Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لاستخدام إعدادات عالية الإنتاجية لفحص الفعالية المضادة للبكتيريا من كوكتيلات البكتيريا.
Abstract
مسببات الأمراض البكتيرية تتحدى باستمرار أنظمة سلامة الأغذية في جميع أنحاء العالم. مع تزايد المخاوف بشأن ظهور البكتيريا المقاومة للحرارة والمطهر ، هناك حاجة ماسة إلى عوامل مضادة للبكتيريا جديدة. استراتيجية المكافحة البيولوجية القائمة على البكتيريا هي الاستخدام العلاجي للفاج للسيطرة على مسببات الأمراض البكتيرية في البيئات الزراعية. ويتزايد قبول المكافحة البيولوجية للفياج كتكنولوجيا مستدامة وفعالة في إزالة التلوث من مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية. لضمان نتائج فعالة للتحكم البيولوجي، فإن الفحص المنهجي لتركيبات ال phage ضد البكتيريا المستهدفة في ظل الظروف البيئية المطلوبة أمر بالغ الأهمية. قد تتأثر الفعالية المضادة للبكتيريا من الكوكتيلات phage من قبل جنس phage والجمع بين السلالات البكتيرية المستهدفة ، وتعدد العدوى ، ودرجة الحرارة ، والوقت. لصياغة كوكتيل phage مع فعالية فائقة ، كانت الطريقة المقترحة لتقييم فعالية phages الفردية وكوكتيلات phage بشكل منهجي في قتل مسببات الأمراض البكتيرية المنقولة بالأغذية في ظل ظروف مستهدفة. تم رصد فعالية القتل البكتيري من خلال قياس الكثافة البصرية في درجات الحرارة والمدد المطلوبة. تم تحديد فعالية phage الفائقة عن طريق تثبيط كامل للنمو البكتيري. الطريقة المقترحة هي نهج قوي قائم على الأدلة لتسهيل صياغة كوكتيلات phage مع فعالية فائقة مضادة للبكتيريا.
Introduction
البكتيريا (phages) هي الفيروسات التي تغزو الخلايا البكتيرية بشكل طبيعي ، مما يعطل عملية التمثيل الغذائي البكتيري ويسبب تحلل البكتيريا. وعلى النقيض من مضادات الميكروبات التقليدية (مثل المضادات الحيوية)، فإن الطيف المضيف للphage ضيق نسبيا، وقادر فقط على إصابة مجموعة مستهدفة من الأنواع البكتيرية أو السلالات، وبالتالي ينبغي أن يقلل من الآثار الجانبية على الكائنات الحية الدقيقة التي تفيد صحة الحيوان والإنسان. مع ظهور مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) ، تؤدي ال phages ومشتقاتها إلى مضادات الميكروبات البديلة للسيطرة على الأمراض المعدية البكتيرية ، بما في ذلك العدوى البكتيرية المضادة للميكروبات في البشر والحيوانات1،2. وقد أكدت Phages إمكانات علاجية ضد مسببات الأمراض البكتيرية >20 التي تسبب التهابات سطحية والتهابات في الجهاز التنفسي العلوي والجهاز الهضمي للبشر3.
في البيئات الزراعية ، واستراتيجية المكافحة البيولوجية القائمة على phage هو الاستخدام العلاجي للphages للسيطرة على مسببات الأمراض البكتيرية. الضوابط البيولوجية Phage مقبولة جيدا كتكنولوجيا خضراء ، فعالة في إزالة التلوث من مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية (على سبيل المثال ، شيغا - السم المنتجة الإشريكية القولونية (STEC) ، السالمونيلا ، والليستيريا) في مختلف foods4،5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام ال phages كمطهرات لتطهير أسطح تجهيز الأغذية والجلود الحيوانية، والتي يمكن دمجها في النظم التقليدية المضادة للميكروبات (مثل المواد الكيميائية والبخار وبسترة المياه الساخنة) لتعزيز النتائج المرجوة والحد من الآثار البيئية. استخدام phages للحد من البكتيريا الحيوانية في الحيوانات واعدة أيضا1. ومع ذلك، هناك حاجة إلى التصدي للتحديات التقنية لتحسين النتائج الناجمة عن نهج المكافحة البيولوجية للغذاء لتطبيقها شعبيا في نظم إنتاج الأغذية المتنوعة. التحدي الرئيسي هو ضعف فعالية phages بسبب تطور المسوخ المقاومة للبكتيريا5 والتغيرات في فسيولوجيا البكتيريا بسبب التعرض للضغوط البيئية6.
للتقليل إلى أدنى حد من خطر مقاومة phage، يقترح تناول كوكتيلات phage (أي مزيج من ال phages متعددة) وتحسين فاعلية التحكم الحيوي في الزراعة وتربية الأحياء المائية.7 ومع ذلك ، من عدة دراسات ، فقد ثبت أن الكوكتيلات phage لم تقدم دائما فعالية أفضل من إدارة phage واحد. على سبيل المثال ، كان مزيج من 3 phages تشبه T4 نطاق مضيف أضيق ضد سلالات الإشريكية القولونية8. وعلاوة على ذلك، كان AKFV33، وهو عضو في فيروس التكينتا، أكثر فعالية من مزيج من أربعة phages في إزالة E. coli O157 من لحوم البقر، على الرغم من درجات حرارة الحضانة المطبقة4. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أن فعالية phages الفردية لا تتوقع فعالية كوكتيلات phage للسيطرة على O1579 ، حيث يمكن أن تغير التفاعلات بين phages متعددة الفعالية. والأهم من ذلك، أن العديد من العوامل، مثل أجناس الفياج وتركيباتها، والسلالات المستهدفة و MOIs، ودرجات حرارة الحضانة وأوقاتها، قد تؤثر على التفاعلات بين ال phages. لذلك ، فإن فحص مجموعات من ال phages بعناية ضد بكتيريا محددة لتقييم التآزر أو التيسير ، أو على الأقل لضمان الحد الأدنى من العداء في ظل ظروف بيئية محددة ، أمر بالغ الأهمية لتحقيق النتائج المثلى. هنا، يتم وصف طريقة لتقييم منهجي لفعالية تركيبات phage المختلفة ضد مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية في ظل مجموعة من الظروف البيئية. والفائدة من هذا النهج هو تمكين فحص جميع العوامل الحيوية والأحيائية المحتملة المتوقع أن تؤثر على الفعالية المضادة للبكتيريا من phages في البيئات الطبيعية. في البروتوكول ، يتم استخدام STEC O157 وphages المصابة كمثال.
Protocol
1. إعداد العازلة والكواشف
- جعل 500 مل من مرق الصويا tryptic (TSB) (15 غرام من مسحوق TSB و 500 مل من المياه فائقة الشراء) وautclave.
ملاحظة: يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. - جعل 500 مل من أجار الصويا tryptic (TSA) (20 غرام من مسحوق TSA و 500 مل من المياه فائقة البور) وautclave.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. - جعل 500 مل من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS; 4 غرام من NaCl, 0.1 غرام من KCl, 0.77 غرام من Na2HPO4, و 0.12 غرام من KH2PO4, 500 مل من المياه فائقة الشراء), قياس وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 ± 0.2 في 25 درجة مئوية وautclave.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. - جعل 200 مل من 1 M MgSO4 (49.294 غرام و 200 مل من المياه فائقة البور) وتعقيم عن طريق مرشح البولي إيثرسولفون 0.22 ميكرومتر.
- جعل 500 مل من TSB مع 10 M MGSO4 (mTSB; 15 غرام من مسحوق TSB, 500 مل من المياه فائقة البور, و 5 مل من 1 M MgSO4) وautclave; السماح للوسائط autoclaved بارد لدرجة حرارة الغرفة. تطبيق تقنية العقيم. باستخدام ماصة المصلية، ونقل بعناية 5.0 مل من 1 M MgSO4؛ دوامة بلطف لخلط.
2. إعداد الثقافة البكتيرية
- لإعداد زراعة مختبر البحوث البكتيرية (BRLC)، قم بإزالة قارورة (قارورة) مخزون الجلسرين من مخزون الفريزر ونقلها إلى المختبر.
- استخدام حلقة التطعيم المتاح أو ما يعادلها، وتراجع في القارورة، وإزالة كشط inoculum (طين المجمدة)، ومكلمة على لوحة TSA أو ما يعادلها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المستوى الثاني. احتضان اللوحة عند 37 ± 2 درجة مئوية لمدة 15−18 ساعة.
- حقيبة لوحات BRLC المعدة وتخزينها في 4 °C.
ملاحظة: فترة انتهاء الصلاحية العامة لBRLC: 14 يوما عند 4 درجات مئوية بعد جيل. - تلقيح مستعمرة واحدة من كل سلالة E. coli O157 من لوحات BRLC ليتم اختبارها في 10 مل من TSB واحتضان ثابت في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة للوصول إلى 9 log10 CFU / مل.
- إعداد تخفيف المسلسل من الثقافات بين عشية وضحاها (في صباح اليوم التالي)، كل سلالة O157 القولونية E. باستخدام mTSB تحتوي على 10 mM من MgSO4 لتحقيق 4-5 log10 CFU /ml (أو غيرها من مستوى inoculum المطلوب).
- مزيج حجم متساو من ثقافة بين عشية وضحاها من كل سلالة لتحقيق 4-5 log10 CFU / مل في المجموع (أو على النحو المطلوب) لإعداد الخليط البكتيري.
- ضع على الفور الثقافة البكتيرية المخففة عند 4 درجة مئوية للاستخدام المعلق.
- تمييع ثقافة inoculum 10 أو 100 أضعاف ولوحة 0.1 مل aliquots من هذه التخفيفات على لوحات TSA للحصول على المستعمرات المعزولة.
3. إعداد حلول العمل phage
- نشر مخزونات العمل عالية التأر لكل phage ليتم فحصها (≥108 PFU/mL) باتباع الطرق القياسية4.
ملاحظة: فترة انتهاء الصلاحية العامة للمخزونات phage هو 3 أشهر في زجاجة بلاستيكية في 4 درجة مئوية بعد جيل. - لتحقيق titer المطلوب من، على سبيل المثال، ~ 108 PFU / مل لحركية تحلل، تمييع الاستعدادات phage الفردية مع mTSB تحتوي على 10 mM من MgSO4. إعداد الكوكتيلات phage عن طريق خلط كميات متساوية من كل مخزون العمل مع نفس titer في جميع التركيبات الممكنة.
4. إعداد الحركية في المختبر تحلل لالكوكتيلات phage الفردية وphage
- إعداد المسلسل 10 أضعاف التخفيف من كل phages في الأعمدة 1-8 في لوحات صغيرة معقمة 96 جيدا لإعداد المقايسة microplate.
ملاحظة: يمكن اختبار أربعة phages ضد سلالة بكتيرية واحدة في مكررة، في الأعمدة المجاورة، على كل لوحة. الأعمدة الأربعة المتبقية هي لعناصر التحكم التي هي بدون phage، وكذلك mTSB فارغة (الشكل 1). - ضع 180 ميكرولتر من mTSB إلى الآبار من الأعمدة من 1 إلى 12 من اللوحة الدقيقة ذات 96 بئرا.
- إضافة 20 ميكرولتر من phages الفردية المخفف أو الكوكتيلات phage (~ 108 PFU / مل) إلى الآبار 1-8 من الصف العلوي من لوحة صغيرة (الصف A).
- للتحكم الخالي من ال phage و Blank، أضف 20 ميكرولتر من mTSB إلى البئر العلوي للأعمدة 9 و10 و11.
- مع ماصة من 12 قناة، تمييع أسفل لوحة. نقل 20 ميكرولتر من صف إلى صف. امزج محتويات البئر عن طريق الطموح اللطيف والمتكرر والقذف (خمس مرات على الأقل) وتغيير النصائح بين التخفيفات. إزالة 20 ميكرولتر من الصف الأخير (الصف H).
ملاحظة: ينصح باستخدام تلميحات مع مرشحات لمنع التلوث المتبادل. - إعداد خزان لكل سلالة، واستخدام ماصة 1 مل لنقل 2-3 مل من الثقافة المخففة في الخزان. للأعمدة 1-10، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 20 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية المخففة إلى كل بئر. تغيير النصائح بين كل إضافة.
- تغطية واحتضان اللوح الدقيق في الظروف المطلوبة (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعة أو 22 درجة مئوية لمدة 22 ساعة).
- عند 2 ساعة أو أي فواصل زمنية أخرى مرغوبة، قم بإزالة اللوحات الدقيقة من الحاضنة.
5. تحديد الكثافة البصرية
- فحص للكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600nm) باستخدام قارئ Microplate.
ملاحظة: ينصح بإعداد وحفظ بروتوكول الفحص في البرنامج قبل إعداد لوحة الاختبار. - تشغيل قارئ microplate وفتح البرنامج.
- حدد الوضع البسيط في إطار خيارات بدء التشغيل وحدد إنشاء بروتوكول جديد في إدارة المهام (الشكل التكميلي 1a، b).
- من نافذة تحديد نوع اللوحة ، اختر 96 Well Plate من القائمة المنسدلة (الشكل التكميلي 2).
- حدد الامتصاص لطريقة الكشف، وخيار Endpoint/Kinetic لنوع القراءة، وMonochromators لنوع البصريات. انقر على موافق (الشكل التكميلي 3).
- لقراءة الخطوة، أدخل 600 نانومتر للأطوال الموجية وحدد عادي لسرعة القراءة. انقر على موافق (الشكل التكميلي 4).
- لضبط درجة الحرارة للمقايسة، انقر على خانة الاختيار حضانة وحدد حاضنة على. أدخل درجة الحرارة المطلوبة في مربع درجة الحرارة . انقر على موافق. لمنع التكثيف على غطاء اللوحة أثناء الحضانة، قم بتعيين تدرج درجة الحرارة بإدخال قيمة (1-3) في مربع التدرج . انقر على موافق (الشكل التكميلي 5a).
ملاحظة: انقر على خانة الاختيار "سخن قبل المتابعة مع الخطوة التالية " لدرجة حرارة الحضانة 37 درجة مئوية. هذه الخطوة غير مطلوبة لحالة الاختبار عند 22 درجة مئوية (RT). - بعد ذلك، انقر على خانة الاختيار الحركية لفتح الإعداد الحركي. حدد وقت التشغيل لمدة 10 ساعة لاحتضان 37 درجة مئوية أو 22 ساعة ل RT. أدخل 2 ساعة للفاصل الزمني للقراءة. انقر على موافق (الشكل التكميلي 5ب).
- انقر على خانة الاختيار اهتزاز في إطار الإجراء لإعداد حالة اهتزاز، إذا لزم الأمر، لكل قراءة الحركية (الشكل التكميلي 6a).
- حدد الخطي لأوضاع اهتزاز وتغيير المدة إلى 30 s. تعيين قيمة التردد الخطي إلى 731 cpm (2 مم)، ثم انقر فوق موافق (الشكل التكميلي 6b).
- في إطار "حوار ملخص البروتوكول "، انقر فوق تخطيط لوحة وحدد الفراغات وعناصر التحكم في المقايسة والعينات. انقر على التالي (الشكل التكميلي 7).
ملاحظة: أدخل 1 في عدد أنواع التحكم المختلفة للتحكم السالب. - بعد تحديد إعدادات كل نوع جيد، انقر على إنهاء.
- حدد معرف جيد في واجهة الجانب الأيسر، ثم قم بتعيينه إلى المصفوفة الموضحة في أرملة تخطيط اللوحة. انقر على موافق (الشكل التكميلي 8).
- انقر على زر قراءة لوحة وحفظ البروتوكول كملف .prt وانقر على حفظ (الشكل التكميلي 9).
- إدراج لوحة وانقر على موافق.
- بمجرد الانتهاء من التجربة، حفظ التجربة كملف .xpt وانقر على حفظ (الشكل التكميلي 10).
- تصدير البيانات إلى Excel بالنقر فوق الزر نعم في مربع إطار الرسالة لمزيد من التحليل (الشكل التكميلي 11).
- انقر على الاختيار حفظ نعم/لا وخانة عدم السؤال مرة أخرى لحفظ التفضيل.
6. تحليلات البيانات
- كرر تجربتين مستقلتين على الأقل كما هو موضح أعلاه. تجميع النتائج من جميع التجارب المستقلة. حساب متوسط الانحراف المعياري ل OD600 من كل ثقافة phage-المعالجة و-free.
- تنفيذ الجذر التربيعي لقيم OD في 600 نانومتر وتحليلها باستخدام نموذج إحصائي مناسب لكل سلالة بكتيرية ودرجة الحرارة.
ملاحظة: بالنسبة لبرنامج SAS، يتم تحديد الطراز Mixed والمربعات الأقل للتمييز بين الوسائل (P < 0.05). لكل سلالة، قم بتعيين لوحات A−G لكل علاج phage تختلف فيه الفعالية الشاملة المضادة ل O157 عبر الزمن وMOIs (P < 0.05). - تحديد فعالية phage متفوقة على أساس قيمة OD600nm ≤ 0.01 المقابلة لنمو البكتيريا لا يمكن الكشف عنها (حد الكشف: 300 CFU / مل).
- تحليل آثار الوقت ودرجة حرارة الحضانة وسلالات E. coli O157 و MOIs وأنواع phage على فعالية phage باستخدام نموذج إحصائي مناسب.
ملاحظة: بالنسبة لبرنامج SAS، استخدم GLIMMIX مع مقاييس عشوائية. - حساب نسب الاحتمالات لمقارنة فعالية متفوقة لمختلف العوامل البيئية والبيولوجية ذات الفائدة.
- تحليل آثار الوقت ودرجة حرارة الحضانة وسلالات E. coli O157 و MOIs وأنواع phage على فعالية phage باستخدام نموذج إحصائي مناسب.
Representative Results
بعد البروتوكول، تم إجراء مقارنة بين فعالية phage المضادة O157 مع تركيبات phage المختلفة ودرجات الحرارة والأوقات وMOIs. يتم عرض آثار درجة حرارة الحضانة وأوقاتها، MOIs، phages، والسلالات البكتيرية المستخدمة في تعزيز فعالية O157 المضادة للكولاي في الجدول 1 (جدول نسبة الاحتمالات)9. تم تحليل النسبة المئوية (٪) لقياس العكر البصري ≤ 0.01 الناتجة عن كل إعداد phage تحت كل حالة تجريبية. وبناء على هذا التحليل، تم تعظيم فعالية phage المضادة O157 بعد 14، 16، أو 18 ساعة من الحضانة عند 22 درجة مئوية (P < 0.001) و MOI = 1000 (P < 0.001)، مع 75٪ و 89٪ من نمو الثقافة المعالجة بالphage يتم تثبيطها تماما، على التوالي. بشكل عام ، من بين 11 إعدادا للفاج ، كان مزيج من T1 و T4 و rV5 أكثر فعالية (P < 0.05) ضد O157. بالإضافة إلى ذلك ، عبر درجات حرارة الحضانة ، والأوقات ، وMOIs ، وال phages اختبارها ، وتفاوتت الحساسية لphages ، مع سلالات O157 اختبارها مع سلالة CO281-31N كونها الأكثر حساسية (P < 0.001) و 3081 (P < 0.001) كونها أقل حساسية للphages.
لفهم الحركية القاتلة للفياج لكل سلالة بكتيرية تم اختبارها ، تم رسم قيمة OD600 مقابل كل وقت أخذ عينات ، MOIs ، وعلاج phage في كل درجة حرارة حضانة. تظهر النتائج التمثيلية من فعالية phages ضد E. coli O157 3081 عند 37 درجة مئوية في الشكل 2. ومن ضمان أن منحنى النمو للثقافة السيطرة خالية من phage أمر طبيعي قبل تقييم تثبيط منحنى النمو للثقافة phage المعالجة. ووفقا لل الشكل 2، فإن إدراج T4 أعاق تماما نمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية، في كل وقت أخذ عينات في وزارة الداخلية منخفضة إلى 1. ولمعرفة كيف منع phage نمو البكتيريا بمرور الوقت في درجات حرارة مختلفة، بغض النظر عن MOIs، تم رسم متوسط قيمة OD600nm من جميع MOIs (MOI > 0) مقابل كل وقت أخذ العينات وعلاج phage (الشكل 3). بالمقارنة مع 37 درجة مئوية، تم تعزيز فعالية قتل phage خاصة، على سبيل المثال، phages T4 و T1 + T4، أكثر من 22 درجة مئوية. 10- ويظهر في الجدول 2 والجدول 39 نهج آخر لتلخيص ومقارنة الفعالية الكلية لمكافحة O157 بين ال phages. تم متوسط قيمة OD600 من كل وقت أخذ العينات و MOI وفعالية phage المرتبة من أعلى (A) إلى أدنى (F: 37 درجة مئوية و D: 22 درجة مئوية). يسهل هذا الجدول تحديد أفضل علاج phage. فعلى سبيل المثال، بالنسبة للسلالة 3081، كانت ال phages T4 و T5 + T4 (اللوحة A) هي العلاج الأكثر فعالية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، في حين أنه بالإضافة إلى phage T4، كانت phages T1 + T4 و T4 + rV5 و 4 كوكتيلات phage (لوحة A) العلاج الأكثر فعالية عند 22 درجة مئوية.
هذا البروتوكول أيضا مكنتنا من مقارنة فعالية phage ضد مختلف السلالات البكتيرية المستهدفة وتخصيص إعداد phage. على سبيل المثال، عند اختيار phages، في 37 درجة مئوية، باستثناء سلالة 3081، كان phage T1 + T4 + rV5 الفعالية الأكثر أهمية ضد جميع السلالات الأخرى، بغض النظر عن أنواع phage الخاصة بهم. عند 22 درجة مئوية، كان الكوكتيل 4-phage الأكثر فعالية ضد جميع السلالات التي تم اختبارها. وقد أسفرت أفضل الأنظمة عن تحلل كامل (OD600 ≤ 0.01)، وهو ما يبرر فعالية فائقة محتملة في ظل ظروف تجريبية (الجدول 2 والجدول 3).
الشكل 1: التخطيط المقترح لل المقايسة الدقيقة 96 جيدا. يتم إعداد التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف من كل phage في الأعمدة 1-8 من لوحات صغيرة معقمة 96 جيدا. يمكن اختبار أربعة phages ضد سلالة بكتيرية واحدة في مكررة، في الأعمدة المجاورة، على كل لوحة. الأعمدة المتبقية هي لعناصر التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منحنيات النمو من E. coli O157 سلالة 3081 في 37 درجة مئوية تعامل ولا تعامل مع phages في كل MOIs. جمعت البيانات من تجربتين مستقلتين. أشرطة تقديم الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنيات النمو من E. coli O157 سلالة 3081 سلالات. (أ) منحنيات النمو في 37 درجة مئوية (B) منحنيات النمو في 22 درجة مئوية. يمثل كل منحنى ثقافات فردية ومختلطة ، تعامل ولا تعامل مع phages عبر MOIs. جمعت البيانات من تجربتين مستقلتين. أشرطة تقديم الخطأ القياسي للوضيع (مقتبس من Reference9 بإذن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: نسب الاحتمالات التي تقارن احتمال فعالية phage متفوقة ضد E. coli O157 في درجات حرارة الحضانة، وأوقات الحضانة، MOIs، phages، وسلالات من E. coli O157 (مقتبس من Reference9 بإذن).
الجدول 2: فعالية ال phage الشاملة ضد E. coli O157 عند 37 درجة مئوية (مقتبسة من Reference9 بإذن).
الجدول 3: فعالية phage الشاملة ضد E. coli O157 عند 22 درجة مئوية (مقتبسة من Reference9 بإذن).
الأرقام التكميلية 1-11: لقطات من عملية القارئ microplate والإجراءات. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
وصف هذا البروتوكول نهجا قويا لتقييم فعالية ال phage بشكل منهجي ضد مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية ، بما في ذلك STEC9 و Salmonella10. خطوة واحدة حاسمة هي عندما تمييع ثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا، وذلك باستخدام المتوسطة المبردة مسبقا والتلاعب في تخفيف مع دلو الجليد يوصي للحد من النمو البكتيري المحتمل. بالإضافة إلى ذلك ، تم إعداد تخفيف ال phage قبل تمييع الثقافة البكتيرية. 10- ووفرت خطوة التعداد 2-8 أرقاما فعلية من الأرقام البكتيرية لحساب وزارة الداخلية النهائية المطبقة. لإعداد phage، يستخدم عموما lysates phage الخام التي أعدتها phage مرشح المصابة في 4-6 ساعة من الثقافة البكتيرية. الخطوة الحاسمة المرتبطة بالعدوى phage هو دائما لاستخدام مخزون العمل phage أعدت في غضون 3 أشهر. ماصة دقيقة للغاية (لا سيما عند استخدام ماصة متعددة القنوات) وتوحيد النهج ضرورية أيضا للحصول على نتائج قابلة للمقارنة وقابلة للتفسير. تم استخدام TSB المعدلة المكملة ب 10 مللي متر من Mg2 + لتخفيف ال phages ، والثقافة البكتيرية ، وقاعدة متوسطة لتحسين الامتزاز والعدوى من phages.
مع انتشار البكتيريا خلال مرحلة السجل ، حتى أقل من درجة حرارة الحاضنة ، يوصى باستخدام الثقافة المخففة بين عشية وضحاها بدلا من ثقافة مرحلة السجل ، لتقليل النمو البكتيري المحتمل.
البروتوكول المقترح له حدود. أولا، لأن اللوحة الدقيقة يمكنها حمل 200 ميكرولتر فقط، فإن الحضانة المطولة قد تسبب تبخرا كبيرا ولا يوصى بها. في هذه الحالة، قد لا يكون الفحص مناسبا للبكتيريا البطيئة النمو. ثانيا، لم يتمكن البروتوكول المقترح من رصد تضخيم ال phages. ثالثا، لم يتمكن هذا البروتوكول من رصد تطور مقاومة ال phage بمرور الوقت، وهو عامل حاسم يحدد نتيجة علاج phage11,12. ويلزم إجراء تجارب متابعة لتقييم الأداء الإضافي للكوكتيل الأكثر تأثيرا في الفحص في منع ظهور المسوخ المضادة للفياج في نظام واسع النطاق لثقافة المرق والمصفوفات البيولوجية الأخرى.
وعلى النقيض من مضادات الميكروبات التقليدية، تؤثر الطبيعة البيولوجية للفياج على تعقيد المكافحة البيولوجية والاستخدام العلاجي في البيئات العملية. تقليديا، ويستند الاختيار العقلاني من الكوكتيلات phage في المقام الأول على النشاط الليكي ومجموعة المضيف من phages. غالبا ما ينصح المرشحون Phage مع أقوى نشاط lytic وأوسع نطاق المضيف13،14. ومع ذلك ، استنادا إلى الدراسة الحالية ، فإن phages مثل rV5 و T1 ، على الرغم من أنها وحدها ليست خبيثة مثل T4 و T5 ، سهلت بشكل كبير النتيجة الإجمالية للتحكم البيولوجي عند دمجها مع T4 و / أو T5. وبالتالي ، لتحقيق فعالية فائقة من الكوكتيلات phage ، يوصى بالفحص المنهجي للنشاط المضاد للبكتيريا من تركيبات phage المحتملة ضد سلالات المضيف المستهدفة في ظل الظروف البيئية المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يمنع تحديد مستقبلات المرشحين phage وإدراج phages مع مستقبلات مختلفة المنافسة على مرفق المضيف ، وإحباط التطور السريع للمسوخ المضادة للفيج ، وتحسين نتائج التحكم الحيوي13.
مكنت هذه الطريقة من التحديد الكمي الدقيق حركية تحلل البلغ في شكل عالي الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التقييم المنهجي لمختلف العوامل البيولوجية والبيئية على فعالية مضادة للبكتيريا من مجموعة متنوعة من phages، وبالتالي تسهيل صياغة الكوكتيلات phage مع النتائج المثلى. ويفترض أن التطبيقات المستقبلية للطريقة وتطويرها تشارك في رصد فعالية كل phages داخل الكوكتيلات phage عن طريق وضع العلامات الفلورية من phages. وبالإضافة إلى البروتوكول المقترح، فإن فهم المحددات الجينية التي تعزز التآزر والآثار الميسرة بين ال phages عند المشاركة في إصابة مضيف واحد من شأنه أن يسهل صياغة كوكتيلات الفواج المناسبة ذات الفعالية الفائقة.
Disclosures
ويعلن المؤلفان أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية الكندي (منحة اكتشاف NSERC ، RGPIN-2019-04384) ، والمؤسسة الكندية للابتكار (المشروع رقم 38710) ، وصندوق الابتكار الرئيسي ، ألبرتا. نشكر الدكتور جون كاستيليك على تحرير المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essential supplies, reagents, and equipment | |||
| Inoculating loops | VWR | 12000-806 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 1374361 | MgSO4.7H2O |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | Diameter: 100 mm, sterile |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher | 10010023 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014405 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17013808 | |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014412 | |
| Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention | METTLER TOLEDO | 30389213 | |
| Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5 | METTLER TOLEDO | 17005860 | |
| Pipette Tips SR LTS 300µL 768A/4 | METTLER TOLEDO | 17005867 | no filter |
| Reservoir | METTLER TOLEDO | 89094-662 | |
| Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids | Fisher | 168055 | |
| Tryptic soy agar (TSA) | Sigma | 105458-0500 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | Sigma | 105459-0500 | |
| T-Shaped Cell Spreaders | VWR | 76299-566 | |
| Instruments | |||
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Compact Microbiological Incubators | Fisher | 50125590H | |
| Magnetic Stirrer Hotplates | FIsher | 13-889-335 | |
| Polygon Stir Bars | FIsher | 14-512-125 | length: 20 mm |
| Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader | Fisher | BTNEO2M | |
| Software | |||
| SAS | SAS Institute | 9.4 |
References
- Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections. Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).
- Czaplewski, L., et al. Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review. The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).
- Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Liu, H., et al. Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages. Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).
- Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), (2018).
- Ly-Chatain, M. H. The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy. Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).
- Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture. Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).
- Bourdin, G., et al. Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails. Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157. Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures. Virology Journal. 17, 3 (2020).
- Brüssow, H. What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine. Virology. 434 (2), 138-142 (2012).
- Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. Phage cocktails and the future of phage therapy. Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).
- Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Bacteriophage therapy: developments and directions. Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135 (2020).
- Niu, Y. D., et al. Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).
