Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling av pH, redokskjemier og nedbrytende kapasitet for makropinosomer ved hjelp av dual-fluorofor ratiometrisk mikroskopi

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

Vi beskriver protokoller for måling av pH, oksidative hendelser og proteinfordøyelse i individuelle makropinosomer i levende celler. Det legges vekt på metrisk mikroskopi med dobbel fluorofor og fordelene ved populasjonsbaserte teknikker.

Abstract

I de senere år har feltet makropinocytose vokst raskt. Makropinocytose har dukket opp som en sentral mekanisme der medfødte immunceller opprettholder organismal homeostase og immunitet. Samtidig, og i motsetning til sin homeostatiske rolle, kan den også drive ulike patologier, inkludert kreft og virusinfeksjoner. I motsetning til andre moduser for endokytose forblir verktøyene utviklet for å studere modning av makropinosomer underutviklet. Her beskriver protokollen nyutviklede verktøy for å studere redoksmiljøet i lumen av tidlige og modne makropinosomer. Metoder for bruk av ratiometrisk fluorescensmikroskopi i vurderingen av pH, produksjon av reaktive oksygenarter og nedbrytningskapasiteten i lumen av individuelle makropinosomer i levende celler er beskrevet. Enkle organelle målinger gir fordelen av å avsløre romlig heterogenitet, som ofte går tapt med befolkningsbaserte tilnærminger. Det legges vekt på de grunnleggende prinsippene for dobbel fluoroforeringsmålingsmikroskopi, inkludert sondevalg, instrumentering, kalibrering og encellede versus populasjonsbaserte metoder.

Introduction

Makropinocytose refererer til opptaket av store mengder ekstracellulær væske i membranbundne cytoplasmiske organeller kalt makropinosomer1,2. Det er en svært bevart prosess utført av frittlevende encellede organismer, for eksempel amoeba Dictyostelium spp. 3, samt anthozoans4 og metazoans2. I de fleste celler er makropinocytose en indusert hendelse. Ligasjonen av celleoverflatereseptorer induserer fremspringet av aktindrevne plasmamembranforlengelser referert til som ruffles. En brøkdel av disse ruffles, av noen dårlig forstått mekanisme, forsegle på sine distale tips for å danne makropinosomer (men utover omfanget av dette metodepapiret, for detaljerte vurderinger av makropinocytosemekanikken, vennligst se referanse1,2,5,6,7). Den ekstracellulære stimulansen som induserer makropinocytose er oftest en løselig vekstfaktor5,8. Følgelig tillater den makropinocytiske hendelsen inntak av en bolus av ekstracellulært materiale som cellen kan utlede nyttige metabolitter for å lette veksten. Dessverre kan denne veien for næringslevering også drive patologi. Visse kreftceller har mutasjoner som resulterer i kontinuerlig eller konstituerende makropinocytose. Kontinuerlig levering av næringsstoffer letter ukontrollert spredning av kreftceller og har vært knyttet til spesielt aggressive svulster9,10,11,12,13. På samme måte kan virus indusere makropinocytose for å få tilgang til vertsceller, og dermed drive viral patologi14.

Macropinocytose fungerer også i vedlikehold av immunitet mot patogener. Visse medfødte immunceller som makrofager og dendrittiske celler engasjerer seg i konstituerende og aggressiv prøvetaking av ekstracellulær væske via makropinocytose6,15,16. Denne modusen for makropinocytose er utrolig aktiv, og en enkelt dendrittisk celle kan engorge seg med et volum ekstracellulær væske som tilsvarer sin egen vekt hver time17. Til tross for denne konstituerende prøvetakingen, replikerer ikke makrofager og dendrittiske celler ukontrollert som tumorceller, i stedet ser de ut til å behandle det ekstracellulære materialet på en slik måte at informasjon kan trekkes ut for å informere om tilstedeværelsen, eller faktisk fravær, av potensielle trusler. Informasjon ekstraheres som i) patogen-assosierte molekylære mønstre som kan leses av intracellulære patogengjenkjenningsreseptorer og ii) korte strekninger av aminosyrer som kan lastes på store histokompatibilitetsmolekyler for screening av celler i det adaptive immunsystemet16,18,19. Hvorvidt patogener undergraver denne banen for informasjonsbehandling av immunceller er for tiden uklart.

Til tross for disse veldefinerte og kritiske rollene for makropinocytose i både vedlikehold av immunitet og homeostase og i motsetning til andre mer ofte studerte moduser for endokytose, er lite av de indre (luminale) arbeidene til makropinosomer kjent. Å utvikle standardiserte protokoller og verktøy for å studere makropinosomenes lysende biokjemi vil ikke bare hjelpe oss med å forstå deres unike biologi bedre, men vil gi innsikt som kan utnyttes for nye terapeutiske strategier, inkludert legemiddellevering20. Dette metodemanuskriptet vil fokusere på nylig utviklede verktøy for å dissekere, på enkelt organellnivå, ulike aspekter av lysende biokjemi av makropinosomer.

Fluoroforer kan brukes til å måle spesifikke biokjemier av organeller hvis i) de partisjonerer fortrinnsvis inn i rommet av interesse og / eller ii) de gjennomgår spektralendringer som svar på interesseparameteren. For eksempel, når det gjelder pH, akkumuleres fluorescerende svake baser, som acridine oransje, cresylfiolett og LysoTracker-fargestoffer fortrinnsvis i sure organeller. Derfor er deres relative intensitet en grov indikasjon på at den merkede organellen er sur. Andre pH-responsive fluoroforer, som fluorescein, pHrodo og cypHer5e, gjennomgår spektralendringer ved binding til protoner (Figur 1A-C). Endringer i fluorescensutslippet av pH-sensitive fluoroforer kan derfor gi en nyttig tilnærming av pH. Bruken av enkle fluoroforer presenterer imidlertid en rekke ulemper. For eksempel kan endringer i fokusplanet, fotobleaching og endringer i volumet av individuelle organeller, en vanlig forekomst i makropinosomer21, indusere endringer i fluorescensintensiteten til enkle fluoroforer, og dette kan ikke lett korrigeres for22. Enkeltbølgelengdevurderinger, selv om de er nyttige for visualisering av sure rom, er derfor rent kvalitative.

En mer kvantitativ tilnærming er å målrette den parameterfølsomme fluoroforen sammen med en referansefluoreor til organell av interesse. Referansen fluorofor er ideelt ufølsom for biokjemiske endringer i organellen (Figur 1D-F) og kan derfor brukes til å korrigere for endringer i fokusplanet, organellarvolumet og til en viss grad fotobleking23. Ved hjelp av denne tilnærmingen, referert til som dual-fluorophore ratiometric fluorescence, kan korreksjon oppnås ved å generere et forhold mellom fluorescensutslippet av den parameterfølsomme fluoroforen til referansefluorefoforen.

Her vil protokollen bruke prinsippet om dual-fluorophore ratiometric imaging for å måle pH, oksidative hendelser og proteinforringelse innen makropinosomer. I hvert tilfelle vil en fluorofor bli valgt som er følsom for interesseparameteren og en referansefluorefor. For å målrette fluoroforene spesielt mot makropinosomer, vil de bli kovalent koblet til 70 kDa dextran, som fortrinnsvis er innlemmet i makropinosomer24. Alle analyser vil bli utført i Raw264.7 celler, men kan tilpasses andre celletyper. Der det er mulig, vil fluorescensforholdene kalibreres mot en referansekurve for å få absolutte verdier. Det er viktig at alle målinger utføres i levende celler for dynamisk og kvantitativ vurdering av lysstyrkemiljøet til makropinosomer.

Ved valg av pH-sensitive fluoroforer må en rekke hensyn veies. Den første er pKa av fluoroforen, som indikerer rekkevidden av pH-verdier der sonden vil være mest følsom. Hvis det antas at kort tid etter dannelsen vil makropinosomets pH være nær det ekstracellulære mediet (~ pH 7.2), og at det gradvis vil surne gjennom interaksjoner med sene endosomer og lysosomer (~ pH 5.0), bør en sonde med en pKa som er følsom innenfor dette området (Figur 2C) velges. Fluoroforfluorecein, som har en pKa på 6,4, er optimalt følsom innenfor det området. Det har blitt brukt mye for å måle andre lignende organeller, som fagosomer, og vil være den valgte fluoroforen i dette manuskriptet22,25. Som referanse fluorofor vil tetrametylrhodamin bli brukt, noe som er ufølsomt for pH (Figur 1E). Andre fluoroforer, som pHrodo og cypHer5e, kan erstattes av fluorescein der spektralegenskapene til fluorescein samsvarer med andre eksperimentelle variabler. Noen foreslåtte referansefluoreforer for pHrodo og cypHer5e er vist i figur 1.

En annen vurdering er metoden der de to fluoroforene vil bli målrettet spesielt mot makropinosomer. Dextran av størrelsen 70 kDa, som har en hydrodynamisk radius på omtrent 7 nm, holder seg ikke spesielt til celler og er innlemmet i makropinosomer, men ikke klarrinbelagte groper eller caveolae, og markerer derfor makropinosomer (Figur 2A og Figur 3A, B)16,24,26. I denne protokollen vil fluorescein-merket 70 kDa dextran og tetrametylrhodamin (TMR)-merket 70 kDa dextran bli brukt som henholdsvis pH-sensitive og referansesonder.

I medfødte immunceller representerer makropinocytose og fagocytose de to store rutene for internalisering av eksogent materiale for behandling og etterfølgende presentasjon til celler i adaptiv immunrespons27. Den forsiktige og koordinerte kontrollen av redokskjemien til lumen av fagosomer og makropinosomer er avgjørende for kontekstspesifikk behandling av eksogent materiale. Kanskje den mest studerte regulatoren av oksidative hendelser i fagosomer er NADPH oksidase, et stort multi-subenhetskompleks som produserer store mengder reaktive oksygenarter (ROS) innen lumen av fagosomer28. Faktisk er aktiviteten sentral for passende antigenbehandling innen fagosomer29,30. Likevel har aktiviteten til NADPH-oksidasen på makropinosomale membraner ikke blitt utforsket.

I denne protokollen brukes H2DCFDA succinimidyl ester til måling av oksidative hendelser i makropinosomet. Dette er en modifisert form for fluorescein (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate), som er minimalt fluoresccent i sin reduserte form. Ved oksidasjon øker fluorescensutslippet betydelig. Det er imidlertid verdt å merke seg en betydelig advarsel om H2DCFDA - som det er basert på fluorofor fluorescein, er fluorescensen også slokket i sure rom, og det må tas hensyn til å kontrollere for denne variabelen når du designer eksperimenter28. I likhet med tilnærmingen for måling av pH, vil H2DCFDA succinimidylsteren festes kovalent til 70 kDa dextran og TMR-merket 70 kDa dextran vil bli brukt som referansefluorefofor (figur 3A).

Fluorescerende ovalbumin vil bli brukt til å måle proteinforringelse innen makropinosomer. Ovalbumin som brukes her er tett merket med en 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL fargestoff som er selvslukket. Ved fordøyelsen frigjøres sterkt fluorescerende fargestoffmerkede peptider. Siden ovalbumin ikke lett kan konjugeres til 70 kDa dextran, vil celler med TMR-merket 70 kDa dextran og væskefase ovalbumin bli co-inkubert. TMR-signalet vil bli brukt til å generere en makropinosommaske under postavbildningsanalyse, og signalet frigjort fra det fordøyde ovalbuminet måles i masken (Figur 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av celler

  1. Vokse Raw264.7 celler ved 37 °C og 5% CO2 til 70% samløp i RPMI supplert med 10% varmeinaktivert serum.
  2. En dag før analysen frø rå264,7 celler med en tetthet på 5 x 104 celler per brønn i en 96-brønns plate. Sørg for at hver brønn inneholder 100 μL vekstmedium. Sørg for at 96-brønnsplaten har svarte sider og en glassbunn for avbildning.
    MERK: Her ble 96-brønnsplater brukt til avbildning. 96-brønnsplatene tillater bruk av mindre mengder celler og reagenser i forhold til større bildekamre. Imidlertid kan ethvert kammer designet for avbildning av levende celler brukes, og reagenser kan skaleres opp tilsvarende.
  3. På analysedagen må du kontrollere om brønnene er minst 70 % sammenfallende.

2. Måling av makropinosom pH

  1. Klargjør cellene som i avsnitt 1.
  2. Vask alle brønnene med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  3. Fyll hver brønn med 100 μL HBSS som inneholder 0,025 mg/ml TMR-merket 70 kDa dextran og 0,025 mg/ml fluoresceinmerket 70 kDa dextran.
  4. Plasser cellene i en inkubator satt til 37 °C i 15 minutter.
  5. Fjern cellene fra inkubatoren og vask cellene 6x med 100 μL HBSS.
  6. Fyll hver brønn med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  7. Plasser platen på mikroskopet med et oppvarmet stadium og kammer.
  8. Juster eksitasjons-/utslippsparametrene for hver fluorofor etter behov.
    MERK: Ideelle forhold for bildeanskaffelse vil variere med fluoroforer som brukes og individuelle mikroskopoppsett. Her ble bilder anskaffet på et Leica SP5 laserskanningskonfokalt mikroskop. TMR var spent med en 543-laserlinje og utslipp ble samlet inn fra 610 nm til 650 nm. Fluorescein var spent med en 488-laserlinje og utslipp ble samlet inn fra 500 nm til 550 nm. Et 63x oljeinnlevelsesmål ble brukt og et 10 μm Z-volum ble anskaffet med 0,5 μm intervaller.
  9. Skaff deg et bilde fra hver brønn, vekslende mellom fluoroforer mellom hver brønn.
  10. Etter det første oppkjøpet må du kontrollere om alle brønnene holdt fokus over hele platen.
  11. Skaff bilder av hver brønn med intervaller på 1-15 minutter i ønsket tidsperiode.

3. In situ kalibrering av makropinosom pH

  1. Under bildeanskaffelsen forbereder du 1 L kaliumrik (K+-rik) løsning som inneholder 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2og 5 mM glukose. Suppler ett 400 ml volum av K+-rik løsning med 25 mM HEPES (fra en 1 M, pH 7,2 lagerløsning) og et separat 400 ml volum med 25 mM MES (fra en 0,5 M, pH 6,0 lagerløsning).
  2. Juster en 50 ml aliquot av den K+-rike løsningen bufret med 25mM HEPES til pH 7.5 ved hjelp av 10 M HCl eller 10 M KOH etter behov.
  3. Juster tre separate 50 ml aliquots av K+-rik løsning bufret med 25mM MES til pH 6.5, pH 5.5 og pH 5.0 ved hjelp av 10 M HCl eller 10 M KOH etter behov.
    MERK: En acetat-eddiksyrebuffer kan være å foretrekke for lavere pH-løsninger.
  4. Etter ferdigstillelse av bildeoppkjøp, fjern HBSS fra 96-brønnsplaten som inneholder cellene og erstatt den med den K+-rike løsningen som er på pH 7.5.
  5. Tilsett nigericin i en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml.
    MERK: Nigericin er en ionofor som bytter K+ for H+. Ved å sette K+ konsentrasjonen av den K+-rike løsningen til en verdi som tilnærmer K+ konsentrasjonen av cytosolen, kan det sikres at nigericin vil klemme pH i makropinosomet til cytosolens, som igjen gjenspeiler pH i kalibreringsbufferen.
  6. Plasser platen tilbake på mikroskopet og skaff bilder av hver brønn ved hjelp av de samme oppkjøpsinnstillingene som ovenfor.
  7. Gjenta trinn 3.5 og 3.6 for hver kalibreringsbuffer.

4. Dataanalyse for makropinosom pH

  1. Bruk FIJI-programvare, trekk bakgrunnen fra både TMR og fluoresceinkanalen.
  2. Generer en maske på TMR-kanalen. Hvis du vil generere en maske, konverterer du bildet til et binært bilde ved å velge Juster > Terskelverdi > Bruk. Deretter merker du det binære bildet og velger Rediger > markering > Opprett maske.
  3. Påfør det på både TMR- og fluorescein-bildene. Dette gjør du ved å merke masken og velge Rediger > markering > Opprett merket område. Klikk på TMR-bildet og trykk skift + E for å bruke masken på TMR-kanalen. På samme måte klikker du på fluoresceinbildet og trykker på Skift + E for å bruke masken på OB-kanalen.
  4. Registrer TMR- og fluoresceinintensiteten for hvert makropinosom i maskene.
  5. Gjenta trinn 4.1-4.3 for hvert tidspunkt fra tidskurset.
  6. Gjenta trinn 4.1-4.3 for bildene som er tatt i in situ-kalibreringen.
  7. Del fluoresceinintensiteten med TMR-intensiteten for å generere fluorescein:TMR-forholdet.
  8. Tegn pH mot fluorescein:TMR-forholdene for kalibreringsbildene.
  9. Tilpass en kurve til kalibreringsdataene.
  10. Interpoler dataene for hvert tidspunkt fra tidskurset for å få absolutte pH-verdier.

5. Måling av oksidative hendelser innen makropinosomer

  1. Klargjør cellene som i avsnitt 1.
  2. En dag før analysen, forberede H2DCFDA succinimidyl ester merket 70 kDa dextran ved resuspending 10 mg av 70 kDa dextran-amino i 1 ml av 0,1 M natriumbikarbonatoppløsning (pH 8,3). Tilsett 1 mg H2DCFDA succinimidylstere til dextran-aminooppløsningen og inkuber i 1 time. Dialyze H2DCFDA-merket 70 kDa dextran mot PBS. Må ikke oppbevares i mer enn 1 dag, da H2DCFDA-merket 70 kDa dextran oksideres ved lagring.
  3. På analysedagen vasker du alle brønnene med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  4. Fyll hver brønn med 100 μL HBSS som inneholder 0,025 mg/ml TMR-merket 70 kDa dextran og 0,025 mg/ml H2DCFDA-merket 70 kDa dextran.
  5. Plasser cellene i en inkubator satt til 37 °C i 15 minutter.
  6. Fjern celler fra inkubatoren og vask cellene 6x med 100 μL HBSS.
  7. Fyll hver brønn med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  8. Plasser platen på mikroskopet med et oppvarmet stadium og kammer og juster eksitasjons-/utslippsparametrene for hver fluorofor etter behov.
    MERK: Ideelle forhold for bildeanskaffelse vil variere med fluoroforer som brukes og individuelle mikroskopoppsett. Her ble bilder anskaffet på et Leica SP5 laserskanningskonfokalt mikroskop. TMR var spent med en 543-laserlinje, og utslipp ble samlet inn fra 610 nm til 650 nm. H2DCFDA var spent med en 488-laserlinje og utslipp ble samlet inn fra 500 nm til 550 nm. Et 63x oljeinnlevelsesmål ble brukt, og et 10 μm Z-volum ble anskaffet med 0,5 μm intervaller.
  9. Skaff deg et bilde fra hver brønn, vekslende mellom fluoroforer mellom hver brønn.
  10. Etter det første oppkjøpet må du kontrollere om alle brønnene forblir i fokus over hele platen.
  11. Skaff bilder av hver brønn med intervaller på 1-15 minutter i ønsket tidsperiode.

6. Dataanalyse for oksidative hendelser innen makropinosomer

  1. Bruk FIJI-programvare, trekk bakgrunnen fra både TMR- og H2DCFDA-kanalene.
  2. Generer en maske på TMR-kanalen. Hvis du vil generere en maske, konverterer du bildet til et binært bilde ved å velge Juster > Terskelverdi > Bruk. Deretter merker du det binære bildet og velger Rediger > markering > Opprett maske.
  3. Bruk masken på både TMR- og H2DCFDA-avbildningene. Dette gjør du ved å merke masken og velge Rediger > markering > Opprett merket område. Klikk på TMR-bildet og trykk skift + E for å bruke masken på TMR-kanalen. På samme måte klikker du på H2DCFDA-bildet og trykker På Skift + E for å bruke masken på H2DCFDA-kanalen.
  4. Registrer TMR- og H2DCFDA-intensiteten for hvert makropinosom i maskene.
  5. Gjenta trinn 4.1-4.3 for hvert tidspunkt fra tidskurset.
  6. Del H2DCFDA-intensiteten med TMR-intensiteten for å generere et H2DCFDA: TMR-forhold.
  7. Plott inn forholdet mellom H2DCFDA: TMR og klokkeslett.

7. Måling av protein fordøyelse innen makropinosomer

  1. Klargjør cellene som i avsnitt 1.
  2. På analysedagen vasker du alle brønnene med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  3. Løs opp BODIPY-merket ovalbumin i en konsentrasjon på 4 mg/ml i HBSS.
  4. Fyll hver brønn med 100 μL HBSS som inneholder 0,025 mg/ml TMR-merket 70 kDa dextran og 0,2 mg/ml BODIPY-merket ovalbumin.
  5. Plasser cellene i en inkubator satt til 37 °C i 15 minutter.
  6. Fjern celler fra inkubatoren og vask cellene 6x med 100 μL HBSS.
  7. Fyll hver brønn med 100 μL HBSS ved 37 °C.
  8. Plasser platen på mikroskopet med et oppvarmet stadium og kammer og juster eksitasjons-/utslippsparametrene for hver fluorofor etter behov.
    MERK: Ideelle forhold for bildeanskaffelse vil variere med fluoroforer som brukes og individuelle mikroskopoppsett. Her ble bilder anskaffet på et Leica SP5 laserskanningskonfokalt mikroskop. TMR var spent med en 543-laserlinje, og utslipp ble samlet inn fra 610 nm til 650 nm. BODIPY var spent med en 488-laserlinje, og utslipp ble samlet inn fra 500 nm til 550 nm. Et 63x oljeinnlevelsesmål ble brukt og et 10 μm Z-volum ble anskaffet med 0,5 μm intervaller.
  9. Skaff deg et bilde fra hver brønn, vekslende mellom fluoroforer mellom hver brønn.
  10. Etter det første oppkjøpet må du kontrollere om alle brønnene forblir i fokus over hele platen.
  11. Skaff bilder av hver brønn med intervaller på 1-15 minutter i ønsket tidsperiode.

8. Dataanalyse for protein fordøyelse innen makropinosomer

  1. Bruk FIJI-programvare, trekk bakgrunnen fra både TMR- og BODIPY-kanalene.
  2. Generer en maske på TMR-kanalen og bruk den på både TMR- og BODIPY-bildene som i trinn 6.2 og 6.3 ovenfor (Figur 3B).
  3. Registrer TMR- og BODIPY-intensiteten for hvert makropinosom i maskene.
  4. Gjenta trinn 4.1-4.3 for hvert tidspunkt fra tidskurset.
  5. Del BODIPY-intensiteten med TMR-intensiteten for å generere BODIPY:TMR-forholdet.
  6. Tegn bodipy: TMR forholdet mot tiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved måling av makropinosom pH er det en periode hvor dynamikken i forsuring ikke kan måles. Denne perioden tilsvarer dekstran innlastingsfasen (grå boks i figur 2C og figur 3C,D) og vil variere avhengig av celletypen som brukes. Lengden på lastefasen vil variere med (i) cellenes makropinocytiske aktivitet og (ii) følsomheten til instrumentet som brukes. Det anbefales å justere denne perioden ved starten av hvert eksperiment slik at et signal: støyforhold på større enn 4: 1 oppnås for både fluorescein- og TMR-kanalene. I ubehandlede celler bør fluoresceinutslippet bli gradvis svakere etter hvert som makropinosomene surner, og TMR-signalet skal forbli konstant eller bli lysere. TMR-signalet kan bli lysere hvis makropinosomene krymper i størrelse16,21. Dette vil ikke påvirke forholdet da fluoresceinsignalet er utsatt for de samme variasjonene i organellarstørrelse22. Fluorescein:TMR-forholdet blir gradvis mindre og vil platå i løpet av de første 15 min av oppkjøpet (Figur 2C). Dette platået tilsvarer en pH på ~ 5, som omtrent samsvarer med pH av lysosomer25. På slutten av hvert oppkjøp utføres en in situ-kalibrering. Fluorescein:TMR-forholdet bør være størst med kalibreringsbufferen ved pH 7.5 og bli gradvis mindre etter hvert som kalibreringsbufferne blir surere. Dette gjør det mulig å bruke en kalibreringskurve (figur 2B). Fluorescein:TMR-forholdene kan deretter interpoleres for makropinosomal pH (figur 2C).

Oksidative hendelser i makropinosomer vil sannsynligvis også variere med celletypen som brukes. Det anbefales å laste cellene med H2DCFDA-dextran, og å stimulere NADPH-oksidasen ved hjelp av phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) som en positiv kontroll (Figur 3C). Dette vil gi en bedre ide om det dynamiske spekteret til analysen og vil tillate justering av mikroskopinnstillingene. Etter hvert som oksidative hendelser oppstår i makropinosomene, vil H2DCFDA-signalet bli gradvis lysere. TMR-signalet kan forbli konstant eller variere med størrelsen på makropinosom, som beskrevet ovenfor. Forholdet mellom H2DCFDA:TMR vil bli gradvis større og vil sannsynligvis platå i løpet av de første 20-30 min i inaktiverte Raw264.7-celler (Figur 3A,C).

Ved måling av makropinosomal protein fordøyelse, vil et gradvis sterkt fluorescerende signal frigjøres når ovalbumin fordøyes. I Raw264.7 celler vil økningen i fluorescens frigjort fra det fordøyde BODIPY-merkede ovalbuminplatået i løpet av de første 30 min (Figur 3B,D). Som før kan TMR-signalet forbli konstant eller variere med størrelsen på makropinosom. Når nedbrytning av ovalbumin begynner umiddelbart etter den makropinosome lukkingen, kan en negativ kontroll være nyttig for å bestemme det dynamiske området til analysen. Til dette formål kan syrehydrolaser i makropinosomet hemmes ved hjelp av en hemmer av V-ATPase, for eksempel Concanamycin A (CcA) (Figur 3D) eller Bafilomycin A.

Figure 1
Figur 1: Prinsipper for avbildning med dobbel fluorofor ratiometric. (A-C). Spektralskanninger (eksitasjonsfaste, utslippssensitive) pH-sensitive fluoroforer suspendert i buffere av den angitte pH. Fluorescein, pHrodo og cypHer5e brukes ofte som sensorer av pH i cellulære analyser. (D-F). Spektralskanninger (eksitasjonsfaste, utslipps varierte) av pH-ufølsomme fluoroforer suspendert i buffere av den angitte pH. Fargestoffer som ikke varierer med pH, gjør nyttig referanse fluoroforer. Fluorescein, er ikke optimalt følsomme ved de surere pH-verdiene som oppleves i endosomer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Dynamiske målinger av makropinosomal pH. (A) Raw264.7 celler ble lastet med fluorescein-merket 70 kDa dextran og TMR-merket 70 kDa dextran ved 37 °C i nærvær eller fravær av 500 ng/ml Lipopolysaccharide (LPS) i 15 minutter. De ble også inkubert med fluorescein-merket 70 kDa dextran og TMR-merket 70 kDa dextran ved 4 °C som en kontroll for den ikke-spesifikke bindingen av dekstran. Innfellinger viser individuelle celler (skalastenger = 20 μm). (B) In situ kalibrering av Raw264.7 celler lastet med fluorescein-merket 70 kDa dextran og TMR-merket 70 kDa dextran ved hjelp av K+-rike buffere på den angitte pH og nigericin. (C) Makropinosom pH i Raw264.7 celler. Innfellinger representerer fluorescein:TMR-forholdet i individuelle makropinosomer. Grå bokser angir tidspunktene da cellene ble lastet med dextran. Data fra to uavhengige eksperimenter som hver inneholder ≥ 80 celler. Data representert som gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Dynamiske målinger av oksidative hendelser og proteinfordøyelighet i lumen av makropinosomer. (A) Rå264,7 celler ble lastet med H2DCFDA-merket 70 kDa dextran og TMR-merket 70 kDa dextran ved 37 °C i 15 minutter, etterfulgt av en 45 min jakt ved 37 °C. Innfellinger viser rasjonerte bilder (H2DCFDA/TMR) av individuelle makropinosomer. Skalastenger = 20 μm. (B) Rå264,7 celler ble lastet med BODIPY-merket ovalbumin og TMR-merket 70 kDa dextran ved 37 °C i 15 minutter, etterfulgt av en 45 min jakt ved 37 °C. TMR-kanalen ble brukt til å generere en maske, som ble brukt på BODIPY-kanalen. Innfellinger viser enkeltceller. Skalastenger = 20 μm. (C) H2DCFDA oksidasjon i lumen av makropinosomer. Celler ble også stimulert med PMA som en positiv kontroll. Grå bokser angir tidspunktene da cellene ble lastet med dextran. Data fra to uavhengige eksperimenter, som hver inneholder ≥ 80 celler. Data representert som gjennomsnittlig ± SEM. Hvert tidspunkt ble sammenlignet med PMA-kontrollen. En students t-testble brukt til statistisk analyse. (D) BODIPY-merket ovalbumin nedbrytning i makropinosomer. Concanamycin A (CcA) ble brukt som en negativ kontroll da det forhindrer aktivering av lyssyrehydrokser. Data fra to uavhengige eksperimenter, som hver inneholder ≥ 80 celler. Data representert som gjennomsnittlig ± SEM. Hvert tidspunkt ble sammenlignet med CcA-kontrollen. En students t-testble brukt til statistisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om det finnes en rekke protokoller for både lave og høye gjennomstrømningsmålinger av makropinocytisk opptak i makrofager, fibroblaster og til og med Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, svært få forsøk er gjort for å måle lysbiokjemien til disse dynamiske rommene. Dette skyldes sannsynligvis en paucity av sonder som effektivt kan målrettes mot det makropinosomale rommet samtidig som du unngår andre endokytiske rom. Beskrevet her er teknikkene for å målrette fluorescerende sonder for dynamisk måling av pH, oksidative hendelser og protein fordøyelse i makropinosomer.

Ratiometrisk fluorescensmikroskopi har vært den primære teknikken som endosomal pH har blitt målt med i flere tiår. Fluorescein har blitt mye brukt til å måle endosomal pH og fortsetter å være fluoroforen av valget som sin pKen muliggjør nøyaktige målinger med det typiske spekteret av endosomal pH-verdier (~ pH 7.2-4.5). Her benyttet studien fluorescein konjugert til 70 kDa dextran for makropinosomspesifikke pH-målinger. En begrensning av denne tilnærmingen er 15 min dextran lasteperiode der makropinosomal pH ikke kan registreres. Denne perioden er nødvendig for å laste tilstrekkelig fluorofor-merket dextran inn i makropinosomale rommet, men effektivt utelukker tidlige makropinosom pH-målinger. Dette utelukker imidlertid ikke bestemmelse av ulike lysparametere som bufferkapasitet, relativ protonlekkasje og V-ATPase pumpekraft, som alle er avledet fra makropinosomale pH-målinger. Som vist i figur 1,kan en rekke andre pH-sensitive fluoroforer også brukes til å måle pH, inkludert pHrodo (pKa = 6,8) og CypHer5e (pKa = 7,3). Men siden de har en betydelig høyere pKa enn fluorescein, er de ikke optimale for måling av endosomal pH ved surere pH-verdier.

Siden makropinosomer er svært dynamiske organeller og gjennomgår betydelig krymping kort tid etter å ha dannet16,21, er det nødvendig med dobbel fluorofor ratiometrisk fluorescens. Endringer i fluorescens på grunn av endringer i volumet av makropinosomer korrigeres for bruk av en referansefluorefofor i alle analysene som presenteres.

Oksidative hendelser i celler er målt ved hjelp av en rekke redokssensitive sonder, inkludert nitroblue tetrazolium (NBT), luminol og H2DCFDA. Luminol-baserte tilnærminger er spesielt nyttige for måling av ROS-produksjon i en populasjon av celler, men er vanskelig å tilpasse seg organellspesifikke målinger. NBT danner en lett visualisert uoppløselig avsetning kalt formazan ved oksidasjon, men skjuler fluorescerende signaler og er både ikke-lineær og vanskelig å lokalisere. H2DCFDA frigjør et lineært fluorescerende signal ved oksidasjon og kan lett konjugeres til sporstoffer som dekstran for organellespesifikke målinger. Ved å feste H2DCFDA til 70 kDa dextran, kan oksidative hendelser i individuelle makropinosomer (figur 3B) visualiseres. Det er imidlertid en advarsel til denne tilnærmingen. Siden H2DCFDA er en modifisert form for fluorescein, er signalet frigjort pH følsomt. Selv om gevinsten i fluorescens ved oksidasjon er stor nok til å bli oppdaget, er den utvilsomt maskert av makropinosomets sure lumen. En pH-ufølsom variant av H2DCFDA har tidligere vært kommersielt tilgjengelig og er å foretrekke; Men på tidspunktet for forberedelsen av dette manuskriptet var dette produktet ikke lenger kommersielt tilgjengelig. ROS fremstår som et viktig signalmolekyl og har vært involvert i membranoppussing, organellarhandel og mer nylig i behandlingen av materialet av antigen-presenterende celler for presentasjon til T-celler28,30. Metoden som presenteres her kan brukes til å studere bidraget fra makropinosomal ROS-produksjon til disse ulike fysiologiske prosessene.

Protein fordøyelse i makropinosomer er av interesse i studiet av antigen presentasjon av immunceller samt studiet av næringstilegnelse av kreftceller. For eksempel antas endosomal protein fordøyelse av dendrittiske celler å begrense bassenget av peptider som er tilgjengelige for presentasjon til T-celler på store histokompatibilitetsmolekyler. Siden makropinosomer er en viktig vei for antigenanskaffelse, kan målinger av makropinosomal protein fordøyelse brukes til å sondere molekylære maskineri som er ansvarlige for finjustering av antigenpresentasjon. En rekke kommersielt tilgjengelige verktøy brukes til å måle protein fordøyelse i endosomale rom. DE BODIPY-merkede BSA- og ovalbumin-sondene, som blir sterkt fluorescerende ved fordøyelsen, har vist seg spesielt populære. De er lett koblet til endokytiske sporstoffer og kan målrettes mot spesifikke endosomale rom, for eksempel fagosomer. Sondene er imidlertid ikke lett koblet til dextran og krever derfor en samlokaliseringstilnærming. Denne tilnærmingen resulterer i lasting av alle endosomale rom, inkludert makropinosomer, med BODIPY-merket ovalbumin, og en maske brukes til å måle makropinosomspesifikk nedbrytning. Denne tilnærmingen krever bedre oppløsning og er ikke lett skalert opp for større, mer høye gjennomstrømningsanalyser. Teknikker for å kovalent pare protein nedbrytningsverktøy til 70 kDa dextran vil sannsynligvis vise seg nyttig og blir for tiden utviklet i vårt laboratorium.

Ettersom feltet makropinocytose fortsetter å vokse34, vil verktøy for dynamisk måling av lysende biokjemi av makropinosomer, inkludert pH, redokskjemier, protein fordøyelse, ionkonsentrasjoner og lipidkjemier gi innsikt i den unike biologien til disse raskt utviklende organellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Universitetet i Calgary for støtten. Vi vil også takke Dr. Robin Yates for tilgang til reagenser, utstyr og nyttige diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 174 makropinocytose makropinosom endokytose pH V-ATPase protonpumpe reaktive oksygenarter ROS NADPH oxidase fagocytt makrofag dendrittisk celle
Måling av pH, redokskjemier og nedbrytende kapasitet for makropinosomer ved hjelp av dual-fluorofor ratiometrisk mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring… More

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter