Samtidig Brightfield, Fluorescens och optisk koherens Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Det övergripande målet med detta förfarande är att demonstrera integrationen av tre bildsystem i en enda enhet, vilket möjliggör en samtidig mätning av den mekaniska funktionen, jonisk dynamik och geometrisk förändring av kontrakterande hjärtvävnad. Specifikt mäter vi vävnadens kraftproduktion, kalciumtransienter, lokala förskjutningar och formförändring. Kombination av dessa bildframställningsmetoder kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i hjärtsjukdomar, med stora konsekvenser för utvecklingen av effektiva behandlingsstrategier.

Den största fördelen med denna teknik är att det gör det möjligt för oss att studera heterogeniteten i muskelaktivitet. Enheten som används i detta protokoll innehåller tre bildsystem som kan avbilda samma prov, ett brightfieldmikroskop, fluorescensmikroskop och en optisk koherenstomografi. En serie tärande speglar används för att separera fluorescensutsläppet och ljusfältsöverföringsbilden.

De grundläggande egenskaperna hos denna enhet är två oberoende aktiverade monteringskrokar, en mätkammare med tre optiskt klara axlar och en extern triggerlinje som synkroniserar brightfield- och OCT-kamerorna med en stimulator. I den här videon visar vi hur man isolerar, förbereder och avbildar hjärt trabeculae och presenterar några representativa resultat. Efter att ha excising ett hjärta från en bedövad råtta, överför det till dissekeringskammaren.

Använd två böjda tångar, dra aortan över perfusions cannula. Håll aortan på plats med en tr styrka. Öppna under tiden slanglinjen för att tillåta dissekeringslösning att flöda genom perfusionsbaleln.

När kranskärlsvaskulaturen är rensad från blod och hjärtat är helt perfused med dissekeringslösning, säkra aortan på plats med hjälp av en sutur. Placera hjärtat genom att rotera kanylen så att den vänstra kranskärlen är synlig på den överlägsna ytan. Fäst hjärtats spets på botten av dissekeringskammaren.

Skär av båda atria. Skär längs höger sida av septum till hjärtats topp. Fäst den öppnade vänstra ventrikeln på dissekeringskammarens botten.

Skär sedan längs septumens vänstra sida, öppna den högra ventrikeln och fäst den på basen av dissekeringskammaren också. Identifiera en frikörd trabecula i höger ventrikel. Använd fjädersaxen och en tång och skär väggvävnaden som omger trabecula.

Skär sedan väggvävnaden i hälften, orthogonal till trabeculas riktning. Trimma väggvävnaden tills dess dimension är lämplig för monteringskonfigurationen som används. Lämna den strukna trabeculan i dissekeringskammaren.

Spola varmt vatten, destillerat vatten och superfusera sedan lösningen genom mätkammaren. Slå på ljusfältets mikroskopljuskälla och tryck på F1 för att aktivera fångst. Justera nedströmskroken manuellt tills den är centrerad i brightfield-bilden.

Klicka på noll nedströmsaxel och inaktivera sedan nedströms för att aktivera motorn. Flytta skjutreglaget nedströms börvärde tills krokens ände justeras mot kanten av standardområdet av intresse. Nollställ nedströmsaxeln igen och flytta sedan skjutreglaget för nedströms börvärde till 1 000.

Upprepa processen med den uppströms kroken, men flytta inte skjutreglaget uppströms börvärde efter att ha nollställt den överordnade axeln igen. Klicka på Flytta till montering. Starta lysrörsbelysningssystemet genom att växla lampbrytaren innan du snabbt slår på styrenhetens delsystem genom att växla huvudbrytaren.

Växla driftläget till turbo blanking genom att trycka på lägesknappen på frontpanelen, följt av två och sedan en. Tryck på onlineknappen för att aktivera extern kontroll. Pausa superfusatflödet genom mätkammaren.

Fyll monteringskammaren med dissekeringslösning. Använd en spruta med en milliliter och transportera trabeculan från dissekeringskammaren till monteringskammaren. Låt trabeculan sjunka ner i monteringskammaren via gravitationen.

Sänk vätskenivån i monteringskammaren så att den är jämn med krokens mittsektion. Justera avståndet mellan krokarna så att det återspeglar trabeculas slacklängd genom att flytta skjutreglaget för nedströms börvärdet. Använd ett mikroskop för att underlätta visualisering, greppa lätt en av bitarna av ändvävnaden med tång och montera den på den uppströms kroken.

Montera den andra delen av ändvävnaden på nedströmskroken. När trabekulan är ordentligt monterad flyttar du tillbaka trabecula till mätkammaren genom att trycka på flytta till kammaren och återuppta superfusatflödet. Ställ in stimulansfrekvensen på en, stimulanstiden till 10 och stimulansspänningen till 10.

Börja stimuleringen genom att trycka på stimulansen. Slå på ljusfältets belysningssystem. Tryck på F1 och välj en intresseregion som omsluter ett strimmiga område i användargränssnittet.

Klicka på beräkna sarkomlängd för att beräkna den genomsnittliga sarkomlängden i det markerade området. Öka muskellängden tills den genomsnittliga sarkomlängden är cirka 2,32 mikron. Flytta muskeln genom att justera mittpunktens skjutreglage på fliken mitt- och separationskontroll så att kanten på nedströmskroken bara syns i brightfield-bilden.

Samla fluorescensinformation för 10 ryckningar. Öka värdet för mittpunkten med 200 och samla in ytterligare 10 ryckningar med fluorescensinformation. Upprepa den här processen tills brightfield-bilden innehåller den uppströms kroken.

Samla in det sista fönstrets värde av fluorescensinformation. Sätt tillbaka trabecula till en central position genom att ställa in mittinställningsvärdet till noll. Minska stimulansfrekvensen till 0,2 Hertz och växla från K-H-superfusatet till Fura-2-lastlösningen.

Mät fluorescenssignalen var 10:e minut. Visualisera signalen på fliken PMT-signal. Efter att 360 nanometerssignalen har ökat med en faktor 10, returnera stimulansfrekvensen till en Hertz och växla tillbaka till K-H-superfusatlösningen.

Kontrollera förhållandesmätningen var 10:e minut tills signalen stabiliseras, då datainsamlingen kan börja. Sätt tillbaka muskeln i den position där kanten på den nedströms kroken bara finns i brightfield-bilden. Fånga fluorescensinformation genom att klicka på aktivera fluorescenskälla.

Börja strömma maskinvarudata. På användargränssnittet för brightfield imaging ställer du in hämtningsläget på extern utlösare, ökar bildhastigheten till 100 Hertz och ställer in antalet bilder som ska fångas till 100. Tryck på control-shift-S, följt av F1, för att spela in ljusfältsavbildningsdata för det här fönstret.

Öka värdet för mittpunkten med 200 och upprepa insamlingsprocessen för brightfield. Fortsätt med skanningsprotokollet tills bilddata har samlats in för det slutliga fönstret. Sätt tillbaka trabecula till en central position genom att ställa in mittinställningsvärdet till noll.

Slå på OCT-belysningskällan genom att vrida på huvudknappen och trycka på strömbrytaren, följt av SLD-knappen. Täck galvanometerhuvudet och klicka på få bakgrund för att mäta bakgrundsstörningsmönstret och subtrahera det från mätningen. Ställ in bildinspelningsläget på livevisning.

Centrera trabecula i X- och Y-axlarna genom att justera X- och Y-förskjutningsvärdena. Med trabecula centrerad, skanna längs y-axeln genom att justera Y-positionen för att hitta de positioner som motsvarar uppströms- och nedströmskrokarna. Notera dessa positioner nedåt.

Ställ in intervallet Y på den absoluta skillnaden mellan dessa värden dividerat med 10. Ställ in bildinspelningsläget på stimulansutlöst, intervall X till 100 och klicka på knappen Inställda aktiva parametrar. Klicka på strömma data och hämta sedan.

För att fånga den regionala kalcium och brightfield information för hela längden av trabecula presenteras här, sju muskel positioner krävdes. Denna siffra av den genomsnittliga kraften från var och en av positionerna överlagrad tyder på att ryckkraften var ostörd av denna rörelse, vilket avslöjade att det inte fanns något positionsberoende av kraftproduktion. Dessa skanningar som samlats in med hjälp av optisk koherenstomografi med en hastighet av 100 Hertz segmenterades med Hjälp av ImageJ-plugin, Weka.

Varje tvärsnitt verkar förvrängt på grund av skillnaden mellan sido- och djupupplösningarna. Detta korrigerades genom att skala varje axel oberoende av varandra med respektive upplösning. Efter skalning av den råa C-skanningen av trabecula är muskeln ungefär cylindrisk.

Reflektionen av mätkammarens vägg kan ibland överlappa muskeldata, men segmenteringsprogramvaran kan tränas för att ta hänsyn till detta. När det har segmenterats kan tvärsnittsområdet längs muskelns längd beräknas under hela rycket. Observera att just denna trabecula har en liten gren.

Grenens rörelse är uppenbar ungefär halvvägs längs trabecula. Slutligen kan de segmenterade bilderna omvandlas till maskor för att underlätta byggandet av geometriska modeller. Bilddata som tagits vid var och en av de sju positionerna med en hastighet av 100 bilder per sekund syddes ihop för att skapa en enda fullständig bild av trabecula.

Förhållandet mellan det utelämnade fluorescens som är associerat med excitationsljuset på 340 och 380 nanometer korrelerar med det intracellulära kalciumet efter att trabecula har laddats med Fura-2. Genomsnittet av 10 intracellulära kalcium transienter från varje fönster är i linje med regionen de avbildades. Medan toppen av transienterna för denna trabecula verkar rimligt konsekvent, minskade det diastoliska kalciumet längs dess längd.

På samma sätt tyder resultaten av beräkningarna av förskjutningsspårning och sarkomlängd också på förekomsten av regional variabilitet. Den markörlösa spårningstekniken som används kan beräkna förskjutningen av varje pixel. Lämpligheten av sarkomlängd uppskattningar testades baserat på bredden och amplituden av gaussiska passform till FFT signalen.

Dessa villkor var inte uppfyllda i muskel regionen mellan noll och 500 mikron, så ingen sarkom längd information kunde beräknas där. Med tanke på de associerade förskjutningarna är det troligt att sarkomerna i denna region förlängdes under den kontraktila fasen av ryckningarna. Efter att ha tittat på den här videon bör du ha en god förståelse för hur du isolerar hjärt trabeculae och förbereder dem för multimodal avbildning på ett tillförlitligt sätt.

Denna process fastställer en väg för insamling av ett dataset som krävs för konstruktion av fysiologiskt informerade finita elementmodeller av hjärtvävnadskontraktion.