Summary
Vi utviklet en reproduserbar metode for å visualisere internaliseringen av ikke-hydroolyzable fluorescerende adenosin triphosfat (ATP), en ATP surrogat, med høy cellulær oppløsning. Vi validerte metoden vår ved hjelp av uavhengige in vitro- og in vivo-analyser-menneskelige tumorcellelinjer og immunodeficient mus xenografted med humant tumorvev.
Abstract
Adenosin tripfosfat (ATP), inkludert ekstracellulær ATP (eATP), har vist seg å spille betydelige roller i ulike aspekter av tumorigenesis, som narkotikaresistens, epitel-mesenchymal overgang (EMT) og metastase. Intratumoral eATP er 103 til 104 ganger høyere i konsentrasjon enn i normalt vev. Mens eATP fungerer som en budbringer for å aktivere purinergisk signalering for EMT-induksjon, er den også internalisert av kreftceller gjennom upregulert makropinocytose, en bestemt type endokytose, for å utføre et bredt spekter av biologiske funksjoner. Disse funksjonene inkluderer å gi energi til ATP-krevende biokjemiske reaksjoner, donere fosfatgrupper under signaltransduksjon, og legge til rette for eller akselerere genuttrykk som transkripsjonell kofaktor. ATP er lett tilgjengelig, og studien på kreft og andre felt vil utvilsomt øke. Imidlertid forblir eATP-studien på et tidlig stadium, og uløste spørsmål forblir ubesvart før de viktige og allsidige aktivitetene som spilles av eATP og internalisert intracellulær ATP kan løses helt.
Disse forfatternes laboratoriers bidrag til disse tidlige eATP-studiene inkluderer mikroskopisk avbildning av ikke-hydrolysbar fluorescerende ATP, kombinert med høy- og lavmolekylære fluorescerende dextrans, som fungerer som makropinocytose og endokytosesporere, samt ulike endokytosehemmere, for å overvåke og karakterisere eATP-internaliseringsprosessen. Denne avbildningsmodaliteten ble brukt på tumorcellelinjer og på immunodeficient mus, xenografted med menneskelige kreftsvulster, for å studere eATP internalisering in vitro og in vivo. Dette dokumentet beskriver disse in vitro- og in vivo-protokollene, med vekt på å endre og finjustere analyseforhold slik at makropinocytose-/endokytosemediert eATP internaliseringsanalyser kan utføres i forskjellige systemer.
Introduction
Det opportunistiske opptaket av intratumorale ekstracellulære (dvs.) næringsstoffer har nylig blitt kalt et sentralt kjennetegn for kreftmetabolisme1. Et av disse viktige næringsstoffene er ATP, da konsentrasjonen av ieATP er 103 og 104 ganger høyere enn den som finnes i normalt vev, i området flere hundre μM til lav mM2,3,4,5. Som et viktig energi- og signalmolekyl spiller ATP en sentral rolle i cellulær metabolisme i kreft og sunne celler6,7,8. Ekstracellulær ATP er ikke bare involvert i kreftcellevekst, men det fremmer også legemiddelresistens9. Tidligere ukjente funksjoner av ATP, som hydrotropisk aktivitet, har nylig blitt identifisert, og dermed implisert ATP-involvering i sykdommer som Alzheimers10. Faktisk ser det ut til at vår forståelse av ATP og dens funksjoner i kreftceller, sunne celler og andre syke celler er langt fra komplett. På grunn av ATPs ustabilitet og høye omsetningshastigheter i celler er det imidlertid teknisk utfordrende å overvåke ATPs bevegelse over cellemembranen og inn i cellen.
For å løse dette problemet og fylle behovet for dette forskningsområdet, ble det utviklet en metode der ikke-hydroolysert fluorescerende ATP (NHF-ATP) (figur 1) ble brukt som surrogat for å visualisere internaliseringen av ATP og observere den intracellulære romlige lokaliseringen av internalisert ATP, både in vitro og in vivo11,12 . NHF-ATP har vist seg å erstatte endogen ATP for å undersøke ATP-bevegelse på tvers av dyrecellemembraner, både i kreftcellelinjer og i humant tumorvev xenograftert på immunodeficient mus11,12. Videre, administrere makropinocytosehemmere til celler blokkert eATP internalisering, noe som tyder på at intracellulært opptak av eATP innebærer en makropinocytotisk mekanisme9,11,12. Denne protokollen tillater immunobased colabeling mot cellespesifikke proteiner og dermed identifisering av hvilken celletype som internaliserer NHF-ATP. Ved hjelp av in vivo tumor xenografts og høyoppløselig mikroskopi kan NHF-ATP visualiseres romlig over vevsprøven og til og med i en enkelt celle. Disse metodene tillater også kvantitativ analyse, for eksempel prosentandelen av cellulært opptak, antall makropinocytotiske vesikler og internaliseringskinetikk. Dette dokumentet beskriver i detalj hvordan NHF-ATP, som arbeider alene eller sammen med endokytose-tracer fluorescerende dextrans13,14,15,16, kan brukes i forskjellige eksperimentelle omgivelser for å studere ATPs internalisering og intracellulær lokalisering, etter internalisering i celler.
Figur 1: Strukturer av ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP og tetrametylrhodamin merket høymolekylær fluorescerende dextran. (A) Struktur av NHF-ATP. (B) Skjematisk representasjon av HMWFD. Forkortelser: ATP = adenosin tripfosfat; NHF-ATP = ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP; TMR = tetrametylrhodamin; HMWFD = fluorescerende dekstran med høy molekylvekt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer rapportert heri ble utført i samsvar med Ohio Universitys IACUC og med NIH.
1. Valg av ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP (NHF-ATP) og dextrans
- Velg en fluorofor-konjugert NHF-ATP (figur 1A) og endokytosesporere, høy og lavmolekylær fluorescerende dextrans (TMR-HMWFD og TMR-LMWFD) (Figur 1B), basert på de foretrukne utslippsbølgelengdene (f.eks. bildebehandlingssystem utstyrt med passende filtre) og den spesifikke endokytoseprosessen som skal studeres.
2. ATP lokaliseringsstudier, in vitro (Figur 2)
Figur 2: In vitro-prosedyre for å undersøke ATP-internalisering. Skjematisk representasjon av protokollen for å visualisere internaliseringen av ekstracellulær ATP i dyrkede kreftceller ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Cellekultur og fremstilling av celler
MERK: Utfør cellekultur under sterile forhold i en vevskulturhette.- Forbered Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), som inneholder 10% (v/v) foster bovint serum (FBS) og 1% (v/v) penicillin/streptomycin (heretter kalt DMEM/FBS), steril fosfatbufret saltvann (PBS) og 0,25 % trypsin/etylendiamintetraketisk syre (EDTA) i et vannbad på 37 °C.
- Kultur humane kreftceller i DMEM/FBS i en 100 mm vevskulturrett. Vedlikehold cellene i en inkubator satt til 37 °C med en 5 % CO2-atmosfære.
- Når cellene når samløp, passerer du cellene ved først å fjerne kulturmediet. Skyll deretter parabolen med 5 ml steril PBS, fjern PBS og tilsett 3 ml 0,25% trypsin. Inkuber ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære i 5 minutter.
- Hent parabolen, og tilsett deretter 6 ml DMEM/FBS for å stoppe trypsiniseringen. Overfør cellene i suspensjon til et 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 800 × g i 5 min for å pellet cellene.
- Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten og bruker 10 ml DMEM/FBS til å resuspendere cellepellet ved pipettering.
- Tell celletettheten og levedyktigheten ved hjelp av et hemocytometer. Bruk DMEM/FBS til å fortynne celleopphenget til en tetthet på ~7,5 × 104 celler/ml.
- Fremstilling av deksler og såddceller
- Vask 12 mm deksler med 70% etanol og tørk dem forsiktig med delikate oppgaveservietter. Steriliser dekslene og ett par tang via autoklavering.
- I en vevskultur hette, bruk tang for å plassere en dekslelip i hver brønn av en 24-brønns vev kulturplate.
MERK: Senere vil dekslene, med celler, monteres direkte på et mikroskopsklie for avbildning. - Dispenser 300 μL av celleopphenget (celler i DMEM/FBS), med en såddtetthet på ~ 2,5 × 104 celler per brønn, inn i 24-brønnsplaten som inneholder de steriliserte dekslene. Inkuber i sterile forhold ved 37 °C med 5 % CO2-strømning.
- Sult av celler
- Tjuefire timer etter sådd, fjern DMEM / FBS fra hver brønn. Tilsett umiddelbart 300 μL forhåndsvarslet serumfri DMEM i hver brønn for å serumstive cellene i 15-18 timer for å indusere opptak av ekstracellulære næringsstoffer.
MERK: Sulteperioden på 15-18 timer er en kritisk parameter.
- Tjuefire timer etter sådd, fjern DMEM / FBS fra hver brønn. Tilsett umiddelbart 300 μL forhåndsvarslet serumfri DMEM i hver brønn for å serumstive cellene i 15-18 timer for å indusere opptak av ekstracellulære næringsstoffer.
- Utarbeidelse av NHF-ATP- og HMWFD/LMWFD-løsninger
- Bruk en analytisk balanse til å veie høymolekylær vekt (70 kDa) fluorescerende TMR-dextran (TMR-HMWFD, 1 mg/ml), en tracer for visualisering av makropinosomer eller NHF-ATP (10 μmol/L) i serumfri DMEM i et 1,5 ml mikrosenterrør. Plasser rørene, beskyttet mot lys, i et 37 °C vannbad i 15 minutter.
- Sentrifuge ved 12.000 × g i 5 min ved romtemperatur. Overfør forsiktig det klare supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosenterrør, slik at pellets eller rusk er intakte for å fjerne uoppløselige krystaller.
- Tilsett løsningene fra trinn 2.4.1 til cellene i hver brønn, og inkuber cellene i 30 min ved 37 °C.
MERK: Hvis HMWFD- og NHF-ATP-løsninger skal blandes for sam inkubasjon med cellene, klargjør begge løsningene ved 2x de endelige konsentrasjonene. Løsningene vil bli blandet senere med et 1:1-forhold for å oppnå de endelige nøyaktige arbeidskonsentrasjonene. Unngå lys da reagensene er lysfølsomme.
- Behandling av celler og fiksering
- I en fersk 24-brønns plate dispenserer du 500 μL for forhåndsvarslet PBS i hver av fem brønner.
- Etter celleinkubasjon, plukk forsiktig opp hver dekslelip ved hjelp av tang. Skyll hvert deksle ved å dyppe det i 500 μL for forhåndsvarslet PBS. Gjenta fem ganger ved hjelp av de fem PBS-fylte brønnene.
MERK: Skånsom vasking av celler-på-deksler er avgjørende for suksessen til dette eksperimentet. - Etter den endelige PBS-vasken trykker du på dekslene på en delikat oppgaveserviett for å absorbere ekstra PBS og overføre dekslene umiddelbart til kaldt (4 °C) 3,7% formaldehyd, forhåndslastet i en 24-brønns plate. Fest cellene i 15 min ved romtemperatur.
- Mens cellene blir fikset, glir pre-clean mikroskop med 70% etanol. Fjern dekslene fra brønnene og monter dem på lysbildene, ved hjelp av 5 μL vandig monteringsmedium som inneholder atomflekken 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), perlipdeksler. Flekket forsiktig overflødig PBS med et papirhåndkle eller en delikat oppgaveserviett.
- Fluorescensmikroskopi og bildeanskaffelse
- To til 24 timer etter trinnene ovenfor, ta bilder av celler og internalisert HMWFD og / eller NHF-ATP ved hjelp av et epifluorescence bildebehandlingssystem og datainnsamlingsprogramvare.
MERK: Denne underdelen beskriver trinn for å skaffe bilder ved hjelp av et Nikon NiU-mikroskop, utstyrt med epifluorescence imaging capability, og Nikon NIS Elements programvare. Andre sammenlignbare bildesystemer og anskaffelsesprogramvare kan imidlertid brukes. Følg bruksanvisningen fra produsenten.- Plasser lysbildet på scenen til et oppreist epifluorescensmikroskop i kikkertmodus. Få tilgang til bildebehandlingsprogrammet.
- Velg 10x-målet, juster scenen for å definere fokus, og skann lysbildet fra venstre til høyre på en serpentinsk måte for å identifisere interesseområdene.
MERK: Identifisering av interesseområder vil variere mellom celletyper, med noen cellelinjer/krefttyper som viser ulike og distinkte grader av TMR-HMWFD og/eller NHF-ATP-opptak. - Velg 40x-målet, og bytt fra kikkertmodus til bildeopptaksmodus ved hjelp av veksleknappen på mikroskopet.
- Klikk på Live Quality-ikonet på bildebehandlingsprogrammet for å se og deretter skaffe bilder.
- Bruk OC-panelet på verktøylinjen Merknader og mål til å definere eksponeringsparameterne for hver filterkube eller fluorescerende kanal.
MERK: Velg riktig eksponeringstid for hver kanal, da signalintensitetene er forskjellige. Velg for eksempel en eksponeringstid på 200 ms for DAPI, 2 s for HMWFD og 4 s for NHF-ATP. Når eksponeringstiden er bestemt per kanal, bruker du denne innstillingen for alle bilder, per kanal, med forskjellig behandling eller forhold. - Når eksponeringsinnstillingene er angitt for hver kanal, bruker du verktøylinjen for flerkanalsanskaffelse til å hente et 3-kanals bilde med de definerte eksponeringsinnstillingene.
MERK: Bildeanskaffelse gjennom flerkanals ND-anskaffelsesmodus muliggjør automatisk bildeopptak for hver kanal med samme synsfelt. Lukkeren lukkes automatisk mellom tårnskift. - Alternativt kan du skaffe flerkanalsbilder manuelt ved å veksle mellom filterkuber, angi eksponeringstid, lukke/åpne lukkeren mellom bildeanskaffelse for hver kanal og legge over hvert bilde som er tatt for individuelle kanaler.
MERK: ND-anskaffelsesmodusen automatiserer denne prosessen og gir sammenslåtte bilder. - Lagre bildet som .nd2-fil (Nikon Elements-format lagrer metadata). Lagre TIF-filer, inkludert det sammenslåtte kanalbildet og individuelle kanalbilder.
MERK: TIF-filer kan brukes med et bredere utvalg av applikasjoner. - Bruk objekttellingsfunksjonen på analyseverktøylinjen til å telle antall NHF-ATP-, TMR-HMWFD- og/eller TMR-LMWFD-positive celler i en lagret ND2-bildefil.
- Eksporter dataene til et regneark gjennom analyseprogrammet.
- To til 24 timer etter trinnene ovenfor, ta bilder av celler og internalisert HMWFD og / eller NHF-ATP ved hjelp av et epifluorescence bildebehandlingssystem og datainnsamlingsprogramvare.
- Data kvantifisering og analyse
- For hver tilstand som er analysert, bilde 50 til 100 celler for kvantifisering. Ved hjelp av dataanalyseprogramvaren (programvare som er inkludert i epifluorescence imaging system eller annen programvare), telle og beregne gjennomsnittlig antall fluorescerende vesicles per celle.
- Bruk egnede statistiske metoder for å analysere de kvantifiserte resultatene.
3. ATP internalisering i svulster, ex vivo (Figur 3)
Figur 3: In vivo-prosedyre for å undersøke ATP-internalisering. Skjematisk representasjon av protokollen for å visualisere internaliseringen av ekstracellulær ATP i tumor xenografts ved hjelp av kryoctioning og fluorescensmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Forberedelse av cellekulturer for implantasjon
- Voks kreftceller til 80% samløp ved 37 °C i en kolbe på 225 cm2, ved hjelp av DMEM supplert med FBS, til en endelig konsentrasjon på 10 % (v/v) og penicillin/streptomycin ved 1 % (v/v).
- Vask cellene to ganger med 10 ml PBS. Forvarm 0,25% trypsin/ EDTA til 37 °C. Tilsett 8 ml trypsin/EDTA og inkuber ved 37 °C i 2 minutter.
- Når cellene begynner å løsne fra bunnen av kolben, bruk en 10 ml steril serologisk pipette for å legge til 8 ml DMEM / FBS. Aspirer to ganger for å løsne eventuelle tilhengerceller. Bruk pipetten til å overføre de frittliggende cellene fra kolben til et 50 ml konisk rør.
- Tilsett 10 ml DMEM/FBS ved hjelp av en 10 ml pipette, og samle alle gjenværende flytende celler i samme koniske rør på 50 ml.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 600 × g, 4 °C i 4 minutter. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml iskald PBS.
- Tell celletettheten ved hjelp av et hemocytometer. Hold cellefjæringen på is mens du teller.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 600 × g, 4 °C i 4 minutter. Fjern supernatanten og suspender cellene i iskald PBS slik at celletettheten blir 5 × 106 celler per 100 μL PBS. Overfør cellefjæringen til et 1,5 ml mikrosenterrør.
- Subkutan injeksjon av kreftceller for xenograft tumorutvikling
- Bruk en lateksfri sprøyte (1 ml) med en presisjonsglide nål (27 G nål) for kreftcelleinjeksjon.
- Overfør cellefjæringen (5 × 106 i 100 μL PBS) til et 1,5 ml mikrosenterrør. Trekk cellene inn i sprøyten.
- Velg et injeksjonssted på flanken av en immunodeficient (naken) mus, og rengjør huden forsiktig ved hjelp av 75% etanol. Tørk av overflødig etanol med en delikat oppgaveserviett.
- For subkutan injeksjon, hold nålen i en ca. 10° vinkel mot huden. Sett inn nålespissen, skråsiden opp, like under huden, slik at bare 1-2 mm av nålen er synlig utenfor huden. Dispenser cellene fra sprøyten langsomt over ca. 10 s.
- Etter å ha injisert hele volumet, fortsett å holde nålen på plass i 3-5 s, trekk deretter nålen og bruk en finger for å påføre forsiktig, men fast trykk på injeksjonsstedet i 3-5 sekunder for å forhindre lekkasje av det injiserte innholdet.
- Overvåk og mål tumorvekst ved hjelp av vernier calipers til svulstene når et volum på 200-500 mm3.
- Fremstilling av HMWFD- og NHF-ATP-løsninger som skal brukes etter tumorreseksjon
- Løs opp 300 μL 16 mg/ml HMWFD i serumfri DMEM (kulturmedium), inkuber i et 37 °C vannbad i 30 minutter, og sentrifuger ved 12 000 × g i 5 minutter som beskrevet ovenfor. Overfør løsningen til et 1,5 ml mikrosenterrør.
- Tilsett 40 μL NHF-ATP analogt lager (1 mM) til 160 μL serumfri DMEM for å forberede en 0,2 mM NHF-ATP-løsning.
- Utarbeidelse av eksperimentelle brønner
MERK: Denne eksperimentelle designen vil analysen av den intracellulære internaliseringen av HMWFD + NHF-ATP, som indikerer opptak av makropinosomer.- Forbered brønnene på følgende måte: Brønn #1, Kontroll: 200 μL serumfri DMEM; Brønn #2, Kontroll: 100 μL 16 mg/ml LMWFD + 100 μL serumfri DMEM = 200 μL 8 mg/ml LMWFD; Brønn #3, Kontroll: 100 μL 0,2 mM NHF-ATP + 100 μL serumfri DMEM = 200 μL 0,1 mM NHF-ATP; Vel # 4; Eksperimentell: 100 μL 16 mg/ml HMWFD + 100 μL 0,2 mM NHF-ATP = 200 μL 0,1 mM NHF-ATP og 8 mg/ml HMWFD.
- Fremstilling av tumorvev
- Avlive musen ved cervical dislokasjon eller i henhold til IACUC-godkjent protokoll.
- Bruk en størrelse 10 skalpell for å kutte de isolerte svulstene med en tykkelse på ~ 500-1000 μm.
- Inkuber tumorskivene i serumfri DMEM supplert med 100 μM NHF-ATP og/eller 8 mg/ml H/LMWFD i mikrosenterrør i 40 minutter ved 37 °C med 5 % CO 2-strømning.
MERK: Etter inkubasjon fører tumorvevmetabolismen til at fargen på mediet endres. - Skyll vevet i 37 °C forvarselt PBS (2 ml for hver skylling i en 24-brønnsplate).
- Overfør vevet til en ny 24-brønns plate med forhåndsvarslet frisk PBS, skyll og gjenta fire ganger med skånsom risting.
- Kryo-innebygging (forbereder frosne vevsblokker)
- Forbered identifikasjonsetiketter for hver svulst som skal høstes. Klipp et 2 cm stykke laboratoriebånd og brett i halvparten, lim sider sammen, på langs. Bruk en merkepenn til å merke koden, for eksempel med et identifikasjonsnummer for mus/svulst.
- Forbered innbygging av former ved å plassere vevsformer i rustfritt stål direkte på tørris.
MERK: Tørris kan forårsake frostskader, brannskader og kvelning. Bruk isolerte hansker ved håndtering av tørris. Bruk tørris i et godt ventilert område. Ikke oppbevar tørris i en tett forseglet beholder. Oppbevar i stedet i en beholder (for eksempel en Styrofoam-kjøler) som gjør at gassen kan slippe ut. - Mens formen kjøler seg ned, legg et lite basseng med vevsfrysende medium i en 10 mm vevskulturplate. Forsikre deg om at volumet er nok til å senke svulstvevet som skal høstes.
- Bruk en perforert skje for å øse opp det resekterte tumorvevet og legg straks vevet i et frysende medium, og sørg for at vevet er nedsenket. Bruk den perforerte skjeen, rull forsiktig vevet i frysemediet, og sørg for at mediet bader alle vevsflatene.
- Flytt forsiktig vevet inn i innbyggingsformen som inneholder frysemediet. Plasser den tilsvarende etikettkoden vertikalt i frysemediet/formen for å fryse på plass. Kontroller at den skrevne etiketten er synlig utenfor mediet.
- Når frysingen er fullført (frysemiddelet blir ugjennomsiktig-hvitt), fjern vevsblokken fra formen, legg den på tørris og gjenta for hver svulst. Oppbevar vevsblokkene ved -80 °C i flere måneder før kryoseksjonsprosedyren.
- Forberedelse av lysbilder av vevsprøver
- For å maksimere sjansen for å finne internaliseringspositive celler og ha mer representative vevsregioner, samle serielle kryoser ved -18 til -20 °C ved hjelp av en kryostat.
- Prechill cryostat verktøy (blad, barberblad, anti-roll plate, vev chuck holder, pensel) og likevekt svulst vev blokker ved å plassere dem i en kryostat kammer ved -18 til -20 °C. Sett bladholdervinkelen til 5-10°. Trim vevsblokken forsiktig etter behov med et barberblad, og monter den på chuckholderen ved hjelp av vevsfrysingsmedium som "lim".
- Lås chuckholderen i vertikal stilling på mikrotomenheten, som går videre til den innstilte avstanden (f.eks. 10 μm) med hver sving på håndsveiven. Plasser antirullplaten slik at den hviler like over bladets høyde. For å forhindre at vevet krøller seg før du beveger mikrotomet, skyver du tommelen forsiktig over den nederste kanten av vevsblokken.
- Etter hvert som mikrotomet beveger seg og vevsdelen faller på metallplaten, bruk en pensel til å lede vevsdelen og rull ut vevet om nødvendig.
- Hold mikroskopet over vevsdelen uten å berøre slik at delen blir tiltrukket av lysbildet.
MERK: Cryostat-kniver (høyprofilerte engangsblader) er ekstremt skarpe og kan forårsake alvorlig skade. Vær forsiktig når du håndterer kniver og bruker kryostaten. Bruk en bladbeskytter, hvis tilgjengelig. Riktig opplæring er nødvendig. - Skjær svulsten i seksjoner på 10 μm tykkelse. Overfør straks de skiver seksjonene til en positivt ladet glassmikroskopsklie.
MERK: For serielle seksjoner må du først samle en 10 μm tykk del på øvre venstre hjørne av hver av åtte positivt ladede lysbilder. Før kryostaten gjennom påfølgende 100-200 μm vev, og kast vevet. Overfør umiddelbart alle skiver seksjoner på glassmikroskop lysbilder. - Deretter samler du en annen 10 μm tykk seksjon, ved siden av den tidligere plasserte vevsdelen, for hver av de åtte lysbildene. Gjenta denne serielle oppsamlingsprosessen til hvert av de åtte lysbildene inneholder åtte vevsseksjoner, hver 100-200 μm fra hverandre. Hold vevsdelene i mørket for å bevare fluorescens.
MERK: Vevsseksjoner på lysbilder kan lagres i en glideboks ved -80 °C i flere måneder.
- For å maksimere sjansen for å finne internaliseringspositive celler og ha mer representative vevsregioner, samle serielle kryoser ved -18 til -20 °C ved hjelp av en kryostat.
- Fiksering av vevssklier
- KRITISK TRINN: Fest vevsseksjonene i 95% etanol ved -18 til -20 °C til 5 min.
- Vask den faste delen i 5 min med romtemperatur PBS, og monter deretter de faste tumordelene under en glassdekslelip ved hjelp av 10 μL av et vandig monteringsmedium med DAPI.
- Tolv til 24 timer etter montering, undersøk de faste tumordelene ved fluorescensmikroskopi og skaff bilder, som beskrevet for de dyrkede cellene ovenfor.
- Fluorescensmikroskopi og bildeanskaffelse
- Identifiser interesseområder og hent bilder, som beskrevet i avsnitt 2.6.
- Data kvantifisering og analyse
- Kvantifisere cellene og anvende hensiktsmessige statistiske analyser, som i pkt. 2.7.
4. ATP internalisering i svulster, in vivo
- Klargjør cellekulturer for implantasjon som beskrevet i pkt. 3.1.
- Subkutan injeksjon av kreftceller for xenograft tumorutvikling
- Generer xenograferte svulster som beskrevet i pkt. 3.2.
- ATP- og/eller dekstraninjeksjon i xenografttumorer
- Forbered behandlingsløsningene til DMEM (kjøretøy) eller 8 mg/ml HMWFD eller LMWFD, med eller uten NHF-ATP (100 μM) i DMEM, som beskrevet ovenfor.
- Bruk en 1 ml sprøyte for å samle 50 μL av en behandlingsløsning og injiser løsningen direkte i hver xenograftsvulst. Gjenta prosedyren for fire biologiske replikeringer av hver behandling.
- Vevshøsting og kryo-innebygging
- Forbered identifikasjonsetiketter for hver svulst som skal høstes. Klipp et 2 cm stykke laboratoriebånd og brett i halvparten, lim sider sammen, på langs. Bruk en merkepenn til å merke koden, for eksempel med et identifikasjonsnummer for mus/svulst.
- Omtrent 5 min etter injeksjon, euthanize musen ved cervical dislokasjon eller i henhold til IACUC godkjent protokollen.
- Bruk en størrelse 10 skalpell, gjør et snitt ved siden av svulsten og omtrent vinkelrett på retningen av nåleinjeksjonen. Bruk tang og kirurgisk saks for å resect svulstvevet fra det omkringliggende vevet.
- Del svulsten i to til fire 1 cm2 stykker, avhengig av den totale svulststørrelsen.
- Forbered innbyggingsformene og legg inn vevet, som beskrevet ovenfor i avsnitt 3.6. Sørg for at høsttiden, fra intratumoral dekstraninjeksjon til kryo-innebygging, ikke er mer enn 7-8 min.
- Forberedelse av lysbilder av vevsprøver
- Samle serielle tumorseksjoner, som beskrevet i pkt. 3.7.
- Fiksering av vevssklier
- Fest vevet, som beskrevet i pkt. 3.8.
- Fluorescensmikroskopi og bildeanskaffelse
- Identifiser interesseområdene og hent bilder, som beskrevet i avsnitt 2.6.
- Data kvantifisering og analyse
- Kvantifisere cellene og anvende hensiktsmessige statistiske analyser, som beskrevet i pkt. 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-studie
Intracellulær internalisering av NHF-ATP ble demonstrert ved samlokalisering av NHF-ATP med HMWFD eller LMWFD (figur 4). Suksessen til denne prosedyren er først og fremst avhengig av bruk av passende konsentrasjoner av NHF-ATP og dextrans og på å bestemme riktig type dextrans (polylyin vs. nøytral). For å undersøke makropinocytose ble for eksempel HMWFD valgt da den bare internaliseres av makropinosomene13,14,15,16. Alternativt, hvis klargardin- og /eller caveolae-medierte endocytoser studeres, skal LMWFD velges fordi de mindre størrelsene på disse endokytose-tilknyttede endosomene bare tillater dem å oppsluke LMWFD14,15,16. Fluorescerende dextrans er også tilgjengelig i to forskjellige former: polylyin dextran og nøytral dextran. Disse dextrans genererer forskjellig fluorescensintensitet og bakgrunnsfarging; Dermed varierer deres anbefalte applikasjoner. For eksempel produserer polyly lysin dextran høyere fluorescensintensitet, men også høyere bakgrunn. Nøytral dextrans genererer tilstrekkelig fluorescensintensitet med relativt lavt bakgrunnssignal og foretrekkes for eksperimenter ved hjelp av kreftcellelinjer. Ved hjelp av denne kostnadseffektive analysen genererte vi høyintensitets og høy signal-til-støy NHF-ATP fluorescerende merking, som matchet fluorescensintensiteten til dextrans uten å forvirre bakgrunnsfluorescens.
Ettersom valget av fikseringsmiddelet og fikseringsprosedyren påvirket utfallet av analysen betydelig, må fikseringsforholdene eksperimentelt bestemmes og velges for hvert enkelt eksperiment (dvs. spesifikk cellelinje eller vevstype). Ekstracellulær ATP er ikke nødvendig i analysen; Faktisk kan høye konsentrasjoner av eATP i analyseløsningen føre til økt bakgrunn. Viktig, etter cellesåing, er den optimale tidsrammen for serum sult ~ 15-18 timer. Hvis serum sult er for lang, vil mangelen på næringsstoffer påvirke cellevedlegg og føre til tap av celler i de følgende trinnene. Hvis serum sult er for kort, cellesyklusen vil ikke bli riktig arrestert, og kjernefysisk farging vil ikke være jevn over lysbildet. Skylling av dekslenelip-bundet vev i varm PBS fem ganger er tilstrekkelig til å fjerne bakgrunnsfarging. Det er viktig å være veldig forsiktig med vevsvask. Unngå overdreven skylling, kald skylling eller kraftig vasking, da disse kan skade cellenes morfologi.
Mens eventuelle kreftcellelinjer kan brukes i denne analysen, kan forskjellige cellelinjer vise forskjellige grader av internalisering. Vi har vist at kreftcellelinjer med KRAS proto-oncogene mutasjoner er fordelaktige for å studere NHF-ATP internalisering. Mens KRAS-mutasjoner ikke er nødvendig for internalisering av eATP, er KRAS-mutasjoner forbundet med økt makropinocytose in vitro13. For disse eksperimentene valgte vi A549 lungekreftceller, som har en KRAS-mutasjon. Faktisk har makropinocytose av eATP i A549-celler tidligere blitt vist ved hjelp av en in vitro ATP internaliseringsanalyse13.
Ex vivo-studie
Figur 5 viser fluorescens mikroskopiske bilder av NHF-ATP internalisering i tumorvevsseksjoner. Suksessen til ex vivo-studien er avhengig av riktig inkubasjon av NHF-ATP med tumorvevet og grundig vasking etter samlingen av tumorseksjonene. En kortere eller lengre inkubasjonstid kan forstyrre internaliseringen. Bestem inkubasjonstider, eksperimentelt og på forhånd, for forskjellige svulster. Utilstrekkelig skylling av tumorvev tillater høy bakgrunnsfarging og dermed et lavt signal-til-støy-forhold.
Valg av fikseringsmiddel er også kritisk. Fiksering i metanol, formaldehyd, aceton og etanol kan testes individuelt og sammenlignes med å identifisere det beste fikseringsmiddelet for det spesifikke studiesystemet. Det er bemerkelsesverdig at de monterte lysbildene må fotograferes innen 12-24 timer, men ikke lenger, for å forhindre at de internaliserte fluorescerende molekylene frigjøres fra celler og bidrar til høy bakgrunn. Til slutt, for å unngå kanteffektfenomenet-intens farging på kantene av tumorvevsseksjoner- er det viktig å samle ensartede vevsseksjoner før ex vivo-inkubasjon.
Gitt heterogeniteten til tumorvev, er det viktig å oppnå vevsseksjoner gjennom hele svulsten. Den beskrevne metoden for å samle serielle tumorseksjoner, tatt hver 100-200 μm fra hverandre, sikrer at representative data fra forskjellige regioner i svulsten kan anskaffes og analyseres. For eksempel, på samme måte som forskjellige tumortyper kan generere forskjellige ATP-internaliseringsdata, kan utvalgte intratumorale regioner også variere i ATP internaliseringskinetikk og mekanisme.
In vivo-studie
Figur 6 viser NHF-ATP internalisering injisert (xenografted) svulster. En viktig parameter for en vellykket og positiv in vivo-studie var NHF-ATP-injeksjonen og tiden mellom injeksjon og animalsk eutanasi. Under injeksjonsprosedyren, plasser injeksjonsnålen for å nå så mye tumorområde som mulig, og hold nålen intakt i svulsten så lenge som 1 min for å sikre at NHF-ATP forblir inne i svulsten og ikke lekker ut. Det korte tidsintervallet mellom injeksjonen og eutanasi sikrer at injisert NHF-ATP transporteres inn i tumorcellene, men at transporten ikke er for lang, slik at mottakerceller ikke vil metabolisere og forringe NHF-ATP betydelig, noe som resulterer i intracellulære smør. Etter eutanasi og tumorfjerning, dokumenter injeksjonsprosedyren for hver svulst, inkludert injeksjonsstedet og injeksjonsretningen. På denne måten kan svulster seksjoneres i spesifikke orienteringer og langs spesifikke anatomiske plan slik at tumorseksjoner går parallelt med injeksjonsretningen, noe som fører til identifisering av flere NHF-ATP-positive celler.
Figur 4: A549-celler internaliserer NHF-ATP, som samlokfester med HMWFD in vitro. Fluorescensmikroskopi av A549-celler inkubert med både 1 mg/ml HMWFD (venstre panel, rød) og 10 μM NHF-ATP (midtpanel, grønn) i 30 min. HMWFD og NHF-ATP samlokiserer i makropinosomer (høyre panel, sammenslått gul). Innsett viser høy forstørrelse av innrammede områder. Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: NHF-ATP = ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP; HMWFD = fluorescerende dekstran med høy molekylvekt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: A549-celler internaliserer NHF-ATP sammen med HMWFD ex vivo. Fluorescensmikroskopi av tumorigeniske A549-celler xenograftert til immunodeficient (Nu / J) mus; NHF-ATP internalisering ble utført ex vivo. Kirurgisk fjernede svulster ble inkubert (ex vivo) med 8 mg /ml HMWFD (venstre panel, rød) og 100 μM NHF-ATP (midtpanel, grønn). Samlokalisering av mobil HMWFD og NHF-ATP vises som et sammenslått bilde (høyre panel, gult). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: NHF-ATP = ikke-hydroolyzable fluorescerende ATP; HMWFD = fluorescerende dekstran med høy molekylvekt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: A549-celler internaliserer NHF-ATP sammen med HMWFD in vivo. Fluorescensmikroskopi av tumorigeniske A549-celler, xenograftert til immunodeficient (Nu / J) mus; NHF-ATP internalisering ble utført in vivo med 8 mg / ml HMWFD og 100 μM NHF-ATP som direkte injiseres i svulster av levende mus. Samlokalisering av mobil HMWFD og NHF-ATP vises som sammenslåtte bilder i A og B (høyre paneler, gule). (A) Bilder med høy forstørrelse fremhever cellulær internalisering av NHF-ATP og HMWFD i svulster in vivo. Skalastenger = 20 μm. (B) Bilder med lav forstørrelse viser regional internalisering i en tumorvevsseksjon. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode ble utviklet for romlig, tidsmessig og kvantitativ analyse av cellulær internalisering av ikke-hydroolysert ATP. Denne metoden er bredt anvendelig for bruk i ulike biologiske systemer, inkludert ulike tumorigeniske modeller, som vi gir teknisk instruksjon og representative data for. For å innhente tolkedata under in vivo ATP internaliseringsstudier (paragraf 4 i protokollen), er det viktig å begrense den eksperimentelle tiden som går fra intratumoral dekstraninjeksjon til kryo-innebygging. Å fikse vev lysbilder-post-tumor seksjonering-er et nødvendig skritt før fluorescens mikroskopisk avbildning. Sammen sikrer disse to kritiske trinnene at tumorceller beholder den internaliserte ATP under bildebehandlingsprosessen. En annen viktig vurdering under analysen av ATP internalisering er å redegjøre for heterogeniteten til xenograft svulster. Ettersom tumorigenesis fortsetter annerledes blant kreftcelletyper, kan det være nødvendig å feilsøke aspekter av denne metoden for å bestemme ideelle eksperimentelle forhold for forskjellige kreftceller. For å sikre en omfattende vurdering av makropinocytose av ATP i svulster, er det viktig å bildevevsseksjoner gjennom hele svulsten, da det kan være regional variasjon når det gjelder beboerceller og deres evne til å internalisere eATP. Faktisk kan denne metoden avdekke forskjellige mekanismer for eATP internalisering blant kreft / tumorceller i fremtidige studier.
Det er viktig å merke seg at NHF-ATP bare kan erstatte ukonjugert ATP eller radioaktiv ATP for internaliseringsstudien. Det kan ikke brukes til andre studier, for eksempel metabolske studier, som NHF-ATP vil oppføre seg og bli metabolisert annerledes når det er frigjort fra makropinosomer og / eller endosomer inne i celler. Tradisjonelt ble ATP internalisering undersøkt ved hjelp av radioaktiv ATP17,18,19. Men gitt ustabiliteten til radioaktive ATP-er, er målbar radioaktivitet inne i målceller ikke nødvendigvis intakt ATP. Fordi NHF-ATP er ikke-hydroolyzable og kan visualiseres mikroskopisk, anbefales bruken over radioaktiv ATP.
Prosedyren som er beskrevet her, er enkel å utføre, rask og kostnadseffektiv. Hvis et bildesystem er utstyrt med videofunksjonalitet i fremtidige applikasjoner, kan den dynamiske prosessen med ATP-internalisering visualiseres i sanntid, og avsløre informasjon om makropinocytotisk kinetikk og menneskehandel i bestemte vev. Denne prosedyren har blitt brukt i andre kreftcellelinjer som H1299-cellene12, ikke-kreftceller som NL-20 celler12og nevronceller, uten eller mindre modifikasjoner (data ikke vist). Siden ATP er intimt involvert i Warburg-effekten i kreftmetabolismen6,7,8,20,21,22, i diabetes23,24,25og andre sykdommer som involverer energimetabolisme, og som eATP kan spille viktige roller i disse sykdommene, vil den beskrevne prosedyren sannsynligvis ha brede applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Kryosectioning ble utført på stedet ved Ohio University Histopathology Core. Dette arbeidet ble delvis støttet av oppstartsfond (Ohio University College of Arts &Sciences) til C Nielsen; NIH gir R15 CA242177-01 og RSAC-prisen til X Chen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker - orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical - sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W.
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
