Summary
طورنا طريقة قابلة للاستنساخ لتصور استيعاب ثلاثي الفوسفات ثلاثي الأدينوزين الفلوري غير القابل للهيدروليزين (ATP)، وهو بديل ATP، بدقة خلوية عالية. لقد أثبتنا صحة طريقتنا باستخدام المختبر المستقل وفي أجهزة قياس الجسم الحي وخطوط خلايا الورم البشرية والفئران ذات المناعة xenografted بأنسجة الورم البشري.
Abstract
أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP), بما في ذلك ATP خارج الخلية (eATP), وقد ثبت أن تلعب أدوارا هامة في جوانب مختلفة من الورم, مثل مقاومة الأدوية, الانتقال الظهاري-المتوسطي (EMT), والانبثاث. eATP داخل الرحم هو 103 إلى 104 مرات أعلى في التركيز مما كانت عليه في الأنسجة العادية. في حين أن eATP يعمل كرسول لتنشيط الإشارات التنقية لتحريض EMT ، إلا أنه يتم استيعابه أيضا من قبل الخلايا السرطانية من خلال داء الماكروبينوسيتوزية الممضوم ، وهو نوع محدد من الغدد الصماء ، لأداء مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية. وتشمل هذه الوظائف توفير الطاقة لتفاعلات البيوكيميائية ATP التي تتطلب، والتبرع مجموعات الفوسفات أثناء نقل الإشارات، وتسهيل أو تسريع التعبير الجيني كمتبرع مساعد النسخ. ATP متاح بسهولة، والدراسة في السرطان وغيرها من المجالات سوف تزيد بلا شك. ومع ذلك، لا تزال دراسة eATP في مرحلة مبكرة، ولا تزال الأسئلة التي لم يتم حلها دون إجابة قبل أن يتم كشف الأنشطة الهامة ومتعددة الاستخدامات التي يقوم بها eATP وATP الداخلية بالكامل.
وتشمل مساهمات مختبرات هؤلاء المؤلفين في هذه الدراسات eATP في وقت مبكر التصوير المجهري من ATP الفلورسنت غير القابلة للتحلل، إلى جانب عالية ومنخفضة الجزيئية الوزن الفلورسنت دكسترانس، والتي هي بمثابة مثبطات التناضح الكلي والغدد الصماء، فضلا عن مثبطات الغدد الصماء المختلفة، لرصد وتوصيف عملية الاستيعاب eATP. تم تطبيق طريقة التصوير هذه على خطوط الخلايا السرطانية وعلى الفئران ذات المناعة ، التي تم نقلها بأورام سرطان الإنسان ، لدراسة استيعاب eATP في المختبر وفي الجسم الحي. تصف هذه الورقة هذه البروتوكولات في المختبر وفي الجسم الحي ، مع التركيز على تعديل وصقل شروط الفحص بحيث يمكن إجراء اختبارات الاستيعاب eATP بوساطة macropinocytosis /endocytosis بنجاح في أنظمة مختلفة.
Introduction
وقد تم مؤخرا امتصاص الانتهازية من المواد الغذائية خارج الخلية داخل الرحم (أي) اسمه السمة المميزة الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للسرطان1. واحدة من هذه العناصر الغذائية الهامة ATP، كما تركيز ieATP هو 103 و 104 مرات أعلى من تلك الموجودة في الأنسجة الطبيعية، في نطاق عدة مئات من ميكرومتر إلى mMمنخفضة 2،3،4،5. كجزيء الطاقة والإشارات الرئيسية، ATP يلعب دورا مركزيا في التمثيل الغذائي الخلوي في الخلايا السرطانية والصحية6،7،8. ATP خارج الخلية لا تشارك فقط في نمو الخلايا السرطانية, ولكنه يعزز أيضا مقاومة المخدرات9. وظائف ATP لم تكن معروفة من قبل، مثل النشاط الهيدروتروبيكي، وقد تم مؤخرا تحديد، وبالتالي تورط ATP في أمراض مثل الزهايمر10. في الواقع ، يبدو أن فهمنا ل ATP ووظائفه في الخلايا السرطانية والخلايا السليمة والخلايا المريضة الأخرى أبعد ما يكون عن الاكتمال. ومع ذلك ، بسبب عدم استقرار ATP وارتفاع معدلات الدوران في الخلايا ، فمن الصعب تقنيا مراقبة حركة ATP عبر غشاء الخلية وإلى الخلية.
لمعالجة هذه المشكلة وسد الحاجة إلى هذا المجال البحثي، تم تطوير طريقة حيث تم استخدام ATP الفلورية غير قابلة للهيدروليز (NHF-ATP)(الشكل 1)كبديل لتصور استيعاب ATP ومراقبة التعريب المكاني داخل الخلية من ATP الداخلي، سواء في المختبر وفي الجسم الحي11،12 . وقد ثبت NHF-ATP لتحل محل ATP الذاتية للتحقيق في حركة ATP عبر أغشية الخلايا الحيوانية، سواء في خطوط الخلايا السرطانية وفي أنسجة الورم البشري xenografted على الفئرانالمناعية 11،12. وعلاوة على ذلك، إدارة مثبطات macropinocytosis للخلايا منعت استيعاب eATP، مما يشير إلى أن امتصاص داخل الخلايا من eATP ينطوي على آلية الماكروبينوسيتوتيك9،11،12. يسمح هذا البروتوكول بتكبيل الكولابيل القائم على المناعة ضد البروتينات الخاصة بالخلايا وبالتالي تحديد نوع الخلية الذي يستوعب NHF-ATP. باستخدام في الجسم الحي xenografts الورم والمجهر عالية الدقة، NHF-ATP يمكن تصور مكانيا عبر عينة الأنسجة وحتى داخل خلية واحدة. تسمح هذه الطرق أيضا بالتحليل الكمي ، مثل النسبة المئوية لامتصاص الخلايا ، وعدد الحويصلات الماكروبينوسيتوتيكية ، وحركية الاستيعاب. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيف يمكن استخدام NHF-ATP ، التي تعمل بمفردها أو مع dextrans الفلورية الانسطية13و14و15و16، في إعدادات تجريبية مختلفة لدراسة استيعاب ATP وتوطينها داخل الخلايا ، بعد الاستيعاب في الخلايا.
الشكل 1: هياكل ATP الفلورسنت غير قابلة للهيدروليزابل وtetrapmethylrhodamine المسمى عالية الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran. (أ) هيكل NHF-ATP. (ب)التمثيل التخطيطي ل HMWFD. المختصرات: ATP = أدينوسين ثلاثي الفوسفات; NHF-ATP = ATP الفلورية غير قابلة للهيدروليز؛ TMR = رباعي ميثيل هودامين; HMWFD = ارتفاع الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة هنا وفقا لIACUC جامعة أوهايو ومع المعاهد القومية للصحة.
1. اختيار ATP الفلورسنت غير قابلة للهيدروليز (NHF-ATP) وديكسترانس
- حدد متتبعات الفلوروفورية المترافقة NHF-ATP(الشكل 1A)ومتتبعات الاندواس، والفلورسنت عالي ومنخفض الوزن الجزيئي (TMR-HMWFD و TMR-LMWFD) (الشكل 1B)،استنادا إلى أطوال الموجات الفلورية المفضلة (على سبيل المثال، نظام التصوير المجهز بفلاتر مناسبة) وعملية التنظير المحيطي المحددة التي سيتم دراستها.
2. دراسات توطين ATP، في المختبر (الشكل 2)
الشكل 2: في إجراء المختبر لفحص استيعاب ATP. التمثيل التخطيطي للبروتوكول لتصور استيعاب ATP خارج الخلية في الخلايا السرطانية المستزرعة باستخدام المجهر الفلوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- زراعة الخلايا وإعداد الخلايا
ملاحظة: إجراء زراعة الخلايا في ظل ظروف معقمة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.- إعداد دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM)، التي تحتوي على 10٪ (v/v) مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ (v/v) البنسلين / العقدية (تسمى فيما بعد D 2000/FBS)، المالحة المعقمة العازلة بالفوسفات (PBS)، و 0.25٪ من حمض تريبسين/إيثيلينديامينتتراستيك (EDTA)، في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- زراعة الخلايا السرطانية البشرية في DMEM / FBS في طبق زراعة الأنسجة 100 ملم. الحفاظ على الخلايا في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 الغلاف الجوي.
- عندما تصل الخلايا إلى التقاء، مرور الخلايا عن طريق إزالة أولا الوسط الثقافة. بعد ذلك، شطف الطبق مع 5 مل من برنامج تلفزيوني عقيم، وإزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة 3 مل من 0.25٪ تريبسين. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 الغلاف الجوي لمدة 5 دقائق.
- استرداد الطبق، ثم إضافة 6 مل من DMEM / FBS لوقف المحاولة. نقل الخلايا في تعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا.
- بعد الطرد المركزي، يستنشق الناموستة واستخدام 10 مل من DMEM/FBS لإعادة إنفاق بيليه الخلية عن طريق الأنابيب.
- عد كثافة الخلية وقابليتها للاستمرار باستخدام مقياس الدم. استخدام DMEM / FBS لتخفيف تعليق الخلية إلى كثافة ~ 7.5 × 104 خلايا / مل.
- إعداد الأغطية وخلايا البذر
- غسل 12 مم coverslips مع الإيثانول 70٪ ومسحها بعناية مع مناديل مهمة حساسة. تعقيم الأغطية وزوج واحد من ملقط عن طريق الالاستعباد التلقائي.
- في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، واستخدام ملقط لوضع غطاء واحد في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا.
ملاحظة: لاحقا، سيتم تركيب غطاء الأغطية، مع الخلايا، مباشرة على شريحة مجهر للتصوير. - الاستغناء عن 300 ميكرولتر من تعليق الخلية (خلايا في DMEM / FBS)، في كثافة البذر من ~ 2.5 × 104 خلايا لكل بئر، في لوحة 24 جيدا تحتوي على الأغطية المعقمة. احتضان في ظروف معقمة في 37 درجة مئوية مع تدفق 5٪ CO2.
- تجويع الخلايا
- بعد 24 ساعة من البذر، قم بإزالة DMEM/FBS من كل بئر. إضافة فورا 300 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل قبل الحرب في كل بئر لتجويع المصل الخلايا لمدة 15-18 ساعة للحث على امتصاص المواد الغذائية خارج الخلية.
ملاحظة: فترة المجاعة 15-18 ساعة معلمة حرجة.
- بعد 24 ساعة من البذر، قم بإزالة DMEM/FBS من كل بئر. إضافة فورا 300 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل قبل الحرب في كل بئر لتجويع المصل الخلايا لمدة 15-18 ساعة للحث على امتصاص المواد الغذائية خارج الخلية.
- إعداد حلول NHF-ATP وHMWFD/LMWFD
- استخدم توازنا تحليليا لوزن الوزن الجزيئي العالي (70 كيلودا) الفلوري TMR-dextran (TMR-HMWFD، 1 ملغم/مل)، وهو متتبع لتصور الماكروبينوسومات، أو NHF-ATP (10 ميكرومول/لتر) في DMEM الخالي من المصل في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. ضع الأنابيب، المحمية من الضوء، في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي في 12،000 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل بعناية supernatant واضحة إلى أنبوب جديد 1.5 مل الطرد المركزي الدقيق، وترك أي بيليه أو الحطام سليمة لإزالة بلورات لا ينفصم.
- إضافة الحلول من الخطوة 2.4.1 إلى الخلايا في كل بئر، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كانت حلول HMWFD وNHF-ATP سيتم خلطها للحضانة المشتركة مع الخلايا ، فعد كلا الحلين عند التركيزات النهائية 2x. سيتم خلط الحلول في وقت لاحق بنسبة 1:1 لتحقيق تركيزات العمل الدقيقة النهائية. تجنب الضوء لأن الكواشف حساسة للضوء.
- علاج الخلايا والتثبيت
- في طبق جديد من 24 بئرا ، استغني عن 500 ميكرولتر من PBS قبل الحرب في كل بئر من الآبار الخمسة.
- بعد حضانة الخلية، التقط بعناية كل غطاء باستخدام ملقط. شطف كل coverslip عن طريق غمسه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني prewarmed. كرر خمس مرات باستخدام الآبار الخمس المليئة ب PBS.
ملاحظة: الغسيل اللطيف للخلايا على الأغطية أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه التجربة. - بعد غسل برنامج تلفزيوني النهائي، اضغط على coverlip على مسح مهمة حساسة لاستيعاب برنامج تلفزيوني إضافي ونقل الغطاء فورا إلى الباردة (4 درجة مئوية) 3.7٪ الفورمالديهايد، محملة مسبقا في لوحة 24 جيدا. إصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- في حين يتم إصلاح الخلايا، الشرائح المجهر قبل نظيفة مع الإيثانول 70٪. إزالة coverlips من الآبار وجبل لهم على الشرائح، وذلك باستخدام 5 ميكرولتر من المتوسطة تصاعد مائي يحتوي على وصمة عار النووية 4′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)، لكل غطاء. لطخة بلطف برنامج تلفزيوني الزائدة مع منشفة ورقية أو مسح مهمة حساسة.
- المجهر الفلوري واكتساب الصورة
- بعد ساعتين إلى 24 ساعة من الخطوات المذكورة أعلاه ، التقط صورا للخلايا و/أو HMWFD و / أو NHF-ATP باستخدام نظام تصوير فائق الفلورة وبرامج الحصول على البيانات.
ملاحظة: يصف هذا القسم الفرعي خطوات الحصول على الصور باستخدام مجهر نيكون نيو، المجهز بقدرة التصوير الفلوروري، وبرنامج نيكون NIS Elements. ومع ذلك، يمكن استخدام أنظمة تصوير أخرى قابلة للمقارنة وبرامج اقتناء. اتبع إرشادات التشغيل من الشركة المصنعة.- ضع الشريحة على خشبة مسرح المجهر المستقيم في وضع المنظار. الوصول إلى برنامج التصوير.
- حدد الهدف 10x، وضبط المرحلة لتحديد التركيز، ومسح الشريحة من اليسار إلى اليمين بطريقة ثعبانية لتحديد المناطق ذات الاهتمام.
ملاحظة: يختلف تحديد المناطق ذات الاهتمام بين أنواع الخلايا، مع بعض خطوط الخلايا/أنواع السرطان التي تظهر درجات متنوعة ومتميزة من امتصاص TMR-HMWFD و/أو NHF-ATP. - حدد الهدف 40x، والتبديل من وضع منظار إلى وضع التقاط الصور، وذلك باستخدام تبديل على المجهر.
- انقر على أيقونة جودة العيش على برنامج التصوير لعرض الصور والحصول عليها في وقت لاحق.
- باستخدام لوحة OC على شريط أدوات التعليقات التوضيحية والقياسات، حدد معلمات التعريض الضوئي لكل مكعب فلتر أو قناة فلورية.
ملاحظة: حدد وقت التعرض المناسب لكل قناة، حيث تختلف كثافة الإشارة. على سبيل المثال، حدد وقت التعرض 200 مللي ثانية ل DAPI، و2 ثانية ل HMWFD، و4 ثانية ل NHF-ATP. بمجرد تحديد وقت التعرض لكل قناة، استخدم هذا الإعداد لجميع الصور، لكل قناة، مع علاج أو ظروف مختلفة. - بمجرد تعيين إعدادات التعريض الضوئي لكل قناة، استخدم شريط أدوات اكتساب القنوات المتعددة للحصول على صورة ثلاثية القنوات مع إعدادات التعرض المحددة.
ملاحظة: يتيح اكتساب الصورة من خلال وضع اكتساب ND متعدد القنوات التقاط الصور تلقائيا لكل قناة من نفس مجال الرؤية. يتم إغلاق الغالق تلقائيا بين تغييرات البرج. - بدلا من ذلك، الحصول على صور متعددة القنوات يدويا عن طريق تحويل بين مكعبات التصفية، وتحديد وقت التعرض، وإغلاق / فتح مصراع بين الحصول على صورة لكل قناة، وتراكب كل صورة اتخذت لقنوات فردية.
ملاحظة: وضع اكتساب ND بأتمتة هذه العملية ويوفر الصور المدمجة. - حفظ الصورة كملف .nd2 (تنسيق عناصر نيكون يحفظ البيانات الوصفية). حفظ ملفات TIF، بما في ذلك صورة القناة المدمجة وصور القناة الفردية.
ملاحظة: يمكن استخدام ملفات TIF مع مجموعة أوسع من تطبيقات البرامج. - استخدم ميزة عدد الكائنات على شريط أدوات التحليل لحساب عدد الخلايا NHF-ATP-, TMR-HMWFD-, و/أو TMR-LMWFD-إيجابية على ملف صورة .nd2 المحفوظة.
- تصدير البيانات إلى جدول بيانات من خلال برنامج التحليل.
- بعد ساعتين إلى 24 ساعة من الخطوات المذكورة أعلاه ، التقط صورا للخلايا و/أو HMWFD و / أو NHF-ATP باستخدام نظام تصوير فائق الفلورة وبرامج الحصول على البيانات.
- تقدير البيانات وتحليلها
- لكل حالة تم فحصها، الصورة 50 إلى 100 خلية للقياس الكمي. باستخدام برنامج تحليل البيانات (البرامج المضمنة في نظام التصوير الفلورسيوني أو برامج أخرى) ، عد وحساب متوسط عدد الحويصلات الفلورية لكل خلية.
- استخدام الطرق الإحصائية المناسبة لتحليل النتائج الكمية.
3. ATP استيعاب في الأورام، ex vivo (الشكل 3)
الشكل 3: في إجراء الجسم الحي لفحص استيعاب ATP. التمثيل التخطيطي للبروتوكول لتصور استيعاب ATP خارج الخلية في الأورام xenografts باستخدام التنظير المجهري التبريد والمضان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إعداد ثقافات الخلايا للزرع
- تنمو الخلايا السرطانية إلى التقاء 80٪ عند 37 درجة مئوية في قارورة 225 سم2، وذلك باستخدام DMEM تستكمل FBS، إلى تركيز نهائي من 10٪ (v/v) وبينسلين / ستريبتومايسين في 1٪ (v/v).
- غسل الخلايا مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. قبل الحارة 0.25٪ تريبسين / EDTA إلى 37 °C. إضافة 8 مل من تريبسين / EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- بمجرد أن تبدأ الخلايا فصل من الجزء السفلي من القارورة، استخدم ماصة المصلية المعقمة 10 مل لإضافة 8 مل من DMEM/FBS. يستنشق مرتين لطرد أي خلايا معتنقة. استخدام ماصة لنقل الخلايا المنفصلة من القارورة إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- إضافة 10 مل من DMEM / FBS باستخدام ماصة 10 مل، وجمع جميع الخلايا العائمة المتبقية في نفس أنبوب مخروطي 50 مل.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 600 × غرام، 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة PBS.
- عد كثافة الخلية باستخدام مقياس الدم. الحفاظ على تعليق الخلية على الجليد أثناء العد.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 600 × غرام، 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. إزالة supernatant وتعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة بحيث تصبح كثافة الخلية 5 × 106 خلايا لكل 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
- الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية لتطوير الورم xenograft
- استخدم حقنة خالية من اللاتكس (1 مل) مع إبرة انزلاق دقيقة (إبرة 27 G) لحقن الخلايا السرطانية.
- نقل تعليق الخلية (5 × 106 في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني) إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. ارسم الخلايا في الحقنة.
- حدد موقع حقن على جانب فأرة (عارية) مناعية، وانظف الجلد برفق باستخدام الإيثانول بنسبة 75٪. مسح الايثانول الزائد مع مسح مهمة حساسة.
- للحقن تحت الجلد، أمسك الإبرة بزاوية 10 درجات تقريبا على الجلد. أدخل طرف الإبرة، الجانب شطبة، فقط تحت الجلد، بحيث فقط 1-2 مم من الإبرة مرئية خارج الجلد. الاستغناء عن الخلايا من الحقنة ببطء أكثر من 10 ق تقريبا.
- بعد حقن وحدة التخزين بأكملها، والاستمرار في عقد الإبرة في مكان لمدة 3-5 ثانية، ثم سحب الإبرة واستخدام إصبع لتطبيق ضغط لطيف ولكن شركة لموقع الحقن لمدة 3-5 ثوان أخرى لمنع تسرب المحتوى المحقون.
- رصد وقياس نمو الورم باستخدام الفرجار vernier حتى تصل الأورام إلى حجم 200-500 مم3.
- إعداد HMWFD وNHF-ATP الحلول لاستخدامها بعد استئصال الورم
- حل 300 ميكرولتر من 16 ملغم/ مل HMWFD في DMEM الخالية من المصل (متوسطة الثقافة)، واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، والطرد المركزي في 12،000 × غرام لمدة 5 دقائق على النحو المبين أعلاه. نقل الحل إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
- إضافة 40 ميكرولتر من المخزون التناظري NHF-ATP (1 mM) إلى 160 ميكرولتر من DMEM الخالية من المصل لإعداد محلول NHF-ATP 0.2 mM.
- إعداد الآبار التجريبية
ملاحظة: هذا التصميم التجريبي سوف تقييم الاستيعاب داخل الخلايا من HMWFD + NHF-ATP، مما يدل على امتصاص من قبل macropinosomes.- إعداد الآبار على النحو التالي: حسنا # 1، التحكم: 200 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل. حسنا # 2 ، التحكم : 100 ميكرولتر من 16 ملغ / مل LMWFD + 100 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل = 200 ميكرولتر من 8 ملغم / مل LMWFD ؛ حسنا # 3 ، التحكم : 100 ميكرولتر من 0.2 م م NHF - ATP + 100 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل = 200 ميكرولتر من 0.1 م م NHF - ATP ؛ حسنا # 4 ؛ 4 ؛ التجريبية: 100 ميكرولتر من 16 ملغم/مل HMWFD + 100 ميكرولتر من 0.2m NHF-ATP = 200 ميكرولتر من 0.1 مللي متر NHF-ATP و 8 ملغم/مل HMWFD.
- إعداد أنسجة الورم
- قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم أو وفقا للبروتوكول المعتمد من IACUC.
- استخدام حجم 10 مشرط لشريحة الأورام المعزولة في سمك ~ 500-1000 ميكرومتر.
- احتضان شرائح الورم في DMEM خالية من المصل تكملها مع 100 ميكرومتر NHF-ATP و / أو 8 ملغ / مل H / LMWFD في أنابيب الطرد المركزي الدقيق لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪تدفق ثاني أكسيد الكربون.
ملاحظة: بعد الحضانة، يؤدي التمثيل الغذائي للأنسجة السرطانية إلى تغير لون الوسط. - شطف الأنسجة في 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني prewarmed (2 مل لكل شطف في لوحة 24 جيدا).
- نقل الأنسجة إلى لوحة جديدة 24 جيدا مع برنامج تلفزيوني الطازجة prewarmed، شطف وتكرار أربع مرات مع اهتزاز لطيف.
- تضمين التبريد (إعداد كتل الأنسجة المجمدة)
- إعداد بطاقات تعريف لكل ورم يتم حصاده. قطع قطعة 2 سم من الشريط المختبري وأضعاف في النصف، والجانبين لاصقة معا، بالطول. استخدم قلم تمييز لتسمية العلامة، على سبيل المثال، برقم تعريف الماوس/الورم.
- إعداد القوالب تضمين عن طريق وضع قوالب الأنسجة الفولاذ المقاوم للصدأ مباشرة على الجليد الجاف.
ملاحظة: قد يتسبب الجليد الجاف في قضمة الصقيع والحروق والاختناق. ارتداء قفازات معزولة عند التعامل مع الجليد الجاف. استخدم الثلج الجاف في منطقة جيدة التهوية. لا تخزن الثلج الجاف في حاوية محكمة الإغلاق. بدلا من ذلك، تخزين في حاوية (مثل مبرد الستايروفوم) الذي يسمح للغاز للهروب. - بينما قشعريرة العفن، ضع بركة صغيرة من الأنسجة تجميد المتوسطة في لوحة زراعة الأنسجة 10 ملم. تأكد من أن حجم كافية لغمر أنسجة الورم التي سيتم حصادها.
- استخدم ملعقة مثقبة لاستخراج أنسجة الورم المكروبة ووضع الأنسجة على الفور في وسط متجمد ، مما يضمن غمر الأنسجة. باستخدام ملعقة مثقبة، لفة بلطف الأنسجة في المتوسط تجميد، وضمان أن المتوسط هو الاستحمام جميع أسطح الأنسجة.
- نقل بعناية الأنسجة في العفن تضمين تحتوي على المتوسطة تجميد. ضع علامة التسمية المقابلة عموديا في الوسط/العفن المتجمد للتجميد في مكانه. تأكد من ظهور الملصق المكتوب خارج الوسط.
- عندما يكتمل التجميد (يتحول متوسط التجميد إلى أبيض معتم) ، قم بإزالة كتلة الأنسجة من القالب ، ضعها على الجليد الجاف ، وكررها لكل ورم. تخزين كتل الأنسجة في -80 درجة مئوية لعدة أشهر قبل إجراء عملية استئصال الشعر.
- إعداد الشرائح من عينات الأنسجة
- لتعظيم فرصة العثور على خلايا إيجابية الاستيعاب وجود مناطق الأنسجة أكثر تمثيلا، وجمع cryosections المسلسل في -18 إلى -20 درجة مئوية باستخدام cryostat.
- أدوات بريستات Prechill (شفرة، شفرة حلاقة، لوحة مضادة للفة، حامل تشاك الأنسجة، فرشاة الطلاء) وتتوازن كتل الأنسجة الورم عن طريق وضعها في غرفة cryostat في -18 إلى -20 درجة مئوية. تعيين زاوية حامل النصل إلى 5-10 درجة. تقليم بعناية كتلة الأنسجة، حسب الحاجة، مع شفرة حلاقة، وجبل على حامل تشاك باستخدام الأنسجة تجميد المتوسطة باسم "الغراء".
- قفل حامل تشاك في الموضع الرأسي على وحدة microtome، الذي يتقدم إلى مسافة مجموعة (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر) مع كل منعطف من كرنك اليد. ضع لوحة مكافحة لفة للراحة فقط فوق ارتفاع النصل. لمنع تجعيد الأنسجة قبل التقدم في microtome، قم بتمرير الإبهام بعناية على الحافة السفلية لكتلة الأنسجة.
- مع تقدم الميكروتوم وسقوط قسم الأنسجة على اللوحة المعدنية، استخدم فرشاة الطلاء لتوجيه قسم الأنسجة وفك الأنسجة، إذا لزم الأمر.
- مرر شريحة المجهر فوق قسم الأنسجة دون لمس بحيث ينجذب القسم إلى الشريحة.
ملاحظة: شفرات Cryostat (رفيعة المستوى، يمكن التخلص منها) حادة للغاية ويمكن أن تسبب إصابات خطيرة. استخدام الرعاية عند التعامل مع ريش وتشغيل cryostat. استخدم واقي شفرة، إذا كان متوفرا. التدريب المناسب مطلوب. - شريحة الورم إلى أقسام من سمك 10 ميكرومتر. نقل على الفور أقسام شرائح على شريحة المجهر الزجاجي مشحونة إيجابيا.
ملاحظة: بالنسبة للأقسام التسلسلية، قم أولا بتجميع مقطع سمكه 10 ميكرومترات في الزاوية اليسرى العليا لكل شريحة من الشرائح الثماني المشحونة إيجابيا. تقدم في cryostat من خلال 100-200 ميكرومتر لاحقة من الأنسجة ، والتخلص من الأنسجة. نقل جميع المقاطع شرائح فورا على الشرائح المجهر الزجاجي. - بعد ذلك، اجمع قسما آخر سمكه 10 ميكرومتر، بجوار قسم الأنسجة الموضوع سابقا، لكل شريحة من الشرائح الثماني. كرر عملية التجميع التسلسلية هذه حتى تحتوي كل شريحة من الشرائح الثمانية على ثمانية أقسام من الأنسجة، يفصل بينها كل 100-200 ميكرومتر. الحفاظ على أقسام الأنسجة في الظلام للحفاظ على الفلورسينس.
ملاحظة: يمكن تخزين مقاطع الأنسجة على الشرائح في مربع شرائح عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
- لتعظيم فرصة العثور على خلايا إيجابية الاستيعاب وجود مناطق الأنسجة أكثر تمثيلا، وجمع cryosections المسلسل في -18 إلى -20 درجة مئوية باستخدام cryostat.
- تثبيت شرائح الأنسجة
- الخطوة الحرجة: إصلاح أقسام الأنسجة في الإيثانول 95٪ في -18 إلى -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- غسل القسم الثابت لمدة 5 دقائق مع PBS درجة حرارة الغرفة، ومن ثم جبل أقسام الورم الثابتة تحت غطاء زجاجي باستخدام 10 ميكرولتر من وسط تصاعد مائي مع DAPI.
- 12-24 ساعة بعد تصاعد, فحص أقسام الورم الثابتة عن طريق المجهر مضان والحصول على الصور, كما هو موضح للخلايا المستزرعة أعلاه.
- المجهر الفلوري واكتساب الصورة
- تحديد المناطق ذات الاهتمام والحصول على الصور، كما هو موضح في القسم 2.6.
- تقدير البيانات وتحليلها
- تحديد الخلايا وتطبيق التحليلات الإحصائية المناسبة، كما هو الحال في القسم 2.7.
4. ATP استيعاب في الأورام، في الجسم الحي
- إعداد ثقافات الخلايا للزرع كما هو موضح في القسم 3.1.
- الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية لتطوير الورم xenograft
- توليد الأورام xenografted كما هو موضح في القسم 3.2.
- ATP و / أو حقن ديكستروان في أورام xenograft
- إعداد حلول العلاج من DMEM (مركبة) أو 8 ملغم / مل HMWFD أو LMWFD، مع أو بدون NHF-ATP (100 ميكرومتر) في DMEM، كما هو موضح أعلاه.
- استخدام حقنة 1 مل لجمع 50 ميكرولتر من محلول علاج واحد وحقن الحل مباشرة في كل ورم xenograft. كرر الإجراء لأربعة تكرارات بيولوجية لكل علاج.
- حصاد الأنسجة وتضمينها بالتبريد
- إعداد بطاقات تعريف لكل ورم يتم حصاده. قطع قطعة 2 سم من الشريط المختبري وأضعاف في النصف، والجانبين لاصقة معا، بالطول. استخدم قلم تمييز لتسمية العلامة، على سبيل المثال، برقم تعريف الماوس/الورم.
- ما يقرب من 5 دقائق بعد الحقن، والقتل الرحيم الماوس عن طريق خلع عنق الرحم أو وفقا للبروتوكول وافق IACUC.
- باستخدام مشرط حجم 10، وجعل شق المتاخمة للورم وعمودي تقريبا إلى اتجاه حقن الإبرة. استخدم ملقط ومقص جراحي لاستئصال نسيج الورم من الأنسجة المحيطة.
- تقسيم الورم إلى قطعتين إلى أربع 1 سم2، اعتمادا على حجم الورم الكلي.
- إعداد القوالب تضمين وتضمين الأنسجة، كما هو موضح أعلاه في القسم 3.6. تأكد من أن وقت الحصاد، من حقن ديكستروان داخل الرحم إلى تضمين التبريد، لا يزيد عن 7-8 دقائق.
- إعداد الشرائح من عينات الأنسجة
- جمع أقسام الورم المسلسل، كما هو موضح في القسم 3.7.
- تثبيت شرائح الأنسجة
- إصلاح الأنسجة، كما هو موضح في القسم 3.8.
- المجهر الفلوري واكتساب الصورة
- تحديد المناطق ذات الاهتمام والحصول على الصور، كما هو موضح في القسم 2.6.
- تقدير البيانات وتحليلها
- تحديد الخلايا وتطبيق التحليلات الإحصائية المناسبة، كما هو موضح في القسم 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في المختبر دراسة
وقد تجلى الاستيعاب داخل الخلايا لNHF-ATP من خلال المشاركة في توطين NHF-ATP مع HMWFD أو LMWFD(الشكل 4). يعتمد نجاح هذا الإجراء في المقام الأول على استخدام تركيزات مناسبة من NHF-ATP و dextrans وعلى تحديد النوع (الأنواع) المناسبة من dextrans (بولي ليسين مقابل محايد). على سبيل المثال، للتحقيق macropinocytosis، تم اختيار HMWFD كما يتم استيعابها فقط من قبل macropinosomes13،14،15،16. بدلا من ذلك، إذا تمت دراسة الكلاترين و / أو الغدد الصماء بوساطة caveolae، ثم LMWFD هو أن يتم اختيار لأن أحجام أصغر من هذه endosomes المرتبطة بالاندوسيتوز تسمح لهم فقط لابتلاع LMWFD14،15،16. كما تتوفر الفلورسنت ديكسترانس في شكلين مختلفين: بولي ليسين ديكستران وديكستران محايدة. هذه dextrans توليد كثافة مضان مختلفة وتلطيخ الخلفية. وبالتالي، تختلف التطبيقات الموصى بها. على سبيل المثال، بولي ليسين ديكستران تنتج أعلى كثافة مضان ولكن أيضا خلفية أعلى. توليد dextrans محايدة كثافة مضان كافية مع إشارة خلفية منخفضة نسبيا ويفضل للتجارب باستخدام خطوط الخلايا السرطانية. باستخدام هذا المقايسة الفعالة من حيث التكلفة ، قمنا بتوليد وضع العلامات الفلورية عالية الكثافة وعالية الإشارة إلى الضوضاء NHF-ATP ، والتي تتطابق مع كثافة الفلورية من dextrans دون تفلور الخلفية المحيرة.
وبما أن اختيار عامل التثبيت وإجراء التثبيت قد أثر تأثيرا كبيرا على نتيجة الفحص، يجب تحديد شروط التثبيت واختيارها تجريبيا لكل تجربة محددة (أي خط خلية محدد أو نوع نسيج محدد). ATP خارج الخلية غير مطلوب في المقايسة; في الواقع، قد تؤدي التركيزات العالية من eATP في محلول الفحص إلى زيادة الخلفية. الأهم من ذلك، بعد بذر الخلية، والإطار الزمني الأمثل لمجاعة المصل هو ~ 15-18 ساعة. إذا كان تجويع المصل طويلا جدا ، فإن نقص العناصر الغذائية سيؤثر على ارتباط الخلية ويؤدي إلى فقدان الخلايا في الخطوات التالية. إذا كان المجاعة المصل قصيرة جدا، ودورة الخلية لن يتم القبض بشكل صحيح، والتلطيخ النووي لن تكون موحدة عبر الشريحة. شطف الأنسجة المقيدة بالأغطية في PBS الدافئة خمس مرات كافية لإزالة تلطيخ الخلفية. من المهم أن تكون لطيفا جدا مع يغسل الأنسجة. تجنب الشطف المفرط أو الشطف البارد أو الغسيل القوي ، لأن هذه قد تضر مورفولوجيا الخلايا.
في حين يمكن استخدام أي خطوط الخلايا السرطانية في هذا المقايسة, خطوط الخلايا المختلفة قد تظهر درجات مختلفة من الاستيعاب. لقد أظهرنا أن خطوط الخلايا السرطانية مع طفرات KRAS proto-oncogene مفيدة لدراسة استيعاب NHF-ATP. في حين أن طفرات KRAS ليست مطلوبة لعملية استيعاب eATP ، ترتبط طفرات KRAS بزيادة داء الماكروبينوسيتوسيس في المختبر13. لهذه التجارب، اخترنا A549 خلايا سرطان الرئة، التي تؤوي طفرة KRAS. في الواقع، macropinocytosis eATP في خلايا A549 وقد ثبت سابقا باستخدام اختبار استيعاب ATP في المختبر 13.
دراسة الجسم الحي السابق
ويبين الشكل 5 الصور المجهرية الفلورية لاستوعب NHF-ATP في أقسام أنسجة الورم. نجاح الدراسة فيفو السابق يعتمد بشكل كبير على الحضانة المناسبة من NHF-ATP مع أنسجة الورم وغسل شامل بعد جمع أقسام الورم. قد يؤدي وقت الحضانة الأقصر أو الأطول إلى تعطيل الاستيعاب. تحديد أوقات الحضانة، تجريبيا وقبلا، للأورام المختلفة. عدم كفاية الشطف من أنسجة الورم يسمح تلطيخ الخلفية العالية، وبالتالي انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
تحديد عامل التثبيت أمر بالغ الأهمية أيضا. يمكن اختبار التثبيت في الميثانول والفورمالديهايد والأسيتون والإيثانول بشكل فردي ومقارنتها لتحديد أفضل عامل تثبيت لنظام الدراسة المحدد. ومن الجدير بالذكر أن الشرائح المركبة تحتاج إلى تصويرها في غضون 12-24 ساعة ، ولكن ليس لفترة أطول ، لمنع جزيئات الفلورسنت الداخلية من إطلاقها من الخلايا والمساهمة في الخلفية العالية. وأخيرا، لتجنب تلطيخ ظاهرة تأثير الحافة مكثفة على حواف أقسام الأنسجة السرطانية- فمن الأهمية بمكان لجمع أقسام الأنسجة موحدة قبل حضانة الجسم الحي السابق.
نظرا تجانس أنسجة الورم، من المهم الحصول على أقسام الأنسجة في جميع أنحاء الورم. الطريقة الموصوفة لجمع أقسام الورم التسلسلي ، التي تؤخذ كل 100-200 ميكرومتر ، تضمن إمكانية الحصول على البيانات التمثيلية من مناطق مختلفة من الورم وتحليلها. على سبيل المثال، كما أن أنواع الأورام المختلفة قد تولد بيانات استيعاب ATP مختلفة، قد تختلف مناطق مختارة داخل الرحم أيضا في حركية التدخيل ATP وآلية.
في دراسة فيفو
يظهر الشكل 6 استيعاب NHF-ATP في الأورام المحقونة (xenografted). كانت إحدى المعلمات الهامة لدراسة ناجحة وإيجابية في الجسم الحي هي حقن NHF-ATP والوقت بين الحقن والقتل الرحيم الحيواني. أثناء إجراء الحقن، ضع إبرة الحقن للوصول إلى أكبر قدر ممكن من منطقة الورم، والحفاظ على الإبرة سليمة داخل الورم لمدة تصل إلى دقيقة واحدة لضمان بقاء NHF-ATP داخل الورم وعدم تسربه. يضمن الفاصل الزمني القصير بين الحقن والقتل الرحيم نقل NHF-ATP المحقون إلى الخلايا السرطانية ، ولكن هذا النقل ليس طويلا جدا ، بحيث لا تقوم الخلايا المتلقية باستقلاب وتدهور NHF-ATP بشكل كبير ، مما يؤدي إلى تلطيخ داخل الخلايا. بعد القتل الرحيم وإزالة الورم، قم بتوثيق إجراء الحقن لكل ورم، بما في ذلك موقع الحقن واتجاه الحقن. وبهذه الطريقة، يمكن تقسيم الأورام في اتجاهات محددة وعلى طول مستويات تشريحية محددة بحيث تعمل أقسام الورم بالتوازي مع اتجاه الحقن، مما يؤدي إلى تحديد المزيد من الخلايا الإيجابية NHF-ATP.
الشكل 4: A549 خلايا استيعاب NHF-ATP، الذي يشارك في توطين مع HMWFD في المختبر. مضان المجهر من الخلايا A549 المحتضنة مع كل من 1 ملغ / مل HMWFD (اللوحة اليسرى، الأحمر) و 10 ميكرومتر NHF-ATP (لوحة الأوسط، الأخضر) لمدة 30 دقيقة HMWFD وNHF-ATP شارك في توطين في macropinosomes (لوحة اليمنى، الأصفر المندمج). تظهر Insets تكبيرا كبيرا للمناطق المعلبة. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: NHF-ATP = ATP الفلوري غير قابل للهيدروليز؛ HMWFD = ارتفاع الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: A549 خلايا استيعاب NHF-ATP جنبا إلى جنب مع HMWFD ex vivo. مضان المجهر من الخلايا السرطانية A549 xenografted في المناعة(نو / J)الفئران; NHF-ATP تم تنفيذ الاستيعاب السابق vivo. تم احتضان الأورام التي تمت إزالتها جراحيا(ex vivo)مع 8 ملغم / مل HMWFD (اللوحة اليسرى ، الأحمر) و 100 ميكرومتر NHF-ATP (لوحة متوسطة ، خضراء). يظهر التوطين المشترك ل HMWFD الخلوية وNHF-ATP كصورة مدمجة (اللوحة اليمنى، الأصفر). أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: NHF-ATP = ATP الفلوري غير قابل للهيدروليز؛ HMWFD = ارتفاع الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: A549 خلايا استيعاب NHF-ATP جنبا إلى جنب مع HMWFD في الجسم الحي. مضان المجهر من الخلايا A549 tumorigenic, xenografted في المناعة(نو / J)الفئران; تم إجراء استيعاب NHF-ATP في الجسم الحي مع 8 ملغم / مل HMWFD و 100 ميكرومتر NHF-ATP يتم حقنها مباشرة في أورام الفئران الحية. يظهر التوطين المشترك ل HMWFD الخلوية وNHF-ATP كصور مدمجة في A و B (اللوحات اليمنى والأصفر). (أ) صور عالية التكبير تسليط الضوء على الاستيعاب الخلوي من NHF-ATP وHMWFD في الأورام في الجسم الحي. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (B) صور منخفضة التكبير تصور الاستيعاب الإقليمي داخل قسم أنسجة الورم. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطوير طريقة للتحليل المكاني والزمني والكمي للتدخيل الخلوي ل ATP غير القابل للهيدروليز. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع للاستخدام في النظم البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك مختلف النماذج الورمية، والتي نقدم لها التعليم التقني والبيانات التمثيلية. للحصول على بيانات قابلة للتفسير أثناء دراسات استيعاب ATP في الجسم الحي (القسم 4 من البروتوكول) ، من الأهمية بمكان الحد من الوقت التجريبي المنقضي من حقن ديكتران داخل الرحم إلى تضمين التبريد. إصلاح الشرائح الأنسجة بعد الورم المقطع- هو خطوة ضرورية قبل التصوير المجهري مضان. معا، تضمن هاتان الخطوتان الحاسمتان احتفاظ الخلايا السرطانية ب ATP الداخلي أثناء عملية التصوير. اعتبار آخر مهم أثناء تحليل استيعاب ATP هو حساب عدم التجانس من أورام xenograft. كما tumorigenesis يمضي بشكل مختلف بين أنواع الخلايا السرطانية, قد يكون من الضروري لاستكشاف جوانب من هذه الطريقة لتحديد الظروف التجريبية المثالية لمختلف الخلايا السرطانية. لضمان تقييم شامل لداء الورم الضام ATP في الأورام ، من المهم تصوير أقسام الأنسجة في جميع أنحاء الورم حيث قد يكون هناك اختلاف إقليمي من حيث الخلايا المقيمة وقدرتها على استيعاب eATP. في الواقع، قد تكشف هذه الطريقة آليات مختلفة من الاستيعاب eATP بين الخلايا السرطانية / السرطانية في الدراسات المستقبلية.
من المهم ملاحظة أن NHF-ATP يمكن أن يحل محل ATP غير المترافق أو ATP المشع فقط لدراسة الاستيعاب. لا يمكن استخدامه لدراسات أخرى، مثل الدراسات الأيضية، كما سوف تتصرف NHF-ATP ويتم استقلابها بشكل مختلف بمجرد إطلاقها من الماكروبينوسومات و / أو الاندوسومات داخل الخلايا. تقليديا، تم التحقيق في استيعاب ATP باستخدام ATPالمشعة 17،18،19. ومع ذلك، وبالنظر إلى عدم استقرار أجهزة الصراف الآلي المشعة، فإن النشاط الإشعاعي القابل للقياس داخل الخلايا المستهدفة ليس بالضرورة سليما من حيث كمية ATP. لأن NHF-ATP غير قابل للهيدروليز ويمكن تصوره مجهريا ، يوصى باستخدامه عبر ATP المشع.
الإجراء الموصوف هنا بسيط الأداء وسريع وفعال من حيث التكلفة. إذا تم تجهيز نظام التصوير مع قدرة الفيديو في التطبيقات المستقبلية، ثم يمكن تصور العملية الديناميكية للان الداخلي ATP في الوقت الحقيقي، والكشف عن معلومات حول الحركية الماكروبينوسيتوتيك والاتجار في أنسجة محددة. وقد استخدم هذا الإجراء بنجاح في خطوط الخلايا السرطانية الأخرى مثل خلايا H129912, الخلايا غير السرطانية مثل NL-20 خلايا12, والخلايا العصبية, مع عدم وجود أو تعديلات طفيفة (البيانات غير مبين). كما ATP تشارك بشكل وثيق في تأثير واربورغ في استقلاب السرطان6,7,8,20,21,22, في مرض السكري23,24,25, وغيرها من الأمراض التي تنطوي على استقلاب الطاقة, وكما eATP قد تلعب أدوارا هامة في تلك الأمراض, الإجراء الموصوف من المرجح أن يكون لها تطبيقات واسعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم إجراء عملية استئصال الأعصاب في الموقع في جامعة أوهايو علم الأمراض الهستوباثولوجية الأساسية. وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء التشغيل (جامعة أوهايو كلية الآداب والعلوم) إلى نيلسن C; المعاهد القومية للصحة منح R15 CA242177-01 وجائزة RSAC لX تشن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker - orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical - sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W.
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
