Summary
Vi utvecklat en reproducerbar metod för att visualisera internalisering av nonhydrolyzable fluorescerande adenosin triphosphate (ATP), en ATP surrogat, med hög cellulär upplösning. Vi validerade vår metod med oberoende in vitro och in vivo analyser-mänskliga tumör cellinjer och immunodeficient möss xenografted med mänskliga tumör vävnad.
Abstract
Adenosintrifosfat (ATP), inklusive extracellulär ATP (eATP), har visat sig spela betydande roller i olika aspekter av tumorigenesis, såsom läkemedelsresistens, epitelial-mesenchymal övergång (EMT) och metastasering. Intratumoral eATP är 103 till 104 gånger högre i koncentration än i normala vävnader. Medan eATP fungerar som en budbärare för att aktivera purinergisk signalering för EMT-induktion, internaliseras den också av cancerceller genom uppreglerad makropinocytos, en specifik typ av endocytos, för att utföra en mängd olika biologiska funktioner. Dessa funktioner inkluderar att ge energi till ATP-krävande biokemiska reaktioner, donera fosfatgrupper under signaltransduktion och underlätta eller påskynda genuttryck som en transkriptionell kofaktor. ATP är lättillgängligt, och dess studie inom cancer och andra områden kommer utan tvekan att öka. EATP-studien är dock fortfarande i ett tidigt skede, och olösta frågor förblir obesvarade innan de viktiga och mångsidiga aktiviteterna som spelas av eATP och internaliserade intracellulära ATP kan rivas upp helt.
Dessa författares laboratorier bidrag till dessa tidiga eATP studier inkluderar mikroskopisk avbildning av icke-hydrolyserbara fluorescerande ATP, tillsammans med hög- och låg-molekylvikt fluorescerande dextrans, som fungerar som makropinocytosis och endocytosis tracers, liksom olika endocytosis inhibitorer, för att övervaka och karakterisera eATP internaliseringsprocessen. Denna bildframställning modalitet tillämpades på tumör cellinjer och immunbrist möss, xenografted med mänskliga cancer tumörer, att studera eATP internalisering in vitro och in vivo. Detta dokument beskriver dessa in vitro och in vivo protokoll, med tonvikt på att ändra och finjustera analys villkor så att macropinocytosis-/endocytosis-medierade eATP internalisering analyser kan utföras framgångsrikt i olika system.
Introduction
Det opportunistiska upptaget av intratumorala extracellulära (dvs) näringsämnen har nyligen utsetts till ett viktigt kännetecken för cancermetabolism1. En av dessa viktiga näringsämnen är ATP, eftersom koncentrationen av ieATP är 103 och 104 gånger högre än den som finns i normala vävnader, i intervallet flera hundra μM till låg mM2,3,4,5. Som en viktig energi- och signalmolekyl spelar ATP en central roll i cellulär metabolism i cancerceller och friska celler6,7,8. Extracellulär ATP är inte bara involverad i cancercelltillväxt, men det främjar också läkemedelsresistens9. Tidigare okända funktioner av ATP, såsom hydrotrop aktivitet, har nyligen identifierats, vilket innebär ATP-engagemang i sjukdomar som Alzheimers10. Det verkar faktiskt som om vår förståelse av ATP och dess funktioner i cancerceller, friska celler och andra sjuka celler är långt ifrån fullständig. Men på grund av ATP: s instabilitet och höga omsättningshastigheter i celler är det tekniskt utmanande att övervaka ATP: s rörelse över cellmembranet och in i cellen.
För att ta itu med detta problem och fylla behovet av detta forskningsområde utvecklades en metod där icke-lättsinnig fluorescerande ATP (NHF-ATP) (figur 1) användes som surrogat för att visualisera internaliseringen av ATP och observera intracellulär rumslig lokalisering av internaliserad ATP, både in vitro och in vivo11,12 . NHF-ATP har visat sig ersätta endogen ATP för att undersöka ATP-rörelse över djurcellsmembran, både i cancercelllinjer och i human tumörvävnad xenografted på immunbrist möss11,12. Dessutom, administrera makropinocytoshämmare till celler blockerade eATP internalisering, vilket tyder på att intracellulärt upptag av eATP innebär en makropinocytotisk mekanism9,11,12. Detta protokoll tillåter immunobaserad colabeling mot cellspecifika proteiner och därmed identifiering av vilken celltyp internaliserar NHF-ATP. Med hjälp av in vivo tumör xenografts och högupplöst mikroskopi, NHF-ATP kan visualiseras rumsligt över vävnadsprovet och även inom en enda cell. Dessa metoder tillåter också kvantitativ analys, såsom andelen cellulära upptag, antal makropinocytotic vesiklar och internalisering kinetik. Detta dokument beskriver i detalj hur NHF-ATP, arbetar ensam eller tillsammans med endocytosis-tracer fluorescerande dextrans13,14,15,16, kan användas i olika experimentella inställningar för att studera ATP: s internalisering och intracellulär lokalisering, efter internalisering i celler.
Figur 1: Strukturer av icke-lättsanerlig fluorescerande ATP och tetrametylrhodamin märkt hög molekylvikt fluorescerande dextran. (A) Struktur hos NHF-ATP. b)Schematisk representation av HMWFD. Förkortningar: ATP = adenosintrifosfat; NHF-ATP = icke-lättslös fluorescerande ATP; TMR = tetrametylrhodamin; HMWFD = fluorescerande dextran med hög molekylvikt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som rapporterats häri utfördes i enlighet med Ohio Universitys IACUC och med NIH.
1. Val av icke-valbara fluorescerande ATP (NHF-ATP) och dextrans
- Välj en fluoroforkonjugerad NHF-ATP(figur 1A)och endocytosspårare, fluorescerande dextrans med hög och låg molekylvikt (TMR-HMWFD och TMR-LMWFD) (figur 1B), baserat på de önskade emissionsvåglängderna (t.ex. bildsystem utrustat med lämpliga filter) och den specifika endocytosprocess som ska studeras.
2. ATP-lokaliseringsstudier, in vitro (figur 2)
Figur 2: In vitro-förfarande för att undersöka ATP-internalisering. Schematisk representation av protokollet för att visualisera internalisering av extracellulär ATP i odlade cancerceller med fluorescensmikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Cellkultur och beredning av celler
OBS: Utför cellodling under sterila förhållanden i en mjukpapperskulturhuv.- Förbered Dulbeccos modified eagle medium (DMEM), innehållande 10% (v/v) fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% (v/v) penicillin/streptomycin (nedan kallad DMEM/FBS), steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 0,25% trypsin/etylendiamintetraacetic acid (EDTA), i ett 37 °C vattenbad.
- Odla mänskliga cancerceller i DMEM/FBS i en 100 mm vävnadskulturrätt. Håll cellerna i en inkubator inställd på 37 °C med en 5% CO2 atmosfär.
- När cellerna når sammanflöde, passage cellerna genom att först ta bort odlingsmediet. Skölj sedan skålen med 5 ml steril PBS, ta bort PBS och tillsätt 3 ml trypsin på 0,25 %. Inkubera vid 37 °C i en 5% CO2 atmosfär i 5 min.
- Hämta skålen och tillsätt sedan 6 ml DMEM/FBS för att stoppa trypsiniseringen. Överför cellerna i suspension till ett koniskt rör på 15 mL och centrifugera vid 800 × g i 5 minuter för att pelletera cellerna.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten och använd 10 ml DMEM/FBS för att återanvända cellpelleten genom pipettering.
- Räkna celltätheten och livskraften med hjälp av en hemocytometer. Använd DMEM/FBS för att späda cellupphängningen till en densitet av ~7,5 × 104 celler/ml.
- Beredning av täcken och såddceller
- Tvätta 12 mm täckben med 70% etanol och torka dem försiktigt med känsliga uppgiftsservetter. Sterilisera täckbenen och ett par tångar via autoklavering.
- I en vävnadskulturhuv, använd tång för att placera ett täckslip i varje brunn på en 24-väl mjukpapperskulturplatta.
OBS: Senare kommer täckslipet, med celler, att monteras direkt på en mikroskopbild för avbildning. - Dispensera 300 μL av cellupphängningen (celler i DMEM/FBS), med en såddtäthet på ~2,5 × 104 celler per brunn, i 24-brunnsplattan som innehåller de steriliserade täcksliparna. Inkubera i sterila förhållanden vid 37 °C med 5% CO2-flöde.
- Svält av celler
- Tjugofyra timmar efter sådd, ta bort DMEM / FBS från varje brunn. Tillsätt omedelbart 300 μL förvarnat serumfritt DMEM i varje brunn för att serumsvälta cellerna i 15-18 h för att inducera upptag av extracellulära näringsämnen.
OBS: Svältperioden på 15-18 timmar är en kritisk parameter.
- Tjugofyra timmar efter sådd, ta bort DMEM / FBS från varje brunn. Tillsätt omedelbart 300 μL förvarnat serumfritt DMEM i varje brunn för att serumsvälta cellerna i 15-18 h för att inducera upptag av extracellulära näringsämnen.
- Beredning av NHF-ATP- och HMWFD/LMWFD-lösningar
- Använd en analytisk balans för att väga fluorescerande TMR-dextran (TMR-HMWFD, 1 mg/mL), en spårämne för visualisering av makropinosomer, eller NHF-ATP (10 μmol/L) i serumfritt DMEM i ett 1,5 ml mikrocentrifugerör. Placera rören, skyddade mot ljus, i ett vattenbad på 37 °C i 15 minuter.
- Centrifug vid 12 000 × g i 5 min vid rumstemperatur. Överför försiktigt det klara supernatanten till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör, vilket lämnar alla pelleter eller skräp intakta för att avlägsna oupplösliga kristaller.
- Tillsätt lösningarna från steg 2.4.1 till cellerna i varje brunn och inkubera cellerna i 30 min vid 37 °C.
OBS: Om HMWFD- och NHF-ATP-lösningar ska blandas för saminkubation med cellerna, förbered båda lösningarna vid 2x de slutliga koncentrationerna. Lösningarna kommer att blandas senare i ett 1:1-förhållande för att uppnå de slutliga exakta arbetskoncentrationerna. Undvik ljus eftersom reagenserna är ljuskänsliga.
- Behandling av celler och fixering
- I en färsk 24-brunnsplatta, dispensera 500 μL förvarnad PBS i var och en av fem brunnar.
- Efter cellinkubation, plocka försiktigt upp varje täcksläp med tång. Skölj varje täckmantel genom att doppa det i 500 μL förvarnad PBS. Upprepa fem gånger med de fem PBS-fyllda brunnarna.
OBS: Skonsam tvättning av celler-på-täcken är avgörande för att detta experiment ska lyckas. - Efter den slutliga PBS-tvätten, knacka på täcket på en delikat uppgiftsservett för att absorbera extra PBS och överför täcket omedelbart till kallt (4 °C) 3,7% formaldehyd, förladdat i en 24-välplatta. Fixera cellerna i 15 min vid rumstemperatur.
- Medan cellerna fixeras, förrensar mikroskopglas med 70% etanol. Ta bort täckglasen från brunnarna och montera dem på rutschkanorna med hjälp av 5 μL vattenhaltigt monteringsmedium som innehåller kärnfläcken 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), per täckslip. Torka försiktigt överflödig PBS med en pappershandduk eller en delikat uppgiftsservett.
- Fluorescensmikroskopi och bildförvärv
- Två till 24 timmar efter stegen ovan, fånga bilder av celler och internaliserade HMWFD och/eller NHF-ATP med hjälp av ett epifluorescensavbildningssystem och programvara för datainsamling.
OBS: I det här underavsnittet beskrivs steg för att hämta bilder med hjälp av ett Nikon NiU-mikroskop, utrustat med epifluorescensavbildningskapacitet, och Nikon NIS Elements-programvara. Andra jämförbara bildsystem och förvärvsprogram får dock användas. Följ tillverkarens bruksanvisning.- Placera bilden på scenen i ett upprätt epifluorescensmikroskop i kikarläge. Gå till bildprogrammet.
- Välj 10x-målet, justera scenen för att definiera fokus och skanna bilden från vänster till höger på ett serpentiniskt sätt för att identifiera de områden som är av intresse.
OBS: Identifierande regioner av intresse kommer att variera mellan celltyper, med vissa cellinjer / cancertyper som uppvisar olika och distinkta grader av TMR-HMWFD och/ eller NHF-ATP-upptag. - Välj 40x-målet och växla från kikarläge till bildinspelningsläge med hjälp av växlingsknappen på mikroskopet.
- Klicka på ikonen Live Quality på bildprogrammet för att visa och sedan hämta bilder.
- Använd OC-panelen i verktygsfältet Anteckningar och mått och definiera exponeringsparametrarna för varje filterkuber eller fluorescerande kanal.
OBS: Välj lämplig exponeringstid för varje kanal, eftersom signalintensiteterna är olika. Välj till exempel en exponeringstid på 200 ms för DAPI, 2 s för HMWFD och 4 s för NHF-ATP. När exponeringstiden har fastställts per kanal använder du den här inställningen för alla bilder, per kanal, med olika behandling eller tillstånd. - När exponeringsinställningarna har ställts in för varje kanal använder du verktygsfältet för flerkanalsförvärv för att hämta en 3-kanalsbild med de definierade exponeringsinställningarna.
OBS: Bildförvärv genom ND-förvärvsläget med flera kanaler möjliggör automatisk bildtagning för varje kanal i samma synfält. Slutaren stängs automatiskt mellan tornbyten. - Alternativt kan du skaffa flerkanalsbilder manuellt genom att växla mellan filterkuber, ställa in exponeringstiden, stänga/öppna slutaren mellan bildförvärv för varje kanal och överlägga varje bild som tagits för enskilda kanaler.
ND-förvärvsläget automatiserar den här processen och tillhandahåller sammanslagna avbildningar. - Spara bilden som ND2-fil (Nikon Elements-format sparar metadata). Spara TIF-filer, inklusive den kopplade kanalbilden och enskilda kanalbilder.
OBS: TIF-filer kan användas med ett bredare urval av program. - Använd funktionen Antal objekt i verktygsfältet Analys om du vill räkna antalet NHF-ATP-, TMR-HMWFD- och/eller TMR-LMWFD-positiva celler i en sparad .nd2-bildfil.
- Exportera data till ett kalkylblad via analysprogrammet.
- Två till 24 timmar efter stegen ovan, fånga bilder av celler och internaliserade HMWFD och/eller NHF-ATP med hjälp av ett epifluorescensavbildningssystem och programvara för datainsamling.
- Kvantifiering och analys av data
- För varje analyserat tillstånd, bild 50 till 100 celler för kvantifiering. Använd dataanalysprogramvaran (programvara som ingår i epifluorescensavbildningssystemet eller annan programvara) och beräkna medelvärdet av fluorescerande blåsor per cell.
- Använd lämpliga statistiska metoder för att analysera de kvantifierade resultaten.
3. ATP internalisering i tumörer, ex vivo (figur 3)
Figur 3: In vivo-förfarande för att undersöka ATP-internalisering. Schematiska representation av protokollet att visualisera internalisering av extracellulär ATP i tumör xenografts med cryosectioning och fluorescence mikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Förberedelse av cellkulturer för implantation
- Odla cancerceller till 80% sammanflöde vid 37 °C i en 225 cm2 kolv, med DMEM kompletterat med FBS, till en slutlig koncentration av 10% (v/v) och penicillin/streptomycin vid 1% (v/v).
- Tvätta cellerna två gånger med 10 ml PBS. Förvarmda 0,25% trypsin/EDTA till 37 °C. Tillsätt 8 ml trypsin/EDTA och inkubera vid 37 °C i 2 min.
- När cellerna börjar lossna från botten av kolven, använd en 10 ml steril serologisk pipett för att tillsätta 8 ml DMEM/FBS. Aspirera två gånger för att rubba eventuella vidhäftande celler. Använd pipetten för att överföra de lossnade cellerna från kolven till ett koniskt rör på 50 ml.
- Tillsätt 10 ml DMEM/FBS med en 10 ml-pipett och samla alla återstående flytande celler i samma koniska rör på 50 ml.
- Centrifugera cellfjädringen vid 600 × g, 4 °C i 4 min. Ta bort supernatanten och återanvänd cellerna i 1 ml iskall PBS.
- Räkna celltätheten med hjälp av en hemocytometer. Håll cellupphängningen på is medan du räknar.
- Centrifugera cellfjädringen vid 600 × g, 4 °C i 4 min. Ta bort supernatanten och suspendera cellerna i iskall PBS så att celltätheten blir 5 × 106 celler per 100 μL PBS. Överför cellfjädringen till ett 1,5 ml mikrocentrifugerör.
- Subkutan injektion av cancerceller för utveckling av xenografttumör
- Använd en latexfri spruta (1 ml) med en precisionsglidnål (27 G nål) för injektion av cancerceller.
- Överför cellfjädringen (5 × 106 i 100 μL PBS) till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör. Dra in cellerna i sprutan.
- Välj ett injektionsställe på flanken av en immunodeficient (naken) mus och rengör försiktigt huden med 75% etanol. Torka av överflödig etanol med en delikat uppgiftsservett.
- För subkutan injektion, håll nålen i cirka 10° vinkel mot huden. Sätt i nålspetsen, avfasningssidan uppåt, precis under huden, så att endast 1-2 mm av nålen är synlig utanför huden. Dosera cellerna från sprutan långsamt under cirka 10 s.
- Efter att ha injicerat hela volymen, fortsätt att hålla nålen på plats i 3-5 s, dra sedan ut nålen och använd ett finger för att applicera försiktigt men fast tryck på injektionsstället i 3-5 sekunder till för att förhindra läckage av det injicerade innehållet.
- Övervaka och mät tumörtillväxt med hjälp av vernierkalibrar tills tumörerna når en volym på 200-500 mm3.
- Beredning av HMWFD- och NHF-ATP-lösningar som ska användas efter tumörresektion
- Lös upp 300 μL 16 mg/ml HMWFD i serumfritt DMEM (odlingsmedium), inkubera i ett vattenbad på 37 °C i 30 minuter och centrifugera vid 12 000 × g i 5 minuter enligt beskrivningen ovan. Överför lösningen till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör.
- Tillsätt 40 μL NHF-ATP analogt bestånd (1 mM) till 160 μL serumfritt DMEM för att förbereda en 0,2 mM NHF-ATP-lösning.
- Förberedelse av försöksbrunnar
OBS: Denna experimentella design kommer att analysera intracellulär internalisering av HMWFD + NHF-ATP, vilket tyder på upptag av makropinosomer.- Förbered brunnarna enligt följande: Tja #1, Kontroll: 200 μL serumfritt DMEM; Brunn #2, Kontroll: 100 μL 16 mg/mL LMWFD + 100 μL serumfritt DMEM = 200 μL 8 mg/mL LMWFD; Brunn #3, Kontroll: 100 μL 0,2 mM NHF-ATP + 100 μL serumfritt DMEM = 200 μL 0,1 mM NHF-ATP; Tja #4; Experimentellt: 100 μL 16 mg/mL HMWFD + 100 μL 0,2 mM NHF-ATP = 200 μL 0,1 mM NHF-ATP och 8 mg/mL HMWFD.
- Beredning av tumörvävnader
- Avliva musen genom livmoderhalscancer förskjutning eller enligt IACUC-godkända protokollet.
- Använd en skalpell i storlek 10 för att skära de isolerade tumörerna med en tjocklek av ~500-1 000 μm.
- Inkubera tumörskivorna i serumfria DMEM kompletterade med 100 μM NHF-ATP och/eller 8 mg/mL H/LMWFD i mikrocentrifugerör i 40 min vid 37 °C med 5% CO2-flöde.
OBS: Efter inkubation orsakar tumörvävnadsmetabolismen mediets färg att förändras. - Skölj vävnaderna i 37 °C förvarnad PBS (2 ml för varje sköljning i en 24-väl tallrik).
- Överför vävnaden till en ny 24-välplatta med förvarnad färsk PBS, skölj och upprepa fyra gånger med mild skakning.
- Cryo-inbäddning (förbereda frysta vävnadsblock)
- Förbered identifieringsetiketter för varje tumör som ska skördas. Skär en 2 cm bit laboratorietejp och vik i hälften, självhäftande sidor tillsammans, på längden. Använd en markeringspenna för att märka taggen, t.ex. med ett mus-/tumöridentifieringsnummer.
- Förbered inbäddning av formar genom att placera vävnadsformar i rostfritt stål direkt på torris.
OBS: Torris kan orsaka köldskador, brännskador och kvävning. Använd isolerade handskar vid hantering av torris. Använd torris i ett välventilerat område. Förvara inte torris i en tätt tillsluten behållare. Förvara i stället i en behållare (till exempel en frigolitkylare) som gör att gas kan komma ut. - Medan formen kyler, placera en liten pool av vävnadsfrysande medium i en 10 mm vävnadskulturplatta. Se till att volymen är tillräcklig för att sänka tumörvävnaden som ska skördas.
- Använd en perforerad sked för att skopa upp den resected tumörvävnaden och omedelbart placera vävnaden i ett frysmedium, vilket säkerställer att vävnaden är nedsänkt. Använd den perforerade skeden och rulla försiktigt vävnaden i frysmediet och se till att mediet badar alla vävnadsytor.
- Flytta försiktigt vävnaden till inbäddningsformen som innehåller frysmediet. Placera motsvarande etiketttaggen vertikalt i frysmediet/formen för att frysa på plats. Se till att den skrivna etiketten är synlig utanför mediet.
- När frysningen är klar (frysmediet blir ogenomskinligt vitt), ta bort vävnadsblocket från formen, placera det på torr is och upprepa för varje tumör. Förvara vävnadsblocken vid -80 °C i flera månader före kryosektionsförfarandet.
- Beredning av diabilder av vävnadsprover
- För att maximera chansen att hitta internaliseringspositiva celler och ha mer representativa vävnadsregioner, samla in seriella kryosektioner vid -18 till -20 °C med hjälp av en kryostat.
- Prechill cryostat verktyg (blad, rakblad, anti-roll platta, vävnad chuck hållare, pensel) och balansera tumör vävnad block genom att placera dem i en cryostat kammare vid -18 till -20 °C. Ställ in klinghållarvinkeln på 5-10°. Trimma försiktigt vävnadsblocket, efter behov, med ett rakblad och montera det på chuckhållaren med hjälp av vävnadsfrysningsmedium som "lim".
- Lås chuckhållaren i vertikalt läge på mikrotomenheten, som avancerar till det inställda avståndet (t.ex. 10 μm) med varje varv på handveven. Placera antirullplattan så att den vilar strax ovanför bladets höjd. För att förhindra vävnadsrullning innan du flyttar fram mikrotomen, skjut försiktigt tummen över vävnadsblockets underkant.
- När mikrotomen avancerar och vävnadssektionen faller på metallplattan, använd en pensel för att styra vävnadssektionen och rulla ut vävnaden om det behövs.
- Håll mikroskopet över vävnadssektionen utan att röra så att sektionen lockas till bilden.
OBS: Cryostat-blad (hög profil, engångs) är extremt vassa och kan orsaka allvarliga skador. Var försiktig när du hanterar blad och använder kryostaten. Använd ett bladskydd, om tillgängligt. Korrekt utbildning krävs. - Skär tumören i sektioner med 10 μm tjocklek. Överför omedelbart de skivade sektionerna till en positivt laddad glasmikroskopbild.
OBS: För seriella sektioner samlar du först en 10 μm tjock sektion i det övre vänstra hörnet av var och en av åtta positivt laddade diabilder. För fram kryostaten genom efterföljande 100-200 μm vävnad och kassera vävnaden. Överför omedelbart alla skivade sektioner till glasmikroskopbilder. - Samla sedan ytterligare en 10 μm tjock sektion, bredvid den tidigare placerade vävnadssektionen, för var och en av de åtta bilderna. Upprepa denna seriella insamlingsprocess tills var och en av de åtta bilderna innehåller åtta vävnadssektioner, var och en 100-200 μm ifrån varandra. Håll vävnadssektionerna i mörker för att bevara fluorescensen.
OBS: Vävnadssektioner på diabilder kan förvaras i en bildruta vid -80 °C i flera månader.
- För att maximera chansen att hitta internaliseringspositiva celler och ha mer representativa vävnadsregioner, samla in seriella kryosektioner vid -18 till -20 °C med hjälp av en kryostat.
- Fixering av vävnadsbilder
- KRITISKT STEG: Fixera vävnadssektionerna i 95% etanol vid -18 till -20 °C till i 5 min.
- Tvätta den fasta sektionen i 5 min med rumstemperatur PBS och montera sedan de fasta tumörsektionerna under ett glastäcke med 10 μL av ett vattenhaltigt monteringsmedium med DAPI.
- Tolv till 24 h efter montering, undersöka de fasta tumör avsnitten genom fluorescens mikroskopi och förvärva bilder, som beskrivs för de odlade cellerna ovan.
- Fluorescensmikroskopi och bildförvärv
- Identifiera områden av intresse och skaffa bilder enligt beskrivningen i avsnitt 2.6.
- Kvantifiering och analys av data
- Kvantifiera cellerna och tillämpa lämpliga statistiska analyser, som i avsnitt 2.7.
4. ATP internalisering i tumörer, in vivo
- Förbered cellkulturer för implantation enligt beskrivningen i avsnitt 3.1.
- Subkutan injektion av cancerceller för utveckling av xenografttumör
- Generera xenografted tumörer som beskrivs i avsnitt 3.2.
- ATP och/eller dextraninjektion i xenografttumörer
- Förbered behandlingslösningarna för DMEM (fordon) eller 8 mg/ml HMWFD eller LMWFD, med eller utan NHF-ATP (100 μM) i DMEM, enligt beskrivningen ovan.
- Använd en 1 ml-spruta för att samla in 50 μL av en behandlingslösning och injicera lösningen direkt i varje xenografttumör. Upprepa proceduren för fyra biologiska replikat av varje behandling.
- Vävnadsskörd och kryoinbäddning
- Förbered identifieringsetiketter för varje tumör som ska skördas. Skär en 2 cm bit laboratorietejp och vik i hälften, självhäftande sidor tillsammans, på längden. Använd en markeringspenna för att märka taggen, t.ex. med ett mus-/tumöridentifieringsnummer.
- Cirka 5 min efter injektionen, avliva musen genom livmoderhalscancer förskjutning eller enligt IACUC godkänt protokoll.
- Använd en skalpell i storlek 10, gör ett snitt intill tumören och ungefär vinkelrätt mot nålinjektionens riktning. Använd tång och kirurgisk sax för att återförsluta tumörvävnaden från den omgivande vävnaden.
- Dela tumören i två till fyra 1 cm2 bitar, beroende på den totala tumörstorleken.
- Förbered inbäddningsformarna och bädda in vävnaden, enligt beskrivningen ovan i avsnitt 3.6. Se till att skördetiden, från intratumoral dextraninjektion till kryoinbäddning, inte är mer än 7-8 min.
- Beredning av diabilder av vävnadsprover
- Samla seriell tumör avsnitt, som beskrivs i avsnitt 3.7.
- Fixering av vävnadsbilder
- Fixera vävnaden enligt beskrivningen i avsnitt 3.8.
- Fluorescensmikroskopi och bildförvärv
- Identifiera de områden som är av intresse och skaffa bilder enligt beskrivningen i avsnitt 2.6.
- Kvantifiering och analys av data
- Kvantifiera cellerna och tillämpa lämpliga statistiska analyser enligt beskrivningen i avsnitt 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-studie
Intracellulär internalisering av NHF-ATP visades genom samlokalisering av NHF-ATP med HMWFD eller LMWFD (figur 4). Framgången för detta förfarande bygger främst på användning av lämpliga koncentrationer av NHF-ATP och dextrans och på att bestämma lämplig typ av dextrans (polylysin kontra neutral). Till exempel, för att undersöka makropinocytos, valdes HMWFD eftersom det internaliseras endast av makropinosomer13,14,15,16. Alternativt, om clathrin- och/eller caveolae-medierade endocytoser studeras, ska LMWFD väljas eftersom de mindre storlekarna på dessa endocytosassocierade endosomer endast tillåter dem att uppsluka LMWFD14,15,16. Fluorescerande dextrans finns också i två olika former: polylysindextran och neutral dextran. Dessa dextrans genererar olika fluorescensintensitet och bakgrundsfärgning; således varierar deras rekommenderade applikationer. Till exempel ger polylysin dextran högre fluorescensintensitet men också högre bakgrund. Neutral dextrans genererar tillräcklig fluorescensintensitet med relativt låg bakgrundssignal och föredras för experiment med cancer cellinjer. Med hjälp av denna kostnadseffektiva analys genererade vi hög intensitet och hög signal-till-brus NHF-ATP fluorescerande märkning, som matchade fluorescensintensiteten av dextrans utan att förvirra bakgrund fluorescens.
Eftersom valet av fixeringsmedel och fixeringsförfarandet väsentligt påverkade resultatet av analysen, måste fixeringsvillkoren bestämmas experimentellt och väljas för varje specifikt experiment (dvs. specifik celllinje eller vävnadstyp). Extracellulär ATP behövs inte i analysen; I själva verket kan höga koncentrationer av eATP i analyslösningen leda till ökad bakgrund. Viktigt, efter cellsådd är den optimala tidsramen för serumsvält ~ 15-18 h. Om serumsvälten är för lång kommer bristen på näringsämnen att påverka cellfästet och leda till förlust av celler i följande steg. Om serumsvälten är för kort kommer cellcykeln inte att arresteras ordentligt, och kärnvapenfärgning kommer inte att vara enhetlig över rutschkanan. Sköljning av den täckslipsbundna vävnaden i varm PBS fem gånger är tillräckligt för att ta bort bakgrundsfärgning. Det är viktigt att vara mycket skonsam med vävnadstvättar. Undvik överdriven sköljning, kall sköljning eller kraftfull tvättning, eftersom dessa kan skada cellernas morfologi.
Medan alla cancer cellinjer kan användas i denna analys, olika cellinjer kan visa olika grader av internalisering. Vi har visat att cancer cellinjer med KRAS proto-oncogene mutationer är fördelaktigt för att studera NHF-ATP internalisering. Medan KRAS mutationer inte krävs för internalisering av eATP, kras mutationer är associerade med ökad macropinocytosis in vitro13. För dessa experiment valde vi A549 lungcancerceller, som hyser en KRAS-mutation. Makropinocytos av eATP i A549-celler har faktiskt tidigare visats med hjälp av en in vitro ATP internaliseringsanalys13.
Ex vivo-studie
Figur 5 visar fluorescens mikroskopiska bilder av NHF-ATP internalisering i tumör vävnad avsnitt. Framgången för ex vivo-studien är starkt beroende av korrekt inkubation av NHF-ATP med tumörvävnaden och noggrann tvättning efter insamlingen av tumörsektionerna. En kortare eller längre inkubationstid kan störa internaliseringen. Bestäm inkubationstider, experimentellt och i förväg, för olika tumörer. Otillräcklig sköljning av tumör vävnad tillåter hög bakgrund färgning och därmed en låg signal-till-buller förhållande.
Valet av fixeringsagenten är också avgörande. Fixering i metanol, formaldehyd, aceton och etanol kan testas individuellt och jämföras för att identifiera det bästa fixeringsmedlet för det specifika studiesystemet. Det är anmärkningsvärt att de monterade bilderna måste fotograferas inom 12-24 h, men inte längre, för att förhindra att de internaliserade fluorescerande molekylerna frigörs från celler och bidrar till hög bakgrund. Slutligen, för att undvika kant-effekt fenomen-intensiv färgning vid kanterna av tumör vävnad avsnitt-det är viktigt att samla enhetliga vävnad avsnitt före ex vivo inkubation.
Med tanke på tumörvävnadens heterogenitet är det viktigt att få vävnadssektioner i hela tumören. Den beskrivna metoden för att samla in seriella tumör avsnitt, tas var 100-200 μm ifrån varandra, säkerställer att representativa data från olika regioner i tumören kan förvärvas och analyseras. Till exempel, precis som olika tumörtyper kan generera olika ATP internaliserings data, kan vissa intratumoral regioner också variera i ATP internalisering kinetik och mekanism.
In vivo-studie
Figur 6 visar NHF-ATP internalisering i injicerade (xenografted) tumörer. En viktig parameter för en framgångsrik och positiv in vivo-studie var NHF- ATP- injektionen och tiden mellan injektion och djurdödasi. Under injektionsproceduren placerar du injektionsnålen för att nå så mycket tumörområde som möjligt och håll nålen intakt i tumören så länge som 1 min för att säkerställa att NHF-ATP förblir inuti tumören och inte läcker ut. Det korta tidsintervallet mellan injektionen och dödshjälp säkerställer att injicerad NHF- ATP transporteras in i tumörcellerna, men den transporten är inte för lång, så att mottagarcellerna inte kommer att metabolisera och försämra NHF-ATP avsevärt, vilket resulterar i intracellulära fläckar. Efter avlivning och tumör borttagning, dokumentera injektion förfarandet för varje tumör, inklusive injektionsstället och injektion riktning. På detta sätt kan tumörer delas upp i specifika orienteringar och längs specifika anatomiska plan så att tumörsektioner löper parallellt med injektionsriktningen, vilket leder till identifiering av fler NHF-ATP-positiva celler.
Figur 4:A549 celler internaliserar NHF-ATP, som samlokaliserar med HMWFD in vitro. Fluorescensmikroskopi av A549-celler inkuberas med både 1 mg/mL HMWFD (vänster panel, röd) och 10 μM NHF-ATP (mittpanel, grön) i 30 min. Insets visar hög förstoring av boxade regioner. Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: NHF-ATP = icke-lättslös fluorescerande ATP; HMWFD = fluorescerande dextran med hög molekylvikt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5:A549 celler internaliserar NHF-ATP tillsammans med HMWFD ex vivo. Fluorescensmikroskopi av tumörogena A549-celler xenografted till immunodeficient (Nu/J) möss; NHF-ATP internalisering utfördes ex vivo. Kirurgiskt borttagna tumörer inkuberades (ex vivo) med 8 mg/mL HMWFD (vänster panel, röd) och 100 μM NHF-ATP (mittpanel, grön). Samlokalisering av cellulära HMWFD och NHF-ATP visas som en sammanslagen bild (höger panel, gul). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: NHF-ATP = icke-lättslös fluorescerande ATP; HMWFD = fluorescerande dextran med hög molekylvikt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6:A549 celler internaliserar NHF-ATP tillsammans med HMWFD in vivo. Fluorescensmikroskopi av tumörogena A549-celler, xenografterade till immunodeficient (Nu/J)möss; NHF-ATP internalisering utfördes in vivo med 8 mg/mL HMWFD och 100 μM NHF-ATP injiceras direkt i tumörer av levande möss. Samlokalisering av cellulära HMWFD och NHF-ATP visas som sammanslagna bilder i A och B (höger paneler, gula). (A) Bilder med hög förstoring markerar cellulär internalisering av NHF-ATP och HMWFD i tumörer in vivo. Skalningsstaplar = 20 μm. (B) Bilder med låg förstoring visar regional internalisering inom en tumörvävnadssektion. Skalningsstaplar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metod utvecklades för rumsliga, tidsmässiga och kvantitativa analys av cellulär internalisering av nonhydrolyzable ATP. Denna metod är i stort sett tillämplig för användning i olika biologiska system, inklusive olika tumörogena modeller, för vilka vi tillhandahåller teknisk instruktion och representativa data. För att erhålla tolkningsbara data under in vivo ATP internaliseringsstudier (avsnitt 4 i protokollet), är det viktigt att begränsa den experimentella tid som förflutit från intratumoral dextran injektion till cryo-inbäddning. Fixering vävnad glider-post-tumör avsnitt-är ett nödvändigt steg före fluorescence mikroskopisk imaging. Tillsammans säkerställer dessa två kritiska steg att tumörceller behåller den internaliserade ATP under avbildningsprocessen. En annan viktig faktor under analysen av ATP internalisering är att ta hänsyn till heterogeniteten av xenograft tumörer. Eftersom tumorigenesis fortskrider olika bland cancercelltyper, kan det vara nödvändigt att felsöka aspekter av denna metod för att bestämma idealiska experimentella förhållanden för olika cancerceller. För att säkerställa en omfattande bedömning av makropinocytos av ATP i tumörer, är det viktigt att bild vävnad avsnitt i hela tumör eftersom det kan finnas regionala variationer när det gäller bosatta celler och deras förmåga att internalisera eATP. Faktum är att denna metod kan avslöja olika mekanismer för eATP internalisering bland cancer/tumörceller i framtida studier.
Det är viktigt att notera att NHF-ATP endast kan ersätta okonjugerad ATP eller radioaktiv ATP för internaliseringsstudien. Det kan inte användas för andra studier, såsom metaboliska studier, eftersom NHF-ATP kommer att bete sig och metaboliseras annorlunda när det släpps från makropinosomer och/eller endosomer inuti celler. Traditionellt undersöktes ATP internalisering med radioaktiv ATP17,18,19. Med tanke på instabiliteten hos radioaktiva ATPs är dock mätbar radioaktivitet inuti målceller inte nödvändigtvis intakt ATP. Eftersom NHF-ATP är icke-lättsinnig och kan visualiseras mikroskopiskt, rekommenderas dess användning över radioaktiv ATP.
Proceduren som beskrivs häri är enkel att utföra, snabb och kostnadseffektiv. Om ett bildsystem är utrustat med videokapacitet i framtida applikationer, kan den dynamiska processen för ATP internalisering visualiseras i realtid, avslöjar information om makropinocytotisk kinetik och handel med specifika vävnader. Denna procedur har framgångsrikt använts i andra cancerceller som H1299 celler12, icke-cancerceller som NL-20 celler12och neuronala celler, med inga eller mindre ändringar (data visas inte). Eftersom ATP är intimt involverad i Warburg-effekten i cancermetabolism6,7,8,20,21,22, vid diabetes23,24,25och andra sjukdomar som involverar energimetabolism, och eftersom eATP kan spela viktiga roller i dessa sjukdomar, kommer det beskrivna förfarandet sannolikt att ha breda tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Cryosectioning utfördes på plats vid Ohio University Histopathology Core. Detta arbete stöddes delvis av start-up fonder (Ohio University College of Arts & Sciences) till C Nielsen; NIH-anslag R15 CA242177-01 och RSAC-utmärkelse till X Chen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker - orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical - sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008 (2008).
- Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101 (2013).
- Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
- Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W.
- Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
- Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
- Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
- Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
- Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
- Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
- Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
- Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
- Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
- Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
- Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
- Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
- Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154 (2007).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
