Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לשימוש בהגדרות תפוקה גבוהה כדי לסנן את היעילות האנטיבקטריאלית של קוקטיילים בקטריופאז '.
Abstract
פתוגנים חיידקיים מאתגרים ללא הרף מערכות בטיחות מזון ברחבי העולם. עם חששות גוברים לגבי הופעתם של חיידקים עמידים לחום וחיטוי, חומרים אנטיבקטריאליים חדשניים, נדרשים בדחיפות. אסטרטגיית ביו-שליטה מבוססת בקטריופאז' היא שימוש טיפולי בפאג'ים כדי לשלוט בפתוגנים חיידקיים בסביבה חקלאית. פלג ביו-שלון מקובל יותר ויותר כטכנולוגיה בת קיימא, יעילה בטיהור פתוגנים המועברים במזון. כדי להבטיח תוצאות ביו-שלון יעילות, הקרנה שיטתית של שילובי פאג' נגד חיידקים ממוקדים בתנאים סביבתיים נדרשים היא קריטית. יעילות אנטיבקטריאלית של קוקטיילים פאג 'עשוי להיות מושפע פוג'נדרה ושילוב, זנים חיידקיים ממוקדים, ריבוי של זיהום, טמפרטורה, וזמן. כדי לנסח קוקטייל פאג' עם יעילות מעולה, השיטה המוצעת הייתה להעריך באופן שיטתי את האפקטיביות של פאג'ים בודדים וקוקטיילים פאג 'בהריגת פתוגנים חיידקיים המועברים במזון בתנאים ממוקדים. יעילות ההרג החיידקי הייתה מנוטרת על ידי מדידת צפיפות אופטית בטמפרטורות ובמקופות הזמן הרצויות. יעילות פאג ' מעולה נקבעה על ידי עיכוב מוחלט של צמיחת חיידקים. השיטה המוצעת היא גישה חזקה ומבוססת ראיות כדי להקל על ניסוח קוקטיילים פאג 'עם יעילות אנטיבקטריאלית מעולה.
Introduction
בקטריופאג'ים (פאג'ים) הם וירוסים הפולשים באופן טבעי לתאי חיידקים, משבשים את חילוף החומרים החיידקי וגורמים לתסיסה של החיידק. בניגוד מיקרוביאלים קונבנציונליים (למשל, אנטיביוטיקה), ספקטרום המארח פאג 'צר יחסית, רק מסוגל להדביק קבוצה ממוקדת של מינים חיידקיים או זנים ולכן צריך למזער את ההשפעות המשניות על מיקרוביוטה לטובת בעלי חיים ובריאות האדם. עם עליית ההתנגדות מיקרוביאלית (AMR), פאג'ים ונגזרותיהם מובילים לאנטי מיקרוביאלים חלופיים לשליטה במחלות זיהומיות חיידקיות, כולל זיהומים חיידקיים AMR בבני אדם ובעלי חיים1,2. פאג'ים אישרו פוטנציאל טיפולי נגד >20 פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים שטחיים וזיהומים של מערכת הנשימה העליונה ומערכת העיכול של בני אדם3.
במסגרות חקלאיות, אסטרטגיה ביו-שליטה מבוססת פאג' היא שימוש טיפולי בפאג'ים לשליטה בפתוגנים חיידקיים. פלג ביו-קונטרול מקובלת היטב כטכנולוגיה ירוקה, יעילה בטיהור פתוגנים המועברים במזון (למשל, שיגה-רעלן המייצרת Escherichia coli (STEC), סלמונלה וליסטריה) במזונות שונים4,5. בנוסף, פאג'ים יכולים לשמש כחיובי חיטוי למשטחי עיבוד מזון ומחבואים של בעלי חיים, אשר ניתן לשלב במערכות מיקרוביאלית קונבנציונליות (למשל, כימיקלים, קיטור, פיסטור מים חמים) כדי לשפר את התוצאות הרצויות ולהפחית את ההשפעות הסביבתיות. השימוש בפאג'ים להפחתת חיידקים זואונוטיים בבעלי חיים הוא גם מבטיח1. עם זאת, יש צורך להתמודד עם האתגרים הטכניים כדי לשפר את התוצאות מגישת הפיאג' הביו-שלם שתיושם באופן פופולרי במערכות ייצור מזון מגוונות. האתגר העיקרי הוא היעילות הלקויה של פאג'ים עקב התפתחות מוטציות עמידות בפני חיידקים5 ושינויים בפיזיולוגיה חיידקית עקב חשיפה ללחצים סביבתיים6.
כדי למזער את הסיכון להתנגדות פאג ', קוקטיילים פאג '(כלומר, שילוב של פאג 'מרובים) מוצעים ושיפרו את העוצמה הביו-שלולטת בחקלאות ובהגדרות חקלאות ימית7. עם זאת, ממספר מחקרים, הוכח כי קוקטיילים פאג לא תמיד מציעים יעילות טובה יותר מאשר הממשל של פאג 'אחד. לדוגמה, קוקטייל של 3 פאג'ים דמויי T4 היה מגוון מארח צר יותר נגד זני E. coli8. יתר על כן, AKFV33, חבר Tequintavirus, היה יעילות רבה יותר מאשר קוקטייל של ארבעה פאג 'בהסרת E. coli O157 מבשר בקר, למרות טמפרטורות הדגירה להחיל4. לאחרונה, דווח כי האפקטיביות של פאג'ים בודדים אינה מנבאת את היעילות של קוקטיילים פאג 'לשליטה O1579, כמו אינטראקציות בין פאג 'מרובים יכול לשנות את היעילות. והכי חשוב, גורמים רבים, כגון פישנג'נדרה ושילובים, זנים ממוקדים ו- MOIs, וטמפרטורות ודגירה וזמני דגירה, עשויים להשפיע על אינטראקציות בין פאג'ים. לכן, סינון קפדני של שילובים של פאג'ים נגד חיידקים ספציפיים כדי להעריך סינרגיה או סיוע פאג ', או לפחות כדי להבטיח אנטגוניזם פאג מינימלי בתנאים סביבתיים ספציפיים, חשוב מאוד לתוצאות אופטימליות. כאן, שיטה מתוארת כדי להעריך באופן שיטתי את היעילות של שילובי פאג 'שונים נגד פתוגנים המועברים במזון תחת מגוון של תנאים סביבתיים. היתרון של גישה זו הוא לאפשר סינון של כל הגורמים הביוטיים והאביוטיים האפשריים הצפויים להשפיע על היעילות האנטיבקטריאלית של פאג'ים בהגדרות טבעיות. בפרוטוקול, STEC O157 והפאג'ים הנגועים שלהם מועסקים כדוגמה.
Protocol
1. הכנת חוצץ וריאגנטים
- הפוך 500 מ"ל של ציר סויה טריפטי (TSB) (15 גרם של אבקת TSB ו 500 מ"ל של מים אולטרה-טעם) ו autoclave.
הערה: ניתן לאחסן זאת בטמפרטורת החדר עד 3 חודשים או בטמפרטורה של 4 °C (6 °F) עד 6 חודשים. - הפוך 500 מ"ל של אגר סויה טריפטי (TSA) (20 גרם של אבקת TSA ו 500 מ"ל של מים אולטרה-טעם) ו autoclave.
הערה: זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F) עד 3 חודשים. - הפוך 500 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS; 4 גרם של NaCl, 0.1 גרם של KCl, 0.77 גרם של Na2HPO4, ו 0.12 גרם של KH2PO4, 500 מ"ל של מים אולטרה-סבר), למדוד ולהתאים את ה- pH ל 7.2 ± 0.2 ב 25 °C ו autoclave.
הערה: זה יכול להיות חנות ב 4 °C (5 °F) עד 6 חודשים. - הפוך 200 מ"ל של 1 M MgSO4 (49.294 גרם ו 200 מ"ל של מים אולטרה-סבר) ולחטא באמצעות מסנן פוליאתרסולפון 0.22 מיקרומטר.
- הפוך 500 מ"ל של TSB עם 10 מ"מ MgSO4 (mTSB; 15 גרם של אבקת TSB, 500 מ"ל של מים אולטרה-תול, ו 5 מ"ל של 1 M MgSO4) ו autoclave; תן למדיה האוטו-משועבדת להתקרר לטמפרטורת החדר. החל את הטכניקה האספטית. באמצעות פיפטה סרולוגית, בזהירות להעביר 5.0 מ"ל של 1 M MgSO4; מערבבים בעדינות לערבב.
2. הכנת תרבית חיידקים
- להכנת תרבות המעבדה לחקר חיידקים (BRLC), יש להסיר את מחביוני מלאי הגליצריול ממלאי המקפיא ולהעביר למעבדה.
- השתמש בלולאת חיסון חד פעמית או שווה ערך, טובל בתקנה, הסר שריטה של אינוקולום (רפש קפוא) ופס על צלחת TSA או שווה ערך בתוך ארון בטיחות ביולוגי ברמה II. לדגור על הצלחת ב 37 ± 2 °C (5 °F) עבור 15−18 שעות.
- תיק את צלחות BRLC מוכן ולאחסן ב 4 °C (7 °F).
הערה: תקופת תפוגה כללית עבור BRLC: 14 ימים ב 4 °C (70 °F) לאחר הדור. - לחסן מושבה אחת של כל זן E. coli O157 מלוחות BRLC להיבדק 10 מ"ל של TSB ודגורה סטטית ב 37 °C (18 שעות כדי להגיע 9 log10 CFU/ mL.
- הכן דילול סדרתי של תרביות הלילה (למחרת בבוקר), כל זן E. coli O157 באמצעות mTSB המכיל 10 mM של MgSO4 כדי להשיג 4-5 log10 CFU / ml (או רמת אינוקולום הרצויה אחרת).
- מערבבים נפח שווה של תרבית לילה של כל זן כדי להשיג 4-5 log10 CFU / mL בסך הכל (או לפי הרצון) כדי להכין את תערובת החיידקים.
- מיד למקם את תרבית חיידקים מדולל ב 4 °C (4 °F) לשימוש תלוי ועומד.
- לדלל את תרבות inoculum 10 או 100 פי ותלתלים צלחת 0.1 מ"ל aliquots של דילול אלה על לוחות TSA כדי להשיג את המושבות המבודדות.
3. הכנת פתרונות עבודה פאג'
- הפזר מניות עבודה גבוהות עבור כל פאג' להקרנה (≥108 PFU/mL) על-ידי ביצוע השיטות הסטנדרטיות4.
הערה: תקופת התפוגה הכללית של מניות הפאג' היא 3 חודשים בבקבוק פלסטיק ב-4 מעלות צלזיוס לאחר הדור. - כדי להשיג את titer הרצוי של, למשל, ~ 108 PFU / mL עבור קינטיקה תמוגה, לדלל תכשירי פאג בודדים עם mTSB המכיל 10 mM של MgSO4. הכן קוקטיילים פאג 'על ידי ערבוב נפחים שווים של כל מלאי עובד עם אותו טיטר בכל השילובים האפשריים.
4. הכנת קינטיקה של תמוגה במבחנה לקוקטיילים בודדים של פאג' ופייג'
- הכן דילול טורי של פי 10 של כל פאג'ים בעמודות 1-8 במיקרו-לוחות סטריליים של 96-well כדי להגדיר את בדיקת המיקרו-לוחית.
הערה: ארבעה פאג'ים נגד זן חיידקי אחד ניתן לבדוק כפול, בעמודות סמוכות, על כל צלחת. ארבע העמודות הנותרות מיועדות לפקדים, ללא פאג', וכן ל-mTSB ריק (איור 1). - מקם 180 μL של mTSB לבארות מעמודות 1 עד 12 של 96-well microplate.
- הוסף 20 μL של פאג'ים בודדים מדוללים או קוקטיילים פאג '(~ 108 PFU / mL) לבארות 1-8 של השורה העליונה של המיקרו-לוח (שורה A).
- לשליטה נטולת פאג' וריק, הוסף 20 μL של mTSB לבאר העליונה של עמודות 9, 10 ו- 11.
- עם פיפטה של 12 ערוצים, לדלל את הצלחת. העבר 20 μL משורה לשורה. מערבבים את תכולת הבאר על ידי שאיפה עדינה, חוזרת, פליטה (לפחות חמש פעמים) ושינוי טיפים בין דילול. הסר 20 μL מהשורה האחרונה (שורה H).
הערה: מומלץ להשתמש בעצות עם מסננים כדי למנוע זיהום צולב. - הקימו מאגר לכל זן, השתמשו בצינור 1 מ"ל כדי להעביר 2-3 מ"ל מ"ל מהתרבות המדוללת למאגר. עבור עמודות 1-10, השתמש בצינור רב-ערוצי כדי להוסיף 20 מיקרו-אל של תרבית החיידקים מדוללת לכל באר. שנה עצות בין כל תוספת.
- לכסות ולדגירה את המיקרו-לוח בתנאים הרצויים (למשל, 37 °C (10 שעות או 22 °F) למשך 22 שעות).
- במרווחי זמן רצויים של 2 שעות או אחרים, הסר את המיקרו-לוחות מהאינקובטור.
5. קביעת צפיפות אופטית
- בדוק אם יש צפיפות אופטית ב- 600 ננומטר (OD600nm) באמצעות קורא מיקרופלסטיק.
הערה: מומלץ להגדיר ולשמור את פרוטוקול הבדיקה בתוכנית לפני הכנת צלחת הבדיקה. - הפעל את קורא המיקרו-לוח ופתח את התוכנית.
- בחר את המצב פשוט בחלון אפשרויות אתחול ובחר צור פרוטוקול חדש במנהל המשימות (איור משלים 1a,b).
- מהחלון בחירת סוג לוחית , בחר 96 צלחת באר מהרשימה הנפתחת (איור משלים 2).
- בחר ספיגה עבור שיטת זיהוי, האפשרות נקודת קצה/קינטית עבור סוג קריאה ומונוכרומאטורים עבור סוג אופטיקה. לחצו על 'אישור' (איור משלים 3).
- עבור קרא שלב, הזן 600 ננומטר עבור אורכי גל ובחר רגיל למהירות קריאה. לחצו על 'אישור' (איור משלים 4).
- כדי להגדיר את הטמפרטורה לבדיקה, לחץ על תיבת הסימון דגירה ובחר חממה ב. הזן את הטמפרטורה הרצויה בתיבה טמפרטורה . לחץ על אישור. כדי למנוע עיבוי במכסה הצלחת במהלך הדגירה, הגדר מעבר צבע של טמפרטורה על-ידי הזנת ערך (1-3) בתיבה מעבר צבע . לחץ על אישור (איור משלים 5a).
הערה: לחץ על תיבת הסימון לחמם מראש לפני שתמשיך עם השלב הבא עבור טמפרטורת הדגירה של 37 °C.C. שלב זה אינו נדרש עבור מצב הבדיקה ב 22 °C (RT). - לאחר מכן, לחץ על תיבת הסימון Kinetic כדי לפתוח את ההתקנה הקינטית. הגדר את זמן הריצה עבור 10 שעות עבור דגירה של 37 °C או 22 שעות עבור RT. הזן 2 שעות עבור מרווח קריאה. לחץ על אישור (איור משלים 5b).
- לחץ על תיבת הסימון שייק בחלון הפרוצדורה כדי להגדיר את מצב השייק, במידת הצורך, עבור כל קריאה קינטית (איור 6a משלים).
- בחרו 'ליניארי ' למצבי שייק ושנו את משך הזמן ל-30 שניות. הגדר ערך תדר ליניארי ל-731 סל"ד (2 מ"מ) ולאחר מכן לחץ על אישור (איור משלים 6b).
- בחלון דו-שיח של סיכום פרוטוקול, לחץ על פריסת לוח ובחר ריקים, פקדי Assay ודוגמאות. לחצו על 'הבא' (איור משלים 7).
הערה: הזן 1 במספר סוגי פקדים שונים עבור פקד שלילי. - לאחר הגדרת ההגדרות עבור כל סוג באר, לחץ על סיום.
- בחר מזהה באר בממשק בצד שמאל ולאחר מכן הקצה אותו למטריצה המוצגת באלמנת פריסת הלוח. לחצו על 'אישור' (איור 8 משלים).
- לחץ על לחצן קרא לוח ולשמור את הפרוטוקול כקובץ .prt ולחץ על שמור (איור 9 משלים).
- הכנס את הצלחת ולחץ על אישור.
- לאחר השלמת הניסוי, שמור את הניסוי כקובץ .xpt ולחץ על שמור (איור משלים 10).
- יצא נתונים ל- Excel על-ידי לחיצה על לחצן כן בתיבת חלון ההודעה לניתוח נוסף (איור 11 משלים).
- לחץ על הבחירה שמור כן/לא ועל תיבת הסימון אל תשאל שוב כדי לשמור העדפה.
6. ניתוחי נתונים
- חזור על לפחות שני ניסויים עצמאיים כמתואר לעיל. בצע קומפילציה של תוצאות מכל הניסויים העצמאיים. חשב את הממוצע ואת סטיית התקן של OD600 מכל תרבות שטופלה בפאג' וללא תשלום.
- בצע שורש ריבועי של ערכי OD ב 600 ננומטר ולנתח אותם באמצעות מודל סטטיסטי מתאים עבור כל זן חיידקי וטמפרטורה.
הערה: עבור תוכנת SAS, הדגם המעורב והרבועים הפחותים להבדיל בין אמצעים (P < 0.05) נבחרים. עבור כל זן, להקצות לוחות A−G לכל טיפול פאג אשר היעילות הכוללת נגד O157 לאורך זמן ו- MOIs שונה (P < 0.05). - הגדר יעילות פאג ' מעולה בהתבסס על ערך OD600nm ≤ 0.01 המתאים לצמיחה חיידקית שלא ניתן לזהות (מגבלת הזיהוי:300 יחידות רב-תכליתיות /mL).
- לנתח את ההשפעות של זמן, טמפרטורת הדגירה, זני E. coli O157, MOIs וסוגי פאג 'על יעילות פאג 'באמצעות מודל סטטיסטי מתאים.
הערה: עבור תוכנת SAS, השתמש ב- GLIMMIX באמצעים אקראיים. - חשב יחסי סיכויים כדי להשוות יעילות מעולה עבור גורמים סביבתיים וביולוגיים שונים של עניין.
- לנתח את ההשפעות של זמן, טמפרטורת הדגירה, זני E. coli O157, MOIs וסוגי פאג 'על יעילות פאג 'באמצעות מודל סטטיסטי מתאים.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול, בוצעה השוואה של יעילות הפאג' נגד O157 עם שילובים שונים של פאג', טמפרטורות, זמנים ו- MOIs. השפעות של טמפרטורת הדגירה והזמנים, MOIs, פאג'ים וזני חיידקים המשמשים לשיפור היעילות של אנטי-E. coli O157 מוצגים בטבלה 1 (טבלת יחס סיכויים)9. האחוז (%) של מדידת עכוז אופטית ≤ 0.01 הניב נותח על ידי כל הכנת פאג' בכל מצב ניסיוני. בהתבסס על ניתוח זה, יעילות פאג' נגד O157 הוגדלה לאחר 14, 16, או 18 שעות של דגירה ב 22 °C (P < 0.001) ו- MOI = 1000 (P < 0.001), עם 75% ו 89% מהצמיחה של תרבות שטופלה בפאג 'להיות מעוכב לחלוטין, בהתאמה. באופן כללי, בין 11 תכשירי פאג ', קוקטייל של T1, T4, ו- rV5 היה היעיל ביותר (P < 0.05) נגד O157. בנוסף, על פני טמפרטורות דגירה, פעמים, MOIs, ו phages נבדק, רגישות פאג'ים מגוונת, עם זני O157 נבדק עם זן CO281-31N להיות הרגיש ביותר (P < 0.001) ו 3081 (P < 0.001) להיות פחות רגיש phages.
להבנת הקינטיקה הורגת הפאג' של כל זן חיידקי שנבדק, ערך OD600 התווה כנגד כל זמן דגימה, MOIs וטיפול בפאג' בכל טמפרטורת דגירה. תוצאות מייצגות מהיעילות של פאג'ים נגד E. coli O157 3081 ב 37 °C (7 °F) מוצגות באיור 2. זה מובטח כי עקומת הצמיחה של תרבות שליטה ללא פאג 'היא נורמלית לפני הערכת עיכוב של עקומת הצמיחה של תרבות מטופלת phage. לפי איור 2, ההכללה של T4 מנעה לחלוטין צמיחה חיידקית ב-37 מעלות צלזיוס, בכל זמן דגימה ב-MOI נמוך עד 1.5 מעלות צלזיוס. כדי לסקור כיצד פאג' עכב צמיחה חיידקית לאורך זמן בטמפרטורות שונות, ללא קשר ל- MOIs, ערך OD600nm הממוצע הממוצע מכל MOIs (MOI > 0) היה שרטט נגד כל זמן דגימה וטיפול phage (איור 3). בהשוואה ל 37 °C (55 °F), יעילות הרג פאג ' מסוים, למשל, פאג'ים T4 ו- T1 + T4, שופרה מעל 22 °C (50 °F). גישה נוספת לסיכום והשוואת האפקטיביות הכוללת נגד O157 בין פאג'ים מוצגת בטבלה 2 ובטבלה 39. ערך OD600 היה ממוצע מכל זמן דגימה ו- MOI ודירג את יעילות הפאג מהגבוה ביותר (A) לרמה הנמוכה ביותר (F: 37 °C (37 °C ו- D: 22 °C (72 °F). טבלה זו מאפשרת את הזיהוי של הטיפול הטוב ביותר פאג '. לדוגמה, עבור זן 3081, פאג'ים T4 ו- T5 + T4 (פאנל A) היו הטיפול היעיל ביותר ב 37 °C (7 °F), ואילו בנוסף פאג T4, פאגס T1 + T4, T1 + T4 + rV5, ו 4 קוקטיילים phage (פאנל A) היו הטיפול היעיל ביותר ב 22 °C (70 °F).
פרוטוקול זה גם איפשר לנו להשוות את יעילות הפאג' לזני חיידקים שונים הממוקדים ולהתאים אישית את הכנת הפאג '. לדוגמה, בעת בחירת פאג'ים, ב 37 °C (7 ),,לא כולל זן 3081, phage T1 + T4 + rV5 היה האפקטיביות המשמעותית ביותר נגד כל הזנים האחרים, ללא קשר לסוגי הפאג 'שלהם. ב 22 °C (50 °F), קוקטייל 4-phage היה היעיל ביותר נגד כל הזנים נבדקו. MOIs הטוב ביותר הביא תמזה מלאה (OD600 ≤ 0.01), אשר הצדיק יעילות מעולה פוטנציאלית בתנאים ניסיוניים (טבלה 2 וטבלה 3).
איור 1: פריסה מוצעת של בדיקות מיקרו-לוחית 96-well. דילול טורי פי 10 של כל פאג' מוכן בעמודות 1-8 של מיקרו-לוחות סטריליים של 96-well. ארבעה פאג'ים נגד זן חיידקי אחד ניתן לבדוק כפול, בעמודים סמוכים, על כל צלחת. העמודות הנותרות מיועדות לפקדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומות גדילה של זן E. coli O157 3081 ב 37 °C (50 °F) מטופלים ולא מטופלים עם פאג'ים בכל MOIs. הנתונים נאספו משני ניסויים עצמאיים. ברים מציגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומות צמיחה של זן E. coli O157 3081 זנים. (A) עקומות צמיחה ב 37 °C (B) עקומות צמיחה ב 22 °C (70 °F). כל עקומה מייצגת תרבויות אישיות ומעורבות, מטופלות ולא מטופלות עם פאג'ים על פני MOIs. הנתונים נאספו משני ניסויים עצמאיים. פסים מציגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (מותאם מ- Reference9 עם הרשאה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: יחסי סיכויים המשווה את הסבירות של יעילות פאג ' מעולה נגד E. coli O157 בטמפרטורות דגירה, זמני דגירה, MOIs, phages, וזנים של E. coli O157 (מותאם מ- Reference9 באישור). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: יעילות phage הכוללת נגד E. coli O157 ב 37 °C (מותאם מ- Reference9 עם הרשאה). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: יעילות phage הכוללת נגד E. coli O157 ב 22 °C (מותאם מ- Reference9 עם הרשאה). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איורים משלימים 1-11: תמונות של פעולת ונהלי קורא המיקרו- לוחות אלקטרוניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
פרוטוקול זה תיאר גישה חזקה להערכה שיטתית של יעילות הפאג' נגד פתוגנים המועברים במזון, כולל STEC9 וסלמונלה10. צעד קריטי אחד הוא בעת דילול תרבית הלילה של חיידקים, באמצעות מדיום מקורר מראש מניפולציה דילול עם דלי קרח מומלץ למזער את הצמיחה החיידקית הפוטנציאלית. בנוסף, דילול פאג' הוכן לפני דילול תרבית החיידקים. שלב הספירה 2.8 סיפק מספרים בפועל של אינוקולום חיידקי לחישוב של MOI הסופי שהוחל. להכנת פאג', נעשה שימוש כללי ב-phage lysates גולמי שהוכן על ידי פילטר פאג' הנגוע ב-6-4 שעות של תרבית החיידקים. הצעד הקריטי הקשור לזיהום פאג' הוא תמיד להשתמש במלאי עבודה פאג'י שהוכנו תוך 3 חודשים. צנרת מדויקת ביותר (במיוחד בעת שימוש בפיפטה רב ערוצית) ואחידות הגישה חיוניות גם כדי להשיג תוצאות דומות וניתנות לפרשנות. TSB שונה בתוספת 10 mM של Mg2+ שימש לדלל פאג'ים, תרבית חיידקים, ובסיס בינוני כדי לייעל את הספיגה והזיהום של פאג'ים.
ככל שחיידקים מתרבים בשלב היומן, אפילו מתחת לטמפרטורת האינקובטור, מומלץ להשתמש בתרבית לילה מדוללת במקום בתרבית שלב העץ, כדי למזער את הצמיחה החיידקית הפוטנציאלית.
לפרוטוקול המוצע יש מגבלות. ראשית, מכיוון שמיקרו-לוח יכול להכיל רק 200 μL, דגירה ממושכת עלולה לגרום לאידוי משמעותי ואינה מומלצת. במקרה זה, בדיקת הישבן לא יכולה להיות מתאימה לחיידקים הגדלים לאט. שנית, הפרוטוקול המוצע לא היה מסוגל לפקח על הגברה של פאג'ים. שלישית, פרוטוקול זה לא יכול היה לפקח על התפתחות ההתנגדות פאג לאורך זמן, גורם קריטי הקובע את התוצאה של טיפול phage11,12. ניסויי מעקב נדרשים כדי להעריך את הביצועים הנוספים של הקוקטייל המשפיע ביותר בהקרנה במניעת הופעתם של מוטציות אנטי-פאג' במערכת תרבות מרק נרחבת ובמטריטריות ביולוגיות אחרות.
בניגוד מיקרוביאלים קונבנציונליים, האופי הביולוגי של פאג'ים משפיע על המורכבות של ביו-שליטה ושימוש טיפולי בהגדרות מעשיות. באופן קונבנציונלי, בחירה רציונלית של קוקטיילים פאג 'מבוסס בעיקר על פעילות ליטית ואת מגוון המארח של פאג'ים. מועמדי פאג' עם הפעילות הטיקית החזקה ביותר וטווח המארחים הרחב ביותר מומלצים לעתים קרובות 13,14. עם זאת, בהתבסס על המחקר הנוכחי, פאג'ים כגון rV5 ו- T1, אם כי לבדם לא אלימים כמו T4 ו- T5, הקלו מאוד על התוצאה הכללית של הביו-שליטה בשילוב עם T4 ו / או T5. כתוצאה מכך, כדי להשיג יעילות מעולה של קוקטיילים פאג ', הקרנה מערכתית של פעילות אנטיבקטריאלית של שילובי פאג 'פוטנציאליים נגד זנים מארח ממוקד בתנאים סביבתיים הרצויים מומלץ. בנוסף, קביעת קולטנים למועמדים פאג 'והכללת פאג'ים עם קולטנים שונים עשויים למנוע תחרות על התקשרות מארח, לסכל התפתחות מהירה של מוטציות אנטי פאג ', ולשפר את תוצאות הביו-שלולטור13.
שיטה זו אפשרה כימות מדויק של קינטיקה של פאג' תמוגה בפורמט בעל תפוקה גבוהה. יתר על כן, היא אפשרה הערכה שיטתית של גורמים ביולוגיים וסביבתיים שונים על היעילות האנטיבקטריאלית של מגוון של פאג'ים, ובכך להקל על ניסוח קוקטיילים פאג 'עם תוצאות אופטימליות. ההנחה היא שהיישומים וההתפתחות העתידיים של השיטה כרוכים בניטור היעילות של כל פאג'ים בתוך קוקטיילים פאג' על ידי תיוג פלואורסצנטי של פאג'ים. בנוסף לפרוטוקול המוצע, הבנת דטרמיננטים גנטיים המקדמים השפעות סינרגטיות והקלה בין פאג'ים בעת הדבקה משותפת של פונדקאי אחד תקל על ניסוח קוקטיילים פאג ' מתאימים עם יעילות מעולה.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), קרן קנדה לחדשנות (פרויקט # 38710) וקרן החדשנות הגדולה, אלברטה. אנו מודים לד"ר ג'ון קסטליק על עריכת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essential supplies, reagents, and equipment | |||
| Inoculating loops | VWR | 12000-806 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 1374361 | MgSO4.7H2O |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | Diameter: 100 mm, sterile |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher | 10010023 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014405 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17013808 | |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014412 | |
| Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention | METTLER TOLEDO | 30389213 | |
| Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5 | METTLER TOLEDO | 17005860 | |
| Pipette Tips SR LTS 300µL 768A/4 | METTLER TOLEDO | 17005867 | no filter |
| Reservoir | METTLER TOLEDO | 89094-662 | |
| Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids | Fisher | 168055 | |
| Tryptic soy agar (TSA) | Sigma | 105458-0500 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | Sigma | 105459-0500 | |
| T-Shaped Cell Spreaders | VWR | 76299-566 | |
| Instruments | |||
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Compact Microbiological Incubators | Fisher | 50125590H | |
| Magnetic Stirrer Hotplates | FIsher | 13-889-335 | |
| Polygon Stir Bars | FIsher | 14-512-125 | length: 20 mm |
| Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader | Fisher | BTNEO2M | |
| Software | |||
| SAS | SAS Institute | 9.4 |
References
- Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections. Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).
- Czaplewski, L., et al. Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review. The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).
- Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Liu, H., et al. Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages. Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).
- Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), (2018).
- Ly-Chatain, M. H. The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy. Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).
- Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture. Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).
- Bourdin, G., et al. Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails. Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157. Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures. Virology Journal. 17, 3 (2020).
- Brüssow, H. What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine. Virology. 434 (2), 138-142 (2012).
- Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. Phage cocktails and the future of phage therapy. Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).
- Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Bacteriophage therapy: developments and directions. Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135 (2020).
- Niu, Y. D., et al. Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).
