Summary
Bu protokol, bakteriyofaj kokteyllerinin antibakteriyel etkinliğini taramak için yüksek aktarım hızı ayarlarını kullanmak için sağlam bir yöntem açıklar.
Abstract
Bakteriyel patojenler dünya çapında gıda güvenliği sistemlerine sürekli olarak meydan okuyor. Isıya ve dezenfektana dirençli bakterilerin ortaya çıkmasıyla ilgili artan endişelerle, yeni antibakteriyel ajanlara acilen ihtiyaç vardır. Bakteriyofaj tabanlı bir biyokontrol stratejisi, tarımsal ortamlarda bakteriyel patojenleri kontrol etmek için fajların terapötik kullanımıdır. Faj biyokontrolü, gıda kaynaklı patojenlerin arındırılmasında etkili olan sürdürülebilir bir teknoloji olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. Etkili biyokontrol sonuçları sağlamak için, faj kombinasyonlarının gerekli çevresel koşullar altında hedeflenen bakterilere karşı sistematik olarak taranması çok önemlidir. Faj kokteyllerinin antibakteriyel etkinliği faj cins ve kombinasyonundan, hedeflenen bakteri suşlarından, enfeksiyonun çokluğundan, sıcaklık ve zamandan etkilenebilir. Üstün etkili bir faj kokteyli formüle etmek için önerilen yöntem, bireysel fajların ve faj kokteyllerinin gıda kaynaklı bakteriyel patojenleri hedeflenen koşullar altında öldürmedeki etkinliğini sistematik olarak değerlendirmekti. İstenilen sıcaklık ve sürelerde optik yoğunluk ölçülerek bakteriyel öldürme etkinliği izlendi. Üstün faj etkinliği bakteriyel büyümenin tamamen inhibisyonu ile belirlendi. Önerilen yöntem, faj kokteyllerinin üstün antibakteriyel etkinlikle formüle edilerek formüle edilerek formüle edilinin kolaylaştırılması için sağlam, kanıta dayalı bir yaklaşımdır.
Introduction
Bakteriyofajlar (fajlar), bakteri hücrelerini doğal olarak istila eden, bakteri metabolizmasını bozan ve bakterinin lizizine neden olan virüslerdir. Geleneksel antimikrobiyallerin (örneğin antibiyotikler) aksine, faj konak spektrumları nispeten dardır, sadece hedeflenen bir bakteri türü veya suş kümesini enfekte edebilir ve bu nedenle hayvan ve insan sağlığına fayda sağlayan mikrobiyota üzerindeki ikincil etkileri en aza indirmelidir. Antimikrobiyal direncin (AMR) artmasıyla, fajlar ve türevleri, insanlarda ve hayvanlarda AMR bakteriyel enfeksiyonları da dahil olmak üzere bakteriyel bulaşıcı hastalıkları kontrol etmek için alternatif antimikrobiyallere yol açar1,2. Fajlar, yüzeysel enfeksiyonlara ve insanların üst solunum sistemi ve gastrointestinal sisteminin enfeksiyonlarına neden olan 20 > bakteriyel patojenlere karşı terapötik potansiyeli doğruladı3.
Tarımsal ortamlarda, faj bazlı bir biyokontrol stratejisi, bakteriyel patojenleri kontrol etmek için fajların terapötik kullanımıdır. Faj biyokontrolü, çeşitli gıdalarda gıda kaynaklı patojenlerin (örneğin, Shiga-toksin üreten Escherichia coli (STEC), Salmonella ve Listeria) dekontaminasyonunda etkili olan yeşil bir teknoloji olarak kabul edilir4,5. Ek olarak, fajlar, istenen sonuçları iyileştirmek ve çevresel etkileri azaltmak için geleneksel antimikrobiyal sistemlere (örneğin kimyasallar, buhar ve sıcak su pastörizasyonu) entegre edilebilen gıda işleme yüzeylerini ve hayvan postlarını dezenfekte etmek için dezenfektan olarak kullanılabilir. Hayvanlarda zoonotik bakterileri azaltmak için fajların kullanımı da umut vericidir1. Bununla birlikte, çeşitli gıda üretim sistemlerinde popüler olarak uygulanacak faj biyokontrol yaklaşımından kaynaklanan sonuçları iyileştirmek için teknik zorlukların ele alınmasına ihtiyaç vardır. Temel zorluk, bakterilere dirençli mutantların gelişimi nedeniyle fajların etkinliğinin bozulması5 ve çevresel stresörlere maruz kalmaya bağlı bakteri fizyolojislerindeki değişikliklerdir6.
Faj direnci riskini en aza indirmek için faj kokteylleri (yani birden fazla faj kombinasyonu) önerilmektedir ve tarım ve su ürünleri ortamlarında biyokontrol gücünü artırmıştır7. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalardan, faj kokteyllerinin her zaman tek bir fajın yönetiminden daha iyi etkinlik sunmadığını kanıtlamıştır. Örneğin, 3 T4 benzeri fajdan oluşan bir kokteyl, E. coli suşlarına karşı daha dar bir konak aralığına sahipti8. Ayrıca, Tequintavirus'un bir üyesi olan AKFV33, uygulanan kuluçka sıcaklıklarına rağmen E. coli O157'yi sığır etinden çıkarmada dört fajlık bir kokteylden daha fazla etkililiğe sahipti4. Son zamanlarda, bireysel fajların etkinliğinin, birden fazla faj arasındaki etkileşimler etkinliği değiştirebileceğinden, O1579'un kontrolü için faj kokteyllerinin etkinliğini tahmin etmediği bildirilmiştir. En önemlisi, faj cins ve kombinasyonları, hedeflenen suşlar ve MBI'ler ve kuluçka sıcaklıkları ve zamanları gibi çok sayıda faktör fajlar arasındaki etkileşimleri etkileyebilir. Bu nedenle, faj sinerjisini veya kolaylaştırmayı değerlendirmek veya en azından belirli çevresel koşullar altında minimum faj düşmanlığını sağlamak için fajların belirli bakterilere karşı kombinasyonlarını dikkatlice taramak, optimal sonuçlar için hayati derecede önemlidir. Burada, çeşitli faya kombinasyonlarının çeşitli çevresel koşullar altında gıda kaynaklı patojenlere karşı etkinliğini sistematik olarak değerlendirmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yaklaşımın yararı, fajların antibakteriyel etkinliğini etkileyeceği tahmin edilen tüm olası biyotik ve abiyotik faktörlerin doğal ortamlarda taranmasını sağlamaktır. Protokolde, STEC O157 ve enfekte edici fajları örnek olarak bunların sınanmıştır.
Protocol
1. Tampon ve reaktiflerin hazırlanması
- 500 mL triptik soya suyu (TSB) (15 g TSB tozu ve 500 mL ultra saf su) ve otoklav yapın.
NOT: Bu, oda sıcaklığında 3 aya kadar veya 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. - 500 mL triptik soya agar (TSA) (20 g TSA tozu ve 500 mL ultra saf su) ve otoklav yapın.
NOT: Bu, 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. - 500 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na2HPO4 ve 0,12 g KH2PO4, 500 mL ultra saf su), pH'ı ölçün ve 25 °C'de 0,2'± 7,2'ye ayarlayın ve otoklav.
NOT: Bu, 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. - 200 mL 1 M MgSO4 (49.294 g ve 200 mL ultra saf su) yapın ve 0.22 μm poliethersülfon filtre ile sterilize edin.
- 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g TSB tozu, 500 mL ultra saf su ve 5 mL 1 M MgSO4) ve otoklav ile 500 mL TSB yapın; otomatik kapatılmış ortamı oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Aseptik tekniği uygulayın. Serolojik bir pipet kullanarak, 1 M MgSO4'ün 5.0 mL'sini dikkatlice aktarın; karıştırmak için hafifçe döndürün.
2. Bakteri kültürünün hazırlanması
- Bakteriyel Araştırma Laboratuvarı Kültürünü (BRLC) hazırlamak için gliserol stok şişelerini dondurucu envanterinden çıkarın ve laboratuvara aktarın.
- Tek kullanımlık bir aşılama döngüsü veya eşdeğeri kullanın, şişeye daldırın, inoculum (dondurulmuş çamur) kazımasını çıkarın ve seviye II biyolojik güvenlik kabini içinde bir TSA plakasına veya eşdeğerine çizgi çizin. Plakayı 15−18 saat boyunca 37 ± 2 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Hazırlanan BRLC plakalarını torbalayın ve 4 °C'de saklayın.
NOT: BRLC için genel son kullanma süresi: Nesilden sonra 4 °C'de 14 gün. - BRLC plakalarından 10 mL TSB'de test edilecek her E. coli O157 suşundan tek bir koloni aşılayın ve 9 kütüğe ulaşmak için 18 saat boyunca 37 °C'de statik olarak kuluçkaya yatırın10 CFU/mL.
- 4-5 log10 CFU/ml (veya diğer istenen inoculum seviyesi) elde etmek için 10 mM MgSO4 içeren mTSB kullanarak her bir E. coli O157 suşu olan gece kültürlerinin seri seyreltilmesini hazırlayın (ertesi sabah).
- Bakteri karışımını hazırlamak için toplamda (veya isndenildiği gibi) 4-5 log10 CFU/mL elde etmek için her bir suşun bir gecede kültürünün eşit hacmini karıştırın.
- Seyreltilmiş bakteri kültürünü bekleyen kullanım için hemen 4 °C'ye yerleştirin.
- İzole kolonileri elde etmek için TSA plakalarında inokülum kültürünü 10 veya 100 kat ve plaka 0,1 mL aliquots'u seyreltin.
3. Faj çalışma çözümlerinin hazırlanması
- Standart yöntemleri izleyerek taranacak her faj için yüksek titreli çalışma stoklarını (≥108 PFU/mL) yayın4.
NOT: Faj stokları için genel son kullanma süresi, nesilden sonra 4 °C'de plastik bir şişede 3 aydır. - Lizis kinetiği için ~108 PFU/mL gibi istenen titeri elde etmek için, 10 mM MgSO4 içeren mTSB ile bireysel faj preparatlarını seyreltin. Her çalışan stoğun eşit hacimlerini tüm olası kombinasyonlarda aynı titreyle karıştırarak faj kokteylleri hazırlayın.
4. Bireysel faj ve faj kokteylleri için in-vitro liziz kinetiğinin hazırlanması
- Mikro plaka testini ayarlamak için steril 96 kuyulu mikro plakalarda Sütun 1-8'deki her fajın seri 10 kat seyreltmelerini hazırlayın.
NOT: Bir bakteri suşuna karşı dört faj, her plakada bitişik sütunlarda, yinelenen olarak test edilebilir. Kalan dört sütun, fajsız ve mTSB boş olan kontroller içindir (Şekil 1). - 96 kuyulu mikro plakanın Sütun 1 ila 12'sinden kuyularına 180 μL mTSB yerleştirin.
- Mikro plakanın üst sırasının (Satır A) 1-8'indeki kuyulara 20 μL seyreltilmiş bireysel faj veya faj kokteyli (~108 PFU/mL) ekleyin.
- Fajsız ve Boş kontrol için Sütun 9, 10 ve 11'in üst kuyusuna 20 μL mTSB ekleyin.
- 12 kanallı pipetle plakayı seyreltin. 20 μL'yi satırdan satıra aktarın. Kuyu içeriğini nazik, tekrarlanan aspirasyon, fırlatma (en az beş kez) ve seyreltmeler arasındaki ipuçlarını değiştirerek karıştırın. Son satırdan 20 μL çıkarın (H Satırı).
NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için filtreli uçların kullanılması önerilir. - Her suş için bir rezervuar kurun, seyreltilmiş kültürün 2-3 mL'lik kısmını rezervuara aktarmak için 1 mL pipet kullanın. 1-10 sütunları için, her kuyuya seyreltilmiş bakteri kültürünün 20 μL'lik kısmını eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Her ekleme arasında ipuçlarını değiştirin.
- Mikro plakayı istediğiniz koşullarda örtün ve kuluçkaya yatırın (örneğin, 10 saat için 37 °C veya 22 saat için 22 °C).
- 2 saat veya istenen diğer aralıklarla, mikro plakaları inkübatörden çıkarın.
5. Optik yoğunluğun belirlenmesi
- Microplate Reader kullanarak 600 nm'de (OD600nm) optik yoğunluk haline gelen optik yoğunluğu inceleyin.
NOT: Test plakası hazırlığından önce test protokolünün programda kurulması ve kaydedilmeleri önerilir. - Mikro plaka okuyucuyu açın ve programı açın.
- Başlangıç Seçenekleri penceresinde Basit modu seçin ve Görev Yöneticisi'nde Yeni Protokol Oluştur'u seçin (Tamamlayıcı Şekil 1a,b).
- Plaka Türünü Seç penceresinden, açılan listeden 96 Kuyu Plakası'nı seçin (Tamamlayıcı Şekil 2).
- Algılama yöntemi için Absorbance'ı , okuma türü için Bitiş Noktası/Kinetik seçeneğini ve optik türü için Monokromatörler'i seçin. Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 3).
- Okuma Adımı için dalga boyları için 600 nm girin ve okuma hızı için Normal'i seçin. Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 4).
- Test sıcaklığını ayarlamak için Kuluçka onay kutusunu tıklatın ve İnkübatör Açık'ı seçin. Sıcaklık kutusuna istediğiniz sıcaklığı girin. Tamam'a tıklayın. Kuluçka sırasında plaka kapağında yoğuşma olmasını önlemek için Degrade kutusuna bir değer (1-3) girerek bir sıcaklık gradyanı ayarlayın . Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 5a).
NOT: 37 °C kuluçka sıcaklığı için Sonraki Adımla Devam Etmeden Önce Önceden Isın onay kutusunu tıklatın. Bu adım 22 °C'deki (RT) test durumu için gerekli değildir. - Ardından, Kinetik Kurulumu açmak için Kinetik onay kutusunu tıklatın. Çalışma süresini 37 °C inkübasyon için 10 saat veya RT için 22 saat olarak ayarlayın. Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 5b).
- Her kinetik okuma için gerekirse sallama koşulu ayarlamak için Yordam penceresindeki Sallama onay kutusunu tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 6a).
- Sallama Modları için Doğrusal'ı seçin ve Süre'yi 30 sn olarak değiştirin Doğrusal Frekans değerini 731 cpm (2 mm) olarak ayarlayın ve Tamam'a tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 6b).
- Protokol Özeti Diyaloğu penceresinde, Plaka Düzeni'ni tıklatın ve Boşluklar, Test Denetimleri ve Örnekler'i seçin. İleri'ye tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 7).
NOT: Negatif denetim için Farklı Denetim Türü Sayısı'na 1 girin. - Her kuyu türünün ayarlarını tanımladıktan sonra Son'a tıklayın.
- Sol taraftaki arabirimde bir Kuyu Kimliği seçin ve sonra bunu plaka düzeni dulunda gösterilen matrise atayın. Tamam'a tıklayın (Ek Şekil 8).
- Plakayı Oku düğmesine tıklayın ve protokolü .prt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 9).
- Plakayı takın ve Tamam'ı tıklatın.
- Deneme tamamlandıktan sonra, denemeyi .xpt dosyası olarak kaydedin ve Kaydet'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 10).
- Daha fazla analiz için ileti penceresi kutusundaki Evet düğmesini tıklatarak verileri Excel'e verin (Tamamlayıcı Şekil 11).
- Tercihi kaydetmek için Evet/Hayır Kaydet seçimine ve Bir Daha Sorma onay kutusuna tıklayın.
6. Veri analizleri
- Yukarıda açıklandığı gibi en az iki bağımsız deneyi tekrarlayın. Tüm bağımsız denemelerden sonuçları derleyin. OD600'ün her fajla işlenmiş ve içermeyen kültürden ortalama ve standart sapması hesaplayın.
- OD değerlerinin karekökünü 600 nm'de gerçekleştirin ve her bakteri suşu ve sıcaklığı için uygun bir istatistiksel model kullanarak analiz edin.
NOT: SAS yazılımı için, KARMA model ve araçları ayırt etmek için en az kareler (P < 0.05) seçilir. Her suş için, zaman ve MBI'ler arasında genel anti-O157 etkinliğinin farklı olduğu her faj tedavisine A−G panelleri atayın (P < 0.05). - Tespit edilebilir bakteri üremesine karşılık gelen OD600nm değerine ≤ 0,01'e göre üstün faj etkinliği tanımlayın (algılama sınırı:300 CFU/mL).
- Uygun bir istatistiksel model kullanarak zamanın, kuluçka sıcaklığının, E. coli O157 suşlarının, MBI'lerin ve faj türlerinin faj etkinliği üzerindeki etkilerini analiz edin.
NOT: SAS yazılımı için GLIMMIX'i rastgele önlemlerle kullanın. - Farklı çevresel ve biyolojik ilgi faktörleri için üstün etkinliği karşılaştırmak için Oran Oranlarını Hesaplayın.
- Uygun bir istatistiksel model kullanarak zamanın, kuluçka sıcaklığının, E. coli O157 suşlarının, MBI'lerin ve faj türlerinin faj etkinliği üzerindeki etkilerini analiz edin.
Representative Results
Protokolün ardından, anti-O157 faj etkinliğinin çeşitli faj kombinasyonları, sıcaklıklar, zamanlar ve MOI'lerle karşılaştırılması gerçekleştirildi. İnkübasyon sıcaklığı ve zamanlarının etkileri, MBI'ler, fajlar ve anti-E. coli O157 etkinliğinin artırılmasında kullanılan bakteriyel suşlar Tablo 1'de (oran oranı tablosu)9'da sunulmuştur. 0.01'≤ optik bulanıklık ölçümünün yüzdesi (%) her deneysel durum altında her faj preparatı tarafından analiz edildi. Bu analize dayanarak, anti-O157 faj etkinliği 22 °C'de (P < 0.001) ve MOI = 1000'de (P < 0.001) 14, 16 veya 18 saat inkübasyondan sonra en üst düzeye çıkarıldı ve sırasıyla fajla tedavi edilen kültürün büyümesinin% 75'i ve% 89'u tamamen inhibe edildi. Genel olarak, 11 faj preparatı arasında, T1, T4 ve rV5 kokteyli O157'ye karşı en etkili (P < 0.05). Buna ek olarak, inkübasyon sıcaklıkları, zamanları, MBI'ler ve test edilen fajlar arasında, Fajlara duyarlılık değişti, O157 suşları co281-31N gerinim co281-31N ile test edildi en hassas (P < 0.001) ve 3081 (P < 0.001) fajlara karşı en az duyarlı.
Test edilen her bakteriyel suşun faj öldürici kinetiğini anlamak için, OD600 değeri her kuluçka sıcaklığında her örnekleme süresine, MBI'lere ve faj tedavisine karşı çizilmiştir. Fajların 37 °C'de E. coli O157 3081'e karşı etkinliğinin temsili sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. Fajla tedavi edilen kültürün büyüme eğrisinin inhibisyonunu değerlendirmeden önce fajsız kontrol kültürünün büyüme eğrisinin normal olması sağlanır. Şekil 2'ye göre, T4'ün dahil edilmesi, 37 °C'de bakteri üremesini tamamen inhibe etti, her örnekleme zamanında 1 kadar düşük bir MOI'de. Faki'lerden bağımsız olarak, fayanın çeşitli sıcaklıklarda zaman içinde bakteri üremesini nasıl engellediğine genel bakmak için, tüm MBI'lerden ortalama OD600nm değeri (MOI > 0) her örnekleme süresine ve faj tedavisine göre çizilmiştir (Şekil 3). 37 °C ile karşılaştırıldığında, T4 ve T1 + T4 fajları gibi belirli faj öldürme etkinliği 22 °C'nin üzerinde geliştirilmiştir. Fajlar arasındaki genel anti-O157 etkinliğini özetlemek ve karşılaştırmak için bir başka yaklaşım Tablo 2 ve Tablo 39'da gösterilmiştir. OD600 değeri her örnekleme süresinden ve MOI'den ortalama alındı ve faj etkinliğini en yüksekten (A) en düşük seviyeye (F: 37 °C ve D: 22 °C) derecelendi. Bu tablo en iyi faj tedavisinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Örneğin, 3081 suşu için T4 ve T5 + T4 (Panel A) faj T4'te en etkili tedavi olurken, faj T4'e ek olarak T1 + T4, T1 + T4 + rV5 ve 4 faj kokteyli (Panel A) 22 °C'de en etkili tedaviydi.
Bu protokol aynı zamanda faj etkinliğini hedeflenen çeşitli bakteri suşlarıyla karşılaştırmamızı ve faj hazırlamayı özelleştirmemizi sağladı. Örneğin, fajları seçerken, 3081 suşu hariç 37 °C'de, faj T1 + T4 + rV5, faj tiplerine bakılmaksızın diğer tüm suşlara karşı en önemli etkililiğe sahipti. 22 °C'de, 4-faj kokteyl test edilen tüm suşlara karşı en etkili olanıydı. En iyi MSI'ler, deneysel koşullar altında potansiyel üstün etkinliği garanti eden tam liziz (OD600 ≤ 0.01) ile sonuçlandı (Tablo 2 ve Tablo 3).
Şekil 1: Önerilen 96 kuyu mikro plaka test düzeni. Her fajın seri 10 kat seyreltmeleri, steril 96 kuyulu mikro plakaların Sütun 1-8'inde hazırlanır. Bir bakteri suşuna karşı dört faj, her plakada bitişik sütunlarda, yinelenen olarak test edilebilir. Kalan sütunlar denetimler içindir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 37 °C'de E. coli O157 suşu 3081 büyüme eğrileri tedavi edilir ve her MBI'de fajlarla tedavi edilmez. Veriler iki bağımsız denemeden derlenmiştir. Çubuklar standart sapma sunar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: E. coli O157 gerinim büyüme eğrileri 3081 suşları. (A) Büyüme eğrileri 37 °C'de. (B) Büyüme eğrileri 22 °C'de. Her eğri, MBI'ler arasında fajlarla muamele edilen ve tedavi olmayan bireysel ve karışık kültürleri temsil eder. Veriler iki bağımsız denemeden derlenmiştir. Çubuklar ortalamanın standart hatasını sunar (reference9'dan izin ayla uyarlanmıştır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: İnkübasyon sıcaklıklarında, kuluçka sürelerinde, MOI'lerde, fajlarda ve E. coli O157 suşlarında (referans9'dan izin alarak uyarlanmıştır) üstün faj etkinliğinin E. coli O157'ye karşı olasılığını karşılaştıran oran oranları bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: 37 °C'de E. coli O157'ye karşı genel faj etkinliği (referans9'dan izin ayla uyarlanmıştır).
Tablo 3: 22 °C'de E. coli O157'ye karşı genel faj etkinliği (referans9'dan izin ayla uyarlanmıştır).
Tamamlayıcı Şekiller 1-11: Mikro plaka okuyucu işlemi ve prosedürlerinin anlık görüntüleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, STEC9 ve Salmonella10 da dahil olmak üzere gıda kaynaklı patojenlere karşı faj etkinliğini sistemsel olarak değerlendirmek için sağlam bir yaklaşım tanımlamaktadır. Kritik bir adım, bakterinin geceleme kültürünü seyreltirken, önceden soğutulmuş ortam kullanırken ve seyreltmeyi bir buz kovasıyla manipüle ederken potansiyel bakteri üremesini en aza indirmesi tavsiye edilir. Ek olarak, bakteri kültürünü seyreltmeden önce faj seyreltme hazırlandı. Numaralandırma adımı 2.8, uygulanan nihai MOI'nin hesaplanması için gerçek sayıda bakteriyel inoculum sağladı. Faj hazırlamada genellikle 4-6 saat bakteri kültüründe enfekte olmuş filtre fajı ile hazırlanan ham fajlysates kullanılır. Faj enfeksiyaklığı ile ilişkili kritik adım her zaman 3 ay içinde hazırlanan faj iş stoklarını kullanmaktır. Son derece doğru pipetleme (özellikle çok kanallı pipet kullanırken) ve yaklaşımın homojenliği de karşılaştırılabilir ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. 10 mM Mg2+ ile desteklenmiş modifiye TSB, fajların adsorpsiyonunu ve enfeksiyonunu optimize etmek için fajları, bakteri kültürünü ve baz ortamı seyreltmek için kullanıldı.
Bakteriler kütük aşamasında, hatta inkübatör sıcaklığının altında çoğaldıkça, potansiyel bakteri üremesini en aza indirmek için kütük faz kültürü yerine seyreltilmiş geceleme kültürünün kullanılması önerilir.
Önerilen protokolün sınırlamaları vardır. İlk olarak, mikro plaka sadece 200 μL tutabildiğinden, uzun süreli inkübasyon önemli buharlaşmaya neden olabilir ve önerilmez. Bu durumda, test yavaş büyüyen bakteriler için uygun olmayabilir. İkincisi, önerilen protokol fajların amplifikasyonunu izleyemedi. Üçüncü olarak, bu protokol faj tedavisinin sonucunu belirleyen kritik bir faktör olan faj direncinin gelişimini zaman içinde izleyemedi11,12. Kapsamlı bir et suyu kültürü sisteminde ve diğer biyolojik matrislerde anti-faj mutantlarının ortaya çıkmasını önlemede taramadaki en etkili kokteylin daha fazla performansını değerlendirmek için takip deneyleri gereklidir.
Geleneksel antimikrobiyallerin aksine, fajların biyolojik doğası pratik ortamlarda biyokontrol ve terapötik kullanımın karmaşıklığını etkiler. Geleneksel olarak, faj kokteyllerinin rasyonel seçimi öncelikle litik aktiviteye ve ana faj aralığına dayanmaktadır. En güçlü litik aktiviteye ve en geniş konak aralığına sahip faj adayları genellikle 13,14 önerilir. Bununla birlikte, mevcut çalışmaya dayanarak, rV5 ve T1 gibi fajlar, tek başına T4 ve T5 kadar virülan olmasa da, T4 ve / veya T5 ile birleştirildiğinde genel biyokontrol sonucunu büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Sonuç olarak, faj kokteyllerinin üstün etkinliğini elde etmek için, potansiyel faj kombinasyonlarının istenen çevresel koşullar altında hedeflenen konak suşlarına karşı antibakteriyel aktivitesinin sistemik olarak taranması önerilir. Ek olarak, faj adayları için reseptörlerin belirlenmesi ve çeşitli reseptörlere sahip fajların dahil edilmesi, konak bağlanma rekabetini önleyebilir, anti-faj mutantlarının hızlı gelişimini engelleyebilir ve biyokontrol sonuçlarını iyileştirebilir13.
Bu yöntem, faj liziz kinetiğinin yüksek aktarım hızı biçiminde doğru ölçülmesini sağladı. Ayrıca, çeşitli fajların antibakteriyel etkinliği üzerinde çeşitli biyolojik ve çevresel faktörlerin sistematik olarak değerlendirilmesini sağladı ve böylece faj kokteyllerinin formülasyonunu optimize edilmiş sonuçlarla kolaylaştırdı. Yöntemin gelecekteki uygulamalarının ve gelişiminin, fajların floresan etiketlemesi ile faj kokteyllerindeki her fajın etkinliğini yerinde izlemeyi içerdiği varsayılıyor. Önerilen protokole ek olarak, bir konağı birlikte enfekte ederken fajlar arasındaki sinerjik ve kolaylaştırılmış etkileri teşvik eden genetik belirleyicileri anlamak, uygun faj kokteyllerinin üstün etkinlikle formülasyonunu kolaylaştıracaktır.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu araştırma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), Canada Foundation for Innovation (Project # 38710) ve Major Innovation Fund, Alberta tarafından desteklendi. Dr. John Kastelic'e taslağı düzenlediği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essential supplies, reagents, and equipment | |||
| Inoculating loops | VWR | 12000-806 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 1374361 | MgSO4.7H2O |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | Diameter: 100 mm, sterile |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher | 10010023 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014405 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17013808 | |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014412 | |
| Pipette Tips RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention | METTLER TOLEDO | 30389213 | |
| Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5 | METTLER TOLEDO | 17005860 | |
| Pipette Tips SR LTS 300µL 768A/4 | METTLER TOLEDO | 17005867 | no filter |
| Reservoir | METTLER TOLEDO | 89094-662 | |
| Sterile, clear, 96-well flat-bottom polystyrene microplates with lids | Fisher | 168055 | |
| Tryptic soy agar (TSA) | Sigma | 105458-0500 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | Sigma | 105459-0500 | |
| T-Shaped Cell Spreaders | VWR | 76299-566 | |
| Instruments | |||
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Compact Microbiological Incubators | Fisher | 50125590H | |
| Magnetic Stirrer Hotplates | FIsher | 13-889-335 | |
| Polygon Stir Bars | FIsher | 14-512-125 | length: 20 mm |
| Synergy Neo2 Hybrid Multi-Mode Reader | Fisher | BTNEO2M | |
| Software | |||
| SAS | SAS Institute | 9.4 |
References
- Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections. Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).
- Czaplewski, L., et al. Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review. The Lancet. Infectious Diseases. 16 (2), 239-251 (2016).
- Cisek, A. A., Dabrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyzewski, Z. Phage therapy in bacterial infections treatment: one hundred years after the discovery of bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Liu, H., et al. Control of Escherichia coli O157 on beef at 37, 22 and 4°C by T5-, T1-, T4-and O1-like bacteriophages. Food Microbiology. 51, 69-73 (2015).
- Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), (2018).
- Ly-Chatain, M. H. The factors affecting effectiveness of treatment in phages therapy. Frontiers in Microbiololgy. 5, 51 (2014).
- Dy, R. L., Rigano, L. A., Fineran, P. C. Phage-based biocontrol strategies and their application in agriculture and aquaculture. Biochemical Society Transactions. 46 (6), 1605-1613 (2018).
- Bourdin, G., et al. Coverage of diarrhoea-associated Escherichia coli isolates from different origins with two types of phage cocktails. Microbial Biotechnology. 7 (2), 165-176 (2014).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Efficacy of individual bacteriophages does not predict efficacy of bacteriophage cocktails for control of Escherichia coli O157. Frontiers in Microbiololgy. 12, 616712 (2021).
- Niu, Y. D., Liu, H., Johnson, R. P., McAllister, T. A., Stanford, K. Effect of a bacteriophage T5virus on growth of Shiga toxigenic Escherichia coli and Salmonella strains in individual and mixed cultures. Virology Journal. 17, 3 (2020).
- Brüssow, H. What is needed for phage therapy to become a reality in Western medicine. Virology. 434 (2), 138-142 (2012).
- Chan, B. K., Abedon, S. T., Loc-Carrillo, C. Phage cocktails and the future of phage therapy. Future Microbiology. 8 (6), 769-783 (2013).
- Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Bacteriophage therapy: developments and directions. Antibiotics. 9 (3), Basel, Switzerland. 135 (2020).
- Niu, Y. D., et al. Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology. 107 (2), 646-656 (2009).
