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Immunology and Infection

खाद्यजनित रोगजनकों के बायोकंट्रोल के लिए बैक्टीरियोफेज प्रभावशीलता उच्च-थ्रूपुट सेटिंग्स के माध्यम से मूल्यांकन किया गया

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62812
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Ecosystem and Public Health, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary

Summary

यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियोफेज कॉकटेल की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता को स्क्रीन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन करता है।

Abstract

बैक्टीरियल रोगजनकों लगातार दुनिया भर में खाद्य सुरक्षा प्रणालियों को चुनौती देते हैं। गर्मी और सैनिटाइजर-प्रतिरोधी बैक्टीरिया के उद्भव के बारे में बढ़ती चिंताओं के साथ, उपन्यास जीवाणुरोधी एजेंटों की तत्काल आवश्यकता है। एक बैक्टीरियोफेज-आधारित बायोकंट्रोल रणनीति कृषि सेटिंग्स में जीवाणु रोगजनकों को नियंत्रित करने के लिए फेज का चिकित्सीय उपयोग है। फेज बायोकंट्रोल को तेजी से एक स्थायी तकनीक के रूप में स्वीकार किया जाता है, जो खाद्य जनित रोगजनकों को दूषित करने में प्रभावी है। प्रभावी जैव नियंत्रण परिणामों को सुनिश्चित करने के लिए, आवश्यक पर्यावरणीय परिस्थितियों में लक्षित बैक्टीरिया के खिलाफ फेज संयोजनों की व्यवस्थित स्क्रीनिंग महत्वपूर्ण है। फेज कॉकटेल की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता फेज जेनेरा और संयोजन, लक्षित जीवाणु उपभेदों, संक्रमण की बहुलता, तापमान और समय से प्रभावित हो सकती है। बेहतर प्रभावकारिता के साथ एक फेज कॉकटेल तैयार करने के लिए, प्रस्तावित विधि लक्षित परिस्थितियों में खाद्यजनित जीवाणु रोगजनकों को मारने में व्यक्तिगत फेज और फेज कॉकटेल की प्रभावशीलता का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करना था। वांछित तापमान और अवधि पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर बैक्टीरियल हत्या प्रभावकारिता की निगरानी की गई थी। सुपीरियर फेज प्रभावकारिता को जीवाणु विकास के पूर्ण निषेध द्वारा निर्धारित किया गया था। प्रस्तावित विधि बेहतर जीवाणुरोधी प्रभावकारिता के साथ फेज कॉकटेल तैयार करने की सुविधा के लिए एक मजबूत, साक्ष्य-आधारित दृष्टिकोण है।

Introduction

बैक्टीरियोफेज (फेज) वायरस हैं जो स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया कोशिकाओं पर आक्रमण करते हैं, बैक्टीरिया चयापचय को बाधित करते हैं और बैक्टीरिया के लाइसिस का कारण बनते हैं। पारंपरिक रोगाणुरोधी (जैसे, एंटीबायोटिक्स) के विपरीत, फेज होस्ट स्पेक्ट्रम अपेक्षाकृत संकीर्ण होते हैं, केवल बैक्टीरिया प्रजातियों या उपभेदों के लक्षित सेट को संक्रमित करने में सक्षम होते हैं और इस प्रकार माइक्रोबायोटा पर संपार्श्विक प्रभाव को कम करना चाहिए जो पशु और मानव स्वास्थ्य को लाभान्वित करते हैं। रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) के उदय के साथ, फेज और उनके डेरिवेटिव बैक्टीरिया के संक्रामक रोगों को नियंत्रित करने के लिए वैकल्पिक रोगाणुरोधी का कारण बनते हैं, जिसमें मनुष्यों और जानवरों में एएमआर जीवाणु संक्रमण शामिल हैं1,2। फेज ने >20 जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ चिकित्सीय क्षमता की पुष्टि की है जो सतही संक्रमण और ऊपरी श्वसन प्रणाली और मनुष्यों के जठरांत्र संबंधी मार्ग के संक्रमण का कारण बनते हैं3।

कृषि सेटिंग्स में, एक फेज-आधारित बायोकंट्रोल रणनीति जीवाणु रोगजनकों को नियंत्रित करने के लिए फेज का चिकित्सीय उपयोग है। फेज बायोकंट्रोल को एक हरी तकनीक के रूप में अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है, जो खाद्य जनित रोगजनकों (उदाहरण के लिए, शिगा-विष उत्पादन एस्चेरिचिया कोलाई (एसटीईसी), साल्मोनेला और लिस्टेरिया) को विभिन्न खाद्य पदार्थों में विघटित करने में प्रभावी है4,5। इसके अलावा, खाद्य प्रसंस्करण सतहों और जानवरों की खाल को कीटाणुरहित करने के लिए फेज का उपयोग सैनिटाइजर के रूप में किया जा सकता है, जिसे वांछित परिणामों को बढ़ाने और पर्यावरणीय प्रभावों को कम करने के लिए पारंपरिक रोगाणुरोधी प्रणालियों (जैसे, रसायनों, भाप और गर्म पानी के पास्चुरीकरण) में एकीकृत किया जा सकता है। जानवरों में जूनोटिक बैक्टीरिया को कम करने के लिए फेज का उपयोग भी आशाजनक है। हालांकि, विभिन्न खाद्य उत्पादन प्रणालियों में लोकप्रिय रूप से लागू किए जाने वाले फेज बायोकंट्रोल दृष्टिकोण से परिणामों में सुधार करने के लिए तकनीकी चुनौतियों को संबोधित करने की आवश्यकता है। मुख्य चुनौती बैक्टीरिया-प्रतिरोधी म्यूटेंट 5 के विकास के कारण फेज की बिगड़ा प्रभावशीलता और पर्यावरणीय तनावों के संपर्क में आने के कारण जीवाणु शरीर विज्ञान में परिवर्तन है6।

फेज प्रतिरोध के जोखिम को कम करने के लिए, फेज कॉकटेल (यानी, कई फेज का संयोजन) प्रस्तावित हैं और कृषि और एक्वाकल्चर सेटिंग्स में बायोकंट्रोल शक्ति में सुधार हुआ है। हालांकि, कई अध्ययनों से, यह साबित हो गया है कि फेज कॉकटेल हमेशा एक ही फेज के प्रशासन की तुलना में बेहतर प्रभावशीलता प्रदान नहीं करता था। उदाहरण के लिए, 3 टी 4-जैसे फेज के कॉकटेल में ई कोलाई उपभेदों 8 के खिलाफ एक संकीर्ण मेजबान सीमा थी। इसके अलावा, AkFV33, Tequintavirus के एक सदस्य, गोमांस से ई कोलाई O157 को हटाने में चार फेज के कॉकटेल की तुलना में अधिक प्रभावकारिता थी, इनक्यूबेशन तापमान लागू होने के बावजूद। हाल ही में, यह बताया गया है कि व्यक्तिगत फेज की प्रभावशीलता O1579 के नियंत्रण के लिए फेज कॉकटेल की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी नहीं करती है, क्योंकि कई फेज के बीच बातचीत प्रभावकारिता को बदल सकती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, कई कारक, जैसे फेज जेनेरा और संयोजन, लक्षित उपभेदों और एमओआई, और इनक्यूबेशन तापमान और समय, फेज के बीच बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, फेज तालमेल या सुविधा का आकलन करने के लिए विशिष्ट बैक्टीरिया के खिलाफ फेज के संयोजनों की सावधानीपूर्वक स्क्रीनिंग, या कम से कम विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों में न्यूनतम फेज विरोध सुनिश्चित करने के लिए, इष्टतम परिणामों के लिए महत्वपूर्ण रूप से महत्वपूर्ण है। यहां, पर्यावरणीय परिस्थितियों की एक श्रृंखला के तहत खाद्यजनित रोगजनकों के खिलाफ विभिन्न फेज संयोजनों की प्रभावकारिता का व्यवस्थित रूप से आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस दृष्टिकोण का लाभ प्राकृतिक सेटिंग्स में फेज की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी किए गए सभी संभावित जैविक और अजैविक कारकों की स्क्रीनिंग को सक्षम करना है। प्रोटोकॉल में, एसटीईसी O157 और उनके संक्रमित फेज को एक उदाहरण के रूप में नियोजित किया जाता है।

Protocol

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 500 मिलीलीटर ट्राइप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) (15 ग्राम टीएसबी पाउडर और 500 एमएल अल्ट्राप्योर पानी) और आटोक्लेव बनाएं।
    नोट: इसे कमरे के तापमान पर 3 महीने तक या 6 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 500 मिलीलीटर ट्राइप्टिक सोया अगर (टीएसए) (टीएसए पाउडर के 20 ग्राम और अल्ट्राप्योर पानी के 500 एमएल) और आटोक्लेव बनाएं।
    नोट: यह 3 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. फॉस्फेट बफ़र्ड सेलाइन (PBS; NaCl के 4 ग्राम, KCl के 0.1 ग्राम, Na2HPO4 के 0.77 ग्राम, और KH2PO4 के 0.12 ग्राम, अल्ट्राप्योर पानी के 500 मिलीलीटर) के 500 मिलीलीटर के 500 मिलीलीटर के फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (PBS; NaCl के 4 ग्राम, KCl के 0.1 ग्राम, Na2HPO4 के 0.77 ग्राम, और KH2PO4 के 0.12 ग्राम, अल्ट्राप्योर पानी के 500 मिलीलीटर) के 500 मिलीलीटर, मापने और 25 डिग्री सेल्सियस और आटोक्लेव पर 0.2 ± पीएच को समायोजित करें।
    नोट: यह 6 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
  4. 1 M MgSO4 (49.294 g और 200 mL ultrapure water) के 200 mL बनाएं और 0.22 μm polyethersulfone फ़िल्टर के माध्यम से स्टरलाइज़ करें।
  5. 10 mM MgSO4 (mTSB; TSB पाउडर के 15 ग्राम, अल्ट्राप्योर पानी के 500 mL, और 1 M MgSO4 के 5 mL) और आटोक्लेव के साथ TSB के 500 mL बनाओ; कमरे के तापमान के लिए autoclaved मीडिया ठंडा चलो. एसेप्टिक तकनीक को लागू करें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करते हुए, सावधानीपूर्वक 1 M MgSO4 के 5.0 mL स्थानांतरित करें; मिश्रण करने के लिए धीरे से घुमाएं।

2. जीवाणु संस्कृति की तैयारी

  1. बैक्टीरियल रिसर्च लेबोरेटरी कल्चर (बीआरएलसी) तैयार करने के लिए, फ्रीजर इन्वेंट्री से ग्लिसरॉल स्टॉक शीशी (ओं) को हटा दें और प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें।
  2. एक डिस्पोजेबल इनोक्यूलेशन लूप या समकक्ष का उपयोग करें, शीशी में डुबकी लगाएं, इनोकुलम (जमे हुए कीचड़) के स्क्रैपिंग को हटा दें, और एक स्तर II जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर एक टीएसए प्लेट या समकक्ष पर लकीर डालें। प्लेट को 37 ± 2 °C पर 15−18 h के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. तैयार BRLC प्लेटों बैग और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    नोट: BRLC के लिए सामान्य समाप्ति अवधि: पीढ़ी के बाद 4 °C पर 14 दिन।
  4. बीआरएल प्लेटों से प्रत्येक ई कोलाई O157 तनाव की एक एकल कॉलोनी को टीएसबी के 10 मिलीलीटर में परीक्षण करने के लिए और 9 लॉग 10 सीएफयू / एमएल तक पहुंचने के लिए 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से इनक्यूबेट करें।
  5. रात भर की संस्कृतियों (अगली सुबह) का एक सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें, प्रत्येक ई कोलाई O157 तनाव mTSB का उपयोग करके MgSO4 के 10 mM युक्त 4-5 log10 CFU / ml (या अन्य वांछित इनोकुलम स्तर) प्राप्त करने के लिए।
  6. बैक्टीरिया मिश्रण तैयार करने के लिए कुल (या वांछित के रूप में) में 4-5 log10 CFU / mL प्राप्त करने के लिए प्रत्येक तनाव की रातोंरात संस्कृति की एक समान मात्रा मिलाएं।
  7. लंबित उपयोग के लिए तुरंत पतला जीवाणु संस्कृति को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  8. अलग-थलग कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए टीएसए प्लेटों पर इन dilutions के इन dilutions के 10 या 100 गुना और प्लेट 0.1 mL एलीकोट को पतला करें।

3. फेज काम समाधान की तैयारी

  1. मानक विधियों का पालन करके प्रत्येक फेज (≥108 PFU / mL) की जांच के लिए उच्च-टिटर काम करने वाले स्टॉक का प्रचार करें।
    नोट: फेज स्टॉक के लिए सामान्य समाप्ति अवधि पीढ़ी के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लास्टिक की बोतल में 3 महीने है।
  2. के वांछित टिटर को प्राप्त करने के लिए, उदाहरण के लिए, lysis कैनेटीक्स के लिए ~ 108 PFU / mL, MTSB के साथ व्यक्तिगत फेज तैयारी को पतला करें जिसमें MgSO4 का 10 mM शामिल है। सभी संभव संयोजनों में एक ही टिटर के साथ प्रत्येक काम कर रहे स्टॉक के बराबर मात्रा में मिश्रण करके फेज कॉकटेल तैयार करें।

4. व्यक्तिगत फेज और फेज कॉकटेल के लिए इन-विट्रो लाइसिस कैनेटीक्स की तैयारी

  1. माइक्रोप्लेट परख स्थापित करने के लिए बाँझ 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में कॉलम 1-8 में प्रत्येक फेज के सीरियल 10 गुना dilutions तैयार करें।
    नोट: एक जीवाणु तनाव के खिलाफ चार फेज डुप्लिकेट में, आसन्न कॉलम में, प्रत्येक प्लेट पर परीक्षण किया जा सकता है। शेष चार कॉलम नियंत्रण के लिए हैं, जो फेज के बिना हैं, साथ ही एमटीएसबी रिक्त (चित्रा 1)।
  2. 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कॉलम 1 से 12 तक के कुओं के लिए एमटीएसबी के 180 μL रखें।
  3. माइक्रोप्लेट (पंक्ति ए) की शीर्ष पंक्ति के 1-8 कुओं में पतला व्यक्तिगत फेज या फेज कॉकटेल (~ 108 PFU / mL) के 20 μL जोड़ें।
  4. फेज-मुक्त और रिक्त नियंत्रण के लिए, कॉलम 9, 10 और 11 के शीर्ष कुएं में एमटीएसबी के 20 μL जोड़ें।
  5. एक 12-चैनल पिपेट के साथ, प्लेट को पतला करें। पंक्ति से पंक्ति में 20 μL स्थानांतरित करें. कोमल, बार-बार आकांक्षा, इजेक्शन (कम से कम पांच बार), और कमजोर पड़ने के बीच युक्तियों को बदलने से अच्छी तरह से सामग्री को मिलाएं। अंतिम पंक्ति (पंक्ति H) से 20 μL निकालें.
    नोट:: फ़िल्टर के साथ युक्तियों का उपयोग क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए अनुशंसित है।
  6. प्रत्येक तनाव के लिए एक जलाशय स्थापित करें, जलाशय में पतला संस्कृति के 2-3 मिलीलीटर को स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। कॉलम 1-10 के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से पतला जीवाणु संस्कृति के 20 μL जोड़ने के लिए एक multichannel पिपेट का उपयोग करें। प्रत्येक अतिरिक्त के बीच युक्तियाँ परिवर्तित करें.
  7. वांछित परिस्थितियों में माइक्रोप्लेट को कवर और इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस या 22 घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस)।
  8. 2 घंटे या अन्य वांछित अंतराल पर, इनक्यूबेटर से माइक्रोप्लेट्स को हटा दें।

5. ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण

  1. एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 600 एनएम (OD600nm) पर ऑप्टिकल घनत्व के लिए जांच करें।
    नोट: यह सेट अप करने के लिए और परीक्षण प्लेट तैयारी से पहले कार्यक्रम में परख प्रोटोकॉल को बचाने की सलाह दी जाती है।
  2. माइक्रोप्लेट रीडर को चालू करें और प्रोग्राम खोलें।
  3. स्टार्टअप विकल्प विंडो में सरल मोड का चयन करें और कार्य प्रबंधक (अनुपूरक चित्र1a,b) में एक नया प्रोटोकॉल बनाएँ का चयन करें।
  4. प्लेट प्रकार का चयन करें विंडो से, ड्रॉप-डाउन सूची (अनुपूरक चित्र2) से 96 वेल प्लेट चुनें।
  5. पता लगाने की विधि के लिए Absorbance , पठन प्रकार के लिए समापन बिंदु / काइनेटिक विकल्प, और प्रकाशिकी प्रकार के लिए मोनोक्रोमेटर्स का चयन करें। OK (Supplementary Figure 3) पर क्लिक करें।
  6. पठन चरण के लिए, तरंग दैर्ध्य के लिए 600 एनएम दर्ज करें और पढ़ने की गति के लिए सामान्य का चयन करें। OK (Supplementary Figure 4) पर क्लिक करें।
  7. परख के लिए तापमान सेट करने के लिए, इनक्यूबेट चेकबॉक्स पर क्लिक करें और इनक्यूबेटर ऑन का चयन करें। तापमान बॉक्स में वांछित तापमान दर्ज करें। OK पर क्लिक करें। इनक्यूबेशन के दौरान प्लेट ढक्कन पर संघनन को रोकने के लिए, ग्रेडिएंट बॉक्स में एक मान (1-3) दर्ज करके एक तापमान ग्रेडिएंट सेट करें। OK (Supplementary Figure 5a) पर क्लिक करें।
    नोट:: 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन तापमान के लिए अगले चरण चेकबॉक्स के साथ जारी रखने से पहले प्रीहीट पर क्लिक करें। यह चरण 22 °C (RT) पर परीक्षण स्थिति के लिए आवश्यक नहीं है।
  8. अगला, काइनेटिक सेटअप खोलने के लिए काइनेटिक चेकबॉक्स पर क्लिक करें। 37 °C इनक्यूबेशन के लिए 10 h या RT के लिए 22 h के लिए रन टाइम सेट करें। पठन अंतराल के लिए 2 h दर्ज करें। OK (Supplementary Figure 5b) पर क्लिक करें।
  9. शेक स्थिति सेट करने के लिए प्रक्रिया विंडो में शेक चेकबॉक्स पर क्लिक करें, यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक गतिज पढ़ने के लिए (पूरक चित्रा 6a)।
  10. शेक मोड के लिए रैखिक का चयन करें और अवधि को 30 s में परिवर्तित करें रैखिक आवृत्ति मान 731 सीपीएम (2 मिमी) पर सेट करें, और फिर ठीक (अनुपूरक चित्र6b) पर क्लिक करें।
  11. प्रोटोकॉल सारांश संवाद विंडो में, प्लेट लेआउट पर क्लिक करें और रिक्त स्थान, परख नियंत्रण, और नमूने का चयन करें। Next (Supplementary Figure 7) पर क्लिक करें।
    नोट:: नकारात्मक नियंत्रण के लिए विभिन्न नियंत्रण प्रकारों की संख्या में 1 दर्ज करें।
  12. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रकार के लिए सेटिंग्स को परिभाषित करने के बाद, समाप्त पर क्लिक करें।
  13. बाएं हाथ की ओर इंटरफ़ेस में एक अच्छी तरह से आईडी का चयन करें, और फिर इसे प्लेट लेआउट विधवा में दिखाए गए मैट्रिक्स को असाइन करें। OK (Supplementary Figure 8) पर क्लिक करें।
  14. प्लेट पढ़ें बटन पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल को .prt फ़ाइल के रूप में सहेजें और सहेजें (अनुपूरक चित्रा 9) पर क्लिक करें।
  15. प्लेट डालें और ठीक पर क्लिक करें।
  16. एक बार प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, प्रयोग को .xpt फ़ाइल के रूप में सहेजें और सहेजें (अनुपूरक चित्रा 10) पर क्लिक करें।
  17. आगे के विश्लेषण के लिए संदेश विंडो बॉक्स में हाँ बटन पर क्लिक करके Excel को डेटा निर्यात करें (अनुपूरक चित्र11).
  18. पसंद को बचाने के लिए सहेजें हाँ /नहीं चयन और फिर से मत पूछो चेकबॉक्स पर क्लिक करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. ऊपर वर्णित कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों को दोहराएं। सभी स्वतंत्र परीक्षणों से परिणामों को संकलित करें। प्रत्येक फेज-उपचारित और -मुक्त संस्कृति से OD600 के औसत और मानक विचलन की गणना करें।
  2. 600 एनएम पर ओडी मूल्यों के वर्गमूल का प्रदर्शन करें और प्रत्येक जीवाणु तनाव और तापमान के लिए एक उपयुक्त सांख्यिकीय मॉडल का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।
    नोट:: SAS सॉफ़्टवेयर के लिए, मिश्रित मॉडल और अंतर करने के लिए कम से कम वर्गों का मतलब है (P < 0.05) चयनित हैं। प्रत्येक तनाव के लिए, प्रत्येक फेज उपचार के लिए पैनलों A-G असाइन करें, जिनमें से समय और MOIs में समग्र विरोधी O157 प्रभावकारिता अलग-अलग थी (पी < 0.05)।
  3. OD600nm मान ≤ 0.01 के आधार पर बेहतर फेज प्रभावकारिता को परिभाषित करें जो कोई पता लगाने योग्य जीवाणु विकास (पता लगाने योग्य जीवाणु विकास की सीमा: 300 CFU / mL) के अनुरूप है।
    1. समय के प्रभावों का विश्लेषण करें, इनक्यूबेशन तापमान, ई कोलाई O157 उपभेदों, MOIs, और एक उपयुक्त सांख्यिकीय मॉडल का उपयोग कर फेज प्रभावकारिता पर फेज प्रकार।
      नोट:: SAS सॉफ़्टवेयर के लिए, यादृच्छिक उपायों के साथ GLIMMIX का उपयोग करें।
    2. ब्याज के विभिन्न पर्यावरणीय और जैविक कारकों के लिए बेहतर प्रभावकारिता की तुलना करने के लिए ऑड्स अनुपात की गणना करें।

Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, विभिन्न फेज संयोजनों, तापमान, समय और एमओआई के साथ एंटी-ओ 157 फेज प्रभावकारिता की तुलना की गई थी। इनक्यूबेशन तापमान और समय के प्रभाव, MOIs, फेज, और जीवाणु उपभेदों विरोधी ई कोलाई O157 प्रभावकारिता को बढ़ाने पर इस्तेमाल किया तालिका 1 (बाधाओं अनुपात तालिका) 9 में प्रस्तुत किया गया है। ऑप्टिकल टर्बिडिटी माप के प्रतिशत (%) ≤ 0.01 उपज का विश्लेषण प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के तहत प्रत्येक फेज तैयारी द्वारा किया गया था। इस विश्लेषण के आधार पर, एंटी-O157 फेज प्रभावकारिता को 22 डिग्री सेल्सियस (पी < 0.001) और एमओआई = 1000 (पी < 0.001) पर इनक्यूबेशन के 14, 16, या 18 घंटे के बाद अधिकतम किया गया था, जिसमें क्रमशः फेज-उपचारित संस्कृति के विकास का 75% और 89% पूरी तरह से बाधित किया गया था। सामान्य तौर पर, 11 फेज की तैयारियों के बीच, T1, T4 और rV5 का कॉकटेल O157 के खिलाफ सबसे प्रभावी (पी < 0.05) था। इसके अलावा, इनक्यूबेशन तापमान, समय, एमओआई और फेज का परीक्षण किया गया, फेज के प्रति संवेदनशीलता अलग-अलग थी, जिसमें O157 उपभेदों ने तनाव CO281-31N के साथ परीक्षण किया था, जो सबसे अधिक संवेदनशील (पी < 0.001) और 3081 (पी < 0.001) फेज के प्रति कम से कम संवेदनशील था।

परीक्षण किए गए प्रत्येक जीवाणु तनाव के फेज-हत्या कैनेटीक्स को समझने के लिए, OD600 मूल्य को प्रत्येक इनक्यूबेशन तापमान पर प्रत्येक नमूना समय, MOIs और फेज उपचार के खिलाफ प्लॉट किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई O157 3081 के खिलाफ फेज की प्रभावकारिता से प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2 में दिखाए गए हैं। यह सुनिश्चित किया जाता है कि फेज-मुक्त नियंत्रण संस्कृति का विकास वक्र फेज-उपचारित संस्कृति के विकास वक्र के निषेध का आकलन करने से पहले सामान्य है। चित्रा 2 के अनुसार, टी 4 के समावेश ने 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया के विकास को पूरी तरह से रोक दिया, प्रत्येक नमूना समय में एक एमओआई में 1 के रूप में कम। यह देखने के लिए कि कैसे फेज ने एमओआई के बावजूद विभिन्न तापमानों पर समय के साथ जीवाणु विकास को कैसे बाधित किया, सभी एमओआई (एमओआई > 0) से औसत औसत औसत OD600nm मूल्य को प्रत्येक नमूना समय और फेज उपचार (चित्रा 3) के खिलाफ प्लॉट किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस की तुलना में, विशेष फेज हत्या प्रभावकारिता, उदाहरण के लिए, फेज टी 4 और टी 1 + टी 4, को 22 डिग्री सेल्सियस से अधिक बढ़ाया गया था। फेज के बीच समग्र विरोधी O157 प्रभावशीलता को संक्षेप में प्रस्तुत करने और तुलना करने के लिए एक और दृष्टिकोण तालिका 2 और तालिका 39 में दिखाया गया है। OD600 मान प्रत्येक नमूना समय और MOI से औसत किया गया था और उच्चतम (ए) से सबसे कम (एफ: 37 डिग्री सेल्सियस और डी: 22 डिग्री सेल्सियस) तक फेज प्रभावकारिता को रैंक किया गया था। यह तालिका सबसे अच्छा फेज उपचार की पहचान की सुविधा प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, तनाव 3081 के लिए, फेज T4 और T5 + T4 (पैनल ए) 37 डिग्री सेल्सियस पर सबसे प्रभावी उपचार थे, जबकि फेज टी 4 के अलावा, फेज टी 1 + टी 4, टी 1 + टी 4 + आरवी 5, और 4 फेज कॉकटेल (पैनल ए) 22 डिग्री सेल्सियस पर सबसे प्रभावी उपचार थे।

इस प्रोटोकॉल ने हमें लक्षित विभिन्न जीवाणु उपभेदों के खिलाफ फेज प्रभावकारिता की तुलना करने और फेज तैयारी को अनुकूलित करने में भी सक्षम बनाया। उदाहरण के लिए, फेज का चयन करते समय, 37 डिग्री सेल्सियस पर, तनाव 3081 को छोड़कर, फेज टी 1 + टी 4 + आरवी 5 में उनके फेज प्रकारों की परवाह किए बिना, अन्य सभी उपभेदों के खिलाफ सबसे महत्वपूर्ण प्रभावशीलता थी। 22 डिग्री सेल्सियस पर, 4-फेज कॉकटेल परीक्षण किए गए सभी उपभेदों के खिलाफ सबसे प्रभावी था। सर्वश्रेष्ठ MOIs के परिणामस्वरूप पूर्ण lysis (OD600 ≤ 0.01) हुआ, जिसने प्रयोगात्मक परिस्थितियों (तालिका 2 और तालिका 3) के तहत संभावित बेहतर प्रभावकारिता की आवश्यकता थी।

Figure 1
चित्रा 1: 96-अच्छी तरह से microplate परख का सुझाव दिया लेआउट. प्रत्येक फेज के सीरियल 10-गुना dilutions बाँझ 96-अच्छी तरह से microplates के कॉलम 1-8 में तैयार कर रहे हैं। एक जीवाणु तनाव के खिलाफ चार फेज का परीक्षण डुप्लिकेट में, आसन्न स्तंभों में, प्रत्येक प्लेट पर किया जा सकता है। शेष स्तंभ नियंत्रणों के लिए हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ई कोलाई O157 तनाव 3081 के विकास घटता 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज किया और प्रत्येक MOIs पर फेज के साथ इलाज नहीं किया। डेटा को दो स्वतंत्र परीक्षणों से संकलित किया गया था। सलाखों मानक विचलन प्रस्तुत करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ई कोलाई O157 स्ट्रेन 3081 उपभेदों की वृद्धि वक्र( A) 37 °C पर विकास वक्र (B) 22 °C पर विकास वक्र। प्रत्येक वक्र व्यक्तिगत और मिश्रित संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करता है, जिसका इलाज किया जाता है और एमओआई में फेज के साथ इलाज नहीं किया जाता है। डेटा को दो स्वतंत्र परीक्षणों से संकलित किया गया था। सलाखों माध्य की मानक त्रुटि प्रस्तुत (अनुमति के साथ संदर्भ9 से अनुकूलित). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: ऑड्स अनुपात ई. कोलाई O157 के खिलाफ बेहतर फेज प्रभावकारिता की संभावना की तुलना इनक्यूबेशन तापमान पर, इनक्यूबेशन बार, MOIs, फेज, और ई. कोलाई O157 के उपभेदों (अनुमति के साथ संदर्भ9 से अनुकूलित) पर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: 37 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई O157 के खिलाफ समग्र फेज प्रभावकारिता (अनुमति के साथ संदर्भ9 से अनुकूलित)। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: 22 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई O157 के खिलाफ समग्र फेज प्रभावकारिता (अनुमति के साथ संदर्भ 9 से अनुकूलित)। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक आंकड़े 1-11: माइक्रोप्लेट रीडर ऑपरेशन और प्रक्रियाओं के स्नैपशॉट्स। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस प्रोटोकॉल ने एसटीईसी 9 और साल्मोनेला 10 सहित खाद्यजनित रोगजनकों के खिलाफ फेज प्रभावकारिता का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण का वर्णन किया। एक महत्वपूर्ण कदम यह है कि बैक्टीरिया की रातोंरात संस्कृति को पतला करना, पूर्व-ठंडा माध्यम का उपयोग करना और संभावित जीवाणु विकास को कम करने के लिए बर्फ की बाल्टी के साथ कमजोर पड़ने में हेरफेर करना। इसके अलावा, बैक्टीरिया की संस्कृति को पतला करने से पहले फेज कमजोर पड़ने को तैयार किया गया था। गणना चरण 2.8 ने लागू अंतिम MOI की गणना के लिए बैक्टीरियल इनोकुलम की वास्तविक संख्या प्रदान की। फेज की तैयारी के लिए, बैक्टीरियल संस्कृति के 4-6 ज में संक्रमित फिल्टर फेज द्वारा तैयार क्रूड फेज लिसेट का उपयोग आमतौर पर किया जाता है। फेज infectivity के साथ जुड़े महत्वपूर्ण कदम हमेशा 3 महीने के भीतर तैयार फेज काम स्टॉक का उपयोग करने के लिए है। अत्यंत सटीक पिपेटिंग (विशेष रूप से जब एक multichannel पिपेट का उपयोग कर) और दृष्टिकोण की एकरूपता भी तुलनीय और व्याख्या योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। संशोधित टीएसबी Mg2 + के 10 mM के साथ पूरक phages, जीवाणु संस्कृति, और आधार माध्यम पतला करने के लिए सोखना और फेज के संक्रमण का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

जैसा कि बैक्टीरिया लॉग चरण के दौरान फैलते हैं, यहां तक कि इनक्यूबेटर तापमान से नीचे भी, संभावित जीवाणु विकास को कम करने के लिए लॉग-फेज संस्कृति के बजाय पतला रातोंरात संस्कृति का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

प्रस्तावित प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं। सबसे पहले, क्योंकि माइक्रोप्लेट केवल 200 μL रख सकता है, लंबे समय तक इनक्यूबेशन पर्याप्त वाष्पीकरण का कारण बन सकता है और अनुशंसित नहीं है। इस मामले में, परख धीमी गति से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। दूसरा, प्रस्तावित प्रोटोकॉल फेज के प्रवर्धन की निगरानी करने में सक्षम नहीं था। तीसरा, यह प्रोटोकॉल समय के साथ फेज प्रतिरोध के विकास की निगरानी नहीं कर सका, एक महत्वपूर्ण कारक जो फेज उपचार 11,12 के परिणाम को निर्धारित करता है। अनुवर्ती प्रयोगों को एक व्यापक शोरबा संस्कृति प्रणाली और अन्य जैविक आव्यूहों में एंटी-फेज म्यूटेंट के उद्भव को रोकने में स्क्रीनिंग में सबसे प्रभावशाली कॉकटेल के आगे के प्रदर्शन का आकलन करने की आवश्यकता होती है।

पारंपरिक रोगाणुरोधी के विपरीत, फेज की जैविक प्रकृति व्यावहारिक सेटिंग्स में बायोकंट्रोल और चिकित्सीय उपयोग की जटिलता को प्रभावित करती है। परंपरागत रूप से, फेज कॉकटेल का तर्कसंगत चयन मुख्य रूप से लाइटिक गतिविधि और फेज की मेजबान सीमा पर आधारित है। सबसे मजबूत लिटिक गतिविधि और व्यापक मेजबान रेंज वाले फेज उम्मीदवारों को अक्सर 13,14 की सिफारिश की जाती है। हालांकि, वर्तमान अध्ययन के आधार पर, rV5 और T1 जैसे फेज, हालांकि अकेले T4 और T5 के रूप में विषैले नहीं हैं, T4 और / या T5 के साथ संयुक्त होने पर समग्र जैव नियंत्रण परिणाम की बहुत सुविधा प्रदान करते हैं। नतीजतन, फेज कॉकटेल की बेहतर प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए, वांछित पर्यावरणीय परिस्थितियों में लक्षित मेजबान उपभेदों के खिलाफ संभावित फेज संयोजनों की जीवाणुरोधी गतिविधि की प्रणालीगत स्क्रीनिंग की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, फेज उम्मीदवारों के लिए रिसेप्टर्स का निर्धारण और विभिन्न रिसेप्टर्स के साथ फेज को शामिल करने से मेजबान लगाव के लिए प्रतिस्पर्धा को रोका जा सकता है, एंटी-फेज म्यूटेंट के तेजी से विकास को विफल किया जा सकता है, और बायोकंट्रोल परिणामों में सुधार हो सकता है।

इस विधि ने एक उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में फेज लाइसिस कैनेटीक्स के सटीक परिमाणीकरण को सक्षम किया। इसके अलावा, इसने फेज के वर्गीकरण की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता पर विभिन्न जैविक और पर्यावरणीय कारकों के व्यवस्थित मूल्यांकन की अनुमति दी, जिससे अनुकूलित परिणामों के साथ फेज कॉकटेल के निर्माण की सुविधा मिलती है। विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों और विकास को फेज के प्रतिदीप्ति लेबलिंग द्वारा फेज कॉकटेल के भीतर प्रत्येक फेज की प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए सीटू में शामिल माना जाता है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के अलावा, आनुवांशिक निर्धारकों को समझना जो फेज के बीच सहक्रियात्मक और सुविधाजनक प्रभावों को बढ़ावा देते हैं जब एक मेजबान को सह-संक्रमित करते हैं, तो बेहतर प्रभावकारिता के साथ उपयुक्त फेज कॉकटेल के निर्माण की सुविधा होगी।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित संघर्ष के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

इस शोध को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC डिस्कवरी ग्रांट, RGPIN-2019-04384), नवाचार के लिए कनाडा फाउंडेशन (प्रोजेक्ट # 38710), और मेजर इनोवेशन फंड, अल्बर्टा द्वारा समर्थित किया गया था। हम पांडुलिपि के संपादन के लिए डॉ जॉन कास्टेलिक को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Essential supplies, reagents, and equipment
Inoculating loops VWR 12000-806
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 1374361 MgSO4.7H2O
Petri Dishes with Clear Lid Fisher FB0875713 Diameter: 100 mm, sterile
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher 10010023
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+ METTLER TOLEDO 17014405
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ METTLER TOLEDO 17013808
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014412
Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention METTLER TOLEDO 30389213
Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5 METTLER TOLEDO 17005860
Pipette Tips SR LTS 300µL 768A/4 METTLER TOLEDO 17005867 no filter
Reservoir METTLER TOLEDO 89094-662
Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids Fisher 168055
Tryptic soy agar (TSA) Sigma 105458-0500
Tryptic soy broth (TSB) Sigma 105459-0500
T-Shaped Cell Spreaders VWR 76299-566
Instruments
Analog Vortex Mixer Fisher 02-215-414
Compact Microbiological Incubators Fisher 50125590H
Magnetic Stirrer Hotplates FIsher 13-889-335
Polygon Stir Bars FIsher 14-512-125 length: 20 mm
Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader Fisher BTNEO2M
Software
SAS SAS Institute 9.4

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References

  1. Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections. Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).
  2. Czaplewski, L., et al. Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review. The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).
  3. Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  4. Liu, H., et al. Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages. Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).
  5. Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), (2018).
  6. Ly-Chatain, M. H. The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy. Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).
  7. Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture. Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).
  8. Bourdin, G., et al. Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails. Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).
  9. Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157. Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).
  10. Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures. Virology Journal. 17, 3 (2020).
  11. Brüssow, H. What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine. Virology. 434 (2), 138-142 (2012).
  12. Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. Phage cocktails and the future of phage therapy. Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).
  13. Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Bacteriophage therapy: developments and directions. Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135 (2020).
  14. Niu, Y. D., et al. Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 174
खाद्यजनित रोगजनकों के बायोकंट्रोल के लिए बैक्टीरियोफेज प्रभावशीलता उच्च-थ्रूपुट सेटिंग्स के माध्यम से मूल्यांकन किया गया
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Niu, Y. D., Hyun, J. E., Nguyen, N.… More

Niu, Y. D., Hyun, J. E., Nguyen, N. Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings. J. Vis. Exp. (174), e62812, doi:10.3791/62812 (2021).

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