olarak sırasıyla floresan etiketli 70 kDa dektran ve tetrametrinhodamin (TMR) etiketli 70 kDa dektran kullanılacaktır.

Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde, makropinositoz ve fagositoz, adaptif immün yanıtın hücrelerine işlenmek ve daha sonra sunul için eksojen materyalin içselleştirilmesi için iki ana yolu temsil eder27. Fagozomların ve makropinozomların lümeninin redoks kimyasının dikkatli ve koordineli kontrolü, eksojen malzemenin bağlama özgü işlenmesi için kritik öneme sahiptir. Fagozomlarda oksidatif olayların belki de en iyi çalışılmış düzenleyicisi, fagozomların lümeninde büyük miktarlarda reaktif oksijen türleri (ROS) üreten büyük bir çok alt ünez kompleksi olan NADPHoksidazdır 28. Gerçekten de, aktivitesi fagozomlar içinde uygun antijen işleme merkezidir29,30. Yine de, NADPH oksidazının makropinosomal zarlar üzerindeki aktivitesi araştırılmamıştır.

Bu protokolde, H2DCFDA süksinimsal ester makropinozom içindeki oksidatif olayları ölçmek için kullanılır. Bu, azaltılmış formunda minimal floresan olan modifiye bir floresan formudur (2',7'-diklorodihydrofluorescein diasetat). Oksidasyon üzerine floresan emisyonu önemli ölçüde artar. Bununla birlikte, H2DCFDA'nın önemli bir uyarısını belirtmek gerekir - florofor floresanlara dayandığı için, floresan asidik bölmelerde de söndürülür ve deneyler tasarlarken bu değişkenin kontrolüne özen edilmelidir28. pH ölçümü yaklaşımına benzer şekilde, H2DCFDA süksinidil ester kovalent olarak 70 kDa dektrana bağlanacak ve referans florofor olarak TMR etiketli 70 kDa dektran kullanılacaktır (Şekil 3A).

Floresan ovalbumin makropinozomlar içindeki protein bozulmasını ölçmek için kullanılacaktır. Burada kullanılan ovalbumin yoğun bir şekilde kendiliğinden söndürülen 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL boyası ile etiketlenmiştir. Sindirim üzerine, güçlü floresan boya etiketli peptitler serbest kalır. Ovalbumin kolayca 70 kDa dektran'a konjuge edilemediği için, TMR etiketli 70 kDa dektran ve sıvı fazlı ovalbumin içeren hücreler birlikte inkübe edilecektir. TMR sinyali, görüntüleme sonrası analiz sırasında makropinozom maskesi oluşturmak için kullanılacak ve sindirilen ovalbuminden kurtarılan sinyal maske içinde ölçülecektir (Şekil 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücrelerin hazırlanması

  1. Raw264.7 hücrelerini 37 °C'de ve %5 CO2 ila %70 oranında RPMI'de %10 ısı inaktive serum ile desteklenmiş olarak büyütün.
  2. Testten bir gün önce, tohum Raw264.7 hücreleri 96 kuyu plakasında kuyu başına 5 x10 4 hücre yoğunluğunda. Her kuyunun 100 μL büyüme ortamı içerdiğinden emin olun. 96 kuyu plakasının siyah kenarları ve görüntüleme için cam tabanlı olduğundan emin olun.
    NOT: Burada görüntüleme için 96 kuyu plakası kullanılmıştır. 96 kuyu plakaları, daha büyük görüntüleme odalarına göre daha az miktarda hücre ve reaktif kullanılmasına izin verir. Bununla birlikte, canlı hücreleri görüntülemek için tasarlanmış herhangi bir oda kullanılabilir ve reaktifler buna göre ölçeklendirilebilir.
  3. Tahlil günü, kuyuların en az% 70 birlikte olup olmadığını kontrol edin.

2. Makropinozom pH'larının ölçülmesi

  1. Hücreleri bölüm 1'deki gibi hazırlayın.
  2. Tüm kuyuları 37 °C'de 100 μL HBSS ile yıkayın.
  3. Her kuyuyu 0.025 mg/mL TMR etiketli 70 kDa dektran ve 0.025 mg/mL floresan etiketli 70 kDa dektran içeren 100 μL HBSS ile doldurun.
  4. Hücreleri 15 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
  5. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri 100 μL HBSS ile 6x yıkayın.
  6. Her kuyuyu 37 °C'de 100 μL HBSS ile doldurun.
  7. Plakayı ısıtılmış bir sahne ve hazne ile mikroskop üzerine yerleştirin.
  8. Her florofor için ekscitasyon/emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
    NOT: Görüntü alımı için ideal koşullar, kullanılan floroforlara ve bireysel mikroskop kurulumlarına göre değişecektir. Burada, görüntüler Leica SP5 lazer tarama konfokal mikroskopta elde edildi. TMR 543 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 610 nm'den 650 nm'ye toplandı. Floresan 488 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 500 nm'den 550 nm'ye toplandı. 63x yağ daldırma hedefi kullanıldı ve 0,5 μm aralıklarla 10 μm Z hacmi elde edildi.
  9. Her kuyudan, her kuyunun arasındaki floroforlar arasında değişen bir görüntü elde edin.
  10. İlk satın alma işleminden sonra, tüm kuyuların tüm plaka boyunca odakta kalıp kalmadığını kontrol edin.
  11. İstenilen süre boyunca her kuyunun görüntülerini 1-15 dakika aralıklarla elde edin.

3. Makropinozom pH'ının yerinde kalibrasyonu

  1. Görüntü alımı sırasında, 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mMCaCl2 ve 5 mM glikoz içeren 1 L potasyum bakımından zengin (K+-zengin) çözelti hazırlayın. 25 mM HEPES (1 M, pH 7.2 stok çözümünden) ve 25 mM MES ile ayrı bir 400 mL hacim (0.5 M, pH 6.0 stok çözümünden) ile K+zengin çözeltisinin bir 400 mL hacmini tamamlar.
  2. gerektiğinde 10 M HCl veya 10 M KOH kullanarak 25m HEPES ile tamponlanmış K+zengin çözeltisinin 50 mL'lik bir aliquot'ını pH 7.5'e ayarlayın.
  3. Gerektiğinde 10 M HCl veya 10 M KOH kullanarak 25mM MES ile tamponlanmış üç ayrı 50 mL'lik K+zengin çözeltisini pH 6.5, pH 5.5 ve pH 5.0'a ayarlayın.
    NOT: Daha düşük pH çözeltileri için asetat-asetik asit tamponu tercih edilebilir.
  4. Görüntü alımının tamamlanmasından sonra, HBSS'yi hücreleri içeren 96 kuyu plakasından çıkarın ve pH 7.5'teki K+bakımından zengin çözelti ile değiştirin.
  5. Nijerini 10 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
    NOT: Nijerin, K + ileH+ 'yı değiş tokuş eden bir iyonoforedir. K+ -rich çözeltisinin K+konsantrasyonunu sitozolünün K+ konsantrasyonuna yakın bir değere ayarlayarak, nijerinin makropinozomun pH'ını sitozolunkine sıkıştırması sağlanabilir, bu da kalibrasyon tamponunun pH'ını yansıtır.
  6. Plakayı mikroskopa geri yerleştirin ve yukarıdakiyle aynı alım ayarlarını kullanarak her kuyunun görüntülerini alın.
  7. Her kalibrasyon arabelleği için 3.5 ve 3.6 adımlarını yineleyin.

4. Makropinozom pH için veri analizi

  1. FIJI yazılımını kullanarak, arka planı hem TMR hem de floresan kanalından çıkarın.
  2. TMR kanalında bir maske oluşturun. Maske oluşturmak için, > Eşiğini Ayarla > Uygula 'yıseçerek görüntüyü ikili görüntüye dönüştürün. Ardından, ikili görüntüyü vurgulayın ve Maske Oluştur '> > Seçimi Düzenle 'yiseçin.
  3. Hem TMR hem de floresan görüntülere uygulayın. Bunu yapmak için maskeyi vurgulayın ve Seçimi > Düzenle'> Seçim Oluştur 'useçin. TMR görüntüsüne tıklayın ve maskeyi TMR kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın. Benzer şekilde, floresan resmine tıklayın ve maskeyi OB kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın.
  4. Maskelerin içindeki her makropinozom için TMR ve floresan yoğunluğunu kaydedin.
  5. Zaman diliminden her zaman noktası için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  6. Yerinde kalibrasyonda yakalanan görüntüler için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  7. Floresan:TMR oranını oluşturmak için floresan yoğunluğunu TMR yoğunluğuna bölün.
  8. Kalibrasyon görüntüleri için pH'ı floresan:TMR oranlarına göre çizin.
  9. Kalibrasyon verilerine bir eğri sığdırın.
  10. Mutlak pH değerlerini almak için zaman kursundan her zaman noktası için verileri enterpolasyon.

5. Makropinozomlar içindeki oksidatif olayların ölçülmesi

  1. Hücreleri bölüm 1'deki gibi hazırlayın.
  2. Testlerden bir gün önce, 70 kDa dextran etiketli H2DCFDA süksinimimidyl esterini 10 mg 70 kDa dextran-amino'yu 0,1 M sodyum bikarbonat çözeltisinin (pH 8,3) 1 mL'sinde yeniden yağlayarak hazırlayın. Dektran-amino çözeltisine 1 mg H2DCFDA süksinimimidyl ester ekleyin ve 1 saat kuluçkaya yatırın. PBS'ye karşı H2DCFDA etiketli 70 kDa dektran'ı dialyze edin. H2DCFDA etiketli 70 kDa dextran depolama sırasında oksitlendireceğinden 1 günden fazla saklamayın.
  3. Tahlil gününde, tüm kuyuları 37 ° C'de 100 μL HBSS ile yıkayın.
  4. Her kuyuyu 0.025 mg/mL TMR etiketli 70 kDa dektran ve 0.025 mg/mL H2DCFDA etiketli 70 kDa dextran içeren 100 μL HBSS ile doldurun.
  5. Hücreleri 15 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
  6. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri 100 μL HBSS ile 6x yıkayın.
  7. Her kuyuyu 37 °C'de 100 μL HBSS ile doldurun.
  8. Plakayı ısıtılmış bir sahne ve hazne ile mikroskopa yerleştirin ve her florofor için eksitasyon/emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
    NOT: Görüntü alımı için ideal koşullar, kullanılan floroforlara ve bireysel mikroskop kurulumlarına göre değişecektir. Burada görüntüler Leica SP5 lazer tarama konfokal mikroskopta elde edildi. TMR 543 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 610 nm'den 650 nm'ye toplandı. H2DCFDA 488 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 500 nm'den 550 nm'ye toplandı. 63x yağ daldırma hedefi kullanıldı ve 0,5 μm aralıklarla 10 μm Z hacmi elde edildi.
  9. Her kuyudan, her kuyunun arasındaki floroforlar arasında değişen bir görüntü elde edin.
  10. İlk satın alma işleminden sonra, tüm kuyuların tüm plaka boyunca odakta kalıp kalmadığını kontrol edin.
  11. İstenilen süre boyunca her kuyunun görüntülerini 1-15 dakika aralıklarla elde edin.

6. Makropinozomlar içindeki oksidatif olaylar için veri analizi

  1. FIJI yazılımını kullanarak, arka planı hem TMR hem de H2DCFDA kanallarından çıkarın.
  2. TMR kanalında bir maske oluşturun. Maske oluşturmak için, > Eşiğini Ayarla > Uygula 'yıseçerek görüntüyü ikili görüntüye dönüştürün. Ardından, ikili görüntüyü vurgulayın ve Maske Oluştur '> > Seçimi Düzenle 'yiseçin.
  3. Maskeyi hem TMR hem de H2DCFDA görüntülerine uygulayın. Bunu yapmak için maskeyi vurgulayın ve Seçimi > Düzenle'> Seçim Oluştur 'useçin. TMR görüntüsüne tıklayın ve maskeyi TMR kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın. Benzer şekilde, H2DCFDA görüntüsüne tıklayın ve maskeyi H2DCFDA kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın.
  4. Maskelerin içindeki her makropinozom için TMR ve H2DCFDA yoğunluğunu kaydedin.
  5. Zaman diliminden her zaman noktası için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  6. H2DCFDA: TMR oranı oluşturmak için H2DCFDA yoğunluğunu TMR yoğunluğuna bölün.
  7. H2DCFDA: TMR oranını zamana karşı çizin.

7. Makropinozomlarda protein sindirimi ölçümü

  1. Hücreleri bölüm 1'deki gibi hazırlayın.
  2. Tahlil günü, tüm kuyuları 37 ° C'de 100 μL HBSS ile yıkayın.
  3. BODIPY etiketli ovalbumin'i HBSS'de 4 mg/mL konsantrasyonda çözün.
  4. Her kuyuyu 0.025 mg/mL TMR etiketli 70 kDa dektran ve BODIPY etiketli ovalbumin 0.2 mg/mL içeren 100 μL HBSS ile doldurun.
  5. Hücreleri 15 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
  6. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri 100 μL HBSS ile 6x yıkayın.
  7. Her kuyuyu 37 °C'de 100 μL HBSS ile doldurun.
  8. Plakayı ısıtılmış bir sahne ve hazne ile mikroskopa yerleştirin ve her florofor için eksitasyon/emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
    NOT: Görüntü alımı için ideal koşullar, kullanılan floroforlara ve bireysel mikroskop kurulumlarına göre değişecektir. Burada, görüntüler Leica SP5 lazer tarama konfokal mikroskopta elde edildi. TMR 543 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 610 nm'den 650 nm'ye toplandı. BODIPY 488 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 500 nm'den 550 nm'ye toplandı. 63x yağ daldırma hedefi kullanıldı ve 0,5 μm aralıklarla 10 μm Z hacmi elde edildi.
  9. Her kuyudan, her kuyunun arasındaki floroforlar arasında değişen bir görüntü elde edin.
  10. İlk satın alma işleminden sonra, tüm kuyuların tüm plaka boyunca odakta kalıp kalmadığını kontrol edin.
  11. İstenilen süre boyunca her kuyunun görüntülerini 1-15 dakika aralıklarla elde edin.

8. Makropinozomlarda protein sindirimi için veri analizi

  1. FIJI yazılımını kullanarak, arka planı hem TMR hem de BODIPY kanallarından çıkarın.
  2. TMR kanalında bir maske oluşturun ve yukarıdaki 6.2 ve 6.3 adımlarında olduğu gibi hem TMR hem de BODIPY görüntülerine uygulayın (Şekil 3B).
  3. Maskelerin içindeki her makropinozom için TMR ve BODIPY yoğunluğunu kaydedin.
  4. Zaman diliminden her zaman noktası için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  5. BODIPY:TMR oranını oluşturmak için BODIPY yoğunluğunu TMR yoğunluğuna bölün.
  6. Bodipy:TMR oranını zamana göre çizin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Makropinozom pH'ı ölçerken, asitleşme dinamiklerinin ölçülemediği bir süre vardır. Bu süre dektran yükleme aşamasına (Şekil 2C ve Şekil 3C, D'dekigri kutu) karşılık gelir ve kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişir. Yükleme aşamasının uzunluğu (i) hücrelerin makropinositik aktivitesi ve (ii) kullanılan aletin hassasiyetine göre değişir. Bu sürenin her deneyin başlangıcında hem floresan hem de TMR kanalları için 4:1'den büyük bir sinyal:gürültü oranı elde olacak şekilde ayarlanması önerilir. Tedavi edilmeyen hücrelerde, makropinozomlar asitleştikçe floresan emisyonu giderek zayıflamalı ve TMR sinyali sabit kalmalı veya daha parlak olmalıdır. Makropinozomlar16,21boyutunda küçülürse TMR sinyali daha parlak hale gelebilir. Floresan sinyali organel boyutu22'deaynı varyasyonlara maruz kaldığı için bu oranı etkilemeyecektir. Floresan:TMR oranı giderek küçülecek ve satın almanın ilk 15 dakikası içinde platolanacaktır (Şekil 2C). Bu plato, lizozomların pH'ı 25 ile kabaca eşleşen~5 pH'ınakarşılık gelir. Her alımın sonunda yerinde kalibrasyon yapılır. Floresan:TMR oranı pH 7.5'teki kalibrasyon tamponu ile en büyük olmalı ve kalibrasyon tamponları daha asidik hale geldikçe giderek küçülmelidir. Bu, kalibrasyon eğrisinin üretilmesine izin verir (Şekil 2B). Floresan:TMR oranları daha sonra makropinosomal pH için enterpolasyon yapılabilir (Şekil 2C).

Makropinozomlar içindeki oksidatif olayların da kullanılan hücre tipine göre değişmesi muhtemeldir. Hücrelerin H2DCFDA-dektran ile yüklenmesi ve NADPH oksidazın pozitif kontrol olarak phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) kullanılarak uyarılması önerilir (Şekil 3C). Bu, tahlilin dinamik aralığı hakkında daha iyi bir fikir verecek ve mikroskop ayarlarının ayarını sağlayacaktır. Makropinozomlarda oksidatif olaylar meydana geldikçe, H2DCFDA sinyali giderek daha parlak hale gelecektir. TMR sinyali sabit kalabilir veya yukarıda açıklanmış olduğu gibi makropinozomun boyutuna göre değişebilir. H2DCFDA:TMR oranı giderek daha büyük hale gelecek ve inaktive Raw264.7 hücrelerinde ilk 20-30 dakika içinde plato olacaktır (Şekil 3A,C).

Makropinosomal protein sindirimini ölçerken, ovalbumin sindirildikçe giderek daha güçlü bir floresan sinyal serbest kalacaktır. Raw264.7 hücrelerinde, sindirilen BODIPY etiketli ovalbumin'den kurtarılan floresan artışı ilk 30 dk içinde plato yapacaktır (Şekil 3B,D). Daha önce olduğu gibi, TMR sinyali sabit kalabilir veya makropinozom boyutuna göre değişebilir. Makropinozom kapanışının hemen ardından ovalbumin bozulması başladığından, negatif bir kontrol tahlil dinamik aralığını belirlemede yararlı olabilir. Bu amaçla, makropinozom içindeki asit hidrolazları, Concanamycin A (CcA) (Şekil 3D) veya Bafilomycin A gibi V-ATPaz inhibitörü kullanılarak inhibe edilebilir.

Figure 1
Şekil 1: Çift florofor oranmetrik görüntüleme prensipleri. (A-C). Belirtilen pH tamponlarında asılı pH'a duyarlı floroforların spektral taramaları (ekscitasyon sabit, emisyon bakımından çeşitli). Floresan, pHrodo ve cypHer5e hücresel testlerde pH sensörleri olarak yaygın olarak kullanılır. (D-F). Belirtilen pH tamponlarında asılı pH'a duyarsız floroforların spektral taramaları (ekscitasyon sabit, emisyon bakımından çeşitli). pH ile değişmeyen boyalar faydalı referans floroforlar yapar. Floresan, endozomlarda yaşanan daha asidik pH değerlerinde en iyi şekilde hassas değildir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Makropinosomal pH'ın dinamik ölçümleri. (A) Raw264.7 hücreleri, 15 dakika boyunca Lipopolisakharid'in (LPS) 500 ng/mL'si varlığında veya yokluğunda 37 °C'de floresan etiketli 70 kDa dektran ve TMR etiketli 70 kDa dektran ile yüklendi. Ayrıca dektranın spesifik olmayan bağlanması için bir kontrol olarak 4 °C'de floresan etiketli 70 kDa dektran ve TMR etiketli 70 kDa dektran ile inkübe edildiler. Girişler tek tek hücreleri gösterir (Ölçek çubukları = 20 μm). (B) Belirtilen pH ve nijersin'de K+-zengin tamponlar kullanılarak floresan etiketli 70 kDa dektran ve TMR etiketli 70 kDa dektran ile yüklenen Raw264.7 hücrelerinin yerinde kalibrasyonu. (C) Raw264.7 hücrelerinde makropinozom pH. İçeler bireysel makropinozomlarda floresan:TMR oranını temsil eder. Gri kutular, hücrelerin dektranla yüklendiği zamanları gösterir. Her biri ≥ 80 hücre içeren iki bağımsız deneyden elde edilen veriler. Ortalama olarak temsil edilen veriler SEM±. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Makropinozomların lümeninde oksidatif olayların ve protein sindiriminin dinamik ölçümleri. (A) Raw264.7 hücreleri H2DCFDA etiketli 70 kDa dextran ve TMR etiketli 70 kDa dextran ile 37 °C'de 15 dakika boyunca yüklendi ve ardından 37 °C'de 45 dakikalık bir kovalamaca yapıldı. İçe, tek tek makropinozomların oranlı görüntülerini (H2DCFDA/TMR) gösterir. Ölçek çubukları = 20 μm. (B) Raw264.7 hücreleri 15 dakika boyunca 37 °C'de BODIPY etiketli ovalbumin ve TMR etiketli 70 kDa dextran ile yüklendi ve ardından 37 °C'de 45 dakikalık bir kovalamaca yapıldı. TMR kanalı, BODIPY kanalına uygulanan bir maske oluşturmak için kullanıldı. Girişler tek tek hücreleri gösterir. Ölçek çubukları = 20 μm. (C) Makropinozomların lümeni içinde H2DCFDA oksidasyonu. Hücreler de pozitif kontrol olarak PMA ile uyarıldı. Gri kutular, hücrelerin dektranla yüklendiği zamanları gösterir. Her biri 80 hücre ≥ içeren iki bağımsız deneyden elde edilen veriler. Veriler SEM ± ortalama olarak temsil edilir. Her zaman noktası PMA kontrolü ile karşılaştırıldı. İstatistiksel analiz için bir öğrencinin t-testi kullanılmıştır. (D) Makropinozomlar içinde BODIPY etiketli ovalbumin bozulması. Konanamin A (CcA), luminal asit hidrolazlarının aktivasyonunu önlediği için negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Her biri 80 hücre ≥ içeren iki bağımsız deneyden elde edilen veriler. Veriler SEM ± ortalama olarak temsil edilir. Her zaman noktası CcA kontrolü ile karşılaştırıldı. İstatistiksel analiz için bir öğrencinin t-testi kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Makrofajlarda, fibroblastlarda ve hatta Diktinostelium spp'de makropinositik alımın hem düşük hem de yüksek verimli ölçümleri için bir dizi protokol olmasına rağmen. 3,7,31,32,33, bu dinamik bölmelerin ışık biyokimyasını ölçmek için çok az girişimde bulunulmuştır. Bunun nedeni, diğer endosik bölmelerden kaçınırken makropinosomal bölmeye verimli bir şekilde hedeflenebilen probların azlığıdır. Burada açıklananlar, makropinozomlar içinde pH, oksidatif olaylar ve protein sindiriminin dinamik ölçümü için floresan probları hedefleme teknikleridir.

Oranmetrik floresan mikroskopisi, endosomal pH'ın on yıllardır ölçüldüğü birincil teknik olmuştur. Floresan endozomal pH ölçümü için yaygın olarak kullanılmıştır ve pKa tipik endosomal pH değerleri aralığı (~pH 7.2-4.5) ile doğru ölçümlere izin verdiği için tercih edilen florofor olmaya devam eder. Burada, çalışmada makropinosome özgü pH ölçümleri için 70 kDa dektrana konjuge floresan kullanıldı. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, makropinosomal pH'ın kaydedilemediği 15 dk dektran yükleme süresidir. Bu süre makropinosomal bölmeye yeterli florofor etiketli dektran yüklemek için gereklidir, ancak erken makropinozom pH ölçümlerini etkili bir şekilde önler. Bununla birlikte, bu, arabelleğe alma kapasitesi, göreli proton sızıntısı ve V-ATPase pompalama gücü gibi çeşitli ışık parametrelerinin belirlenmesini engellemez, bunların hepsi makropinosomal pH ölçümlerinden türetilmiştir. Şekil 1'degösterildiği gibi, pHrodo (pK a = 6.8) ve CypHer5e (pKa = 7.3) dahil olmak üzere pH'ı ölçmek için bir dizi başka pH'a duyarlı florofor da kullanılabilir. Bununla birlikte, floresandan önemli ölçüde daha yüksek bir pKa'ya sahip olduklarından, endosomal pH'ı daha asidik pH değerlerinde ölçmek için uygun değildirler.

Makropinozomlar son derece dinamik organeller olduğundan ve16,21oluşturduktankısa bir süre sonra önemli bir büzülme geçirdiğinden, çift florofor oranımetrik floresan gereklidir. Makropinozomların hacmindeki değişikliklere bağlı floresan değişiklikler, sunulan tüm tahlillerde referans floroforu kullanmak için düzeltilmiştir.

Hücrelerdeki oksidatif olaylar, nitroblue tetrazolium (NBT), luminol ve H2DCFDA dahil olmak üzere çeşitli redoks duyarlı problar kullanılarak ölçülmüştür. Luminol tabanlı yaklaşımlar özellikle hücre popülasyonunda ROS üretimini ölçmek için yararlıdır, ancak organel spesifik ölçümlere uyum sağlamak zordur. NBT, oksidasyon üzerine formazan adı verilen kolayca görselleştirilmiş çözünmez bir tortu oluşturur, ancak floresan sinyalleri gizler ve hem doğrusal hem de lokalize edilmesi zordur. H2DCFDA, oksidasyon üzerine doğrusal bir floresan sinyalini serbest bıraktırır ve organel spesifik ölçümler için dektran gibi izleyicilere kolayca eşlenebilir. H2DCFDA'yı 70 kDa dektrana bağlayarak, bireysel makropinozomlar içindeki oksidatif olaylar (Şekil 3B) görselleştirilebilir. Ancak, bu yaklaşımda bir uyarı vardır. H2DCFDA değiştirilmiş bir floresan formu olduğundan, serbest bırakılan sinyal pH'a duyarlıdır. Oksidasyon üzerine floresan kazancı tespit edilecek kadar büyük olsa da, şüphesiz makropinozomun asidik lümeni tarafından maskelenmiştir. H2DCFDA'nın pH'a duyarsız bir varyantı daha önce ticari olarak mevcuttu ve tercih edilir; ancak, bu makale hazırlanırken, bu ürün artık ticari olarak mevcut değildi. ROS önemli bir sinyal molekülü olarak ortaya çıkıyor ve membran remodeling, organeller kaçakçılık ve daha yakın zamanda T hücrelerine sunum için antijen sunan hücreler tarafından malzemenin işlenmesinde bulaşmıştır28,30. Burada sunulan yöntem, makropinosomal ROS üretiminin bu çeşitli fizyolojik süreçlere katkısını incelemek için kullanılabilir.

Makropinozomlarda protein sindirimi, bağışıklık hücreleri tarafından antijen sunumunun yanı sıra kanser hücreleri tarafından besin alımının incelenmesinde de ilgi çekicidir. Örneğin, dendritik hücreler tarafından endosomal protein sindiriminin, ana histocompatibility molekülleri üzerindeki T hücrelerine sunulmak üzere mevcut peptit havuzunu sınırlandırmasına inanılmaktadır. Makropinozomlar antijen alımının önemli bir yolu olduğundan, antijen sunumunda ince ayardan sorumlu moleküler makineleri araştırmak için makropinosomal protein sindirim ölçümleri kullanılabilir. Endosomal bölmelerde protein sindirimini ölçmek için piyasada bulunan bir dizi alet kullanılır. Sindirim üzerine güçlü bir şekilde floresan haline gelen BODIPY etiketli BSA ve ovalbumin probları özellikle popüler olmuştur. Endosit izleyicilerle kolayca bir araya gelebilirler ve fagozomlar gibi belirli endozomal bölmelere hedeflenebilirler. Bununla birlikte, problar dektran ile kolayca birleştirilmiş değildir ve bu nedenle birlikte yerelleştirme yaklaşımı gerektirir. Bu yaklaşım, makropinozomlar da dahil olmak üzere tüm endosomal bölmelerin BODIPY etiketli ovalbumin ile yüklenmesiyle sonuçlanır ve makropinosome özgü bozulmayı ölçmek için bir maske kullanılır. Bu yaklaşım daha iyi çözünürlük gerektirir ve daha büyük, daha yüksek aktarım hızı analizleri için kolayca ölçeklendirilir. Protein bozum araçlarını 70 kDa dektrana kadar çiftleme teknikleri muhtemelen yararlı olacaktır ve şu anda laboratuvarımızda geliştirilmektedir.

Makropinositoz alanı büyümeye devam ettikçe34, pH, redoks kimyaları, protein sindirimi, iyon konsantrasyonları ve lipid kimyaları da dahil olmak üzere makropinozomların parlak biyokimyasını dinamik olarak ölçmek için araçlar, hızla gelişen bu organellerin benzersiz biyolojisi hakkında fikir verecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Calgary Üniversitesi'ne desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Robin Yates'e reaktiflere, ekipmanlara ve faydalı tartışmalara erişim için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 174 makropinositoz makropinozom endositoz pH V-ATPase proton pompası reaktif oksijen türleri ROS NADPH oksidaz fagosit makrofaj dendritik hücre
Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring… More

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter