Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling af makroinoomers pH-, redoxkemikalier og nedbrydende kapacitet ved hjælp af dual-fluorophore ratiometrisk mikroskopi

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

Vi beskriver protokoller til måling af pH, oxidative hændelser og proteinfordøjelse i individuelle makropinoomer i levende celler. Der lægges vægt på dual-fluorophore ratiometrisk mikroskopi og de fordele, det giver i forhold til befolkningsbaserede teknikker.

Abstract

I de senere år er makropinocytose vokset hurtigt. Makropinocytose er opstået som en central mekanisme, hvorved medfødte immunceller opretholder organisme homøostase og immunitet. Samtidig, og i modsætning til sin homøostatiske rolle, det kan også drive forskellige patologier, herunder kræft og virusinfektioner. I modsætning til andre former for endokytose forbliver de værktøjer, der er udviklet til at studere modningen af makropinoomer, underudviklede. Her beskriver protokollen nyudviklede værktøjer til at studere redox miljøet inden for lumen af tidlige og modne makropinoomer. Metoder til brug af ratiometrisk fluorescensmikroskopi ved vurdering af pH, produktion af reaktive iltarter og den nedbrydende kapacitet i lumen af individuelle makropinoomer i levende celler er beskrevet. Enkelt organelle målinger giver den fordel at afsløre spatiotemporal heterogenitet, som ofte går tabt med befolkningsbaserede tilgange. Der lægges vægt på de grundlæggende principper for dobbelt fluorophore ratiometrisk mikroskopi, herunder sondevalg, instrumentering, kalibrering og encellede versus befolkningsbaserede metoder.

Introduction

Makropinocytose refererer til optagelsen af store mængder ekstracellulær væske i membranbundne cytoplasmaorganeller kaldet makrofoinoomer1,2. Det er en meget bevaret proces udført af fritlevende encellede organismer, såsom amøbe Dictyostelium spp. 3, samt anthozoaner4 og metazoer2. I de fleste celler er makropinocytose en induceret begivenhed. Ligationen af celle-overflade receptorer fremkalder fremspring af actin-drevet plasmamembran extensions benævnt flæser. En brøkdel af disse flæser, ved nogle dårligt forstået mekanisme, forsegle på deres distale tips til at danne makropinoomer (men uden for rammerne af denne metode papir, for detaljerede anmeldelser om mekanik makropinocytose, henvises til referencer1,2,5,6,7). Den ekstracellulære stimulus inducerende makropinocytose er oftest en opløselig vækstfaktor5,8. Derfor giver den makropinocytiske begivenhed mulighed for indtagelse af en bolus af ekstracellulært materiale, hvorfra cellen kan udlede nyttige metabolitter for at lette væksten. Desværre kan denne vej til næringsstoflevering også drive patologi. Visse kræftceller havnen mutationer, der resulterer i kontinuerlig eller konstituerende makropinocytose. Den kontinuerlige levering af næringsstoffer letter ukontrolleret spredning af kræftceller og er blevet forbundet med særligt aggressive tumorer9,10,11,12,13. På samme måde kan vira fremkalde makropinocytose for at få adgang til værtsceller og derved køre viral patologi14.

Makropinocytose fungerer også i opretholdelsen af immunitet over for patogener. Visse medfødte immunceller som makrofager og dendritiske celler indgår i konstituerende og aggressiv prøveudtagning af ekstracellulær væske via makropinocytose6,15,16. Denne tilstand af makropinocytose er utrolig aktiv, og en enkelt dendritisk celle kan omformge sig selv med et volumen af ekstracellulær væske svarende til sin egen vægt hver time17. På trods af denne konstituerende prøveudtagning, makrofager og dendritiske celler ikke replikere ukontrollabelt som gør tumorceller, i stedet, de synes at behandle ekstracellulære materiale på en sådan måde, at oplysninger kan udvindes for at informere om tilstedeværelsen, eller endog fravær, af potentielle trusler. Information er udvundet som i) patogen-associerede molekylære mønstre, der kan læses af intracellulære patogen anerkendelse receptorer og ii) korte strækninger af aminosyrer, der kan indlæses på større histokompatibilitet molekyler til screening af celler i adaptive immunsystem16,18,19. Om patogener undergraver denne vej til informationsbehandling af immunceller er på nuværende tidspunkt uklart.

På trods af disse veldefinerede og kritiske roller for makropinocytose i både opretholdelsen af immunitet og homøostase og i modsætning til andre mere almindeligt studerede former for endokytose, lidt af de indre (lysende) funktioner makropinoomer er kendt. Udvikling af standardiserede protokoller og værktøjer til at studere makropinoomers lysende biokemi vil ikke kun hjælpe os med at forstå deres unikke biologi bedre, men vil give indsigt, der kan udnyttes til nye terapeutiske strategier, herunder lægemiddellevering20. Denne metode manuskript vil fokusere på nyligt udviklede værktøjer til at dissekere, på det enkelte organelle niveau, forskellige aspekter af den lysende biokemi af makropinoomer.

Fluorophorer kan anvendes til at måle specifikke biokemikalier af organeller, hvis i) de fortrinsvis opdeles i interesserummet, og/eller ii) de undergår spektrale ændringer som reaktion på interesseparameteren. For eksempel, i tilfælde af pH, fluorescerende svage baser, såsom acridin orange, cresyl violet, og LysoTracker farvestoffer ophobes fortrinsvis i sure organeller. Derfor er deres relative intensitet en grov indikation af, at den mærkede organelle er sur. Andre pH-responsive fluorophorer, såsom fluorescein, pHrodo og cypHer5e, gennemgår spektrale ændringer ved binding til protoner (Figur 1A-C). Ændringer i fluorescensemissionen af pH-følsomme fluorophorer kan derfor give en nyttig tilnærmelse af pH. Brugen af enkelte fluorophorer udgør imidlertid en række ulemper. For eksempel kan ændringer i fokusplanet, fotobleaching og ændringer i mængden af individuelle organeller, en almindelig forekomst i makropinoomer21, fremkalde ændringer i fluorescensintensiteten af enkelte fluorophorer, og dette kan ikke let korrigeres for22. Enkeltbølgelængdevurderinger er derfor rent kvalitative, selv om de er nyttige til visualisering af sure rum.

En mere kvantitativ tilgang er at målrette den parameterfølsomme fluorhest sammen med en referencefluoriphe til interesseorganelle. Referencefluoriphen er ideelt ufølsom over for biokemiske ændringer i organelle (Figur 1D-F) og kan derfor bruges til at korrigere for ændringer i fokusplanet, organellarvolumen og til en vis grad fotobleaching23. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, benævnt dual-fluorophore ratiometrisk fluorescens, kan korrektion opnås ved at generere et forhold mellem fluorescens emission af parameter-følsomme fluorophore til reference fluorophore.

Her vil protokollen bruge princippet om dual-fluorophore ratiometrisk billeddannelse til at måle pH, oxidative hændelser, og protein nedbrydning inden makropinoomer. I hvert tilfælde vælges en fluorophore, der er følsom over for parameteren af interesse og en referencefluoriphe. For at målrette fluorophores specifikt til makropinoomer, vil de blive kovalent koblet til 70 kDa dextran, som fortrinsvis er indarbejdet i makropinosomer24. Alle analyser vil blive udført i Raw264.7 celler, men kan tilpasses andre celletyper. Fluorescensforholdet kalibreres om muligt i forhold til en referencekurve for at opnå absolutte værdier. Det er vigtigt, at alle målinger udføres i levende celler til dynamisk og kvantitativ vurdering af makropinoomers lysende miljø.

Ved valg af pH-følsomme fluorophorer skal en række overvejelser vejes. Den første er pKa af fluorophoren, hvilket angiver det interval af pH-værdier, hvor sonden vil være mest følsom. Hvis det antages, at makropinosomets pH kort efter dannelsen vil være tæt på det ekstracellulære medium (~ pH 7.2), og at det gradvist vil forsuring gennem interaktioner med sene endosomes og lysosomer (~ pH 5.0), skal der vælges en sonde med en pKa, der er følsom inden for dette område (Figur 2C). Fluorophor fluorescein, som har en pKa på 6,4, er optimalt følsom inden for dette område. Det er blevet brugt i vid udstrækning til at måle andre lignende organeller, såsom fagocomer, og vil være fluorophore valg i dette manuskript22,25. Som referencefluoriphe anvendes tetramethylrhodamin, som er ufølsomt over for pH (figur 1E). Andre fluorophorer, såsom pHrodo og cypHer5e, kan erstatte fluorescein, hvor fluoresceins spektrale egenskaber svarer til andre eksperimentelle variabler. Nogle foreslåede referenceflufluoripher til pHrodo og cypHer5e er vist i figur 1.

En anden overvejelse er den metode, hvormed de to fluorophorer vil blive målrettet specifikt til makropinoomer. Dextran af størrelsen 70 kDa, som har en hydrodynamisk radius på ca. 7 nm, klæber ikke specifikt til celler og er indarbejdet i makropinoomer, men ikke clathrinbelagte gruber eller hule, og markerer derfor makropinoomer (Figur 2A og figur 3A, B)16,24,26. I denne protokol vil fluorescein-mærket 70 kDa dextran og tetramethylrhodamin (TMR)-mærket 70 kDa dextran blive brugt som henholdsvis pH-følsomme og referencesonder.

Innat immunceller, makropinocytose og fagocytose repræsenterer de to vigtigste veje til internalisering af eksogent materiale til behandling og efterfølgende præsentation til celler af det adaptive immunrespons27. Den omhyggelige og koordinerede kontrol af redoxkemien hos lumen af phagosomes og makropinoomer er afgørende for den kontekstspecifikke behandling af eksogent materiale. Måske er den mest velundersøgte regulator af oxidative hændelser i phagoomer NADPH-oxidase, et stort multi-subunit kompleks, der producerer store mængder reaktive iltarter (ROS) inden for lumen af phagosomes28. Dens aktivitet er faktisk central for passende antigenbehandling inden for fagocosomer29,30. Men aktiviteten af NADPH-oxidase på makropinosomale membraner er ikke blevet udforsket.

I denne protokol bruges H2DCFDA succinimidyl ester til måling af oxidative hændelser i makropinosomet. Dette er en modificeret form for fluorescein (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate), som er minimalt fluorescerende i sin reducerede form. Ved oxidation øges dens fluorescensemission betydeligt. Det er dog værd at bemærke en betydelig advarsel af H2DCFDA - da det er baseret på fluorophor fluorescein, slukkes dets fluorescens også i sure rum, og man skal sørge for at kontrollere for denne variabel ved design af eksperimenter28. I lighed med tilgangen til måling af pH vil H2DCFDA succinimidyl ester blive kovalent fastgjort til 70 kDa dextran og TMR-mærket 70 kDa dextran vil blive brugt som referencefluoriphe (figur 3A).

Fluorescerende ovalbumin vil blive brugt til at måle protein nedbrydning inden makropinoomer. Den ovalbumin, der anvendes her, er tæt mærket med et 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL farvestof, der er selvlukket. Ved fordøjelsen frigøres stærkt fluorescerende farvestofmærkede peptider. Da ovalbumin ikke let kan bøjes til 70 kDa dextran, vil celler med TMR-mærket 70 kDa dextran og fluid-phase ovalbumin blive inkuberet. TMR-signalet vil blive brugt til at generere en makropinosommaske under analyse efter billeddannelse, og signalet, der frigøres fra det fordøjede ovalbumin, måles i masken (Figur 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af celler

  1. Dyrk Raw264,7-celler ved 37 °C og 5% CO2 til 70% sammenløb i RPMI suppleret med 10% varmeinaktiveret serum.
  2. En dag før analysen, frø Raw264.7 celler på en densitet på 5 x 104 celler pr godt i en 96-brønd plade. Sørg for, at hver brønd indeholder 100 μL vækstmedium. Sørg for, at 96-brøndspladen har sorte sider og en glasbund til billeddannelse.
    BEMÆRK: Her blev 96-brøndsplader brugt til billeddannelse. De 96-brøndsplader giver mulighed for brug af mindre mængder celler og reagenser i forhold til større billedkamre. Men ethvert kammer designet til billeddannelse af levende celler kan bruges, og reagenser kan skaleres op i overensstemmelse hermed.
  3. På dagen for analysen, kontrollere, om brøndene er mindst 70% sammenløb.

2. Måling af makropinoom pH

  1. Forbered cellerne som i afsnit 1.
  2. Vask alle brøndene med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  3. Fyld hver brønd med 100 μL HBSS indeholdende 0,025 mg/mL TMR-mærket 70 kDa dextran og 0,025 mg/mL fluorescein-mærket 70 kDa dextran.
  4. Cellerne placeres i en inkubator, der er indstillet til 37 °C i 15 min.
  5. Fjern cellerne fra inkubatoren, og vask cellerne 6x med 100 μL HBSS.
  6. Fyld hver brønd med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  7. Placer pladen på mikroskopet med et opvarmet stadium og kammer.
  8. Juster excitations-/emissionsparametrene for hver fluorophore efter behov.
    BEMÆRK: Ideelle betingelser for billedopsamling vil variere med anvendte fluorophorer og individuelle mikroskopopsætninger. Her blev der indsamlet billeder på et Leica SP5 laserscanningsmikroskop. TMR var begejstret med en 543-laser linje og emission blev indsamlet fra 610 nm til 650 nm. Fluorescein var begejstret med en 488-laser linje og emission blev indsamlet fra 500 nm til 550 nm. Der blev anvendt et 63x oliedypningsmål, og der blev erhvervet et 10 μm Z-volumen med 0,5 μm intervaller.
  9. Erhverve et billede fra hver brønd, vekslende mellem fluorophores i mellem hver brønd.
  10. Efter det første køb skal du kontrollere, om alle brøndene forblev i fokus på tværs af hele pladen.
  11. Erhverve billeder af hver brønd på 1-15 min intervaller for den ønskede tid.

3. In situ kalibrering af makropinoom pH

  1. Under billedopsamlingen skal du forberede 1 L kaliumrig (K+-rich) opløsning, der indeholder 140 mM KCl, 1 mM MgCl2,1 mM CaCl2og 5 mM glukose. Suppler en 400 mL volumen af K+-rige opløsning med 25 mM HEPES (fra en 1 M, pH 7,2 lager løsning) og en separat 400 mL volumen med 25 mM MES (fra en 0,5 M, pH 6,0 lager løsning).
  2. Juster en 50 mL aliquot af K+-rige opløsning buffered med 25mM HEPES til pH 7,5 ved hjælp af 10 M HCl eller 10 M KOH efter behov.
  3. Juster tre separate 50 mL aliquots af K+-rige opløsning buffered med 25mM MES til pH 6,5, pH 5,5, og pH 5,0 ved hjælp af 10 M HCl eller 10 M KOH efter behov.
    BEMÆRK: En acetat-eddikesyrebuffer kan være at foretrække til lavere pH-opløsninger.
  4. Efter afslutningen af billedopsamlingen skal du fjerne HBSS fra den 96-brønds plade, der indeholder cellerne, og erstatte den med den K+-rige opløsning, der er på pH 7.5.
  5. Der tilsættes nigericin til en endelig koncentration på 10 μg/mL.
    BEMÆRK: Nigericin er en ionophore, der udveksler K+ for H+. Ved at indstille K+ koncentrationen af K+-rige opløsning til en værdi, der tilnærmer K+ koncentrationen af cytosol, kan det sikres, at nigericin vil klemme pH af makropinosomet til cytosol, som igen afspejler pH af kalibrering buffer.
  6. Placer pladen tilbage på mikroskopet og erhverve billeder af hver brønd ved hjælp af de samme erhvervelse indstillinger som ovenfor.
  7. Gentag trin 3.5 og 3.6 for hver kalibreringsbuffer.

4. Dataanalyse for makropinoindgydende pH

  1. Brug FIJI-software til at trække baggrunden fra både TMR og fluoresceinkanalen.
  2. Generer en maske på TMR-kanalen. Hvis du vil oprette en maske, skal du konvertere billedet til et binært billede ved at vælge Juster > tærskel > Anvend. Fremhæv derefter det binære billede, og vælg Rediger > markering > Opret maske.
  3. Påfør det på både TMR og fluorescein billeder. Det kan du gøre ved at fremhæve masken og vælge Rediger > markering > Opret markering. Klik på TMR-billedet, og tryk på Skift + E for at anvende masken på TMR-kanalen. På samme måde skal du klikke på fluoresceinbilledet og trykke på Skift + E for at anvende masken på OB-kanalen.
  4. Optag TMR og fluorescein intensitet for hvert makropinosom i maskerne.
  5. Gentag trin 4.1-4.3 for hvert gangpunkt fra tidskurset.
  6. Gentag trin 4.1-4.3 for de billeder, der er taget i in situ-kalibreringen.
  7. Del fluoresceinintensiteten med TMR-intensiteten for at generere fluorescein:TMR-forholdet.
  8. PH-pH'en skal afbildes i forhold til fluorescein:TMR for kalibreringsbillederne.
  9. Sæt en kurve i kalibreringsdataene.
  10. Interpoler dataene for hvert gangpunkt fra tidskursen for at få absolutte pH-værdier.

5. Måling af oxidative hændelser inden for makropinoomer

  1. Forbered cellerne som i afsnit 1.
  2. En dag før analysen forberedes H2DCFDA succinimidyl ester mærket 70 kDa dextran ved at genudsende 10 mg 70 kDa dextran-amino i 1 mL af 0,1 M natriumbicarbonatopløsning (pH 8.3). Der tilsættes 1 mg af H2DCFDA succinimidyl ester til dextran-aminoopløsningen og inkuberes i 1 time. Dialyze H2DCFDA-mærket 70 kDa dextran mod PBS. Opbevar ikke i mere end 1 dag, da H2DCFDA-mærket 70 kDa dextran oxiderer ved opbevaring.
  3. På analysedagen vaskes alle brøndene med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  4. Fyld hver brønd med 100 μL HBSS indeholdende 0,025 mg/mL TMR-mærket 70 kDa dextran og 0,025 mg/mL H2DCFDA-mærket 70 kDa dextran.
  5. Cellerne placeres i en inkubator, der er indstillet til 37 °C i 15 min.
  6. Fjern celler fra inkubatoren, og vask cellerne 6x med 100 μL HBSS.
  7. Fyld hver brønd med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  8. Placer pladen på mikroskopet med et opvarmet trin og kammer, og juster excitations-/emissionsparametrene for hver fluorophore efter behov.
    BEMÆRK: Ideelle betingelser for billedopsamling vil variere med anvendte fluorophorer og individuelle mikroskopopsætninger. Her blev der indsamlet billeder på et Leica SP5 laserscanningskonfokalt mikroskop. TMR var begejstret med en 543-laser linje, og emission blev indsamlet fra 610 nm til 650 nm. H2DCFDA var begejstret med en 488-laser linje og emission blev indsamlet fra 500 nm til 550 nm. Der blev anvendt et 63x oliedypningsmål, og der blev erhvervet et 10 μm Z-volumen med 0,5 μm intervaller.
  9. Erhverve et billede fra hver brønd, vekslende mellem fluorophores i mellem hver brønd.
  10. Efter den første erhvervelse skal du kontrollere, om alle brøndene forbliver i fokus på tværs af hele pladen.
  11. Erhverve billeder af hver brønd på 1-15 min intervaller for den ønskede tid.

6. Dataanalyse for oxidative hændelser inden for makropinoomer

  1. Brug FIJI-software til at trække baggrunden fra både TMR- og H2DCFDA-kanalerne.
  2. Generer en maske på TMR-kanalen. Hvis du vil oprette en maske, skal du konvertere billedet til et binært billede ved at vælge Juster > tærskel > Anvend. Fremhæv derefter det binære billede, og vælg Rediger > markering > Opret maske.
  3. Anvend masken på både TMR- og H2DCFDA-billederne. Det kan du gøre ved at fremhæve masken og vælge Rediger > markering > Opret markering. Klik på TMR-billedet, og tryk på Skift + E for at anvende masken på TMR-kanalen. På samme måde skal du klikke på H2DCFDA-billedet og trykke på Skift + E for at anvende masken på H2DCFDA-kanalen.
  4. Optag TMR- og H2DCFDA-intensiteten for hvert makropinosom i maskerne.
  5. Gentag trin 4.1-4.3 for hvert gangpunkt fra tidskurset.
  6. Del H2DCFDA-intensiteten med TMR-intensiteten for at generere et H2DCFDA: TMR-forhold.
  7. Plot H2DCFDA: TMR forholdet mod tiden.

7. Måling af proteinfordøjelse i makropinoomer

  1. Forbered cellerne som i afsnit 1.
  2. På analysedagen vaskes alle brøndene med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  3. Bodipy-mærket ovalbumin opløses i en koncentration på 4 mg/mL i HBSS.
  4. Fyld hver brønd med 100 μL HBSS indeholdende 0,025 mg/mL TMR-mærket 70 kDa dextran og 0,2 mg/mL BODIPY-mærket ovalbumin.
  5. Cellerne placeres i en inkubator, der er indstillet til 37 °C i 15 min.
  6. Fjern celler fra inkubatoren, og vask cellerne 6x med 100 μL HBSS.
  7. Fyld hver brønd med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  8. Placer pladen på mikroskopet med et opvarmet trin og kammer, og juster excitations-/emissionsparametrene for hver fluorophore efter behov.
    BEMÆRK: Ideelle betingelser for billedopsamling vil variere med anvendte fluorophorer og individuelle mikroskopopsætninger. Her blev der indsamlet billeder på et Leica SP5 laserscanningsmikroskop. TMR var begejstret med en 543-laser linje, og emission blev indsamlet fra 610 nm til 650 nm. BODIPY var begejstret med en 488-laser linje, og emission blev indsamlet fra 500 nm til 550 nm. Der blev anvendt et 63x oliedypningsmål, og der blev erhvervet et 10 μm Z-volumen med 0,5 μm intervaller.
  9. Erhverve et billede fra hver brønd, vekslende mellem fluorophores i mellem hver brønd.
  10. Efter den første erhvervelse skal du kontrollere, om alle brøndene forbliver i fokus på tværs af hele pladen.
  11. Erhverve billeder af hver brønd på 1-15 min intervaller for den ønskede tid.

8. Dataanalyse for proteinfordøjelse i makropinoomer

  1. Brug FIJI-software til at trække baggrunden fra både TMR- og BODIPY-kanalerne.
  2. Generer en maske på TMR-kanalen, og anvend den på både TMR- og BODIPY-billederne som i trin 6.2 og 6.3 ovenfor (Figur 3B).
  3. Optag TMR- og BODIPY-intensiteten for hvert makropinosom i maskerne.
  4. Gentag trin 4.1-4.3 for hvert gangpunkt fra tidskurset.
  5. Divider BODIPY intensiteten med TMR intensiteten for at generere BODIPY:TMR-forholdet.
  6. Plot BODIPY: TMR forholdet mod tiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved måling af makropinoom pH er der en periode, hvor dynamikken i forsuring ikke kan måles. Denne periode svarer til dextranbelastningsfasen (grå boks i Figur 2C og Figur 3C,D) og varierer afhængigt af den anvendte celletype. Længden af indlæsningsfasen varierer med (i) cellernes makropinocytiske aktivitet og (ii) følsomheden af det anvendte instrument. Det anbefales at justere denne periode ved starten af hvert forsøg, således at der opnås et signal:støj-forhold på over 4:1 for både fluorescein og TMR-kanalerne. I ubehandlede celler bør fluoresceinemissionen gradvist blive svagere, efterhånden som makropinoomer forsurer, og TMR-signalet skal forblive enten konstant eller blive lysere. TMR-signalet kan blive lysere , hvis makropinosomes krymper i størrelse16,21. Dette vil ikke påvirke forholdet, da fluoresceinsignalet er underlagt de samme variationer i organellarstørrelse22. Fluorescein:TMR-forholdet vil blive gradvist mindre og vil plateau inden for de første 15 minutter efter erhvervelsen (Figur 2C). Dette plateau svarer til en pH på ~ 5, som groft matcher pH af lysosomer25. Ved afslutningen af hver erhvervelse udføres en in situ kalibrering. Fluorescein:TMR-forholdet bør være størst med kalibreringsbufferen ved pH 7.5 og blive gradvist mindre, efterhånden som kalibreringsbufferne bliver mere sure. Dette giver mulighed for generering af en kalibreringskurve (Figur 2B). Fluorescein:TMR-forholdet kan derefter interpoleres for makropinosomal pH (Figur 2C).

Oxidative hændelser i makropinoomer vil sandsynligvis også variere med den celletype, der bruges. Det anbefales at indlæse cellerne med H2DCFDA-dextran og at stimulere NADPH-oxidase ved hjælp af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) som en positiv kontrol (Figur 3C). Dette vil give en bedre idé om det dynamiske område af analysen og vil give mulighed for justering af mikroskop indstillinger. Efterhånden som oxidative hændelser forekommer i makropinosomerne, vil H2DCFDA-signalet blive gradvist lysere. TMR-signalet kan forblive konstant eller kan variere med størrelsen af makropinosom, som beskrevet ovenfor. Forholdet mellem H2DCFDA:TMR vil blive gradvist større og vil sandsynligvis plateau inden for de første 20-30 min i inaktiverede Raw264.7 celler (Figur 3A,C).

Ved måling af makropinosomal protein fordøjelse, en gradvis stærk fluorescerende signal vil blive befriet som ovalbumin fordøjes. I Raw264.7-celler vil stigningen i fluorescens, der frigøres fra det fordøjede BODIPY-mærkede ovalbumin plateau inden for de første 30 min (Figur 3B, D). Som før kan TMR-signalet forblive konstant eller kan variere med størrelsen af makropinosomet. Som nedbrydning af ovalbumin begynder umiddelbart efter makropinosome lukning, en negativ kontrol kan være nyttig til bestemmelse af dynamikken i analysen. Til dette formål kan syrehydrlaser i makropinosomet hæmmes ved hjælp af en hæmmer af V-ATPase, såsom Concanamycin A (CcA) (Figur 3D) eller Bafilomycin A.

Figure 1
Figur 1: Principper for dual-fluorophore ratiometrisk billeddannelse. (A-C). Spektralscanninger (excitationsfaste, emissions-varierede) af pH-følsomme fluorophorer, der er suspenderet i buffere af den angivne pH-fejl. Fluorescein, pHrodo, og cypHer5e er almindeligt anvendt som sensorer af pH i cellulære assays. (D-F). Spektralscanninger (excitationsfaste, emissions-varierede) af pH-ufølsomme fluorophorer, der er suspenderet i buffere af den angivne pH-fejl. Farvestoffer, der ikke varierer med pH, gør nyttige referencefluofer. Fluorescein, er ikke optimalt følsomme på de mere sure pH-værdier opleves i endosomer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dynamiske målinger af makropinosomal pH. (A) Raw264.7-celler blev fyldt med fluorescein-mærket 70 kDa dextran og TMR-mærket 70 kDa dextran ved 37 °C i nærværelse eller fravær af 500 ng/mL lipopolysaccharid (LPS) i 15 min. De blev også inkuberet med fluorescein-mærket 70 kDa dextran og TMR-mærket 70 kDa dextran ved 4 °C som en kontrol for den ikke-specifikke binding af dextran. Insetter viser individuelle celler (Skalaer = 20 μm). (B) In situ kalibrering af Raw264.7 celler fyldt med fluorescein-mærket 70 kDa dextran og TMR-mærket 70 kDa dextran ved hjælp af K+-rige buffere ved den angivne pH og nigericin. (C) Makropinosome pH i Raw264.7 - celler. Insets repræsenterer fluorescein:TMR-forholdet i individuelle makropinoomer. Grå bokse angiver de tidspunkter, hvor celler blev fyldt med dextran. Data fra to uafhængige eksperimenter, der hver indeholder ≥ 80 celler. Data, der er repræsenteret som middel ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dynamiske målinger af oxidative hændelser og proteinfordøjelse i lumen af makropinoomer. (A) Raw264,7 celler blev lastet med H2DCFDA-mærket 70 kDa dextran og TMR-mærket 70 kDa dextran ved 37 °C i 15 min, efterfulgt af en 45 min chase ved 37 °C. Insets viser ratiorede billeder (H2DCFDA/TMR) af individuelle makropinoomer. Skalastænger = 20 μm. (B) Raw264,7 celler blev lastet med BODIPY-mærket ovalbumin og TMR-mærket 70 kDa dextran ved 37 °C i 15 min, efterfulgt af en 45 min chase ved 37 °C. TMR-kanalen blev brugt til at generere en maske, som blev anvendt på BODIPY-kanalen. Insets viser individuelle celler. Skalastænger = 20 μm. (C) H2DCFDA oxidation inden for lumen af makropinoomer. Celler blev også stimuleret med PMA som en positiv kontrol. Grå bokse angiver de tidspunkter, hvor celler blev fyldt med dextran. Data fra to uafhængige eksperimenter, der hver indeholder ≥ 80 celler. Data, der repræsenteres som gennemsnitlige ± SEM. Hver gang punkt blev sammenlignet med PMA kontrol. En elevs t-testblev brugt til statistisk analyse. (D) BODIPY-mærket ovalbumin nedbrydning inden for makropinoomer. Concanamycin A (CcA) blev brugt som en negativ kontrol, da det forhindrer aktivering af luminalsyrehydrlaser. Data fra to uafhængige eksperimenter, der hver indeholder ≥ 80 celler. Data, der repræsenteres som gennemsnitlige ± SEM. Hver gang punkt blev sammenlignet med CcA kontrol. En elevs t-testblev brugt til statistisk analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om der er en række protokoller for både lav og høj-throughput målinger af makropinocytiske optagelse i makrofager, fibroblaster, og endda Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, meget få forsøg er gjort for at måle den lysende biokemi af disse dynamiske rum. Dette skyldes sandsynligvis en mangel på sonder, der effektivt kan målrettes til makropinosomale rum og samtidig undgå andre endoytiske rum. Beskrevet her er de teknikker til at målrette fluorescerende sonder til dynamisk måling af pH, oxidative begivenheder, og protein fordøjelse inden makropinoomer.

Ratiometrisk fluorescensmikroskopi har været den primære teknik, hvormed endosomal pH er blevet målt i årtier. Fluorescein har været meget udbredt til måling af endosomal pH og fortsætter med at være fluorophore valg som sin pKa giver mulighed for nøjagtige målinger med det typiske interval af endosomale pH-værdier (~ pH 7,2-4,5). Her anvendte undersøgelsen fluorescein konjugeret til 70 kDa dextran til makropinosomspecifikke pH-målinger. En begrænsning af denne tilgang er den 15 min dextran loading periode, hvor makropinosomal pH ikke kan registreres. Denne periode er nødvendig for at indlæse tilstrækkelig fluorophore-mærket dextran i makropinosomal rum, men effektivt udelukker tidlige makropinosome pH-målinger. Dette udelukker dog ikke bestemmelser af forskellige lysende parametre såsom bufferkapacitet, relativ protonlækage og V-ATPase-pumpekraft, som alle er afledt af makropinosomale pH-målinger. Som vist i figur 1kan en række andre pH-følsomme fluorophorer også anvendes til måling af pH, herunder pHrodo (pKa = 6,8) og CypHer5e (pKa = 7,3). Men da de har en betydeligt højere pKa end fluorescein, er de ikke optimale til måling af endosomal pH ved mere sure pH-værdier.

Da makropinoomer er meget dynamiske organeller og gennemgår betydelig svind kort efter dannelsenaf 16,21,er der behov for dual-fluorophore ratiometrisk fluorescens. Ændringer i fluorescens som følge af ændringer i mængden af makropinoomer korrigeres for brug af en reference fluorophore i alle de præsenterede analyser.

Oxidative hændelser i celler er blevet målt ved hjælp af en række redox-følsomme sonder, herunder nitroblue tetrazolium (NBT), luminol og H2DCFDA. Luminol-baserede tilgange er særligt nyttige til måling af ROS-produktion i en population af celler, men er vanskelige at tilpasse sig organelle-specifikke målinger. NBT danner en let visualiseret uopløselig depositum kaldet formazan ved oxidation, men tilslører fluorescerende signaler og er både ikke-lineær og vanskeligt at lokalisere. H2DCFDA frigør et lineært fluorescerende signal ved oxidation og kan let konjugeres til sporstoffer som dextran til organelle-specifikke målinger. Ved at fastgøre H2DCFDA til 70 kDa dextran kan oxidative hændelser inden for individuelle makropinoomer (Figur 3B) visualiseres. Der er imidlertid en advarsel mod denne tilgang. Da H2DCFDA er en modificeret form for fluorescein, er det frigjorte signal pH-følsomt. Selv om gevinsten i fluorescens ved oxidation er stor nok til at blive opdaget, er det utvivlsomt maskeret af makropinosomets sure lumen. En pH-ufølsom variant af H2DCFDA har tidligere været kommercielt tilgængelig og er at foretrække; Men på tidspunktet for udarbejdelsen af dette manuskript var dette produkt ikke længere kommercielt tilgængeligt. ROS er ved at opstå som et vigtigt signalmolekyle og har været impliceret i membranombygning, organellarhandel og for nylig i behandlingen af materialet ved antigenpræsentationsceller til præsentation til T-celler28,30. Den metode, der præsenteres her, kan bruges til at studere bidraget fra makropinosomal ROS-produktion til disse forskellige fysiologiske processer.

Protein fordøjelse i makropinoomer er af interesse i studiet af antigen præsentation af immunceller samt studiet af næringsstof erhvervelse af kræftceller. For eksempel menes endosomal protein fordøjelse af dendritiske celler at begrænse puljen af peptider til rådighed for præsentation til T-celler på store histokompatibilitet molekyler. Da makropinoomer er en vigtig vej til erhvervelse af antigen, kan målinger af makropinosomal protein fordøjelse bruges til at sondere molekylære maskiner er ansvarlig for finjustering antigen præsentation. En række kommercielt tilgængelige værktøjer bruges til måling af protein fordøjelse i endosomal rum. De BODIPY-mærkede BSA- og ovalbuminsonder, som bliver stærkt fluorescerende ved fordøjelsen, har vist sig at være særligt populære. De er let koblet til endocytic tracers og kan målrettes til specifikke endosomal rum, såsom fagocosomer. Sonderne er dog ikke let koblet til dextran og kræver derfor en co-lokalisering tilgang. Denne tilgang resulterer i indlæsning af alle endosomale rum, herunder makropinoomer, med BODIPY-mærket ovalbumin, og en maske bruges til at måle den makropinosom-specifikke nedbrydning. Denne tilgang kræver bedre opløsning og er ikke let skaleres op til større, mere høj gennemløbsanalyser. Teknikker til kovalent par protein nedbrydning værktøjer til 70 kDa dextran vil sandsynligvis vise sig nyttige og er i øjeblikket ved at blive udviklet i vores laboratorium.

Da makropinocytose fortsætter med at vokse34, vil værktøjer til dynamisk måling af makropinoomers lysende biokemi, herunder pH, redoxkemikalier, proteinfordøjelse, ionkoncentrationer og lipidkekemikalier, give indsigt i den unikke biologi af disse hurtigt udviklende organeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker University of Calgary for dets støtte. Vi vil også gerne takke Dr. Robin Yates for adgang til reagenser, udstyr og nyttige diskussioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).

Tags

Immunologi og infektion Problem 174 makropinocytose makropinosom endokytose pH V-ATPase protonpumpe reaktiv iltart ROS NADPH oxidase fagocyt makrofag dendritisk celle
Måling af makroinoomers pH-, redoxkemikalier og nedbrydende kapacitet ved hjælp af dual-fluorophore ratiometrisk mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring… More

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter