Summary
We beschrijven protocollen voor het meten van pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitvertering in individuele macropinosomen in levende cellen. De nadruk wordt gelegd op dual-fluorofoor ratiometrische microscopie en de voordelen die het biedt ten opzichte van populatiegebaseerde technieken.
Abstract
In de afgelopen jaren is het gebied van macropinocytose snel gegroeid. Macropinocytose is naar voren gekomen als een centraal mechanisme waarmee aangeboren immuuncellen de organismale homeostase en immuniteit handhaven. Tegelijkertijd, en in tegenstelling tot zijn homeostatische rol, kan het ook verschillende pathologieën veroorzaken, waaronder kanker en virale infecties. In tegenstelling tot andere vormen van endocytose, blijven de instrumenten die zijn ontwikkeld voor het bestuderen van de rijping van macropinosomen onderontwikkeld. Hier beschrijft het protocol nieuw ontwikkelde hulpmiddelen voor het bestuderen van de redoxomgeving binnen het lumen van vroege en rijpende macropinosomen. Methodologieën voor het gebruik van ratiometrische fluorescentiemicroscopie bij het beoordelen van de pH, de productie van reactieve zuurstofsoorten en de degradatieve capaciteit binnen het lumen van individuele macropinosomen in levende cellen worden beschreven. Enkelvoudige organelmetingen bieden het voordeel van het onthullen van spatiotemporale heterogeniteit, die vaak verloren gaat bij populatiegebaseerde benaderingen. De nadruk wordt gelegd op de basisprincipes van duale fluorofoor ratiometrische microscopie, waaronder sondeselectie, instrumentatie, kalibratie en eencellige versus populatiegebaseerde methoden.
Introduction
Macropinocytose verwijst naar de opname van grote hoeveelheden extracellulaire vloeistof in membraangebonden cytoplasmatische organellen genaamd macropinosomen1,2. Het is een zeer geconserveerd proces dat wordt uitgevoerd door vrijlevende eencellige organismen, zoals de amoebe Dictyostelium spp. 3, evenals anthozoën4 en metazoën2. In de meeste cellen is macropinocytose een geïnduceerde gebeurtenis. De ligatie van celoppervlakreceptoren induceert het uitsteeksel van actine-aangedreven plasmamembraanuitbreidingen die ruches worden genoemd. Een fractie van die ruches, door een slecht begrepen mechanisme, verzegelen op hun distale uiteinden om macropinosomen te vormen (hoewel buiten het bestek van dit methodedocument, voor gedetailleerde beoordelingen van de mechanica van macropinocytose, raadpleegt u referenties1,2,5,6,7). De extracellulaire stimulus die macropinocytose induceren is meestal een oplosbare groeifactor5,8. Dienovereenkomstig maakt de macropinocytische gebeurtenis de inname mogelijk van een bolus van extracellulair materiaal waaruit de cel nuttige metabolieten kan afleiden om de groei te vergemakkelijken. Helaas kan deze route voor de levering van voedingsstoffen ook de pathologie stimuleren. Bepaalde kankercellen herbergen mutaties die resulteren in continue of constitutieve macropinocytose. De continue levering van voedingsstoffen vergemakkelijkt de ongecontroleerde proliferatie van kankercellen en is in verband gebracht met bijzonder agressieve tumoren9,10,11,12,13. Evenzo kunnen virussen macropinocytose induceren om toegang te krijgen tot gastheercellen, waardoor virale pathologie wordtaansturen 14.
Macropinocytose functioneert ook bij het behoud van de immuniteit tegen pathogenen. Bepaalde aangeboren immuuncellen zoals macrofagen en dendritische cellen houden zich bezig met de constitutieve en agressieve bemonstering van extracellulaire vloeistof via macropinocytose6,15,16. Deze manier van macropinocytose is ongelooflijk actief en een enkele dendritische cel kan zichzelf elk uur ophopen met een volume extracellulaire vloeistof die gelijk is aan zijn eigen gewicht17. Ondanks deze constitutieve bemonstering repliceren macrofagen en dendritische cellen zich niet ongecontroleerd zoals tumorcellen, in plaats daarvan lijken ze het extracellulaire materiaal zodanig te verwerken dat informatie kan worden geëxtraheerd om te informeren over de aanwezigheid, of zelfs afwezigheid, van potentiële bedreigingen. Informatie wordt geëxtraheerd als i) pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen die kunnen worden gelezen door intracellulaire pathogeenherkenningsreceptoren en ii) korte stukken aminozuren die kunnen worden geladen op belangrijke histocompatibiliteitsmoleculen voor screening door cellen van het adaptieve immuunsysteem16,18,19. Of pathogenen deze route voor informatieverwerking door immuuncellen ondermijnen, is op dit moment onduidelijk.
Ondanks deze goed gedefinieerde en kritische rollen voor macropinocytose in zowel het behoud van immuniteit als homeostase en in tegenstelling tot andere meer algemeen bestudeerde vormen van endocytose, is er weinig bekend over de innerlijke (luminale) werking van macropinosomen. Het ontwikkelen van gestandaardiseerde protocollen en hulpmiddelen om de luminale biochemie van macropinosomen te bestuderen, zal ons niet alleen helpen hun unieke biologie beter te begrijpen, maar zal ook inzicht bieden dat kan worden gebruikt voor nieuwe therapeutische strategieën, waaronder medicijnafgifte20. Dit methodemanuscript zal zich richten op recent ontwikkelde hulpmiddelen om, op het niveau van één organel, verschillende aspecten van de luminale biochemie van macropinosomen te ontleden.
Fluoroforen kunnen worden gebruikt om specifieke biochemie van organellen te meten als i) ze bij voorkeur in het interessecompartiment verdelen en /of ii) ze spectrale veranderingen ondergaan als reactie op de parameter van belang. Bijvoorbeeld, in het geval van pH, fluorescerende zwakke basen, zoals acridine sinaasappel, cresypaars en de LysoTracker kleurstoffen accumuleren bij voorkeur in zure organellen. Daarom is hun relatieve intensiteit een ruwe indicatie dat het gelabelde organel zuur is. Andere pH-responsieve fluoroforen, zoals fluoresceïne, pHrodo en cypHer5e, ondergaan spectrale veranderingen bij binding aan protonen (Figuur 1A-C). Veranderingen in de fluorescentie-emissie van pH-gevoelige fluoroforen kunnen daarom een nuttige benadering van de pH opleveren. Het gebruik van enkelvoudige fluoroforen brengt echter een aantal nadelen met zich mee. Bijvoorbeeld, veranderingen in het brandpuntsvlak, fotobleaching en veranderingen in het volume van individuele organellen, een veel voorkomend verschijnsel in macropinosomen21, kunnen veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van enkele fluoroforen veroorzaken, en dit kan niet gemakkelijk worden gecorrigeerd voor22. Beoordelingen met één golflengte, hoewel nuttig voor het visualiseren van zure compartimenten, zijn daarom puur kwalitatief.
Een meer kwantitatieve benadering is om de parametergevoelige fluorofoor samen met een referentiefluoofoor naar het organel van belang te richten. De referentiefluoofoor is idealiter ongevoelig voor biochemische veranderingen in het organel (Figuur 1D-F) en kan daarom worden gebruikt om te corrigeren voor veranderingen in het brandpuntsvlak, organellaire volume en, tot op zekere hoogte, fotobleaching23. Met behulp van deze benadering, aangeduid als dual-fluorofoor ratiometrische fluorescentie, kan correctie worden bereikt door een verhouding te genereren van de fluorescentie-emissie van de parametergevoelige fluorofoor tot de referentiefluoofoor.
Hier zal het protocol het principe van dual-fluorofoor ratiometrische beeldvorming gebruiken om pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitafbraak binnen macropinosomen te meten. In elk geval wordt een fluorofoor geselecteerd die gevoelig is voor de parameter van belang en een referentiefluoofoor. Om de fluoroforen specifiek op macropinosomen te richten, zullen ze covalent worden gekoppeld aan 70 kDa dextran, dat bij voorkeur wordt opgenomen in macropinosomen24. Alle testen worden uitgevoerd in Raw264.7-cellen, maar kunnen worden aangepast aan andere celtypen. Waar mogelijk worden de fluorescentieverhoudingen gekalibreerd aan de hand van een referentiecurve om absolute waarden te verkrijgen. Belangrijk is dat alle metingen zullen worden uitgevoerd in levende cellen voor dynamische en kwantitatieve beoordeling van de luminale omgeving van macropinosomen.
Bij het selecteren van pH-gevoelige fluoroforen moeten een aantal overwegingen worden afgewogen. De eerste is de pKa van de fluorofoor, die het bereik van pH-waarden aangeeft waarbij de sonde het meest gevoelig zal zijn. Als wordt aangenomen dat kort na de vorming de pH van het macropinosoom dicht bij die van het extracellulaire medium (~pH 7,2) zal liggen en dat het geleidelijk zal verzuren door interacties met late endosomen en lysosomen (~pH 5,0), dan moet een sonde met een pKa die gevoelig is binnen dat bereik (Figuur 2C) worden geselecteerd. De fluorofoorfluoesceïne, die een pKa van 6,4 heeft, is binnen dat bereik optimaal gevoelig. Het is uitgebreid gebruikt om andere soortgelijke organellen te meten, zoals fagosomen, en zal de fluorofoor van keuze zijn in dit manuscript22,25. Als referentiefluoofoor zal tetramethylrhodamine worden gebruikt, dat ongevoelig is voor pH(figuur 1E). Andere fluoroforen, zoals pHrodo en cypHer5e, kunnen worden vervangen door fluoresceïne waarbij de spectrale eigenschappen van fluoresceïne overeenkomen met andere experimentele variabelen. Enkele voorgestelde referentiefluoroforen voor pHrodo en cypHer5e zijn weergegeven in figuur 1.
Een tweede overweging is de methode waarmee de twee fluoroforen specifiek gericht zullen worden op macropinosomen. Dextran van de grootte 70 kDa, die een hydrodynamische straal van ongeveer 7 nm heeft, kleeft niet niet-specifiek aan cellen en wordt opgenomen in macropinosomen, maar niet met clathrin bedekte putten of caveolae, en markeert daarom macropinosomen (Figuur 2A en Figuur 3A, B)16,24,26. In dit protocol zullen fluoresceïne-gelabelde 70 kDa dextran en tetramethylrhodamine (TMR)-gelabelde 70 kDa dextran worden gebruikt als respectievelijk de pH-gevoelige en referentie probes.
In aangeboren immuuncellen vertegenwoordigen macropinocytose en fagocytose de twee belangrijkste routes voor de internalisatie van exogene materiaal voor verwerking en daaropvolgende presentatie aan cellen van de adaptieve immuunrespons27. De zorgvuldige en gecoördineerde controle van de redoxchemie van het lumen van fagosomen en macropinosomen is van cruciaal belang voor de contextspecifieke verwerking van exogene materie. Misschien wel de best bestudeerde regulator van oxidatieve gebeurtenissen in fagosomen is de NADPH-oxidase, een groot multi-subunitcomplex dat grote hoeveelheden reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceert binnen het lumen van fagosomen28. De activiteit ervan staat immers centraal in de juiste antigeenverwerking binnen fagosomen29,30. Toch is de activiteit van de NADPH-oxidase op macropinosomale membranen niet onderzocht.
In dit protocol wordt de H2DCFDA-succinimidylester gebruikt voor het meten van oxidatieve gebeurtenissen in het macropinosoom. Dit is een gemodificeerde vorm van fluoresceïne (2',7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat), dat minimaal fluorescerend is in zijn gereduceerde vorm. Bij oxidatie neemt de fluorescentie-emissie aanzienlijk toe. Het is echter vermeldenswaard een belangrijk voorbehoud van H2DCFDA - omdat het is gebaseerd op de fluorofoorfluoesceïne, wordt de fluorescentie ook geblust in zure compartimenten en moet ervoor worden gezorgd dat deze variabele wordt gecontroleerd bij het ontwerpen van experimenten28. Vergelijkbaar met de benadering voor het meten van de pH, zal de H2DCFDA-succinimidylester covalent worden bevestigd aan 70 kDa dextran en TMR-gelabeld 70 kDa dextran zal worden gebruikt als referentiefluoofoor (Figuur 3A).
Fluorescerend ovalbumine zal worden gebruikt om eiwitafbraak binnen macropinosomen te meten. Het hier gebruikte ovalbumine is dicht gelabeld met een 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL-kleurstof die zelf geblust is. Bij de spijsvertering komen sterk fluorescerende kleurstof-gelabelde peptiden vrij. Omdat ovalbumine niet gemakkelijk kan worden geconjugeerd tot 70 kDa dextran, zullen cellen met TMR-gelabeld 70 kDa dextran en vloeibare fase ovalbumine worden gecoïncubeerd. Het TMR-signaal zal worden gebruikt om een macropinosoommasker te genereren tijdens post-imaging analyse, en het signaal dat vrijkomt van het verteerde ovalbumine zal worden gemeten in het masker(Figuur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van cellen
- Kweek Raw264.7 cellen bij 37 °C en 5% CO2 tot 70% confluentie in RPMI aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd serum.
- Een dag voor de test zaait u Raw264.7-cellen met een dichtheid van 5 x 104 cellen per put in een 96-well plaat. Zorg ervoor dat elke put 100 μL groeimedium bevat. Zorg ervoor dat de 96-well plaat zwarte zijkanten en een glazen bodem heeft voor beeldvorming.
OPMERKING: Hier werden 96-well platen gebruikt voor beeldvorming. De 96-putplaten maken het gebruik van kleinere hoeveelheden cellen en reagentia mogelijk in vergelijking met grotere beeldvormingskamers. Elke kamer die is ontworpen voor het afbeelden van levende cellen kan echter worden gebruikt en reagentia kunnen dienovereenkomstig worden opgeschaald. - Controleer op de dag van de test of de putten ten minste 70% confluent zijn.
2. Meten van de pH van macropinosoom
- Bereid de cellen voor zoals in rubriek 1.
- Was alle putjes met 100 μL HBSS bij 37 °C.
- Vul elke put met 100 μL HBSS met 0,025 mg/ml TMR-gelabeld 70 kDa dextran en 0,025 mg/ml fluoresceïne-gelabeld 70 kDa dextran.
- Plaats de cellen gedurende 15 minuten in een couveuse die is ingesteld op 37 °C.
- Verwijder de cellen uit de couveuse en was de cellen 6x met 100 μL HBSS.
- Vul elke put met 100 μL HBSS bij 37 °C.
- Plaats de plaat op de microscoop met een verwarmde trap en kamer.
- Pas de excitatie-/emissieparameters voor elke fluorofoor indien nodig aan.
OPMERKING: Ideale omstandigheden voor beeldacquisitie variëren met gebruikte fluoroforen en individuele microscoopopstellingen. Hier werden beelden verkregen met een Leica SP5 laser scanning confocale microscoop. TMR werd opgewonden met een 543-laserlijn en de emissie werd verzameld van 610 nm tot 650 nm. Fluoresceïne werd geëxciteerd met een 488-laserlijn en de emissie werd verzameld van 500 nm tot 550 nm. Er werd een 63x olie-onderdompelingsdoel gebruikt en een Z-volume van 10 μm werd verkregen met intervallen van 0,5 μm. - Verkrijg een beeld van elke put, afwisselend tussen fluoroforen tussen elke put.
- Controleer na de eerste acquisitie of alle putten over de hele plaat in focus bleven.
- Verkrijg afbeeldingen van elke put met intervallen van 1-15 minuten voor de gewenste tijdsduur.
3. In situ kalibratie van de pH van macropinosoom
- Bereid tijdens de beeldacquisitie 1 L kaliumrijke (K+-rijke) oplossing met 140 mM KCl, 1 mM MgCl2,1 mM CaCl2en 5 mM glucose. Vul een 400 ml volume van de K+-rijke oplossing aan met 25 mM HEPES (uit een 1 M, pH 7,2 stamoplossing) en een afzonderlijk 400 ml volume met 25 mM MES (uit een 0,5 M, pH 6,0 stamoplossing).
- Pas een aliquot van 50 ml van de K+-rijke oplossing gebufferd met 25mM HEPES aan tot pH 7,5 met behulp van 10 M HCl of 10 M KOH indien nodig.
- Pas drie afzonderlijke aliquots van 50 ml van de K+-rijke oplossing gebufferd met 25mM MES aan tot pH 6,5, pH 5,5 en pH 5,0 met behulp van 10 M HCl of 10 M KOH indien nodig.
OPMERKING: Een acetaat-azijnzuurbuffer kan de voorkeur hebben voor oplossingen met een lagere pH. - Verwijder na de voltooiing van de beeldacquisitie de HBSS van de 96-putplaat met de cellen en vervang deze door de K+-rijke oplossing die zich op pH 7,5 bevindt.
- Voeg nigericine toe tot een eindconcentratie van 10 μg/ml.
OPMERKING: Nigericine is een ionofoor die K+ voor H+ verwisselt. Door de K+ -concentratie van de K+-rijke oplossing in te stellen op een waarde die de K+ -concentratie van het cytosol benadert, kan ervoor worden gezorgd dat nigericine de pH van het macropinosoom zal klemmen met die van het cytosol, dat op zijn beurt de pH van de kalibratiebuffer weerspiegelt. - Plaats de plaat terug op de microscoop en verkrijg afbeeldingen van elke put met dezelfde acquisitie-instellingen als hierboven.
- Herhaal stap 3.5 en 3.6 voor elke kalibratiebuffer.
4. Data-analyse voor macropinosoom pH
- Trek met behulp van FIJI-software de achtergrond af van zowel de TMR als het fluoresceïnekanaal.
- Genereer een masker op het TMR-kanaal. Als u een masker wilt genereren, converteert u de afbeelding naar een binaire afbeelding door > drempel aanpassen > toepassente selecteren. Markeer vervolgens de binaire afbeelding en selecteer Bewerken > selectie > Masker maken.
- Pas het toe op zowel de TMR- als fluoresceïneafbeeldingen. Hiertoe markeert u het masker en selecteert u Bewerken > selectie > Selectie maken. Klik op de TMR-afbeelding en druk op Shift + E om het masker op het TMR-kanaal toe te passen. Klik op dezelfde manier op de fluoresceïneafbeelding en druk op Shift + E om het masker op het OB-kanaal toe te passen.
- Noteer de TMR- en fluoresceïne-intensiteit voor elk macropinosoom in de maskers.
- Herhaal stap 4.1-4.3 voor elk tijdstip uit het tijdsverloop.
- Herhaal stap 4.1-4.3 voor de beelden die zijn vastgelegd in de in-situ kalibratie.
- Deel de fluoresceïne-intensiteit door de TMR-intensiteit om de fluoresceïne:TMR-verhouding te genereren.
- Zet de pH uit tegen de fluoresceïne:TMR-verhoudingen voor de kalibratiebeelden.
- Pas een curve aan op de kalibratiegegevens.
- Interpoleer de gegevens voor elk tijdstip uit het tijdsvak om absolute pH-waarden te krijgen.
5. Meten van oxidatieve gebeurtenissen binnen macropinosomen
- Bereid de cellen voor zoals in rubriek 1.
- Bereid een dag voor de test de H2DCFDA-succinimidylester met het label 70 kDa dextran door 10 mg 70 kDa dextran-amino opnieuw op te suspenderen in 1 ml 0,1 M natriumbicarbonaatoplossing (pH 8,3). Voeg 1 mg H2DCFDA-succinimidylester toe aan de dextran-amino-oplossing en incubeer gedurende 1 uur. Dialyseer de H2DCFDA-gelabelde 70 kDa dextran tegen PBS. Bewaar niet langer dan 1 dag, omdat H2DCFDA-gelabeld 70 kDa dextran zal oxideren bij opslag.
- Was op de dag van de test alle putjes met 100 μL HBSS bij 37 °C.
- Vul elke put met 100 μL HBSS met 0,025 mg/ml TMR-gelabeld 70 kDa dextran en 0,025 mg/ml H2DCFDA-gelabeld 70 kDa dextran.
- Plaats de cellen gedurende 15 minuten in een incubator die is ingesteld op 37 °C.
- Verwijder cellen uit de couveuse en was de cellen 6x met 100 μL HBSS.
- Vul elke put met 100 μL HBSS bij 37 °C.
- Plaats de plaat op de microscoop met een verwarmde trap en kamer en pas indien nodig de excitatie- / emissieparameters voor elke fluorofoor aan.
OPMERKING: Ideale omstandigheden voor beeldacquisitie variëren met gebruikte fluoroforen en individuele microscoopopstellingen. Hier werden beelden verkregen op een Leica SP5 laser scanning confocale microscoop. TMR werd opgewonden met een 543-laserlijn en de emissie werd verzameld van 610 nm tot 650 nm. H2DCFDA werd opgewonden met een 488-laserlijn en de emissie werd verzameld van 500 nm tot 550 nm. Er werd een 63x olie-onderdompelingsdoel gebruikt en een Z-volume van 10 μm werd verkregen met intervallen van 0,5 μm. - Verkrijg een beeld van elke put, afwisselend tussen fluoroforen tussen elke put.
- Controleer na de eerste acquisitie of alle putten over de hele plaat in focus blijven.
- Verkrijg afbeeldingen van elke put met intervallen van 1-15 minuten voor de gewenste tijdsduur.
6. Data-analyse voor oxidatieve gebeurtenissen binnen macropinosomen
- Trek met behulp van FIJI-software de achtergrond af van zowel het TMR- als het H2DCFDA-kanaal.
- Genereer een masker op het TMR-kanaal. Als u een masker wilt genereren, converteert u de afbeelding naar een binaire afbeelding door > drempel aanpassen > toepassente selecteren. Markeer vervolgens de binaire afbeelding en selecteer Bewerken > selectie > Masker maken.
- Pas het masker toe op zowel de TMR- als de H2DCFDA-afbeeldingen. Hiertoe markeert u het masker en selecteert u Bewerken > selectie > Selectie maken. Klik op de TMR-afbeelding en druk op Shift + E om het masker op het TMR-kanaal toe te passen. Klik op dezelfde manier op de H2DCFDA-afbeelding en druk op Shift + E om het masker toe te passen op het H2DCFDA-kanaal.
- Noteer de TMR- en H2DCFDA-intensiteit voor elk macropinosoom in de maskers.
- Herhaal stap 4.1-4.3 voor elk tijdstip uit het tijdsverloop.
- Deel de H2DCFDA-intensiteit door de TMR-intensiteit om een H2DCFDA: TMR-verhouding te genereren.
- Zet de H2DCFDA: TMR-verhouding uit tegen de tijd.
7. Meten van eiwitvertering binnen macropinosomen
- Bereid de cellen voor zoals in rubriek 1.
- Was op de dag van de test alle putjes met 100 μL HBSS bij 37 °C.
- Los BODIPY-gelabeld ovalbumine op tot een concentratie van 4 mg / ml in HBSS.
- Vul elke put met 100 μL HBSS met 0,025 mg /ml TMR-gelabeld 70 kDa dextran en 0,2 mg / ml BODIPY-gelabeld ovalbumine.
- Plaats de cellen gedurende 15 minuten in een couveuse die is ingesteld op 37 °C.
- Verwijder cellen uit de couveuse en was de cellen 6x met 100 μL HBSS.
- Vul elke put met 100 μL HBSS bij 37 °C.
- Plaats de plaat op de microscoop met een verwarmde trap en kamer en pas indien nodig de excitatie- / emissieparameters voor elke fluorofoor aan.
OPMERKING: Ideale omstandigheden voor beeldacquisitie variëren met gebruikte fluoroforen en individuele microscoopopstellingen. Hier werden beelden verkregen met een Leica SP5 laser scanning confocale microscoop. TMR werd opgewonden met een 543-laserlijn en de emissie werd verzameld van 610 nm tot 650 nm. BODIPY was enthousiast met een 488-laserlijn en de emissie werd verzameld van 500 nm tot 550 nm. Er werd een 63x olie-onderdompelingsdoel gebruikt en een Z-volume van 10 μm werd verkregen met intervallen van 0,5 μm. - Verkrijg een beeld van elke put, afwisselend tussen fluoroforen tussen elke put.
- Controleer na de eerste acquisitie of alle putten over de hele plaat in focus blijven.
- Verkrijg afbeeldingen van elke put met intervallen van 1-15 minuten voor de gewenste tijdsduur.
8. Data-analyse voor eiwitvertering binnen macropinosomen
- Trek met behulp van FIJI-software de achtergrond af van zowel het TMR- als het BODIPY-kanaal.
- Genereer een masker op het TMR-kanaal en pas het toe op zowel de TMR- als de BODIPY-afbeeldingen zoals in stap 6.2 en 6.3 hierboven(Figuur 3B).
- Noteer de TMR- en BODIPY-intensiteit voor elk macropinosoom in de maskers.
- Herhaal stap 4.1-4.3 voor elk tijdstip uit het tijdsverloop.
- Deel de BODIPY-intensiteit door de TMR-intensiteit om de BODIPY:TMR-verhouding te genereren.
- Zet de VERHOUDING BODIPY:TMR uit tegen de tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het meten van de pH van macropinosomen is er een periode waarin de dynamiek van verzuring niet kan worden gemeten. Deze periode komt overeen met de dextran-laadfase (grijs vak in figuur 2C en figuur 3C,D) en zal variëren afhankelijk van het gebruikte celtype. De lengte van de belastingsfase zal variëren met (i) de macropinocytische activiteit van de cellen en (ii) de gevoeligheid van het gebruikte instrument. Het wordt aanbevolen om deze periode aan het begin van elk experiment zodanig aan te passen dat een signaal-ruisverhouding van meer dan 4:1 wordt bereikt voor zowel het fluoresceïne- als het TMR-kanaal. In onbehandelde cellen moet de fluoresceïne-emissie geleidelijk zwakker worden naarmate de macropinosomen verzuren en het TMR-signaal moet constant blijven of helderder worden. Het TMR-signaal kan helderder worden als de macropinosomen krimpen in grootte16,21. Dit heeft geen invloed op de verhouding, omdat het fluoresceïnesignaal onderhevig is aan dezelfde variaties in organellaire grootte22. De fluoresceïne:TMR-verhouding zal steeds kleiner worden en zal binnen de eerste 15 minuten van acquisitie afvlakken(figuur 2C). Dit plateau komt overeen met een pH van ~5, wat ongeveer overeenkomt met de pH van lysosomen25. Aan het einde van elke acquisitie wordt een in situ kalibratie uitgevoerd. De verhouding fluoresceïne:TMR moet het grootst zijn met de kalibratiebuffer bij pH 7,5 en geleidelijk kleiner worden naarmate de kalibratiebuffers zuurder worden. Dit maakt het mogelijk om een kalibratiecurve te genereren(figuur 2B). De fluoresceïne:TMR-verhoudingen kunnen vervolgens worden geïnterpoleerd voor macropinosomale pH(figuur 2C).
Oxidatieve gebeurtenissen binnen macropinosomen variëren waarschijnlijk ook met het celtype dat wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen om de cellen te belasten met H2DCFDA-dextran en om het NADPH-oxidase te stimuleren met behulp van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) als een positieve controle (Figuur 3C). Dit geeft een beter idee van het dynamische bereik van de test en maakt het mogelijk om de microscoopinstellingen aan te passen. Naarmate oxidatieve gebeurtenissen optreden binnen de macropinosomen, zal het H2DCFDA-signaal geleidelijk helderder worden. Het TMR-signaal kan constant blijven of kan variëren met de grootte van macropinosoom, zoals hierboven besproken. De verhouding van H2DCFDA:TMR zal steeds groter worden en zal waarschijnlijk binnen de eerste 20-30 minuten in geïnactiveerde Raw264.7-cellen(Figuur 3A,C)plateauren.
Bij het meten van de vertering van macropinosomale eiwitten komt een progressief sterk fluorescerend signaal vrij als het ovalbumine wordt verteerd. In Raw264.7-cellen zal de toename van fluorescentie die vrijkomt uit het verteerde BODIPY-gelabelde ovalbumine binnen de eerste 30 minuten plateauren (Figuur 3B, D). Net als voorheen kan het TMR-signaal constant blijven of variëren met de grootte van macropinosoom. Aangezien de afbraak van ovalbumine onmiddellijk na de sluiting van het macropinosoom begint, kan een negatieve controle nuttig zijn bij het bepalen van het dynamisch bereik van de test. Hiertoe kunnen zure hydrolasen in het macropinosoom worden geremd met behulp van een remmer van de V-ATPase, zoals Concanamycine A (CcA) (Figuur 3D) of Bafilomycine A.
Figuur 1: Principes van dual-fluorofoor ratiometrische beeldvorming. (A-C). Spectrale scans (excitatie-gefixeerd, emissie-gevarieerd) van pH-gevoelige fluoroforen gesuspendeerd in buffers van de aangegeven pH. Fluoresceïne, pHrodo en cypHer5e worden vaak gebruikt als sensoren van pH in cellulaire assays. (D-F). Spectrale scans (excitatie-gefixeerd, emissie-gevarieerd) van pH-ongevoelige fluoroforen gesuspendeerd in buffers van de aangegeven pH. Kleurstoffen die niet variëren met de pH zijn nuttige referentiefluooforen. Fluoresceïne, zijn niet optimaal gevoelig bij de meer zure pH-waarden die worden ervaren in endosomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Dynamische metingen van de macropinosomale pH. (A) Raw264.7 cellen werden geladen met fluoresceïne-gelabelde 70 kDa dextran en TMR-gelabelde 70 kDa dextran bij 37 °C in de aan- of afwezigheid van 500 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) gedurende 15 minuten. Ze werden ook geïncubeerd met fluoresceïne-gelabeld 70 kDa dextran en TMR-gelabeld 70 kDa dextran bij 4 °C als controle voor de niet-specifieke binding van dextran. Inzetstukken tonen individuele cellen (Schaalbalken = 20 μm). (B) In situ kalibratie van Raw264.7 cellen geladen met fluoresceïne-gelabeld 70 kDa dextran en TMR-gelabeld 70 kDa dextran met behulp van K+-rijke buffers bij de aangegeven pH en nigericine. (C) Macropinosoom pH in Raw264.7 cellen. Inzetstukken vertegenwoordigen de fluoresceïne:TMR-verhouding in individuele macropinosomen. Grijze vakken geven de tijden aan waarop cellen werden geladen met dextran. Gegevens van twee onafhankelijke experimenten die elk ≥ 80 cellen bevatten. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dynamische metingen van oxidatieve gebeurtenissen en eiwitvertering binnen het lumen van macropinosomen. (A) Raw264.7-cellen werden geladen met H2DCFDA-gelabelde 70 kDa dextran en TMR-gelabelde 70 kDa dextran bij 37 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door een achtervolging van 45 minuten bij 37 °C. Inzetstukken tonen gedividualiseerde beelden (H2DCFDA/TMR) van individuele macropinosomen. Schaalbalken = 20 μm. (B) Raw264.7 cellen werden geladen met BODIPY-gelabeld ovalbumine en TMR-gelabeld 70 kDa dextran bij 37 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door een achtervolging van 45 minuten bij 37 °C. Het TMR-kanaal werd gebruikt om een masker te genereren, dat werd toegepast op het BODIPY-kanaal. Inzetstukken tonen individuele cellen. Schaalbalken = 20 μm. (C) H2DCFDA oxidatie binnen het lumen van macropinosomen. Cellen werden ook gestimuleerd met PMA als positieve controle. Grijze vakken geven de tijden aan waarop cellen werden geladen met dextran. Gegevens van twee onafhankelijke experimenten, elk met ≥ 80 cellen. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM. Elk tijdstip werd vergeleken met de PMA-controle. De t-toetsvan een student werd gebruikt voor statistische analyse. (D) Bodipy-gelabelde ovalbumine afbraak in macropinosomen. Concanamycine A (CcA) werd gebruikt als een negatieve controle omdat het de activering van luminale zuurhydrolasen voorkomt. Gegevens van twee onafhankelijke experimenten, elk met ≥ 80 cellen. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM. Elk tijdstip werd vergeleken met de CcA-controle. De t-toetsvan een student werd gebruikt voor statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel er een aantal protocollen zijn voor zowel lage als hoge doorvoermetingen van macropinocytische opname in macrofagen, fibroblasten en zelfs Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,er zijn zeer weinig pogingen gedaan om de luminale biochemie van deze dynamische compartimenten te meten. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan sondes die efficiënt kunnen worden gericht op het macropinosomale compartiment terwijl andere endocytische compartimenten worden vermeden. Hier worden de technieken beschreven om fluorescerende sondes te richten voor de dynamische meting van pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitvertering binnen macropinosomen.
Ratiometrische fluorescentiemicroscopie is al tientallen jaren de primaire techniek waarmee endosomale pH wordt gemeten. Fluoresceïne is op grote schaal gebruikt voor het meten van endosomale pH en blijft de fluorofoor van keuze, omdat de pKa nauwkeurige metingen mogelijk maakt met het typische bereik van endosomale pH-waarden (~ pH 7,2-4,5). Hier gebruikte de studie fluoresceïne geconjugeerd tot 70 kDa dextran voor macropinosoom-specifieke pH-metingen. Een beperking van deze benadering is de 15 min dextran belastingsperiode gedurende welke macropinosomale pH niet kan worden geregistreerd. Deze periode is nodig om voldoende fluorofoor-gelabeld dextran in het macropinosomale compartiment te laden, maar sluit vroege macropinosoom pH-metingen effectief uit. Dit sluit echter niet uit dat verschillende luminale parameters worden bepaald, zoals de buffercapaciteit, het relatieve protonlek en het pompvermogen van V-ATPase, die allemaal zijn afgeleid van macropinosomale pH-metingen. Zoals te zien is in figuur 1,kunnen ook een aantal andere pH-gevoelige fluoroforen worden gebruikt om de pH te meten, waaronder pHrodo (pKa = 6,8) en CypHer5e (pKa = 7,3). Omdat ze echter een significant hogere pKa hebben dan fluoresceïne, zijn ze niet optimaal voor het meten van endosomale pH bij meer zure pH-waarden.
Aangezien macropinosomen zeer dynamische organellen zijn en kort na de vormingvan 16,21een aanzienlijke krimp ondergaan, is dual-fluorofoor ratiometrische fluorescentie vereist. Veranderingen in fluorescentie als gevolg van veranderingen in het volume van macropinosomen worden gecorrigeerd voor het gebruik van een referentiefluoofoor in alle gepresenteerde assays.
Oxidatieve gebeurtenissen in cellen zijn gemeten met behulp van een verscheidenheid aan redox-gevoelige sondes, waaronder nitroblauw tetrazolium (NBT), luminol en H2DCFDA. Luminol-gebaseerde benaderingen zijn bijzonder nuttig voor het meten van ROS-productie in een populatie van cellen, maar zijn moeilijk aan te passen aan organelspecifieke metingen. NBT vormt een gemakkelijk te visualiseren onoplosbare afzetting die formazan wordt genoemd bij oxidatie, maar verdoezelt fluorescerende signalen en is zowel niet-lineair als moeilijk te lokaliseren. H2DCFDA bevrijdt een lineair fluorescerend signaal bij oxidatie en kan gemakkelijk worden geconjugeerd aan tracers zoals dextran voor organelspecifieke metingen. Door H2DCFDA te hechten aan 70 kDa dextran kunnen oxidatieve gebeurtenissen binnen individuele macropinosomen (Figuur 3B) worden gevisualiseerd. Er is echter een kanttekening bij deze aanpak. Omdat H2DCFDA een gemodificeerde vorm van fluoresceïne is, is het vrijgekomen signaal pH-gevoelig. Hoewel de toename in fluorescentie bij oxidatie groot genoeg is om te worden gedetecteerd, wordt deze ongetwijfeld gemaskeerd door het zure lumen van het macropinosoom. Een pH-ongevoelige variant van H2DCFDA is eerder in de handel verkrijgbaar geweest en verdient de voorkeur; op het moment van het opstellen van dit manuscript was dit product echter niet langer commercieel verkrijgbaar. ROS is in opkomst als een belangrijk signaalmolecuul en is betrokken bij membraanremodellering, organellaire handel en meer recentelijk bij de verwerking van het materiaal door antigeen-presenterende cellen voor presentatie aan T-cellen28,30. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om de bijdrage van macropinosomale ROS-productie aan deze verschillende fysiologische processen te bestuderen.
Eiwitvertering in macropinosomen is van belang in de studie van antigeenpresentatie door immuuncellen en de studie van de verwerving van voedingsstoffen door kankercellen. Er wordt bijvoorbeeld aangenomen dat endosomale eiwitvertering door dendritische cellen de pool van peptiden beperkt die beschikbaar zijn voor presentatie aan T-cellen op belangrijke histocompatibiliteitsmoleculen. Aangezien macropinosomen een belangrijke route zijn voor antigeenacquisitie, kunnen metingen van macropinosomale eiwitvertering worden gebruikt om de moleculaire machinerie te onderzoeken die verantwoordelijk is voor het finetunen van de antigeenpresentatie. Een aantal in de handel verkrijgbare hulpmiddelen worden gebruikt voor het meten van eiwitvertering in endosomale compartimenten. De BSA- en ovalbumine-sondes met bodipy-label, die sterk fluorescerend worden bij de spijsvertering, zijn bijzonder populair gebleken. Ze zijn gemakkelijk te koppelen aan endocytische tracers en kunnen worden gericht op specifieke endosomale compartimenten, zoals fagosomen. De sondes zijn echter niet gemakkelijk gekoppeld aan dextran en vereisen dus een co-lokalisatiebenadering. Deze aanpak resulteert in het laden van alle endosomale compartimenten, inclusief macropinosomen, met BODIPY-gelabeld ovalbumine, en een masker wordt gebruikt om de macropinosoomspecifieke afbraak te meten. Deze aanpak vereist een betere resolutie en is niet eenvoudig op te schalen voor grotere analyses met een hogere doorvoer. Technieken om eiwitafbraakmiddelen covalent te koppelen aan 70 kDa dextran zullen waarschijnlijk nuttig zijn en worden momenteel in ons laboratorium ontwikkeld.
Naarmate het veld van macropinocytose blijft groeien34, zullen hulpmiddelen voor het dynamisch meten van de luminale biochemie van macropinosomen, waaronder pH, redoxchemie, eiwitvertering, ionconcentraties en lipidechemie, inzicht geven in de unieke biologie van deze snel evoluerende organellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de Universiteit van Calgary voor haar steun. We willen ook Dr. Robin Yates bedanken voor de toegang tot reagentia, apparatuur en nuttige discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | - | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
References
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A.
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al.
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A.
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C.
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S.
