Summary
このプロトコルは、バクテリオファージカクテルの抗菌効果をスクリーニングするためにハイスループット設定を使用するための堅牢な方法を記述します。
Abstract
細菌病原体は、世界中の食品安全システムに絶えず挑戦しています。熱および消毒剤耐性菌の出現に対する懸念が高まる中、新しい抗菌剤が緊急に必要とされている。バクテリオファージベースのバイオコントロール戦略は、ファージを治療的に使用して、農業の中で細菌病原体を制御することです。ファージバイオコントロールは、食品媒介病原体の除染に有効な持続可能な技術としてますます受け入れられています。効果的なバイオコントロールの結果を確実にするためには、必要な環境条件下で標的菌に対するファージの組み合わせの体系的スクリーニングが重要です。ファージカクテルの抗菌効果は、ファージ属および組み合わせ、標的菌株、感染の多重度、温度、および時間によって影響を受ける可能性がある。ファージカクテルを優れた有効性で処方するために、提案された方法は、標的条件下で食物媒介性細菌病原体を殺す際の個々のファージおよびファージカクテルの有効性を体系的に評価することであった。細菌の殺滅効果は、所望の温度および持続時間における光学密度を測定することによって監視された。優れたファージの有効性は、細菌の増殖を完全に阻害することによって決定された。提案された方法は、優れた抗菌効果を有するファージカクテルの処方を容易にする堅牢な、エビデンスベースのアプローチである。
Introduction
細菌(ファージ)は、細菌細胞に自然に侵入し、細菌の代謝を破壊し、細菌のリシスを引き起こすウイルスです。従来の抗菌薬(例えば、抗生物質)とは対照的に、ファージ宿主スペクトルは比較的狭く、標的セットの細菌種または株に感染することしかできないため、動物および人間の健康に利益をもたらす微生物叢への副次的影響を最小限に抑えるべきである。抗菌性(AMR)の上昇に伴い、ファージおよびその誘導体は、ヒトおよび動物におけるAMR細菌感染症を含む細菌感染症を制御するための代替抗菌剤につながります1,2。ファージは、ヒトの上気道および胃腸管の表面感染および感染を引き起こす>20の細菌病原体に対する治療可能性を確認した3。
農業の設定では、ファージベースのバイオコントロール戦略は、細菌病原体を制御するためのファージの治療的使用です。ファージバイオコントロールは、様々な食品中の食物媒介病原体(例えば、大腸菌、サルモネラ菌、リステリア菌を生産する滋賀毒素)を除染するのに有効なグリーン技術として好評を得ています4,5。さらに、ファージは、食品加工表面や動物の皮を消毒するために消毒剤として使用することができ、従来の抗菌システム(例えば、化学物質、蒸気、温水低温殺菌)に統合して、所望の結果を高め、環境への影響を低減することができます。動物の人獣共通感染症を減らすためにファージを使用することも有望である1.しかし、多様な食品生産システムに広く適用されるファージバイオコントロールアプローチの成果を改善するための技術的課題に対処する必要があります。主な課題は、細菌耐性変異体5の発生によるファージの有効性の障害と、環境ストストレスへの暴露による細菌生理学の変化である6。
ファージ耐性のリスクを最小限に抑えるために、ファージカクテル(すなわち、複数のファージの組み合わせ)が提案され、農業および養殖の設定におけるバイオコントロールの効力が向上している7。しかし、いくつかの研究から、ファージカクテルは、単一のファージの投与よりも常に良い有効性を提供しなかったことが証明されています。例えば、3 T4様ファージのカクテルは、大腸菌株8に対してより狭い宿主範囲を持っていた。さらに、テキンタウイルスのメンバーであるAKFV33は、インキュベーション温度が適用されたにもかかわらず、牛肉から大腸菌O157を除去する際に4ファージのカクテルよりも大きな有効性を有していた。近年、複数のファージ間の相互作用が有効性を変化させる可能性があるとして、個々のファージの有効性はO1579の制御のためのファージカクテルの有効性を予測しないことが報告されている。最も重要なことは、ファージ属および組み合わせ、標的型株およびMOI、およびインキュベーションの温度および時間のような多くの要因がファージ間の相互作用に影響を与える可能性がある。したがって、ファージの組み合わせを特定の細菌に対して慎重にスクリーニングしてファージの相乗効果やファシリテーションを評価したり、少なくとも特定の環境条件下でファージ拮抗を最小限に抑えるために、最適な結果を得るためには極めて重要です。ここで、様々な環境条件下で食物媒介病原体に対する種々のファージの組み合わせの有効性を体系的に評価する方法が記載されている。このアプローチの利点は、自然界におけるファージの抗菌効果に影響を与えると予測される、すべての可能な生物および非生物的因子のスクリーニングを可能にすることです。プロトコルでは、STEC O157およびそれらの感染ファージが例として用いられます。
Protocol
1. 緩衝液および試薬の調製
- トリプティック大豆ブロス(TSB)(TSBパウダー15g、超純水500mL)とオートクレーブを500mLにします。
注:これは、最大3ヶ月間室温で、または最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。 - トリプティック大豆寒天(TSA)(TSAパウダー20g、超純水500mL)とオートクレーブを500mLにします。
注:これは、最大3ヶ月間4°Cで保存することができます。 - リン酸緩衝生理食塩水500mL(PBS;NaClの4g、KClの0.1g、Na2HPO4の0.77g、KH2PO4の0.12g、超純水500mL)を測定し、25°Cで0.2±7.2に調整し、オートクレーブを調整します。
注:これは、最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。 - 1 M MgSO4 (49.294 g と 200 mL の超純水) を 200 mL にし、0.22 μm のポリエーテルサルホンフィルターで滅菌します。
- 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g の TSB 粉末、 500 mL の超純水、および 1 M MgSO4 の 5 mL) とオートクレーブを使用して、TSB の 500 mL を作ります。オートクレーブされたメディアを室温まで冷やします。無菌技術を適用します。血清学的ピペットを使用して、慎重に1 M MgSO4の5.0 mLを転送します。そっとぐるぐる回して混ぜます。
2. 細菌培養の準備
- 細菌研究所培養(BRLC)を準備するには、冷凍庫の在庫からグリセロールストックバイアルを取り除き、実験室に移します。
- 使い捨て接種ループまたは同等のものを使用し、バイアルに浸し、接種物(凍結スラッシュ)のスクレーピングを取り除き、TSAプレートまたはレベルII生物学的安全キャビネット内の同等のストリークを取り除きます。プレートを37±2°Cで15-18時間インキュベートします。
- 準備したBRLCプレートを袋に入れ、4°Cで保管してください。
注:BRLCの一般的な有効期限:生成後4°Cで14日。 - BrLCプレートから各 大腸菌 O157株の単一コロニーを接種し、TSBの10mLで試験し、37°Cで18時間静電気でインキュベートして9 log10 CFU/mLに達します。
- 一晩培養物の連続希釈を調製(翌朝)、各 大腸菌 O157株は、MgSO4 の10mMを含むmTSBを使用して4-5 log10 CFU/ml(または他の所望の接種レベル)を達成する。
- 各株の一晩培養物の等量を混合して、合計で4-5 log10 CFU/mLを達成し(または望む)細菌混合物を調製する。
- すぐに希釈した細菌培養物を4°Cに入れ、使用を保留します。
- これらの希釈液のイノキュラム培養液10または100倍及びプレート0.1mLのアリコートをTSAプレート上で希釈し、単離されたコロニーを得た。
3. ファージ作業ソリューションの調製
- 標準の方法4に従って、スクリーニングされるファージ(≥108 PFU/mL)の高力剤作業株を伝播する。
注:ファージストックの一般的な有効期限は、生成後4°Cのペットボトルで3ヶ月です。 - 所望の力素を達成するために、例えば、リシス動態に対する〜108PFU /mL、MgSO4の10mMを含有するmTSBで個々のファージ製剤を希釈する。可能なすべての組み合わせで同じツイターを持つ各作業ストックの等量を混合することによってファージカクテルを準備します。
4. 個々のファージおよびファージカクテルのための インビトロ リシス動態の調製
- 1~8列目の各ファージのシリアル10倍希釈液を無菌96ウェルマイクロプレートに準備し、マイクロプレートアッセイをセットアップします。
注:1つの細菌株に対する4つのファージは、各プレート上の隣接する列で重複してテストすることができます。残りの 4 つの列はコントロール用で、ファージなしのコントロールと mTSB ブランクが含まれています (図 1)。 - 96ウェルマイクロプレートの1~12列のウェルに180 μLのmTSBを配置します。
- マイクロプレートの一番上の行のウェル1〜8に希釈した個々のファージまたはファージカクテル(〜108 PFU/mL)を20μL加えます(行A)。
- ファージフリーおよびブランクコントロールの場合、20 μL の mTSB を列 9、10、および 11 の上部ウェルに追加します。
- 12チャンネルのピペットで、プレートを希釈します。20 μL を行から行へ転送します。穏やかで繰り返しの吸引、放出(少なくとも5回)、希釈間の先端を変えることによって、ウェル内容物を混ぜます。最後の行(行H)から20 μLを取り除きます。
注: クロス汚染を防ぐために、フィルターにチップを使用することをお勧めします。 - 各株のリザーバを設定し、1 mLピペットを使用して希釈培養液を2〜3mLのリザーバーに移します。列1~10の場合は、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈された細菌培養液を各ウェルに20μLずつ添加します。各追加の間のヒントを変更します。
- 必要な条件でマイクロプレートを蓋をしてインキュベートします(例えば、37°Cの場合は10時間、22°C)。
- 2時間または他の所望の間隔で、マイクロプレートをインキュベーターから取り出します。
5. 光学濃度の測定
- マイクロプレートリーダーを用いて、600 nm(OD600nm)で光学濃度を調べます。
注:テストプレートの準備の前に、プログラムにアッセイプロトコルを設定して保存することをお勧めします。 - マイクロプレートリーダーとオープンプログラムをオンにします。
- 「スタートアップ・オプション」ウィンドウで「簡易」モードを選択し、「タスク・マネージャーで新規プロトコルを作成する」を選択します (補足図 1a,b)。
- [ プレートタイプの選択] ウィンドウから、ドロップダウン リストから [96 ウェルプレート ]を選択します(補助図2)。
- 検出方法として [吸光度 ]、読み取りタイプの エンドポイント/キネティック オプション、光学タイプの モノクロータ を選択します。OK をクリックします(補足図3)。
- [読み取りステップ]に波長として 600 nm と入力し、読み取り速度として [標準 ] を選択します。OK をクリック します (補足図4)。
- アッセイの温度を設定するには、[ インキュベート ]チェックボックスをクリックし、[ インキュベーターオン]を選択します。[温度]ボックスに希望の 温度 を入力します。 [OK] をクリックします。インキュベーション中にプレート蓋の凝縮を防ぐには、[勾配]ボックスに値(1-3)を入力して温度 勾配 を設定します。OK をクリック します (補足図5a)。
注:37°Cインキュベーション温度の 次のステップを続行する前に、予熱 のチェックボックスをクリックしてください。このステップは22°C(RT)の試験条件には必要ない。 - 次に、[ キネティック ]チェックボックスをクリックして[キネティック設定]を開きます。37 °C インキュベーションの場合は 10 時間、RT の場合は 22 h の実行時間を設定します。OKをクリック します (補足図5b)。
- 「手順」ウィンドウの「振る」チェックボックスをクリックして、必要に応じて、各動読に対して振り分け条件を設定します(補足図6a)。
- [振度モードの 線形 ]を選択し、[時間]を[30 s]に変更し、[リニア周波数]の値を731 cpm(2 mm)に設定し、[ OK]を クリックします(補助図6b)。
- 「 プロトコルの要約ダイアログ」 ウィンドウで、「 プレートレイアウト 」をクリックし 、「ブランク」「アッセイコントロール」「サンプル」を選択します。 [次へ]を クリックします(補足図7)。
注: 負のコントロールの場合は、異なるコントロールタイプの数に 1 を入力します。 - 各井戸タイプの設定を定義したら、[完了]をクリック します。
- 左側のインターフェイスで Well ID を選択し、プレート レイアウトの未亡人に示されているマトリックスに割り当てます。OK をクリック します (補足図8)。
- [プレートの 読み取り ] ボタンをクリックし、プロトコルを .prt ファイルとして保存し、[ 保存 ] をクリックします (補助図 9)。
- プレートを挿入し、[OK]をクリック します。
- 実験が完了したら、実験を .xpt ファイルとして保存し、[ 保存 ] をクリックします (補助図 10)。
- 詳細な分析のために、メッセージ ウィンドウ ボックスの [はい ] ボタンをクリックして、データを Excel にエクスポートします (補足図 11)。
- [ はい/いいえ ]の選択と[ 再び確認しない ]チェックボックスをクリックして、設定を保存します。
6. データ分析
- 上記のように少なくとも2つの独立した実験を繰り返す。すべての独立した試験の結果をコンパイルします。各ファージ処理および-フリー培養からOD600 の平均と標準偏差を計算します。
- 600 nmでOD値の平方根を実行し、各細菌株および温度に適切な統計モデルを使用して分析します。
注: SAS ソフトウェアの場合、混合モデルと、平均を区別するための最小二乗 (P < 0.05) が選択されています。各株について、時間の経過とMOIの全体的な抗O157有効性が異なるファージ治療ごとにパネルA-Gを割り当てます(P < 0.05)。 - 検出可能な細菌増殖なし(検出限界:300 CFU/mL)に対応する0.01≤のOD600nm 値に基づいて優れたファージの有効性を定義します。
- 適切な統計モデルを用いて、時間、インキュベーション温度、 大腸菌 O157株、MOI、ファージタイプのファージ有効性に及ぼす影響を分析します。
注: SAS ソフトウェアの場合は、ランダムな対策で GLIMMIX を使用してください。 - オッズ比を計算して、目的の異なる環境および生物学的要因に対する優れた有効性を比較します。
- 適切な統計モデルを用いて、時間、インキュベーション温度、 大腸菌 O157株、MOI、ファージタイプのファージ有効性に及ぼす影響を分析します。
Representative Results
プロトコルに従い、抗O157ファージの有効性を様々なファージの組み合わせ、温度、時間、およびMOIと比較した。インキュベーション温度及び時間の影響、MOI、ファージ、及び抗大腸菌 O157有効性の増強に用いられる細菌株が 表1 (オッズ比表)9に示されている。得られた0.01≤光学濁度測定の割合(%)を各実験条件下のファージ調製物ごとに分析した。この分析に基づき、抗O157ファージの効力は、22°C(P <0.001)およびMOI=1000(P <0.001)で14、16、または18時間のインキュベーションの後に最大化され、ファージ処理培養物の成長の75%および89%がそれぞれ完全に阻害された。一般に、11ファージ製剤のうち、T1、T4、およびrV5のカクテルはO157に対して最も効果的であった(P <0.05)。さらに、インキュベーション温度、時間、MOI、およびファージ試験の間で、ファージに対する感受性は様々であり、CO281-31N株で試験されたO157株は最も感受性が高く(P <0.001)、3081(P <0.001)がファージに対して最も感受性が低い。
試験した各細菌株のファージ殺死動態を理解するために、各インキュベーション温度で各サンプリング時間、MOI、ファージ処理に対してOD600値をプロットした。37°Cで大腸菌O157 3081に対するファージの効力から得られた代表的な結果を図2に示す。ファージ処理培養の増殖曲線の阻害を評価する前にファージフリー対照培養の成長曲線が正常であることを保証する。図2によれば、T4を含めることは、37°Cでの細菌増殖を完全に阻害し、各サンプリング時間においてMOIで1以下である。様々な温度での経時の細菌増殖を阻害するファージを概説するために、MOIに関係なく、全てのMOI(MOI>0)から平均した平均OD600nm値を、各サンプリング時間およびファージ処理に対してプロットした(図3)。37°Cと比較して、特定のファージ殺死効性、例えば、ファージT4及びT1+T4は、22°C以上に増強された。 ファージ間の全体的な抗O157有効性を要約および比較する別のアプローチは、表2および表39に示されている。OD600値は、各サンプリング時間およびMOIから平均化し、ファージ効力を最高(A)から最低(F:37°CおよびD:22°C)にランク付けした。この表は最高のファージ処置の識別を促進する。例えば、株3081の場合、ファージT4およびT5+T4(パネルA)は37°Cで最も有効な治療であったのに対し、ファージT4、ファージT4、ファージT1+T4、T1+T4+rV5、および4ファージカクテル(パネルA)に加えて、22°Cで最も効果的な治療であった。
このプロトコルはまた、標的となる様々な細菌株に対してファージの有効性を比較し、ファージ製剤をカスタマイズすることを可能にしました。例えば、ファージを選択する場合、37°Cで、株3081を除いて、ファージT1+T4+rV5は、ファージタイプにかかわらず、他のすべての株に対して最も有意な有効性を有していた。22°Cでは、4ファージカクテルは、テストされたすべての株に対して最も効果的でした。最高のMOIは完全なリシス(OD600≤0.01)をもたらし、実験条件下での潜在的な優れた有効性を保証した(表2 および 表3)。
図1:96ウェルマイクロプレートアッセイの推奨レイアウト 各ファージのシリアル10倍希釈液は、無菌96ウェルマイクロプレートの列1〜8に調製される。1つの細菌株に対する4つのファージは、各プレート上の隣接する列で、重複して試験することができる。残りの列はコントロール用です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:大 腸菌 O157株3081の成長曲線を37°Cで処理し、各MOIでファージで処理していない。 データは2つの独立した試験からコンパイルされました。バーは標準偏差を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 大腸菌 O157株3081株の成長曲線 (A)37°Cでの成長曲線(B)22°Cでの成長曲線。 各曲線は、MOI全体でファージで処理され、治療されない個々の培養物と混合培養を表します。データは2つの独立した試験からコンパイルされました。バーは平均の標準誤差を示します(参照9 から権限を得て適応)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:インキュベーション温度、インキュベーション時間、MOI、ファージ、大腸菌O157株の 大腸菌 O157に対するファージ効果の高い可能性を比較するオッズ比(参照9からこの表をダウンロードするにはここをクリックしてください)。
表2: 37°Cで大腸菌O157に対する全体的なファージの有効性 (参照9から権限を得て適合)、この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
表3: 22°Cで大腸菌 O157に対する全体的なファージの有効性(参照9から権限を得て適合)、この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図1-11:マイクロプレートリーダー操作と手順のスナップショット。このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
Discussion
本プロトコルは、STEC9およびサルモネラ菌10を含む食物媒介病原体に対するファージの有効性を全身的に評価するための堅牢なアプローチを説明した。 1つの重要なステップは、細菌の一晩培養物を希釈する際に、冷やされた培地を使用し、氷のバケツで希釈を操作することが推奨される潜在的な細菌の増殖を最小限に抑えることが推奨される。また、ファージ希釈は、細菌培養液を希釈する前に調製した。列挙ステップ2.8は、適用された最終的なMOIの計算のための細菌接種の実際の数を提供した。ファージ調製のために、4〜6時間の細菌培養で感染した濾過ファージによって調製された粗ファージライセートが一般的に使用される。ファージ感染に関連する重要なステップは、常に3ヶ月以内に調製されたファージ作業ストックを使用することです。非常に正確なピペット(特にマルチチャンネルピペットを使用する場合)とアプローチの均一性は、同等かつ解釈可能な結果を得るためにも不可欠です。Mg2+の10 mMを添加した修飾TSBは、ファージの吸着および感染を最適化するためにファージ、細菌培養、および塩基培地を希釈するために使用された。
細菌が対数相中に増殖するにつれて、インキュベーター温度を下回っても、ログ相培養の代わりに希釈された夜間培養を使用して、潜在的な細菌増殖を最小限に抑えることを推奨する。
提案されたプロトコルには制限があります。まず、マイクロプレートは200μLしか保持できないため、長時間のインキュベーションは実質的な蒸発を引き起こす可能性があり、推奨されません。この場合、このアッセイは、成長の遅い細菌には適さない場合がある。第二に、提案されたプロトコルはファージの増幅を監視できなかった。第三に、このプロトコルは、ファージ治療11,12の結果を決定する重要な要因である経時のファージ耐性の発達を監視することができなかった。広範なブロス培養系および他の生物学的マトリックスにおける抗ファージ変異体の出現を防止するスクリーニングにおいて最も影響力のあるカクテルのさらなる性能を評価するために、フォローアップ実験が必要である。
従来の抗菌剤とは対照的に、ファージの生物学的性質は、バイオコントロールの複雑さと実用的な設定での治療的使用に影響を与えます。従来、ファージカクテルの合理的な選択は、主に、ファージの宿主範囲とのリンパ活性に基づく。最も強い精解活性および最も広い宿主範囲を有するファージ候補は、しばしば推奨される13,14。しかし、現在の研究に基づいて、rV5およびT1のようなファージは、T4およびT5ほど毒性はないが、T4および/またはT5と組み合わせると全体的なバイオコントロールの結果を大きく促進した。従って、ファージカクテルの優れた有効性を達成するために、所望の環境条件下で標的宿主株に対する潜在的ファージ組み合わせの抗菌活性の全身スクリーニングが推奨される。さらに、ファージ候補の受容体の決定および様々な受容体を含むファージの決定は、宿主の付着の競争を妨げ、抗ファージ突然変異体の急速な発達を妨げ、そしてバイオコントロールの転帰を改善する13。
この方法により、ファージライシスキネティクスをハイスループット形式で正確に定量化することが可能になりました。さらに、ファージの品揃えの抗菌効果に関する様々な生物学的および環境的要因の系統的評価を可能にし、それによって、最適化された結果を有するファージカクテルの処方を促進した。この方法の将来の用途と開発は、ファージの蛍光標識によってファージカクテル内の各ファージの有効性をその 際 に監視することに関与すると想定される。提案されたプロトコルに加えて、1つの宿主を共感染させるとファージ間の相乗的かつ容易な効果を促進する遺伝的決定因子を理解することは、優れた有効性を有する適切なファージカクテルの処方を促進するであろう。
Disclosures
著者らは、研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERCディスカバリーグラント、RGPIN-2019-04384)、カナダイノベーション財団(プロジェクト#38710)、アルバータ州主要イノベーション基金によって支援されました。原稿を編集してくれたジョン・カステリック博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essential supplies, reagents, and equipment | |||
| Inoculating loops | VWR | 12000-806 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 1374361 | MgSO4.7H2O |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | Diameter: 100 mm, sterile |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher | 10010023 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014405 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17013808 | |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014412 | |
| Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention | METTLER TOLEDO | 30389213 | |
| Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5 | METTLER TOLEDO | 17005860 | |
| Pipette Tips SR LTS 300µL 768A/4 | METTLER TOLEDO | 17005867 | no filter |
| Reservoir | METTLER TOLEDO | 89094-662 | |
| Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids | Fisher | 168055 | |
| Tryptic soy agar (TSA) | Sigma | 105458-0500 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | Sigma | 105459-0500 | |
| T-Shaped Cell Spreaders | VWR | 76299-566 | |
| Instruments | |||
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Compact Microbiological Incubators | Fisher | 50125590H | |
| Magnetic Stirrer Hotplates | FIsher | 13-889-335 | |
| Polygon Stir Bars | FIsher | 14-512-125 | length: 20 mm |
| Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader | Fisher | BTNEO2M | |
| Software | |||
| SAS | SAS Institute | 9.4 |
References
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