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Biology

फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए मैक्रोपिनोसोम के परिमाणीकरण के लिए स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण

Published: August 24, 2021 doi: 10.3791/62828
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, NCI-designated Cancer Center

Summary

बहु-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट का उपयोग करके स्वचालित assays एक ही प्रयोग में स्थितियों की एक भीड़ के आकलन की अनुमति देकर मार्ग नियामकों की पहचान करने के लिए लाभप्रद दृष्टिकोण हैं। यहां, हमने अच्छी तरह से स्थापित मैक्रोपिनोसोम इमेजिंग और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप में अनुकूलित किया है और एक बहु-मोड प्लेट रीडर का उपयोग करके स्वचालन के लिए एक व्यापक रूपरेखा प्रदान की है।

Abstract

Macropinocytosis एक गैर-विशिष्ट द्रव-चरण अपटेक मार्ग है जो कोशिकाओं को बड़े बाह्य कोशिकीय कार्गो, जैसे प्रोटीन, रोगजनकों और सेल मलबे को थोक एंडोसाइटोसिस के माध्यम से आंतरिक बनाने की अनुमति देता है। यह मार्ग विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, जिसमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और कैंसर सेल चयापचय का विनियमन शामिल है। जैविक कार्य में इस महत्व को देखते हुए, सेल संस्कृति की स्थिति की जांच इस मार्ग के नियामकों की पहचान करके और उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की खोज में नियोजित होने के लिए स्थितियों को अनुकूलित करके मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकती है। अध्ययन मानक प्रयोगशाला उपकरण ों का उपयोग करके एक स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण तकनीक का वर्णन करता है और अनुयायी कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स के तेजी से परिमाणीकरण के लिए एक सेल इमेजिंग मल्टी-मोड प्लेट रीडर है। स्वचालित विधि उच्च आणविक भार फ्लोरोसेंट dextran के उत्थान पर आधारित है और एक प्रयोग में कई स्थितियों के आकलन की सुविधा के लिए 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर लागू किया जा सकता है या ग्लास coverslips पर घुड़सवार निश्चित नमूने। इस दृष्टिकोण का उद्देश्य पुनरुत्पादन को अधिकतम करना और प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करना है, जबकि समय की बचत और लागत प्रभावी दोनों है।

Introduction

मैक्रोपिनोसाइटोसिस का गैर-विशिष्ट एंडोसाइटिक मार्ग कोशिकाओं को पोषक तत्वों, प्रोटीन, एंटीजन और रोगजनकों सहित विभिन्न प्रकार के बाह्य कोशिकीय घटकों को आंतरिक बनाने की अनुमति देता है, जो बाहरी तरल पदार्थ और इसके घटकों के थोक उत्थान के माध्यम से होता है। हालांकि कई सेल प्रकारों के जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है, तेजी से, मैक्रोपिनोसाइटोसिस मार्ग को ट्यूमर जीव विज्ञान में एक आवश्यक भूमिका निभाने के लिए वर्णित किया गया है, जहां, मैक्रोपिनोसाइटिक अपटेक के माध्यम से, ट्यूमर कोशिकाएं जीवित रहने में सक्षम होती हैं और पोषक तत्व-क्षीण माइक्रोएन्वायरमेंट 2,3 की उपस्थिति में फैलती हैं। एल्ब्यूमिन और एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स, और नेक्रोटिक सेल मलबे सहित एक्स्ट्रासेल्युलर मैक्रोमोलेक्यूल्स का उत्थान, मैक्रोपिनोसोम और लाइसोसोम संलयन-मध्यस्थता कार्गो कैटाबोलिज्म 4,5,6,7,8 के माध्यम से अमीनो एसिड, शर्करा, लिपिड और न्यूक्लियोटाइड बनाकर बायोमास उत्पादन के लिए एक वैकल्पिक पोषक तत्व स्रोत प्रदान करता है।

मैक्रोपिनोसाइटोसिस का प्रेरण और विनियमन जटिल है और सेलुलर संदर्भ के आधार पर भिन्न हो सकता है। इस प्रकार अब तक, मैक्रोपिनोसाइटोसिस के कई प्रेरकों की पहचान की गई है और इसमें लिगैंड शामिल हैं, जैसे कि एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ), गैलेक्टिन -3, और डब्ल्यूएनटी 3 ए 9, 10,11,12,13। इसके अलावा, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने वाली संस्कृति की स्थिति मार्ग के सक्रियण को ट्रिगर कर सकती है। अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) ट्यूमर पोषक तत्वों से वंचित हैं, विशेष रूप से अमीनो एसिड ग्लूटामाइन के लिए, जो कैंसर कोशिकाओं और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) दोनों को जीवित रहने के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस पर भरोसा करने का कारण बनता है7,13,14,15। इसके अलावा, ट्यूमर तनाव, जैसे कि हाइपोक्सिया और ऑक्सीडेटिव तनाव, इस स्कैवेंजिंग मार्ग 16 को सक्रिय कर सकते हैं। कई बाहरी प्रभावकों के अलावा जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रेरित कर सकते हैं, विभिन्न प्रकार के इंट्रासेल्युलर मार्ग मैक्रोपिनोसोम गठन को नियंत्रित करते हैं। ऑन्कोजेनिक रास-मध्यस्थता परिवर्तन मैक्रोपिनोसाइटिक मशीनरी शुरू करने के लिए पर्याप्त है, और कई कैंसर प्रकार ऑन्कोजेनिक रास-संचालित संरचनात्मक मैक्रोपिनोसाइटोसिस 4,5,9,17 प्रदर्शित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, कैंसर कोशिकाओं और CAFs10,11,15,18 में मैक्रोपिनोसाइटोसिस को सक्रिय करने के लिए जंगली-प्रकार के रास सक्रियण और रास-स्वतंत्र मार्गों की पहचान की गई है। अवरोधक उपचार के साथ संयोजन में विभिन्न इन विट्रो मॉडल के उपयोग के परिणामस्वरूप कई मैक्रोपिनोसाइटोसिस मॉड्यूलेटर की पहचान हुई है, जिसमें सोडियम-हाइड्रोजन एक्सचेंजर्स, छोटे जीटीपीएस आरएसी 1, फॉस्फोइनोसिटाइड 3-किनेज (पीआई 3 के), पी 21-सक्रिय किनेज (पाक), और एएमपी-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एएमपीके) 4,13,15 शामिल हैं। . हालांकि, मैक्रोपिनोसाइटोसिस को विनियमित करने वाले वर्णित कारकों और स्थितियों की भीड़ को देखते हुए, यह कल्पनीय है कि कई और मॉड्यूलेटर और उत्तेजनाएं अज्ञात रहती हैं। उपन्यास मॉड्यूलेटर और उत्तेजनाओं की पहचान को एक ही प्रयोग में स्थितियों की भीड़ के स्वचालित मूल्यांकन द्वारा सुविधाजनक बनाया जा सकता है। यह पद्धति मैक्रोपिनोसोम गठन में शामिल कारकों पर प्रकाश डाल सकती है और उपन्यास छोटे अणुओं या जीवविज्ञान की खोज के लिए अनुमति दे सकती है जो इस मार्ग को लक्षित करते हैं।

यहां, हमने विट्रो में कैंसर कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसाइटोसिस की सीमा को निर्धारित करने के लिए अपने पहले से स्थापित प्रोटोकॉल को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप और स्वचालित इमेजिंग और परिमाणीकरण 19,20 के लिए अनुकूलित किया है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, जो विट्रो में मैक्रोपिनोसाइटोसिस और विवो 4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18 में मैक्रोपिनोसाइटोसिस निर्धारित करने के लिए क्षेत्र में एक मानक बन गया है, 19,20,21,22. मैक्रोपिनोसोम को बड़े मैक्रोमोलेक्यूल्स को आंतरिक बनाने की उनकी क्षमता के माध्यम से अन्य एंडोसाइटिक मार्गों से अलग किया जा सकता है, जैसे कि उच्च आणविक वजन डेक्सट्रान (यानी, 70 केडीए)2,3,4,20,21,22,23। इस प्रकार, मैक्रोपिनोसोम को बाह्यकोशिकीय रूप से प्रशासित फ्लोरोफोर-लेबल वाले 70 केडीए डेक्सट्रान के उत्थान के माध्यम से परिभाषित किया जा सकता है। नतीजतन, मैक्रोपिनोसाइटिक पुटिकाएं 0.2-5 μm से लेकर आकार के साथ फ्लोरोसेंट पंक्टा के इंट्रासेल्युलर समूहों के रूप में प्रकट होती हैं। इन puncta माइक्रोस्कोपिक रूप से चित्रित किया जा सकता है और बाद में सेल में macropinocytosis की सीमा निर्धारित करने के लिए परिमाणित - 'macropinocytic सूचकांक'.

इस प्रोटोकॉल में, 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर विट्रो में अनुयायी कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसोम की कल्पना करने के लिए आवश्यक चरणों और मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके कवरलिप्स का वर्णन किया गया है (चित्रा 1)।। इसके अलावा, एक सेल इमेजिंग मल्टी-मोड प्लेट रीडर का उपयोग करके मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स की छवि अधिग्रहण और परिमाणीकरण को स्वचालित करने के लिए निर्देश प्रदान किए जाते हैं। यह स्वचालन हमारे पहले वर्णित प्रोटोकॉल 19,20 की तुलना में समय, लागत और प्रयास को कम करता है। इसके अलावा, यह अनजाने में पक्षपाती इमेजिंग अधिग्रहण और विश्लेषण से बचता है और इस प्रकार पुनरुत्पादन और विश्वसनीयता को बढ़ाता है। इस विधि को आसानी से विभिन्न सेल प्रकारों या प्लेट पाठकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या वैकल्पिक मैक्रोपिनोसोम सुविधाओं, जैसे आकार, संख्या और स्थान को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यहां वर्णित विधि विशेष रूप से सेल संस्कृति स्थितियों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस, उपन्यास मॉड्यूलेटर की पहचान, या ज्ञात अवरोधकों की दवा सांद्रता के अनुकूलन को प्रेरित करती है।

Figure 1
चित्रा 1: स्वचालित परख की योजनाबद्ध करने के लिए अनुयायी कोशिकाओं में 'macropinocytic सूचकांक' निर्धारित करने के लिए. BioRender का उपयोग कर बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. सामग्री की तैयारी

  1. 20 मिलीग्राम / एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए पीबीएस में FITC या tetramethylrhodamine (TMR) के साथ लेबल किए गए 70 kDa dextran को भंग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर ऐलीकोट स्टोर करें।
  2. एक 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए ddH2O में DAPI भंग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर ऐलीकोट स्टोर करें।
    सावधानी: DAPI एक संभावित कार्सिनोजेन है और इसे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
  3. निर्धारण के दिन, पीबीएस में ताजा 3.7% एसीएस ग्रेड फॉर्मेल्डिहाइड तैयार करें।
    सावधानी: फॉर्मेल्डिहाइड एक फिक्सेटिव, ज्ञात कार्सिनोजेन है और अगर साँस ली जाती है तो विषाक्त होता है। साँस लेने से बचने के लिए एक रासायनिक धुएं के हुड में समाधान बनाएं और देखभाल के साथ संभालें।
  4. एसिड-धुले हुए कवरलिप्स तैयार करें।
    1. 12 मिमी व्यास के साथ 28 ग्राम बोरोसिलिकेट ग्लास कवरलिप्स को गर्म करने के लिए 500 एमएल बीकर और पानी के स्नान का उपयोग करें और 1 एम एचसीएल के 100 मिलीलीटर में 56 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए # 1.5 मोटाई। व्यापक वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लास्टिक रैप के साथ बीकर को सील करें।
      सावधानी: एचसीएल एक मजबूत एसिड है जो अत्यधिक संक्षारक है और इस प्रकार देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए और साँस लेने से बचने के लिए रासायनिक धुएं के हुड में उपयोग किया जाना चाहिए।
    2. आसुत पानी के साथ कवरलिप्स को धोएं। धोने को 4 बार दोहराएं। फिर 95% इथेनॉल के साथ कवरलिप्स को धो लें। धोने को 4 बार दोहराएं।
    3. 95% इथेनॉल में पनडुब्बी के माध्यम से बाँझपन बनाए रखते हुए भविष्य के उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर एक सेल कल्चर डिश में एसिड-धोए गए कवरलिप्स को स्टोर करें। व्यापक वाष्पीकरण से बचने के लिए पैराफिल्म के साथ पकवान को सील करें।

2. कोशिकाओं की तैयारी

  1. ब्याज के अनुयायी कोशिकाओं के साथ एक confluent 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेट का उपयोग करते हुए, मीडिया aspirate और DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला, 37 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed.
  2. 1.5 मिलीलीटर prewarmed 0.25% ट्रिप्सिन जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा प्लेट से कोशिकाओं को अलग करें।
    नोट: ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन समय को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए और पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत टुकड़ी को देखकर इसकी पुष्टि की जा सकती है।
  3. एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए पूर्ण मीडिया के 4.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. 200 x g पर 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं गोली और supernatant aspirate.
  5. सीडिंग के लिए एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए prewarmed पूर्ण मीडिया की पर्याप्त मात्रा में सेल गोली resuspend.
  6. कवरलिप्स या 96-वेल माइक्रोप्लेट प्रारूप (चित्रा 1) के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट पर कोशिकाओं को बीज करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: सीड किए जाने वाले कोशिकाओं की संख्या को प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए क्योंकि प्रसार दर और आकार सेल लाइनों के बीच भिन्न होते हैं। इस प्रोटोकॉल को मैक्रोपिनोसोम लेबलिंग के दिन 80% सेल कॉन्फ्लुएंसी के साथ अनुयायी कैंसर कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है। सेल confluency macropinocytic क्षमता को प्रभावित कर सकता है, और यह भी अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
    1. कवरस्लिप प्रारूप के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट
      1. एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में coverslips जोड़ें, इथेनॉल स्नान से एक एकल coverslip पकड़ करने के लिए संदंश का उपयोग करें। अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए प्लेट की अंदर की दीवार पर कवरस्लिप को टैप करें और एक कुएं के नीचे कवरस्लिप को फ्लैट रखें।
      2. इथेनॉल को वाष्पित होने दें और डीपीबीएस के साथ कवरस्लिप को 2 बार धोएं।
      3. प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 500 μL जोड़कर coverslip के शीर्ष पर कोशिकाओं बीज. कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C सेल इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि मैक्रोपिनोसोम लेबलिंग से पहले दिन में सेल confluency 60% -80% तक नहीं पहुंच जाती।
      4. मैक्रोपिनोसोम लेबलिंग से एक दिन पहले, कुओं से मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μL पूर्वव्यापी सीरम-मुक्त मीडिया जोड़ें और कोशिकाओं को 16-24 घंटे के लिए 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में रखें।
        नोट: अध्ययन की जाने वाली स्थितियों के आधार पर, सीरम-मुक्त मीडिया को विकास कारकों के प्रभावों को कम करने की सिफारिश की जाती है जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रेरित कर सकते हैं और जो आमतौर पर सीरम में मौजूद होते हैं। हालांकि, यह माना जाना चाहिए कि सीरम भुखमरी अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकती है, जैसे प्रसार और ऑटोफैगी। चूंकि अवशिष्ट सीरम कोशिकाओं की मैक्रोपिनोसाइटिक क्षमता को प्रभावित कर सकता है, साथ ही साथ अवरोधक गतिविधि, सीरम को हटाने के लिए धीरे-धीरे कोशिकाओं को धीरे-धीरे 500 μL के साथ 1 या 2 बार धोने से सुधार किया जा सकता है।
    2. 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप
      1. सेल निलंबन को 25 एमएल अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें। एक multichannel पिपेट (8 या 12 चैनलों) का उपयोग करते हुए, ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट चक्रीय ओलेफिन या ग्लास-बॉटम के साथ एक काले 96-अच्छी तरह से उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए सेल निलंबन के बीज 100 μL।
      2. कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C सेल इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि मैक्रोपिनोसोम लेबलिंग से पहले दिन में सेल confluency 60% -80% तक नहीं पहुंच जाती।
      3. मैक्रोपिनोसोम लेबलिंग से एक दिन पहले, एक मल्टीचैनल पिपेट (8 या 12 चैनल) या वैक्यूम पंप से जुड़े मानक युक्तियों के लिए एक मल्टीचैनल आकांक्षा एडाप्टर का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया को हटा दें और छोड़ दें।
      4. एक अभिकर्मक जलाशय और multichannel पिपेट (8 या 12 चैनल) का उपयोग करते हुए, धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से prewarmed सीरम मुक्त मीडिया के 100 μL जोड़ें। कोशिकाओं को 16-24 घंटे के लिए 5% CO2 के साथ 37 °C सेल इनक्यूबेटर में रखें।
        नोट: अध्ययन की जाने वाली स्थितियों के आधार पर, सीरम-मुक्त मीडिया को विकास कारकों के प्रभावों को कम करने की सिफारिश की जाती है जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रेरित कर सकते हैं और जो आमतौर पर सीरम में मौजूद होते हैं। हालांकि, यह माना जाना चाहिए कि सीरम भुखमरी अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकती है, जैसे प्रसार और ऑटोफैगी। चूंकि अवशिष्ट सीरम कोशिकाओं की मैक्रोपिनोसाइटिक क्षमता को प्रभावित कर सकता है, साथ ही साथ अवरोधक गतिविधि, सीरम को हटाने के लिए धीरे-धीरे कोशिकाओं को 100 μL पूर्व-सशस्त्र DPBS के साथ 1 या 2 बार धोने से सुधार किया जा सकता है।

3. Macropinosome लेबलिंग

  1. कवरस्लिप प्रारूप के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट
    1. कुओं को एस्पिरेट करें और 1 मिलीग्राम / एमएल फ्लोरोफोर-लेबल वाले उच्च आणविक भार (70 केडीए) डेक्सट्रान के साथ सीरम-मुक्त मीडिया के 200 μL को वापस जोड़ें। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: ताजा मीडिया का उपयोग करने के बजाय अध्ययन की जाने वाली शर्तों के आधार पर, डेक्सट्रान लोडिंग के लिए वातानुकूलित मीडिया का पुन: उपयोग करना पसंद किया जा सकता है क्योंकि इसमें क्रमशः ईजीएफ या अवरोधक यौगिकों जैसे स्रावित या पूरक कारक शामिल होंगे, जो कोशिकाओं की मैक्रोपिनोसाइटिक क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं।
    2. मीडिया aspirate और धीरे से लेकिन जल्दी से एक precooled धोने की बोतल का उपयोग कर बर्फ ठंडा PBS के साथ कोशिकाओं 5 बार धोना. वॉश के दौरान हाथ से प्लेट को मजबूती से हिलाएं ताकि डेक्सट्रान समुच्चय को हटाने में सहायता मिल सके जो कवरलिप्स में फंस जाते हैं।
    3. 3.7% फॉर्मेल्डिहाइड के 350 μL को जोड़कर और 20 मिनट के लिए incubating द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें। फिर, निर्धारण समाधान aspirate और दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने।
    4. PBS में 2 μg / mL DAPI के 350 μL के साथ नाभिक को दाग दें। 20 मिनट के बाद, DAPI समाधान aspirate और तीन बार PBS के साथ कोशिकाओं को धोलें।
    5. इमेजिंग स्वचालन (चित्रा 2ए, बी) के लिए आवश्यक कवरलिप्स के भी रिक्ति और पुन: प्रस्तुत करने योग्य स्थानीयकरण प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सिलिकॉन आइसोलेटर्स के साथ-साथ पालन करें।
      नोट: संपूर्ण माइक्रोस्कोप स्लाइड को कुल 3 आइसोलेटर के साथ पॉपुलेटेड किया जा सकता है।
    6. प्रत्येक coverslip के लिए, isolator के खुले स्थान के भीतर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कठोर प्रतिदीप्ति बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ें (चित्रा 2C). संदंश का उपयोग करके एक coverslip उठाओ और धीरे से एक लिंट मुक्त पोंछे पर coverslips के पक्ष दोहन द्वारा अतिरिक्त PBS को हटाने.
    7. बढ़ते मीडिया (चित्रा 2 डी) की बूंद पर कवरस्लिप को उल्टा रखें। धीरे से बढ़ते मीडिया (चित्रा 2E) से बुलबुले को हटाने के लिए बंद संदंश का उपयोग कर coverslip नल.
    8. स्लाइड्स को अंधेरे वातावरण में स्टोर करें और बढ़ते मीडिया को कमरे के तापमान पर सूखने की अनुमति दें, आमतौर पर 16-24 घंटे लगते हैं। स्लाइड्स को अब 2 सप्ताह तक -20 °C पर चित्रित या संग्रहीत किया जा सकता है.
    9. इमेजिंग से पहले, माइक्रोस्कोप स्लाइड से आइसोलेटर्स को हटा दें। स्लाइड को कमरे के तापमान पर संतुलित करने दें और अमोनिया-मुक्त ग्लास क्लीनर के साथ गीले कपास-इत्तला वाले एप्लिकेटर का उपयोग करके कवरलिप्स को साफ करें। इसके बाद, एक साफ कपास-इत्तला एप्लिकेटर का उपयोग करें जो 70% इथेनॉल के साथ गीला हो जाता है और कवरस्लिप को सूखा छोड़ देता है।

Figure 2
चित्र 2: सिलिकॉन आइसोलेटर के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कवरलिप्स रखना। (A) सिलिकॉन आइसोलेटर्स को दबाया जाता है और माइक्रोस्कोप स्लाइड का पालन किया जाता है। (बी) पूरे माइक्रोस्कोप स्लाइड को कुल 3 आइसोलेटर्स के साथ पॉप्युलेट किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कवरलिप्स के स्पेसिंग और पुन: प्रस्तुत करने योग्य स्थानीयकरण भी होता है। (सी) प्रत्येक कवरस्लिप के लिए, आइसोलेटर के खुले स्थान के भीतर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रतिदीप्ति बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ें। (डी) संदंश का उपयोग करते हुए, 24-अच्छी तरह से प्लेट से एक कवरस्लिप उठाएं और इसे बढ़ते मीडिया की बूंद पर उल्टा रखें। (ई) जब कवरस्लिप और माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच बुलबुले मौजूद होते हैं, तो बुलबुले को हटाने के लिए बंद संदंश का उपयोग करके कवरस्लिप को धीरे से टैप करें। BioRender का उपयोग कर बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप
    1. एक वैक्यूम से जुड़े एक multichannel आकांक्षा एडाप्टर का उपयोग कर कुओं aspirate और 1 मिलीग्राम / एमएल fluorophore लेबल उच्च आणविक भार (70 kDa) dextran के साथ सीरम मुक्त मीडिया के 40 μL जोड़ें कुओं को वापस. 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: अध्ययन की जाने वाली शर्तों के आधार पर, ताजा मीडिया का उपयोग करने के बजाय, डेक्सट्रान लोडिंग के लिए वातानुकूलित मीडिया का पुन: उपयोग करना पसंद किया जा सकता है क्योंकि इसमें स्रावित या पूरक कारक होंगे, जैसे कि ईजीएफ या अवरोधक यौगिक, क्रमशः जो कोशिकाओं की मैक्रोपिनोसाइटिक क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं।
    2. मैन्युअल रूप से एक खाली 5 एल बीकर (चित्रा 3 ए) में प्लेट को उल्टा फ़्लिक करके माइक्रोप्लेट में मीडिया का निपटान करें।
    3. प्लेट को धीरे-धीरे लंबवत रूप से डुबोकर माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं को कुल्ला करें, एक मामूली कोण पर, बर्फ-ठंडे पीबीएस (चित्रा 3 बी) से भरे 2 एल बीकर में और बाद में प्लेट को उल्टा करके माइक्रोप्लेट में पीबीएस का निपटान करें 5 एल बीकर (चित्रा 3 सी)। 2 बार दोहराएं।
      नोट:: कक्ष जो कमजोर रूप से इमेजिंग माइक्रोप्लेट से अनुलग्न इस प्रक्रिया के दौरान अलग हो सकता है। यदि आवश्यक हो, तो कुओं को मल्टीचैनल आकांक्षा एडाप्टर के साथ भी एस्पिरेटेड किया जा सकता है या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके पीबीएस के साथ धीरे-धीरे धोया जा सकता है। एक 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को संसाधित करने के लिए लगभग 2 एल बर्फ-ठंडे पीबीएस की आवश्यकता होगी। यदि अधिक प्लेटों का विश्लेषण किया जाना है, तो एक बड़े बीकर का उपयोग करें, और प्रत्येक अतिरिक्त प्लेट के लिए 1 एल बर्फ-ठंडे पीबीएस जोड़ें या आवश्यक रूप से बर्फ-ठंडे पीबीएस को ताज़ा करें।
    4. अंतिम कुल्ला से पीबीएस के निपटान के बाद, 25 एमएल अभिकर्मक जलाशय और एक मल्टीचैनल पिपेट (चित्रा 3 डी) का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस में 3.7% फॉर्मेल्डिहाइड के 100 μL जोड़कर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
    5. फिक्सेशन समाधान निकालें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार जलमग्न और फ्लिकिंग तकनीक का उपयोग करके धोएं। पीबीएस प्रति अच्छी तरह से 2 μg / mL DAPI के 100 μL के साथ नाभिक दाग।
    6. 20 मिनट के बाद, ऊपर वर्णित जलमग्न और फ्लिकिंग तकनीक (चरण 3.2.3) का उपयोग करके बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार कुल्ला करें। एक लिंट-मुक्त पोंछे पर माइक्रोप्लेट उल्टा-नीचे दोहन करके किसी भी अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें और 25 एमएल अभिकर्मक जलाशय और मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा पीबीएस के 100 μL जोड़ें। अब कोशिकाओं की छवि बनाएं या उन्हें एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से कवर किया गया स्टोर करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, पीबीएस (पीबीएस के बजाय) में ग्लिसरॉल के समाधान का उपयोग इमेजिंग और भंडारण के लिए किया जा सकता है ताकि प्रतिदीप्ति को बेहतर ढंग से स्थिर किया जा सके (चित्रा 4 ए)।
    7. इमेजिंग से पहले, प्लेट को कमरे के तापमान पर संतुलित होने दें। एक लिंट-मुक्त पोंछे के साथ माइक्रोप्लेट सूखी पोंछें।

Figure 3
चित्रा 3: निर्धारण के लिए तैयार करने के लिए 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को धोना। (ए) मैन्युअल रूप से फ़्लिक करके मीडिया के माइक्रोप्लेट को 5 एल बीकर में खाली करें। (बी) लंबवत और एक मामूली कोण पर, धीरे-धीरे बर्फ-ठंडे पीबीएस से भरे 2 एल बीकर में माइक्रोप्लेट को डुबोएं। (C) मैन्युअल रूप से फ़्लिक करके PBS के माइक्रोप्लेट को 5 L बीकर में खाली करें। धोने के चरणों को दोहराएं जैसा कि बी में वर्णित है, दो बार। (डी) अंतिम बार माइक्रोप्लेट में पीबीएस को खाली करने के बाद, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके कुओं में 100 μL 3.7% फॉर्मेल्डिहाइड जोड़ें। BioRender का उपयोग कर बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. स्वचालित macropinosome इमेजिंग

मैक्रोपिनोसोम की छवियों को एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णित 19,20 था। हालांकि, स्वचालन के माध्यम से दक्षता के संदर्भ में इस तरह की प्रक्रिया में सुधार किया जा सकता है, खासकर जब कई अलग-अलग सेल संस्कृति स्थितियों का आकलन किया जाता है। छवि अधिग्रहण का स्वचालन एक सेल इमेजिंग मल्टी-मोड प्लेट रीडर के माध्यम से पूरा किया जा सकता है, जो हैंडलिंग प्रक्रियाओं को कम करके प्रयास को कम करता है और, महत्वपूर्ण बात यह है कि, निष्पक्ष फैशन में छवियों को प्राप्त करके डेटा पुनरुत्पादन और विश्वसनीयता को बढ़ाता है। एकाधिक इमेजिंग सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और दिशाएं उपकरणों के बीच भिन्न होंगी। यहां, एक साइटेशन 5 का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करने का वर्णन किया गया है। हालांकि, नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को निम्नलिखित दिशानिर्देशों का पालन करके प्रत्येक व्यक्तिगत साधन के अनुरूप बनाया जा सकता है:

  1. Dextran fluorophore (FITC / TMR) और DAPI के तरंग दैर्ध्य चैनल में एक 40x हवा उद्देश्य के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए एक स्वचालन प्रोटोकॉल बनाएँ।
    नोट: आमतौर पर इस्तेमाल किया macropinocytosis अवरोधक EIPA FITC चैनल में autofluorescence प्रदर्शित करता है, खासकर जब पहले DAPI चैनल में उत्साहित। परीक्षण किए जा रहे अन्य यौगिक भी ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित कर सकते हैं। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, उच्चतम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (FITC/TMR) के साथ चैनल में पहले और DAPI चैनल में दूसरा होने के लिए छवि अधिग्रहण सेट करना इस घटना से बचने में मदद करता है।
  2. ओवरएक्सपोजर से बचने के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस के उच्चतम स्तर की भविष्यवाणी करने वाले नमूने का उपयोग करके एक्सपोजर सेटिंग्स को अनुकूलित करें, जिसके परिणामस्वरूप सिग्नल की संतृप्ति और तीव्रता डेटा का नुकसान हो सकता है। फ़ोकस सेटिंग्स का उपयोग करें जो उच्च-गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करने के लिए आसानी से और लगातार नमूने का पता लगाते हैं।
  3. नमूना परिवर्तनशीलता के लिए खाते के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से या कवरस्लिप भर में कई छवियों को प्राप्त करें और नमूने का एक सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करें।
  4. एक बार इमेजिंग सेटिंग्स निर्धारित हो जाने के बाद, प्रयोग के भीतर प्रत्येक नमूने के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें।
  5. एक साइटेशन 5 और Gen5 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते समय मैक्रोपिनोसोम छवि अधिग्रहण के लिए इन निर्देशों का पालन करें:
    1. कवरस्लिप प्रारूप के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट
      1. प्लेट रीडर प्रारंभ करें और स्लाइड धारक का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड को उल्टा डालें।
      2. माइक्रोप्लेट रीडर और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, प्रोटोकॉल पर क्लिक करके एक नया प्रोटोकॉल बनाएं, और नया बनाएँ। प्रक्रिया पर डबल क्लिक करें और प्लेट प्रकार का चयन करें।
        नोट:: यदि प्लेट प्रकार उपलब्ध नहीं है, तो प्लेट प्रकार सिस्टम > प्लेट प्रकार पर क्लिक करके और निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्लेट आयामों का उपयोग करके प्लेट प्रकार > जोड़ें, और प्लेट आयामों का उपयोग करके सॉफ़्टवेयर में प्लेट प्रकार जोड़ें. उपयोग में आसानी के लिए, सिलिकॉन आइसोलेटर्स का उपयोग करके तीन कवरलिप्स के साथ दो माइक्रोस्कोप स्लाइड के लिए टेम्पलेट अनुपूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किया गया है।
      3. इमेजिंग सेटिंग्स तक पहुंचने के लिए, क्रियाएँ > छवि > उलटा इमेजर का चयन करें और ठीक पर क्लिक करें। वाइड एफओवी और ऑटोफोकस बिनिंग के साथ 40x, पीएल एफएल चरण उद्देश्य का उपयोग करें।
      4. पहले चैनल के लिए, डेक्सट्रान फ्लोरोफोर-लेबल (जीएफपी या आरएफपी) के अनुरूप एलईडी क्यूब का चयन करें। ऑटो एक्सपोज़र को अनक्लिक करें और एक्सपोज़र सेटिंग्स को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए माइक्रोस्कोप आइकन बटन पर क्लिक करें। जब उपयुक्त एक्सपोज़र सेटिंग्स निर्धारित की जा चुकी हों, तो सेव सेटिंग्स पर क्लिक करें।
        नोट:: एक नमूने का उपयोग कर एक्सपोज़र सेटिंग्स समायोजित करें जो overexposed छवियों से बचने के लिए macropinocytosis के उच्चतम स्तर है, जिसके परिणामस्वरूप संकेत की संतृप्ति और तीव्रता डेटा की हानि हो सकती है से बचने के लिए भविष्यवाणी की गई है।
      5. DAPI एलईडी घन का उपयोग कर दूसरे चैनल के लिए पिछले चरण को दोहराएँ।
      6. प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए ऑटोफोकस सेटिंग्स सेट करें, फ़ोकस विकल्प का चयन करें. डिफ़ॉल्ट फ़ोकस विधि का चयन रद्द करें और क्रमशः dextran-fluorophore और DAPI चैनल के लिए वैकल्पिक स्कैन के बिना वैकल्पिक स्कैन और Autofocus के साथ Autofocus का उपयोग करें। सेटिंग्स को बचाने के लिए OK पर क्लिक करें।
        नोट: स्कैन दूरी को 200 μm तक कम किया जा सकता है और ऑटोफोकस दक्षता बढ़ाने के लिए 20 μm तक वृद्धि की जा सकती है। कम प्रतिदीप्ति वाले नमूनों पर पर्याप्त ऑटोफोकस के लिए वैकल्पिक स्कैन की आवश्यकता होती है। यह आमतौर पर तब होता है जब कम मैक्रोपिनोसाइटोसिस के साथ स्थितियों का विश्लेषण किया जाता है, जैसे कि जब मैक्रोपिनोसाइटोसिस को रोक दिया जाता है या जन्मजात रूप से मौजूद नहीं होता है।
      7. coverslip के विभिन्न क्षेत्रों में छवियों के अधिग्रहण को स्वचालित करने के लिए बीकन परिभाषित करें विकल्प का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप आइकन पर क्लिक करें और छवि विंडो में क्लिक करके और मंच को अगले क्षेत्र में ले जाकर बीकन जोड़ें। जब क्षेत्रों की उचित संख्या का चयन किया गया है, तो अगले कवरस्लिप पर जाएं और प्रक्रिया को दोहराएं। अंतिम रूप देने के लिए, सेव सेटिंग पर क्लिक करें।
        नोट:: नमूने भर में macropinocytosis का एक अच्छा प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए, लगभग 20 बीकन का चयन करें जो समान रूप से coverslip (चित्रा 4B) भर में वितरित कर रहे हैं। कम बीकन का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन कुछ छवियों को गुणवत्ता विसंगतियों के कारण अधिग्रहण के बाद छवि विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है, जैसे कि जब छवि आउट-ऑफ-फोकस होती है या इसमें बुलबुले या फ्लोरोसेंट धब्बे और धब्बे होते हैं।
      8. इमेजिंग सेटिंग्स के समायोजन को पूरा करने के लिए, ठीक पर क्लिक करें। coverslips छवि के लिए, एक नया प्रयोग बनाएँ और प्रोटोकॉल उपकरण से अब पढ़ें का चयन करें। संकेत दिए जाने पर प्रोटोकॉल और प्रयोग सहेजें.

Figure 4
चित्रा 4: छवि अधिग्रहण के लिए शर्तों का अनुकूलन( A) ग्लिसरॉल एकाग्रता को बढ़ाने से TMR-dextran प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, जैसा कि EGF के साथ इलाज किए गए AsPC-1 कोशिकाओं में निर्धारित किया गया है। (बी) कवरस्लिप्स प्रारूप के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करते समय स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए इमेजिंग बीकन के उदाहरण निर्देशांक। बार ग्राफ 5 प्रयोगों के SEM के साथ औसत सापेक्ष प्रतिदीप्ति दिखाता है। सांख्यिकीय महत्व को पीबीएस के सापेक्ष दो-तरफ़ा एनोवा द्वारा निर्धारित किया गया था। ** पी < 0.01; पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप
    1. प्लेट रीडर शुरू करें और माइक्रोप्लेट डालें।
    2. माइक्रोप्लेट रीडर और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, प्रोटोकॉल पर क्लिक करके एक नया प्रोटोकॉल बनाएं, और नया बनाएँ। प्रक्रिया पर डबल क्लिक करें और प्लेट प्रकार का चयन करें।
      नोट:: यदि प्लेट प्रकार उपलब्ध नहीं है, तो प्लेट प्रकार जोड़ें के लिए सिस्टम > प्लेट प्रकार > पर क्लिक करके और निर्माता द्वारा प्रदान किए गए के रूप में प्लेट आयामों का उपयोग करके सॉफ़्टवेयर के लिए प्लेट प्रकार जोड़ें। उपयोग में आसानी के लिए, PerkinElmer से CellCarrier-96 अल्ट्रा माइक्रोप्लेट्स के लिए टेम्पलेट अनुपूरक फ़ाइल 2 में प्रदान किया गया है।
    3. इमेजिंग सेटिंग्स तक पहुंचने के लिए, क्रियाएँ > छवि > उलटा इमेजर का चयन करें और ठीक पर क्लिक करें। वाइड FOV और Autofocus Binning के साथ 40x PL FL चरण उद्देश्य का उपयोग करें।
    4. पहले चैनल के लिए, डेक्सट्रान फ्लोरोफोर-लेबल (जीएफपी या आरएफपी) के अनुरूप एलईडी क्यूब का चयन करें। ऑटो एक्सपोज़र को अनक्लिक करें और एक्सपोज़र सेटिंग्स को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए माइक्रोस्कोप आइकन बटन पर क्लिक करें। जब उपयुक्त एक्सपोज़र सेटिंग्स निर्धारित की जा चुकी हों, तो सेव सेटिंग्स पर क्लिक करें।
      नोट:: एक्सपोज़र सेटिंग्स के ऑप्टिमाइज़ेशन के दौरान, महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति विरंजन हो सकता है। यह सेटिंग्स में परिणाम कर सकते हैं जो किसी नए फ़ील्ड की छवि होने पर overexposure का कारण बनता है। इसलिए, अभी तक एक unexposed फ़ील्ड की जाँच करके और यह आश्वासन देकर कि चयनित सेटिंग्स पर सिग्नल की कोई संतृप्ति नहीं होती है, एक्सपोज़र सेटिंग्स को मान्य करें। मैक्रोपिनोसोम परिमाणीकरण में एक्सपोज़र सेटिंग के अनुकूलन के लिए उपयोग किए जाने वाले कुओं को शामिल न करें, क्योंकि अनुकूलन के दौरान ब्लीचिंग के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति कम हो गई है। ओवरएक्सपोज्ड छवियों से बचने के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस के उच्चतम स्तर की भविष्यवाणी करने वाले नमूने का उपयोग करके एक्सपोजर सेटिंग्स को समायोजित करें, जिसके परिणामस्वरूप सिग्नल की संतृप्ति और तीव्रता डेटा का नुकसान हो सकता है।
    5. DAPI एलईडी घन का उपयोग कर दूसरे चैनल के लिए पिछले चरण को दोहराएँ।
    6. प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए ऑटोफोकस सेटिंग्स सेट करें, फ़ोकस विकल्प का चयन करें. डिफ़ॉल्ट फ़ोकस विधि का चयन रद्द करें और लेज़र ऑटोफ़ोकस का उपयोग करें. मैक्रोपिनोसोम और नाभिक के इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फोकल प्लेन का निर्धारण करने के बाद एक संदर्भ स्कैन कैप्चर करें। सेटिंग्स को बचाने के लिए OK पर क्लिक करें।
      नोट: स्कैन दूरी को 400 μm तक कम किया जा सकता है और ऑटोफोकस दक्षता बढ़ाने के लिए 3 μm तक वृद्धि की जा सकती है। लेजर ऑटोफोकस विकल्प को ठीक से काम करने के लिए, प्लेट के निचले हिस्से को साफ करें, सूखी और इमेजिंग से पहले एक लिंट-फ्री वाइप के साथ प्लेट को पोंछें। लेजर ऑटोफोकस फोकस के लिए एक बेहतर तरीका है क्योंकि इसे फोकल प्लेन को खोजने के लिए न्यूनतम समय की आवश्यकता होती है। अन्य फोकस विधियों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन, चूंकि कुओं में कोई एंटी-फीका नहीं जोड़ा गया है, इसलिए ये विधियां नमूनों के महत्वपूर्ण ब्लीचिंग का कारण बन सकती हैं जो डेटा के संग्रह को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेंगी।
    7. क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर ऑफसेट को शून्य पर सेट करें और एकल छवि के तहत कोई ओवरलैप के साथ असेंबल का चयन करें और 3 x 3 छवियों का उपयोग करें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि विश्लेषण में कितने कक्ष शामिल होने के लिए वांछित हैं।
      नोट:: आकार और कोशिकाओं के घनत्व के आधार पर, अधिक या कम छवियों को पूरे नमूने में macropinocytosis का एक प्रतिनिधि मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए लिया जा सकता है। अलग-अलग परिस्थितियों में AsPC-1 या MIA PaCa-2 कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसाइटोसिस का आकलन करना, 2 x 2 या 4 x 4 फोटो फ्रेम के बीच डेटा व्याख्या में कोई अंतर नहीं देखा जाता है, हालांकि कम तस्वीरें लेते समय प्रतिकृति नमूनों के बीच भिन्नता बढ़ सकती है (चित्रा 5ए, बी)। फ्रेम के आकार को बढ़ाने या कम करने से प्लेट को स्कैन करने में लगने वाले समय पर असर पड़ेगा। एक्सपोज़र समय के आधार पर, एक पूर्ण 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को 3 x 3 फ्रेम का उपयोग करके पूरी तरह से स्कैन करने में लगभग 1-1.5 घंटे लगेंगे। एक 2 x 2 और 4 x 4 फ्रेम क्रमशः उस समय को आधा या दोगुना कर देगा।
    8. इमेजिंग सेटिंग्स के समायोजन को पूरा करने के लिए, ठीक पर क्लिक करें।
    9. प्लेट की छवि बनाने के लिए, एक नया प्रयोग बनाएँ और प्रोटोकॉल उपकरण से अभी पढ़ें का चयन करें. संकेत दिए जाने पर प्रोटोकॉल और प्रयोग सहेजें.

Figure 5
चित्र 5: PDAC कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसाइटोसिस का आकलन करने के लिए नियंत्रण की स्थिति। (A) AsPC-1 कोशिकाएं 5 मिनट के लिए 100 ng/ mL EGF उत्तेजना के जवाब में मैक्रोपिनोसाइटोसिस प्रदर्शित करती हैं या 24 घंटे के लिए ग्लूटामाइन अभाव। छवि अधिग्रहण के लिए, डेटा गुणवत्ता पर फ़ोटो की संख्या के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3, या 2 x 2 के चित्र फ़्रेम लिए गए थे। (बी) एमआईए PaCa-2 कोशिकाएं संरचनात्मक मैक्रोपिनोसाइटोसिस दिखाती हैं जो 75 μM EIPA या 10 μM EHop-016 के साथ 2-h उपचार के साथ 30-मिनट के उपचार से बाधित होती हैं। चित्र फ्रेम ए में के रूप में लिया गया था। स्केल बार = 25 μm. बार रेखांकन 4 प्रतिकृतियों के साथ 1 प्रयोग के एसडी के साथ औसत सापेक्ष मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स दिखाते हैं। सांख्यिकीय महत्व +Q या वाहन की स्थिति के सापेक्ष दो-तरफ़ा एनोवा द्वारा निर्धारित किया गया था। पी < 0.001 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. मैक्रोपिनोसाइटिक सूचकांक का निर्धारण

'मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स' सेलुलर मैक्रोपिनोसाइटोसिस की सीमा है जो माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग 19 का उपयोग करके प्रति सेल फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान अपटेक को परिमाणित करके निर्धारित किया जाता है। इस अंत तक, अधिग्रहित छवियों का उपयोग कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता या प्रतिदीप्ति-सकारात्मक क्षेत्र और DAPI धुंधला द्वारा निर्धारित कोशिकाओं की कुल संख्या को मापकर आंतरिक डेक्सट्रान की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह विश्लेषण ओपन-सोर्स इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ किया जा सकता है, जैसे कि सेल प्रोफाइलर या फिजी / इमेजजे, जैसा कि पहले वर्णित 19,20 था। हालांकि, मल्टी-मोड प्लेट रीडर के साथ काम करते समय उपकरण के साथ प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर में अंतर्निहित विश्लेषण अनुप्रयोग शामिल हो सकते हैं जिनका उपयोग मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स की गणना के उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है। कुछ मामलों में, अंतर्निहित सॉफ़्टवेयर विश्लेषण पाइपलाइन उपयोगकर्ता के लिए पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हो सकती है। इसलिए एक गैर-स्वचालित प्रक्रिया, जैसे सेल प्रोफाइलर या फिजी / इमेजजे के साथ तुलना करके प्रारंभिक चरण में सॉफ़्टवेयर को मान्य करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल को निम्नलिखित सामान्य निर्देशों का पालन करके अन्य छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर उपकरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है:

  1. DAPI और इसी dextran छवि के लिए, उपयुक्त फ़ंक्शन को लागू करके पृष्ठभूमि को घटाएं, जिसे अक्सर रोलिंग बॉल फ़ंक्शन कहा जाता है। सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि पृष्ठभूमि शोर कम से कम हो और DAPI और dextran सिग्नल पर कोई घटाव प्रभाव कम से कम न हो।
  2. उच्च डेक्सट्रान सिग्नल के साथ एक फ़ील्ड का उपयोग करते हुए, नाभिक का चयन करने और केवल मैक्रोपिनोसोम का चयन करने के लिए आवश्यक न्यूनतम तीव्रता संकेत सेटिंग निर्धारित करने के लिए तीव्रता सिग्नल सेटिंग्स, जिसे अक्सर थ्रेशोल्ड फ़ंक्शन कहा जाता है, निर्धारित करें।
  3. dextran छवि के लिए, बनाए गए मैक्रोपिनोसोम चयन के भीतर कुल प्रतिदीप्ति की गणना करें या dextran के लिए कुल क्षेत्र सकारात्मक निर्धारित करने के लिए चयन का उपयोग करें।
  4. DAPI छवि के लिए, मौजूद कक्षों की संख्या को प्रतिबिंबित करने के लिए छवि में नाभिक की संख्या निर्धारित करने के लिए चयन का उपयोग करें।
  5. मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स को निर्धारित करने के लिए, कुल डेक्सट्रान प्रतिदीप्ति या क्षेत्र को डीएपीआई द्वारा निर्धारित कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करें।
  6. सभी अधिग्रहित छवियों के लिए इन विश्लेषण चरणों को दोहराएँ एक ही संख्यात्मक सेटिंग्स को लागू करने भर में।
  7. Gen5 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते समय मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स का निर्धारण करने के लिए इन निर्देशों का पालन करें:
    नोट:: अंतर्निहित विश्लेषण पाइपलाइन मान्य किया गया था और फिजी / ImageJ के सापेक्ष गणना में कोई अंतर नहीं पाया गया (चित्र 6A).
    1. इमेजिंग पूरा होने के बाद, मैक्रोपिनोसाइटोसिस के उच्च स्तर के साथ एक छवि का चयन करें। पृष्ठभूमि संकेत निकालें, प्रक्रिया (अनुपूरक चित्र1A) क्लिक करें और छवि प्रीप्रोसेसिंग विकल्प का चयन करें।
    2. Dextran चैनल के लिए, ऑटो का चयन रद्द करें और 5 μm की एक रोलिंग गेंद व्यास का उपयोग करें, ठीक परिणामों को प्राथमिकता दें और 1 चक्र के साथ छवि को चिकना करें।
    3. DAPI चैनल के लिए, स्वत: preprocessing और 1 चिकनी चक्र का उपयोग करें। ठीक पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल के लिए छवि preprocessing कदम जोड़ें; चरण जोड़ेंक्लिक करें। अगला, छवि रोल-आउट (अनुपूरक चित्रा 1B) के अंतर्गत संसाधित छवि का चयन करें और विश्लेषण बटन (अनुपूरक चित्रा 1C) पर क्लिक करें।
    4. विश्लेषण सेटिंग्स के अंतर्गत, सेलुलर विश्लेषण के लिए प्रकार सेट करें। DAPI चैनल का चयन करें और विकल्प (अनुपूरक चित्रा 2A) पर क्लिक करें।
    5. प्राथमिक मुखौटा के लिए, संसाधित DAPI छवि का उपयोग करके, एकल नाभिक का चयन करने के लिए एक मुखौटा बनाएँ। डार्क बैकग्राउंड और ऑटो ऑप्शन का इस्तेमाल करें। इसके अतिरिक्त, निर्धारित करें कि कौन सी सेटिंग्स एकल नाभिक के मुखौटा चयन के लिए अनुमति देती हैं और समाप्त होने पर, यह निर्धारित करने के लिए लागू करें बटन पर क्लिक करें कि क्या मुखौटा उचित रूप से लागू किया गया है।
      नोट:: स्प्लिट टचिंग ऑब्जेक्ट्स को सक्रिय करना और मास्क में छेद भरें विकल्प एकल नाभिक का चयन करने के लिए सबसे अच्छा काम कर सकते हैं। सेल लाइन के आधार पर न्यूनतम और अधिकतम ऑब्जेक्ट आकारों को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है और आमतौर पर 5-40 μm रेंज में सेट किया जाता है। प्राथमिक एज ऑब्जेक्ट्स को शामिल किया जा सकता है, और पूरी छवि का विश्लेषण किया जाना चाहिए। स्लाइडर को संकेत तीव्रता के लिए मुखौटा चयन को समायोजित करने के लिए लागू किया जा सकता है।
    6. अगला, मैक्रोपिनोसोम फ्लोरोसेंट puncta का चयन करने के लिए सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए एक द्वितीयक मुखौटा लागू करें। द्वितीयक मास्क फ़ंक्शन के भीतर माप का उपयोग करें और कोशिकाओं के आकार के आधार पर प्राथमिक मास्क को 40 μm तक विस्तृत करें।
    7. सकारात्मक dextran क्षेत्रों का चयन करने के लिए मास्क विधि में थ्रेशोल्ड फ़ंक्शन और थ्रेशोल्ड का उपयोग करें। यह निर्धारित करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें कि सेटिंग्स सही ढंग से लागू की गई हैं या नहीं।
      नोट:: थ्रेशोल्ड मान निर्धारित करने के लिए, दृश्य रेखा प्रोफ़ाइल उपकरण (अनुपूरक आकृति 2B) का उपयोग करें और एक dextran-धनात्मक क्षेत्र (अनुपूरक चित्र2C) पर एक रेखा आरेखित करें। मैक्रोपिनोसोम का चयन करता है और पृष्ठभूमि संकेत (अनुपूरक चित्र2D) को बाहर करता है जो एक मुखौटा बनाने के लिए सबसे अच्छी सेटिंग निर्धारित करने के लिए मापा तीव्रता का उपयोग करें।
    8. नाभिक और मैक्रोपिनोसोम का चयन करने के लिए उपयुक्त मास्क बनाने के बाद, परिकलित मैट्रिक्स टैब पर क्लिक करें और रुचि के ऑब्जेक्ट-स्तर मैट्रिक्स का चयन करें या बनाएँ का चयन करें या बनाएँ का चयन करें।
    9. मौजूद सभी मैट्रिक्स निकालें और द्वितीयक मास्क के विश्लेषण के लिए इंटीग्रल और एरिया मीट्रिक जोड़ें। ठीक पर क्लिक करें और नए मैट्रिक्स के लिए गणना करें और दिखाएँ का चयन करें। समाप्त होने पर, ठीक पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल में विश्लेषण और गणना जोड़ने के लिए STEP जोड़ें का चयन करें।
    10. भविष्य के उपयोग के लिए अंतिम प्रोटोकॉल सहेजें, फ़ाइल और प्रोटोकॉल इस रूप में सहेजें क्लिक करें.
    11. डेटा विश्लेषण समाप्त होने के बाद, ब्याज के मैट्रिक्स का चयन करें और मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स निर्धारित करने के लिए डेटा निर्यात करें। मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स निम्नानुसार निर्धारित करें:
      Dextran प्रतिदीप्ति प्रति सेल = वस्तु Int_2 [Dextran fluorophore]
      प्रति सेल Dextran क्षेत्र = ऑब्जेक्ट Area_2 [Dextran fluorophore]
      नोट:: coverslips स्वरूप के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, मैट्रिक्स प्रति छवि औसत macropinocytic सूचकांक का माध्य को प्रतिबिंबित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स को सभी छवियों के लिए 'क्षेत्र' या 'इंटीग्रल' के योग को कुल 'सेल काउंट' से विभाजित करके पूरे नमूने के लिए मैन्युअल रूप से गणना की जा सकती है। मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स की गणना में इन दृष्टिकोणों के बीच का अंतर अधिकांश सेटिंग्स में न्यूनतम है। 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप के लिए, मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स की गणना पूरे नमूने के लिए औसत के रूप में की जाती है।
    12. इमेजिंग और बाद के स्वचालित विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल सहेजें। एक ही fluorophores के साथ भविष्य के प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल का पुन: उपयोग करें।
      नोट: लेजर autofocus फ़ंक्शन का उपयोग करते समय, एक नया संदर्भ स्कैन लिया जाना चाहिए जब एक अलग सेल लाइन का विश्लेषण किया जाना है क्योंकि नाभिक और मैक्रोपिनोसोम संभवतः एक अलग विमान के लिए स्थानीयकृत हैं। हर बार जब पहले से निर्धारित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक नया प्रयोग किया जाता है, तो उस प्रयोग के लिए एक्सपोज़र सेटिंग्स को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

6. उपचार के अलावा

सेल उपचार (छोटे अणुओं, जीवविज्ञान, विकास कारकों, चयापचयों आदि) को प्रोटोकॉल के किसी भी चरण में शामिल किया जा सकता है, और सटीक समय अध्ययन के लक्ष्यों और उद्देश्यों पर निर्भर करेगा।

  1. कक्षों को अनुभाग 2 के रूप में तैयार करें.
  2. ब्याज के उपचार को जोड़ने से पहले, सीरम-मुक्त मीडिया में दो बार अपने अंतिम सांद्रता में उपचार और उचित नियंत्रण तैयार करें। मूल्यांकन किए जा रहे प्रतिकृति कुओं की संख्या की मात्रा के बराबर मात्रा में उपचार तैयार करें।
    नोट: सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करने में स्रावित कारकों की भूमिका को देखते हुए, वातानुकूलित मीडिया में रुचि के उपचार को पतला करना पसंद किया जा सकता है। इन उद्देश्यों के लिए, यह अतिरिक्त प्लेटों को बीज करने में सहायक हो सकता है, जैसे कि 6-सेमी या 10-सेमी सेल कल्चर व्यंजन, जब उपचार समाधानों की तैयारी के लिए वातानुकूलित मीडिया उत्पन्न करने के लिए अनुभाग 2 में वर्णित कोशिकाओं को तैयार किया जाता है।
  3. अच्छी तरह से मीडिया को हटाने के बिना, प्रत्येक अच्छी तरह से उपचार समाधान की एक अच्छी तरह से मात्रा जोड़ें। उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को हिलाएं। समय की वांछित राशि के लिए कोशिकाओं incubate.
  4. अनुभाग 3 के साथ जारी रखें।
    नोट:: dextran जोड़ते समय, ताजा मीडिया का उपयोग जोड़ा उपचार, जो macropinocytosis के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं को हटाने का कारण बनता है। इसलिए, एस्पिरेटिंग या वैकल्पिक रूप से उपचार को फिर से जोड़ने या डेक्सट्रान समाधान तैयार करने के लिए वातानुकूलित मीडिया का पुन: उपयोग किए बिना सीधे कुओं में डेक्सट्रान जोड़ना पसंद किया जा सकता है।

Figure 6
चित्रा 6: मैक्रोपिनोसाइटोसिस अवरोधकों के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र का प्रदर्शन। एक नई सेल लाइन में ज्ञात मैक्रोपिनोसाइटोसिस अवरोधकों का परीक्षण करते समय प्राप्त उदाहरण डेटा। PATU8998T कोशिकाओं का उपयोग 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप के लिए किया गया था और क्रमशः (ए) ईहॉप -16 और (बी) ईआईपीए की इंगित सांद्रता के साथ 2 एच और 30 मिनट के लिए इलाज किया गया था। Gen5 सॉफ़्टवेयर या ImageJ द्वारा छवि विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त परिणामों की तुलना दो दृष्टिकोणों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाती है जैसा कि एनएस द्वारा (ए) में इंगित किया गया है। स्केल बार = 25 μm. बार रेखांकन 4 प्रतिकृतियों के साथ एक एकल प्रयोग के औसत और एसडी को दिखाते हैं। सांख्यिकीय महत्व अनुपचारित स्थितियों की तुलना में एक या दो-तरफ़ा एनोवा द्वारा निर्धारित किया गया था। * पी < 0.05; पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

जब उपर्युक्त वर्णित प्रोटोकॉल के चरणों और समायोजन का तदनुसार पालन किया जाता है, तो अंतिम प्रयोगात्मक परिणामों को इस बारे में जानकारी प्रदान करनी चाहिए कि अध्ययन की गई सेल संस्कृति की स्थिति या अवरोधक ब्याज की सेल लाइन में मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रेरित या कम करते हैं या नहीं। इन निष्कर्षों की वैधता को मजबूत करने के लिए, नियंत्रण शर्तों को शामिल करने से परिणामों की जांच के लिए यह निर्धारित करने की अनुमति मिलेगी कि प्रयोग सफलतापूर्वक पूरा हो गया है या नहीं। Macropinocytosis प्रेरण नियंत्रण मैक्रोपिनोसाइटोसिस के सापेक्ष स्तर के बारे में जानकारी प्रदान करेगा। इस उद्देश्य के लिए, लिगैंड ईजीएफ का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है13। AsPC-1 PDAC कोशिकाओं में, dextran जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए 100 ng / mL पर EGF जोड़ने से मैक्रोपिनोसाइटोसिस (चित्रा 5A) सक्रिय हो जाता है। इसके अलावा, मैक्रोपिनोसाइटोसिस के ऑटोक्राइन ईजीएफ सक्रियण को 16-24 घंटे (चित्रा 5 ए) के लिए ग्लूटामाइन की कोशिकाओं से वंचित करके प्रेरित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सेल प्रकार और उपलब्ध साहित्य के आधार पर अन्य प्रेरकों को शामिल किया जा सकता है; इनमें PDGF या WNT3A10,11,12 शामिल हो सकते हैं। सभी कोशिकाएं समान रूप से व्यवहार नहीं करती हैं, और केआरएस उत्परिवर्ती कोशिकाएं संरचनात्मक मैक्रोपिनोसाइटोसिस 13 प्रदर्शित कर सकती हैं। एक उदाहरण एमआईए PaCa-2 PDAC सेल लाइन है, जो EGF उपचार का जवाब नहीं देता है। यहां, ज्ञात मैक्रोपिनोसाइटोसिस इनहिबिटर के अलावा यह सत्यापित करेगा कि मनाया और परिमाणित फ्लोरोसेंट पंक्टा वास्तव में मैक्रोपिनोसोम हैं। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले निरोधात्मक नियंत्रणों में सोडियम-हाइड्रोजन एक्सचेंजर इनहिबिटर ईआईपीए शामिल है, जो एक विशिष्ट मैक्रोपिनोसाइटोसिस इनहिबिटर (चित्रा 5 बी) 4 है। अन्य नियंत्रणों को भी शामिल किया जा सकता है, जैसे कि Rac1 अवरोधक EHop-016 (चित्रा 5B), पाक अवरोधक FRAX597, या PI3K अवरोधक LY294002; हालांकि, मैक्रोपिनोसाइटोसिस पर उनका प्रभाव मॉडल विशिष्ट 13 हो सकता है।

सेल लाइनों के लिए जो पहले मैक्रोपिनोसाइटोसिस और इनहिबिटर के लिए मूल्यांकन नहीं किया गया है, खुराक-प्रतिक्रिया वक्र मैक्रोपिनोसाइटोसिस की पुष्टि करने और भविष्य के उपयोग के लिए इष्टतम दवा एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण है। इन उद्देश्यों के लिए, 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप प्रोटोकॉल का उपयोग एक सेल लाइन में संवैधानिक मैक्रोपिनोसाइटोसिस को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसका पहले प्रयोगशाला में मूल्यांकन नहीं किया गया था, PATU8998T PDAC कोशिकाएं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ये कोशिकाएं मैक्रोपिनोसाइटोसिस का प्रदर्शन करती हैं, डेक्सट्रान अपटेक (ईएचओपी -016 और ईआईपीए) के दो ज्ञात अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन किया गया था। जैसा कि सचित्र है, खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग ने धीरे-धीरे उच्च दवा सांद्रता (चित्रा 6 ए, बी) पर मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स को कम कर दिया, जिससे इन कोशिकाओं में संवैधानिक Rac1-निर्भर मैक्रोपिनोसाइटोसिस के अस्तित्व की पुष्टि हुई। इसके अलावा, परिणाम इस सेल लाइन में मैक्रोपिनोसाइटोसिस का अध्ययन करते समय भविष्य के प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले इष्टतम दवा सांद्रता के लिए जानकारी प्रदान करते हैं।

Figure 7
चित्र7: परेशानी-शूटिंग की स्थिति जिसका सामना किया जा सकता है। (A) छवि अतिरंजित है, जैसा कि गुलाबी रंग में दर्शाया गया है। (बी) छवि आउट-ऑफ-फोकस है। (C) छवि में dextran धब्बे या धब्बे होते हैं। (d) छवि में अवशेष होते हैं। (ई) छवि में एक बुलबुला होता है। (एफ) कोशिकाएं दवा-प्रेरित ऑटोफ्लोरेसेंस दिखाती हैं। स्केल बार = 25 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 1: छवि preprocessing के स्क्रीनशॉट. (ए) प्रक्रिया बटन। (बी) छवि रोल-आउट। (c) विश्लेषण बटन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: छवि परिमाणीकरण सेटिंग्स का स्क्रीनशॉट। (ए) विश्लेषण सेटिंग्स। (ख) लाइन प्रोफ़ाइल उपकरण देखें. (c) dextran सकारात्मक क्षेत्र पर लाइन। (डी) देखें लाइन प्रोफ़ाइल परिणाम कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रयोगों और डेटा अधिग्रहण की गुणवत्ता अत्यधिक अभिकर्मकों की गुणवत्ता, सेटिंग्स के अनुकूलन, और कवरलिप्स और माइक्रोप्लेट की स्वच्छता पर निर्भर करती है। अंतिम परिणामों को प्रतिकृतियों के बीच न्यूनतम भिन्नता देनी चाहिए; हालांकि, जैविक विविधताएं स्वाभाविक रूप से होती हैं या अन्यथा कई कारकों के कारण हो सकती हैं। सेल घनत्व कोशिकाओं को मैक्रोपिनोसाइटोसिस प्रेरकों या अवरोधकों के लिए कम या ज्यादा प्रतिक्रिया करने का कारण बन सकता है। इसलिए, प्रोटोकॉल में यहां प्रस्तावित 80% confluency का पालन करना महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, यह माइक्रोप्लेट निर्माताओं द्वारा अच्छी तरह से प्रलेखित है कि मीडिया वाष्पीकरण 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर होता है। यहां, बाहरी कुएं आंतरिक कुओं के सापेक्ष अधिक वाष्पीकरण के अधीन हैं और इस प्रकार मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, विश्लेषण में बाहरी कुओं को शामिल नहीं करने का विकल्प चुना जा सकता है और इसके बजाय इन कुओं को पीबीएस के साथ भरें ताकि आंतरिक कुओं को व्यापक वाष्पीकरण से बचाने के लिए 'बफर वॉल' का निर्माण किया जा सके।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अधिग्रहण सफलतापूर्वक पूरा हो गया था, प्रत्येक स्थिति के लिए छवियों का नेत्रहीन निरीक्षण करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यह शर्तों के पहले सेट की इमेजिंग के दौरान किया जा सकता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि लागू सेटिंग्स वास्तव में सही हैं और यदि आवश्यक हो तो हस्तक्षेप की अनुमति दें। हो सकने वाली विशिष्ट समस्याएँ निम्नानुसार हैं; छवियों overexposed हैं (चित्रा 7A), छवियों को आउट-ऑफ-फोकस (चित्रा 7B) कर रहे हैं, छवियों फ्लोरोसेंट dextran (चित्रा 7C) या अवशेषों (चित्रा 7D) के धब्बे होते हैं, छवियों में बुलबुले (चित्रा 7E) होते हैं, या autofluorescence dextran या DAPI चैनल (चित्रा 7F) में दिखाई देता है। पहले दो मुद्दों के लिए, overexposure और आउट-ऑफ-फोकस (चित्रा 7A, B), छवि अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित किया जाना है, और अधिग्रहण को दोहराया जाना चाहिए। इसके अलावा, ऑटोफोकस को ठीक से काम करने के लिए प्लेट और कवरलिप्स को साफ किया जाना चाहिए। यदि केवल कुछ छवियां आउट-ऑफ-फ़ोकस हैं, तो विशिष्ट छवियों या पूरे कुएं को 'मास्क' छवि फ़ंक्शन का उपयोग करके विश्लेषण से भी बाहर रखा जा सकता है। यह वही फ़ंक्शन उन छवियों को बाहर करने के लिए लागू किया जा सकता है जिनमें डेक्सट्रान चैनल (चित्रा 7 सी), अशुद्धियों (चित्रा 7 डी), या बुलबुले (चित्रा 7 ई) में धब्बे होते हैं। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि नमूनों को अच्छी तरह से धोया गया है, डेक्सट्रान को पूरी तरह से भंग कर दिया गया है, जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पर डेक्सट्रान समाधान को गर्म करके और भंवर द्वारा सुधारा जा सकता है, और यह कि प्रयोग ताजा तैयार और साफ अभिकर्मकों के साथ किया जाता है। अंत में, दवा-प्रेरित autofluorescence हो सकता है और macropinocytosis अवरोधक EIPA के लिए काफी आम है जो FITC और DAPI चैनल में फ्लोरेसेस करता है, खासकर जब पहले DAPI चैनल में उत्साहित होता है। एक समाधान DAPI से पहले FITC चैनल का अधिग्रहण है। वैकल्पिक रूप से, TMR-dextran का उपयोग FITC-dextran के बजाय किया जा सकता है, या एक्सपोज़र सेटिंग्स के लिए, लाभ को बढ़ाते हुए प्रकाश तीव्रता और एक्सपोज़र समय को कम किया जा सकता है।

मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स की गणना करने के लिए, प्रत्येक छवि में सेल संख्या निर्धारित करने के लिए परमाणु डीएपीआई स्टेनिंग का उपयोग किया जाता है। इस धुंधला प्रक्रिया को लागू करना आसान है और कोशिकाओं की संख्या के लिए एक विश्वसनीय रीडआउट है और इस प्रकार प्रति सेल सापेक्ष डेक्सट्रान अपटेक की गणना के लिए। इस दृष्टिकोण के लिए एक चेतावनी यह है कि यह सेल के आकार में अंतर पर विचार नहीं करता है, जो विभिन्न सेल लाइनों की तुलना करते समय या औषधीय उपचार के जवाब में हो सकता है। इन मामलों में, जहां सेल के आकार को मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स को प्रभावित करने का संदेह है, सेल क्षेत्र का उपयोग डेक्सट्रान अपटेक के सामान्यीकरण के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णित है। यह निर्धारण के बाद एक सेल मास्क दाग को शामिल करने या चरण कंट्रास्ट या उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग को शामिल करने के लिए प्रोटोकॉल को थोड़ा संशोधित करके प्राप्त किया जा सकता है। यह भी अत्यधिक अनुशंसित है कि वर्णित परख का उपयोग करके किसी भी निष्कर्ष का पालन करने के लिए मूल्यांकन करें कि क्या मैक्रोपिनोसाइटोसिस एक पोषक तत्व आपूर्ति मार्ग है जो विशेष सेल-आधारित प्रणाली में सेलुलर फिटनेस में योगदान देता है। यह proliferative क्षमता, उत्तरजीविता, या पोषक तत्वों में व्यवहार्यता का आकलन करके प्राप्त किया जा सकता है-समाप्त स्थितियों के साथ और बिना extracellular albumin4,7 के अलावा के बिना। इसके अतिरिक्त, एक DQ-BSA पल्स-चेस परख के लिए सबूत प्रदान कर सकते हैं कि क्या macropinocytosis में परिवर्तन लाइसोसोम में एल्बुमिन गिरावट में परिवर्तन के लिए अनुवाद. उच्च आणविक भार डेक्सट्रान की तरह, डीक्यू-बीएसए को मैक्रोपिनोसाइटोसिस के माध्यम से आंतरिक किया जाता है और लाइसोसोम को वितरित किया जाता है, जहां यह प्रोटियोलिटिक पाचन 4 के बाद फ्लोरेसेस होता है। फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान अपटेक की समानता को देखते हुए, वर्णित विधि को डीक्यू-बीएसए अपटेक का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसी तरह, इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंटली टैग किए गए कार्गो के उत्थान का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एल्ब्यूमिन, लिपिड, या नेक्रोटिक सेल मलबे को मैक्रोपिनोसाइटोसिस के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए जाना जाता है। सभी अवसरों पर, इन अनुकूलन निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुरूप होना चाहिए, और प्रयोगात्मक नियंत्रण परख को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

माइक्रोस्कोपिक छवि विश्लेषण और परिमाणीकरण मैक्रोपिनोसाइटोसिस का आकलन करने के लिए एक पसंदीदा दृष्टिकोण है और क्षेत्र में मानक बन गया है4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20 ,21,22. यह नमूनों के दृश्य निरीक्षण के लिए अनुमति देता है और मैक्रोपिनोसोम संख्या, आकार और स्थान के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, नेत्रहीन छवियों का निरीक्षण करने की संभावना सेल फिटनेस और व्यवहार्यता के मूल्यांकन और दवा प्रशासन के कारण कलाकृतियों और / या ऑटोफ्लोरेसेंस की पहचान की अनुमति देती है। अन्य प्रस्तावित परिमाणीकरण विधियों की तुलना में, जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री, इन आंकड़ों को अन्यथा खो दिया जा सकता है या अनदेखा किया जा सकता है और झूठी सकारात्मक या नकारात्मक 23 का कारण बन सकता है। हालांकि, इमेजिंग अधिक श्रम-गहन है और प्रवाह साइटोमेट्री के रूप में पक्षपाती डेटा अधिग्रहण के लिए अधिक प्रवण है। यहां, हमने प्रोटोकॉल के स्वचालन के माध्यम से इन बाधाओं को दूर किया है, जिससे पूर्वाग्रह, श्रम, लागत और समय कम हो जाता है।

मैक्रोपिनोसाइटोसिस के कई मॉड्यूलेटर सबसे अधिक संभावना अज्ञात रहते हैं और, कैंसर जैसे कुछ विकृतियों में मैक्रोपिनोसाइटिक मार्ग के महत्व को देखते हुए, उनकी खोज संभवतः उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण 2,3 के विकास के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकती है। इन मॉड्यूलेटरों की पहचान यौगिकों की उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है, जिसके लिए यहां प्रस्तावित विधि एक आधारशिला के रूप में कार्य कर सकती है। उल्लिखित प्रोटोकॉल का उद्देश्य मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ प्रयोग करना है। हालांकि, 96-वेल प्लेट प्रारूप को उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित और अनुकूलित किया जा सकता है। 384 या 1536-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट तक अच्छी तरह से प्रारूप को बढ़ाने से उपयोगकर्ता को उन यौगिकों की संख्या बढ़ाने की अनुमति मिलेगी जिन्हें एक प्लेट पर परीक्षण किया जा सकता है। इसके अलावा, सेल सीडिंग, प्लेट वॉशिंग, कंपाउंड और डेक्सट्रान प्रशासन का रोबोटीकरण मैनुअल हैंडलिंग और अच्छी तरह से अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता को कम करेगा, और इस तरह स्केलेबिलिटी में सुधार करेगा। आखिरकार, उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का एक अनुकूलन मैक्रोपिनोसाइटोसिस को विनियमित करने वाले नए कारकों की पहचान करने में बहुत सुविधा प्रदान करेगा।

कुल मिलाकर, यहां प्रस्तावित विधि ब्याज की कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसाइटोसिस के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण है, प्रक्रिया के नियामकों की पहचान, और ज्ञात अवरोधकों के लिए दवा सांद्रता का अनुकूलन। इसके अलावा, प्रोटोकॉल डेक्सट्रान के अलावा अन्य कार्गो के मैक्रोपिनोसाइटिक अपटेक का आकलन करने के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में काम कर सकता है, और लीड यौगिकों की पहचान करने के उद्देश्य से उच्च सामग्री स्क्रीनिंग जो संभावित रूप से उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में परिणाम कर सकती है।

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Disclosures

सी.C एक जारी पेटेंट पर एक आविष्कारक है जिसका शीर्षक है "कैंसर निदान, चिकित्सीय, और मैक्रोपिनोसाइटोसिस से जुड़ी दवा की खोज," पेटेंट नंबर: 9,983,194।

Acknowledgments

इस काम को NIH / NCI अनुदान (R01CA207189, R21CA243701) द्वारा C.C को समर्थित किया गया था। KMO.G. एक TRDRP पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप अवार्ड (T30FT0952) का प्राप्तकर्ता है। BioTek Cytation 5 सैनफोर्ड बर्नहैम प्रीस सेल इमेजिंग कोर का एक हिस्सा है, जो NCI कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट (P30 CA030199) से वित्तीय सहायता प्राप्त करता है। आंकड़े 1-3 BioRender का उपयोग कर बनाया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25053CI 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisherbrand 05-408-129
10-cm Tissue culture dish Greiner Bio-One 664160 CELLSTAR
15 mL Centrifuge tube Fisherbrand 07-200-886
2 L Beaker Fisherbrand 02-591-33
24-well Tissue culture plate Greiner Bio-One 662160 CELLSTAR
25 mL Reagent reservoir Genesee Scientific Corporation 28-121
500 mL Beaker Fisherbrand 02-591-30
6-cm Tissue culture dish Greiner Bio-One 628160 CELLSTAR
8-Channel aspiration adapter Integra Biosciences 155503
8-Channel aspiration adapter for standard tips Integra Biosciences 159024
95% Ethanol Decon Laboratories Inc 4355226
Ammonia-free glass cleaner Sparkle FUN20500CT
Black 96-well high-content screening microplate PerkinElmer 6055300 CellCarrier-96 Ultra
Cotton-tipped applicator Fisherbrand 23-400-101
Coverslips Fisherbrand 12-545-80 12 mm diameter
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek CYT5FW
DAPI Millipore Sigma 5.08741
Dextran 70 kDa - FITC Life Technologies D1822 Lysine-fixable
Dextran 70 kDa - TMR Life Technologies D1819
DMSO Millipore Sigma D1435
DPBS Corning 21031CV Without Calcium and Magnesium
Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5
Formaldehyde, 37% Ricca Chemical RSOF0010-250A ACS Reagent Grade
Glycerol Fisher BioReagents BP229-1
Hardening fluorescence mounting media Agilent Tech S302380-2 DAKO
Hoechst 33342 Millipore Sigma B2261
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Chemical A144-212 Certified ACS Plus, 36.5%–38.0%
Lint-free wipes Kimberly-Clark 34155 Kimwipes
Miscroscope slides Fisherbrand 12-544-1 Premium plain glass
Multichannel pipette Gilson FA10013 8 channels, 0.5–10 µL
Multichannel pipette Gilson FA10012  12 channels, 20–200 µL
Multichannel pipette Gilson FA10011 8 channels, 20–200 µL
Parafilm M Pechiney PM996
Plastic wrap Kirkland Signature 208733 Stretch-Tite
Silicone isolators Grace Bio Labs Inc 664107 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm
Slide adapter Biotek 1220548
Wash bottle Fisherbrand FB0340922C

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References

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जीव विज्ञान अंक 174
फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए मैक्रोपिनोसोम के परिमाणीकरण के लिए स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण
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Galenkamp, K. M. O., Galapate, C. M., Zhang, Y., Commisso, C. Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes. J. Vis. Exp. (174), e62828, doi:10.3791/62828 (2021).

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