Summary
Çok kuyulu mikro plakalar kullanan otomatik tahliller, tek bir deneyde çok sayıda koşulun değerlendirilmesine izin vererek yol düzenleyicilerini tanımlamak için avantajlı yaklaşımlardır. Burada, köklü makropinozom görüntüleme ve niceleme protokolünü 96 kuyulu bir mikro plaka formatına uyarladık ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak otomasyon için kapsamlı bir anahat sağladık.
Abstract
Makropinositoz, hücrelerin toplu endositoz yoluyla proteinler, patojenler ve hücre kalıntıları gibi büyük hücre dışı kargoları içselleştirmesine izin veren spesifik olmayan bir sıvı fazlı alım yoludur. Bu yol, bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesi ve kanser hücresi metabolizması da dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar. Biyolojik fonksiyondaki bu önem göz önüne alındığında, hücre kültürü koşullarının incelenmesi, bu yolun düzenleyicilerini belirleyerek ve yeni terapötik yaklaşımların keşfinde kullanılacak koşulları optimize ederek değerli bilgiler sağlayabilir. Çalışma, standart laboratuvar ekipmanı kullanılarak otomatik bir görüntüleme ve analiz tekniğini ve yapışık hücrelerdeki makropinositik indeksinin hızlı bir şekilde ölçülmesi için bir hücre görüntüleme çok modlu plaka okuyucusunu tanımlamaktadır. Otomatik yöntem, yüksek moleküler ağırlıklı floresan dektranın alımına dayanır ve cam kapaklara monte edilmiş bir deneyde veya sabit numunelerde birden fazla koşulun değerlendirilmesini kolaylaştırmak için 96 kuyulu mikro plakalara uygulanabilir. Bu yaklaşım, hem zaman kazandıran hem de uygun maliyetli olurken tekrarlanabilirliği en üst düzeye çıkarmayı ve deneysel varyasyonu azaltmayı amaçlamaktadır.
Introduction
Makropinositozun spesifik olmayan endositotik yolu, hücrelerin hücre dışı sıvı ve bileşenlerinin toplu alımı yoluyla besin maddeleri, proteinler, antijenler ve patojenler de dahil olmak üzere çeşitli hücre dışı bileşenleri içselleştirmelerini sağlar1. Çok sayıda hücre tipinin biyolojisi için önemli olsa da, giderek artan bir şekilde, makropinositoz yolunun, makropinositik alım yoluyla tümör hücrelerinin besin tükenmiş bir mikroçevrenin varlığında hayatta kalabildiği ve çoğalabildiği tümör biyolojisinde önemli bir rol oynadığı açıklanmaktadır2,3. Albümin ve hücre dışı matris ve nekrotik hücre kalıntıları da dahil olmak üzere hücre dışı makromoleküllerin alınması, makropinozom ve lizozom füzyon aracılı kargo katabolizması ile amino asitler, şekerler, lipitler ve nükleotidler oluşturarak biyokütle üretimi için alternatif bir besin kaynağı sağlar4,5,6,7,8.
Makropinositozun indüksiyonu ve regülasyonu karmaşıktır ve hücresel içeriğe bağlı olarak değişebilir. Şimdiye kadar, epidermal büyüme faktörü (EGF), trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF), galektin-3 ve Wnt3A9,10,11,12,13 gibi çeşitli makropinositoz indükleyicileri tanımlanmıştır ve ligandları içerir. Ek olarak, tümör mikroçevrimini taklit eden kültleme koşulları yolun aktivasyonunu tetikleyebilir. Pankreas düktal adenokarsinom (PDAC) tümörleri, özellikle hem kanser hücrelerine hem de kanserle ilişkili fibroblastlara (CAL) sağkalım için makropinositoza güvenmesine neden olan amino asit glutamin için besinden yoksundur7,13,14,15. Ayrıca, hipoksi ve oksidatif stres gibi tümör stresleri bu atma yolunu aktive edebilir16. Makropinositozu indükleyebilecek çok sayıda dışsal influencer'a ek olarak, çeşitli hücre içi yollar makropinozom oluşumunu kontrol eder. Makropinosik makineleri başlatmak için onkojenik Ras aracılı dönüşüm yeterlidir ve birden fazla kanser türü onkojenik Ras güdümlü konsitültif makropinositoz4,5,9,17 gösterir. Alternatif olarak, kanser hücrelerinde ve CAL'lerde makropinositozu aktive etmek için vahşi tip Ras aktivasyonu ve Ras-bağımsız yollar tanımlanmıştır10,11,15,18. İnhibitör tedavileri ile birlikte çeşitli in vitro modellerin kullanılması, sodyum-hidrojen eşanjörleri, küçük GTPase Rac1, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), p21-aktif kinaz (Pak) ve AMP-aktive protein kinaz (AMPK)4,13,15 içeren çeşitli makropinositoz modülatörlerinin tanımlanmasına neden olmuştur. . Bununla birlikte, makropinositozu düzenleyen tarif edilen faktörlerin ve koşulların çokluğu göz önüne alındığında, daha birçok modülatör ve uyaranın keşfedilmemiş kalması düşünülebilir. Yeni modülatörlerin ve uyaranların tanımlanması, tek bir deneyde çok sayıda koşulun otomatik olarak değerlendirilmesi ile kolaylaştırılabilir. Bu metodoloji makropinozom oluşumunda rol oynayan faktörlere ışık tutabilir ve bu yolu hedefleyen yeni küçük moleküllerin veya biyolojiklerin keşfine izin verebilir.
Burada, in vitro kanser hücrelerinde makropinositozun kapsamını belirlemek için daha önce belirlediğimiz protokolümüzü 96 kuyu mikro plaka formatına ve otomatik görüntüleme ve niceleme19,20'ye uyarladık. Bu protokol, makropinositoz in vitro ve in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18 belirlemek için sahada bir standart haline gelen floresan mikroskopiye dayanmaktadır. 19,20,21,22. Makropinozomlar, yüksek moleküler ağırlık dektranı (yani, 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23 gibi büyük makromolekülleri içselleştirme yetenekleri sayesinde diğer endosit yollarından ayırt edilebilir. Böylece, makropinozomlar hücre dışı olarak uygulanan florofor etiketli 70 kDa dektran alımı ile tanımlanabilir. Sonuç olarak, makropinositik vesiküller, 0,2-5 μm arasında değişen boyutlara sahip floresan puncta hücre içi kümeler olarak kendini gösterir. Bu puncta mikroskobik olarak görüntülenebilir ve daha sonra hücredeki makropinositozun kapsamını belirlemek için ölçülebilir - 'makropinositik indeks'.
Bu protokolde, 96 kuyulu bir mikro plaka ve kapaklar üzerinde 96 kuyulu bir mikro plaka ve kapaklar üzerinde yapışan hücre in vitrolarındaki makropinozomları standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak görselleştirmek için gerekli adımlar açıklanmıştır (Şekil 1). Buna ek olarak, bir hücre görüntüleme çok modlu plaka okuyucu kullanarak makropinositik indeksin görüntü alımını ve nicelliğini otomatikleştirmek için talimatlar sağlanır. Bu otomasyon, daha önce açıklanan protokollerimize kıyasla zaman, maliyet ve çabayı azaltır19,20. Buna ek olarak, istemeden önyargılı görüntüleme alımını ve analizini önler ve böylece tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği arttırır. Bu yöntem, farklı hücre türlerine veya plaka okuyucularına kolayca uyarlanabilir veya boyut, sayı ve konum gibi alternatif makropinozom özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. Burada açıklanan yöntem özellikle makropinositozu indükleyen hücre kültürü koşullarının taranması, yeni modülatörlerin tanımlanması veya bilinen inhibitörlerin ilaç konsantrasyonlarının optimizasyonu için uygundur.
Şekil 1: Yandaş hücrelerdeki 'makropinositik indeksi' belirlemek için otomatik tahlil şeması. BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malzemelerin hazırlanması
- 20 mg/mL'lik bir çözelti elde etmek için PBS'de FITC veya tetrametilrhodamin (TMR) ile etiketlenmiş 70 kDa dektranı çözün. Aliquotları -20 °C'de saklayın.
- 1 mg/mL'lik bir çözelti elde etmek için DAPI'yı ddH2O'da çözün. Aliquotları -20 °C'de saklayın.
DİkKAT: DAPI potansiyel bir kanserojendir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. - Sabitleme gününde PBS'de taze %3,7 ACS sınıfı formaldehit hazırlayın.
DİkKAT: Formaldehit fiksatif, bilinen bir kanserojendir ve solunursa toksiktir. Çözeltiyi kimyasal bir duman kaputunda solumaktan kaçınmak ve dikkatli bir şekilde işlemek için yapın. - Asitle yıkanmış kapak örtüleri hazırlayın.
- 12 mm çapında 28 g borosilikat cam kapakları ısıtmak için 500 mL beher ve su banyosu kullanın ve 1 M HCl'nin 100 mL'sinde 56 °C'de 24 saat boyunca 1,5 kalınlıkta 1,5 kalınlıkta kapsamlı buharlaşmayı önlemek için beheri plastik sargı ile kapatın.
DİkKAT: HCl, oldukça aşındırıcı olan ve bu nedenle özenle ele alınması ve solunmasını önlemek için kimyasal duman kaputunda kullanılması gereken güçlü bir asittir. - Kapakları damıtılmış suyla yıkayın. Yıkamayı 4 kez tekrarlayın. Daha sonra kapakları% 95 etanol ile yıkayın. Yıkamayı 4 kez tekrarlayın.
- Asitle yıkanmış kapakları, %95 etanolde dalgıçlık yoluyla steriliteyi koruyarak ileride kullanılmak üzere oda sıcaklığında bir hücre kültürü kabında saklayın. Kapsamlı buharlaşmayı önlemek için çanağı parafilm ile kapatın.
- 12 mm çapında 28 g borosilikat cam kapakları ısıtmak için 500 mL beher ve su banyosu kullanın ve 1 M HCl'nin 100 mL'sinde 56 °C'de 24 saat boyunca 1,5 kalınlıkta 1,5 kalınlıkta kapsamlı buharlaşmayı önlemek için beheri plastik sargı ile kapatın.
2. Hücrelerin hazırlanması
- İlgi çekici hücrelerle birleştiğinde 10 cm'lik bir doku kültürü plakası kullanarak, ortamı aspire edin ve hücreleri 37 °C'de önceden ısıtılmış 5 mL DPBS ile durulayın.
- 1,5 mL önceden ısıtılmış %0,25 tripsin ekleyerek ve 37 °C'de inkübe ederek hücreleri plakadan ayırın.
NOT: İlgi çekici hücreleri ayırmak için gereken tripsin inkübasyon süresi ampirik olarak belirlenmeli ve geleneksel bir ışık mikroskobu altında müfreze gözlemlenerek doğrulanabilir. - Hücreleri 15 mL santrifüj tüpünde toplayın ve tripsinleri söndürmek için 4,5 mL tam ortam ekleyin.
- Hücreleri 200 x g'da 3 dakika santrifüjleme ile pelet ve süpernatantı aspire edin.
- Tohumlama için tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre peletini yeterli miktarda önceden ısıtılmış tam ortama yeniden depolayın.
- Hücreleri kapaklı 24 kuyulu bir plakaya veya 96 kuyu mikro plaka formatına (Şekil 1) tohumla devam edin.
NOT: Çoğalma oranları ve boyutu hücre çizgileri arasında değiştiğinden, tohumlanacak hücre sayısı her hücre hattı için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu protokol, makropinozom etiketleme gününde% 80 hücre konfeksiyonlu yapışık kanser hücreleri için optimize edilmiştir. Hücre konflüensi makropinositik kapasiteyi etkileyebilir ve bu da ampirik olarak belirlenmelidir.- Kapak kılıfı formatında 24 kuyu plakası
- 24 kuyulu bir doku kültürü plakasına kapaklar ekleyin, etanol banyosundan tek bir kapak sapını kavramak için asalar kullanın. Fazla etanol çıkarmak için kapak kılıfını plakanın iç duvarına dokunun ve kapak kapağını bir kuyunun dibine düz yerleştirin.
- Etanol buharlaşsın ve kapak kapağını DPBS ile 2 kez yıkayın.
- Her kuyuya 500 μL hücre süspansiyonu ekleyerek kapak kapağının üzerine hücreleri tohumla. Makropinozom etiketlemesinden önceki gün hücre konflüensi %60-%80'e ulaşana kadar hücreleri %5 CO2'li 37 °C hücre inkübatörüne yerleştirin.
- Makropinozom etiketlemeden bir gün önce, medyayı kuyulardan epire edin ve her kuyuya 500 μL önceden ısıtılmış serumsuz ortam ekleyin ve hücreleri 16-24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C hücre inkübatörüne yerleştirin.
NOT: Çalışılacak koşullara bağlı olarak, makropinositoza neden olabilecek ve normalde serumda bulunan büyüme faktörlerinin etkilerini azaltmak için serumsuz ortam önerilir. Bununla birlikte, serum açlığın çoğalma ve otofaji gibi diğer hücresel süreçleri etkileyebileceği düşünülmelidir. Artık serum hücrelerin makropinositik kapasitesini ve inhibitör aktivitesini etkileyebileceğinden, hücrelerin 500 μL önceden uyarılmış DPBS ile 1 veya 2 kez hafifçe durulanarak serumun çıkarılması iyileştirilebilir.
- 96 kuyulu mikro plaka formatı
- Hücre süspansiyonu 25 mL reaktif rezervuara aktarın. Çok kanallı pipet (8 veya 12 kanal) kullanarak, optik olarak net siklik olefin veya cam tabanlı siyah 96 kuyulu yüksek içerikli bir tarama mikro plakasının her kuyusuna hücre süspansiyonunun 100 μL tohumunun tohumla.
- Makropinozom etiketlemesinden önceki gün hücre konflüensi %60-%80'e ulaşana kadar hücreleri %5 CO2'li 37 °C hücre inkübatörüne yerleştirin.
- Makropinozom etiketlemeden bir gün önce, vakum pompasına bağlı standart uçlar için çok kanallı pipet (8 veya 12 kanal) veya çok kanallı aspirasyon adaptörü kullanarak medyayı her kuyudan çıkarın ve atın.
- Reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet (8 veya 12 kanal) kullanarak, her kuyuya 100 μL önceden ısıtılan serumsuz ortam ekleyin. Hücreleri 16-24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C hücre inkübatörüne yerleştirin.
NOT: Çalışılacak koşullara bağlı olarak, makropinositoza neden olabilecek ve normalde serumda bulunan büyüme faktörlerinin etkilerini azaltmak için serumsuz ortam önerilir. Bununla birlikte, serum açlığın çoğalma ve otofaji gibi diğer hücresel süreçleri etkileyebileceği düşünülmelidir. Artık serum hücrelerin makropinositik kapasitesini ve inhibitör aktivitesini etkileyebileceğinden, hücrelerin 100 μL önceden uyarılmış DPBS ile 1 veya 2 kez hafifçe durulanarak serumun çıkarılması iyileştirilebilir.
- Kapak kılıfı formatında 24 kuyu plakası
3. Makropinosome etiketleme
- Kapak kılıfı formatında 24 kuyu plakası
- Kuyuları aspire edin ve 1 mg/mL florofor etiketli yüksek moleküler ağırlık (70 kDa) dektran ile 200 μL serumsuz ortam ekleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca 37 °C hücre inkübatörüne yerleştirin.
NOT: Çalışılacak koşullara bağlı olarak, taze ortam kullanmak yerine, hücrelerin makropinositik kapasitesini etkileyebilecek egf veya inhibitör bileşikler gibi salgılanmış veya eklenmiş faktörler içereceğinden, dektran yüklemesi için koşullandırılmış ortamın yeniden kullanılması tercih edilebilir. - Ortamı epire edin ve önceden soğmuş bir yıkama şişesi kullanarak hücreleri buz gibi PBS ile 5 kez hafifçe ama hızlı bir şekilde yıkayın. Kapak örtülerine yapışan dektran agregalarının yerinden çıkmalarına yardımcı olmak için yıkamalar sırasında plakayı elle sıkıca çalkalayın.
- %3,7 formaldehitin 350 μL'sini ekleyerek ve 20 dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri sabitle. Ardından, fiksasyon çözeltisini epire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
- PBS'de çekirdeği 350 μL 2 μg/mL DAPI ile lekele. 20 dakika sonra, DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri PBS üç kez yıkayın.
- Görüntüleme otomasyonu için gerekli olan kapak örtülerinin eşit aralık ve tekrarlanabilir lokalizasyonunu elde etmek için silikon izolatörleri mikroskop kaydırağı üzerine yan yana yerleştirin (Şekil 2A,B).
NOT: Mikroskop slaydının tamamı toplam 3 izolatörle doldurulabilir. - Her kapak için, izolatörnün açık alanı içindeki mikroskop kaydırasına bir damla sertleştirici floresan montaj ortamı ekleyin (Şekil 2C). Tiftiksiz bir mendilin üzerindeki kapak uçlarının yanına hafifçe dokunarak, tokmak kullanarak bir kapak kapağı alın ve fazla PBS'yi çıkarın.
- Kapak kapağını montaj medyasının damlasına baş aşağı yerleştirin (Şekil 2D). Kabarcıkları montaj medyasından çıkarmak için kapalı tokmaklar kullanarak kapak kılıflarına hafifçe dokunun (Şekil 2E).
- Slaytları karanlık bir ortamda saklayın ve montaj ortamının oda sıcaklığında kurumasını bekleyin, genellikle 16-24 saat sürer. Slaytlar artık 2 haftaya kadar -20 °C'de görüntülenebilir veya saklanabilir.
- Görüntülemeden önce, izolatörleri mikroskop slaydından çıkarın. Slaytların oda sıcaklığına dengelensin ve amonyak içermeyen cam temizleyici ile ıslanmış pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak kapakları temizleyin. Daha sonra, kapak kapağını temizlemek ve kuru bırakmak için% 70 etanol ile ıslatlanmış temiz bir pamuk uçlu aplikatör kullanın.
- Kuyuları aspire edin ve 1 mg/mL florofor etiketli yüksek moleküler ağırlık (70 kDa) dektran ile 200 μL serumsuz ortam ekleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca 37 °C hücre inkübatörüne yerleştirin.
Şekil 2: Kapakları silikon izolatörlü bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirmek. (A) Silikon izolatörlere basılır ve mikroskop kaydırağı yapıştırılır. (B) Tüm mikroskop slaydı toplam 3 izolatörle doldurulabilir, bu da kapak kapaklarının eşit aralıklarla ve tekrarlanabilir lokalizasyonuyla sonuçlanır. (C) Her kapak için, izolatörnün açık alanı içindeki mikroskop kaydırasına bir damla floresan montaj ortamı ekleyin. (D) Toparlama kullanarak, 24 kuyu plakasından bir kapak kapağı alın ve montaj medyasının damlasına baş aşağı yerleştirin. (E) Kapak ve mikroskop kaydırağı arasında kabarcıklar bulunduğunda, kabarcıkları çıkarmak için kapalı tokmaklar kullanarak kapak kılıflarına hafifçe dokunun. BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- 96 kuyulu mikro plaka formatı
- Kuyuları vakuma bağlı çok kanallı bir aspirasyon adaptörü kullanarak epire edin ve kuyulara 1 mg/mL florofor etiketli yüksek moleküler ağırlık (70 kDa) dektran ile 40 μL serumsuz ortam ekleyin. Hücreleri 37 °C hücre inkübatöründe 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Çalışılacak koşullara bağlı olarak, taze ortam kullanmak yerine, hücrelerin makropinositik kapasitesini etkileyebilecek egf veya inhibitör bileşikleri gibi salgılanmış veya eklenmiş faktörler içereceğinden, dektran yüklemesi için koşullandırılmış ortamın yeniden kullanılması tercih edilebilir. - Plakayı manuel olarak baş aşağı boş bir 5 L behere çevirerek ortamı mikro plakaya atın (Şekil 3A).
- Plakayı hafif bir açıyla yavaşça dikey olarak, buz gibi PBS (Şekil 3B) ile dolu 2 L'lik bir kabın içine batırarak mikro plakadaki hücreleri durulayın ve daha sonra plakayı baş aşağı 5 L behere (Şekil 3C) çevirerek PBS'yi mikro plakaya atın. 2 kez tekrarlayın.
NOT: Görüntüleme mikro plakasına zayıf bir şekilde bağlanan hücreler bu işlem sırasında ayrılabilir. Gerekirse, kuyular çok kanallı bir aspirasyon adaptörü ile de aspire edilebilir veya çok kanallı pipet kullanılarak PBS ile daha nazikçe yıkanabilir. Bir adet 96 kuyulu mikro plakanın işlenmesi için yaklaşık 2 L buz gibi PBS gerekir. Daha fazla plaka analiz edilecekse, daha büyük bir beher kullanın ve her ek plaka için 1 L buz gibi PBS ekleyin veya gerektiğinde buz gibi PBS'yi yenileyin. - PBS'nin son durulamadan atılmasını takiben, 25 mL reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya PBS'de 100 μL%3,7 formaldehit ekleyerek hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika sabitlayın (Şekil 3D).
- Sabitleme çözümünü çıkarın ve batırma ve kaydırma tekniğini kullanarak hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Çekirdeği kuyu başına PBS'de 100 μL 2 μg/mL DAPI ile lekele.
- 20 dakika sonra, yukarıda açıklanan batırma ve kaydırma tekniğini kullanarak hücreleri buz gibi PBS ile üç kez durulayın (adım 3.2.3). Mikro plakayı tiftiksiz bir mendile baş aşağı dokunarak kalan PBS'leri çıkarın ve 25 mL reaktif rezervuarı ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 100 μL taze PBS ekleyin. Hücreleri şimdi görüntüleyin veya bir haftaya kadar 4 °C'de ışıktan kaplayın.
NOT: Alternatif olarak, floresanları daha iyi stabilize etmek için görüntüleme ve depolama için PBS'de (PBS yerine) bir gliserol çözeltisi kullanılabilir (Şekil 4A). - Görüntülemeden önce, plakanın oda sıcaklığına eşdeğer olmasını bırakın. Mikro plakayı tüy bırakmayan bir mendille kurulayın.
- Kuyuları vakuma bağlı çok kanallı bir aspirasyon adaptörü kullanarak epire edin ve kuyulara 1 mg/mL florofor etiketli yüksek moleküler ağırlık (70 kDa) dektran ile 40 μL serumsuz ortam ekleyin. Hücreleri 37 °C hücre inkübatöründe 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Şekil 3: Fiksasyona hazırlanmak için 96 kuyulu mikro plakayı durulama. (A) Ortamın mikro plakasını manuel olarak kaydırarak 5 L'lik bir kabın içine boşaltın. (B) Dikey ve hafif bir açıyla, mikro plakayı buz gibi PBS ile dolu 2 L'lik bir behere yavaşça batırın. (C) PBS mikro plakasını manuel olarak kaydırarak 5 L beherin içine boşaltın. B'de açıklandığı gibi yıkama adımlarını iki kez tekrarlayın. (D) PBS'yi mikro plakada son kez boşalttıktan sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak kuyulara 100 μL% 3.7 formaldehit ekleyin. BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Otomatik makropinozom görüntüleme
Makropinozomların görüntüleri, daha önce açıklandığı gibi standart bir floresan mikroskop kullanılarak yakalanabilir19,20. Bununla birlikte, özellikle çok sayıda farklı hücre kültürü koşulu değerlendirilirken, böyle bir prosedür otomasyon yoluyla verimlilik açısından geliştirilebilir. Görüntü alımının otomasyonu, işleme prosedürlerini azaltarak çabayı azaltan ve daha da önemlisi, tarafsız bir şekilde görüntü alarak veri tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini artıran bir hücre görüntüleme çok modlu plaka okuyucusu aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Birden fazla görüntüleme sistemi ticari olarak mevcuttur ve talimatlar cihazlar arasında farklılık gösterecektir. Burada, Cytation 5 kullanarak görüntü almak açıklanmıştır. Ancak, aşağıdaki protokol aşağıdaki yönergelere bağlı olarak her bir enstrümana uyarlanabilir:
- Dektran floroforunun dalga boyu kanalında (FITC/TMR) ve DAPI'da 40x hava hedefi olan görüntüleri elde etmek için bir otomasyon protokolü oluşturun.
NOT: Yaygın olarak kullanılan makropinositoz inhibitörü EIPA, özellikle DAHA önce DAPI kanalında heyecanlandığında FITC kanalında otoflüoresans gösterir. Test edilen diğer bileşikler de otomatik horlama görüntüleyebilir. Bu sorunu atlatmak için, görüntü alımının en yüksek heyecan dalga boylarına (FITC/TMR) sahip kanalda ilk, DAPI kanalında ikinci olarak gerçekleşecek şekilde ayarlanması bu oluşumu önlemeye yardımcı olur. - Aşırı pozlamayı önlemek için en yüksek makropinositoza sahip olduğu tahmin edilen bir örnek kullanarak pozlama ayarlarını optimize edin, bu da sinyalin doygunluğuna ve yoğunluk verilerinin kaybına neden olabilir. Yüksek kaliteli görüntüler üretmek için örneği kolayca ve tutarlı bir şekilde konumlandıran odak ayarlarını kullanın.
- Örnek değişkenliğini hesaba katmak ve numunenin doğru bir gösterimini elde etmek için her kuyuda veya kapak kapağında birden fazla görüntü elde edin.
- Görüntüleme ayarları belirlendikten sonra, denemedeki her örnek için aynı ayarları kullanın.
- Cytation 5 ve Gen5 yazılımı kullanırken makropinozom görüntü alımı için şu yönergeleri izleyin:
- Kapak kılıfı formatında 24 kuyu plakası
- Plaka okuyucuyu başlatın ve slayt tutucusunu kullanarak mikroskop slaytlarını baş aşağı yerleştirin.
- Mikro plaka okuyucu ve görüntüleme yazılımını açın, Protokoller'e tıklayarak yeni bir protokol oluşturun ve Yeni Oluştur'u tıklatın. Prosedür'e çift tıklayın ve plaka türünü seçin.
NOT: Plaka türü mevcut değilse, Plaka Eklemek > Sistem > Plaka Tipleri'ne tıklayarak ve üreticinin sağladığı plaka boyutlarını kullanarak plaka tipini yazılıma ekleyin. Kullanım kolaylığı için, silikon izolatörler kullanılarak aralıklı üç kapaklı iki mikroskop slayt şablonu Ek Dosya 1'de sağlanmıştır. - Görüntüleme ayarlarına erişmek için Görüntü > Ters Görüntüleyileyici > Eylemler'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Geniş FOV ve Otomatik Odaklama Binning ile 40x, PL FL Faz hedefini kullanın.
- İlk kanal için, dektran florofor etiketine (GFP veya RFP) karşılık gelen LED küpünü seçin. Otomatik Pozlama'yı tıklatın ve pozlama ayarlarını optimize etmek için mikroskop simgesi düğmesini tıklatın. Uygun pozlama ayarları belirlendiğinde Ayarları Kaydet'e tıklayın.
NOT: Aşırı pozlanmış görüntüleri önlemek için en yüksek makropinositoza sahip olduğu tahmin edilen bir örnek kullanarak pozlama ayarlarını yapın, bu da sinyalin doygunluğuna ve yoğunluk verilerinin kaybına neden olabilir. - DAPI LED küpünü kullanarak ikinci kanal için önceki adımı yineleyin.
- Her floresan kanalı için otomatik netleme ayarlarını yapın, Odak Seçenekleri'ni seçin. Varsayılan odak yönteminin seçimini kaldırın ve sırasıyla dektran-fluorophore ve DAPI kanalı için İsteğe Bağlı Tarama olmadan İsteğe Bağlı Tarama ve Otomatik Netleme ile Otomatik Netleme kullanın. Ayarları kaydetmek için Tamam'ı tıklatın.
NOT: Otomatik odaklama verimliliğini artırmak için tarama mesafesi 200 μm'ye ve artış 20 μm'ye düşürülebilir. İsteğe bağlı tarama, floresan düşük olan numunelerde yeterli otomatik odaklama için gereklidir. Bu normalde, makropinositozun inhibe edildiği veya doğuştan bulunmadığı gibi düşük makropinositozlu durumları analiz ederken ortaya çıkar. - Kapak sarmalının farklı bölgelerinde görüntülerin alımını otomatikleştirmek için İşaretçileri Tanımla seçeneğini kullanın. Mikroskop simgesine tıklayın ve görüntü penceresine tıklayıp sahneyi bir sonraki bölgeye taşıyarak işaretçiler ekleyin. Uygun sayıda bölge seçildiğinde, sonraki kapak parçasına geçin ve işlemi tekrarlayın. Sonlandırmak için Ayarları Kaydet'e tıklayın.
NOT: Örnek genelinde makropinositozun iyi bir temsilini elde etmek için, kapak boyunca eşit olarak dağılmış yaklaşık 20 işaretçi seçin (Şekil 4B). Daha az işaretçi kullanılabilir, ancak görüntünün odak dışında olduğu veya kabarcıklar veya floresan lekeler ve lekeler içerdiği gibi kalite tutarsızlıkları nedeniyle bazı görüntülerin elde edildikten sonra görüntü analizinden dışlanmaları gerekebilir. - Görüntüleme ayarlarının ayarını tamamlamak için Tamam'ı tıklatın. Kapakları görüntülemek için Protokol Araçlarından Yeni Deneme Oluştur ve Şimdi Oku'u seçin. İstendiğinde protokolü ve denemeyi kaydedin.
- Kapak kılıfı formatında 24 kuyu plakası
Şekil 4: Görüntü alma koşullarının optimizasyonu. (A) Gliserol konsantrasyonunun artırılması, EGF ile tedavi edilen AsPC-1 hücrelerinde belirlendiği gibi TMR-dekstran floresanını arttırır. (B) Kapak kılıfı formatlı 24 kuyu plakasını kullanırken otomatik görüntü alımı için görüntüleme işaretçilerinin örnek koordinatları. Çubuk grafik, 5 deneyin SEM'i ile ortalama göreli floresan gösterir. İstatistiksel anlamlılık PBS'ye göre iki yönlü ANOVA ile belirlendi. ** s < 0.01; s < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- 96 kuyulu mikro plaka formatı
- Plaka okuyucuyu başlatın ve mikro plakayı yerleştirin.
- Mikro plaka okuyucu ve görüntüleme yazılımını açın, Protokoller'e tıklayarak yeni bir protokol oluşturun ve Yeni Oluştur'u tıklatın. Prosedür'e çift tıklayın ve plaka türünü seçin.
NOT: Plaka türü mevcut değilse, Plaka Ekle > Sistem > Plaka Tipleri'ne tıklayarak ve üreticinin sağladığı plaka boyutlarını kullanarak plaka tipini yazılıma ekleyin. Kullanım kolaylığı için, PerkinElmer'den CellCarrier-96 Ultra Microplates şablonu Ek Dosya 2'de sağlanmıştır. - Görüntüleme ayarlarına erişmek için Görüntü > Ters Görüntüleyileyici > Eylemler'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Geniş FOV ve Otomatik Odaklama Binning ile 40x PL FL Faz hedefini kullanın.
- İlk kanal için, dektran florofor etiketine (GFP veya RFP) karşılık gelen LED küpünü seçin. Otomatik Pozlama'yı tıklatın ve pozlama ayarlarını optimize etmek için mikroskop simgesi düğmesini tıklatın. Uygun pozlama ayarları belirlendiğinde Ayarları Kaydet'e tıklayın.
NOT: Maruz kalma ayarlarının optimizasyonu sırasında önemli floresan ağartma meydana gelebilir. Bu, yeni bir alan görüntülendiğinde aşırı pozlamaya neden olan ayarlara neden olabilir. Bu nedenle, henüz pozlanmamış bir alanı denetleyerek ve seçilen ayarlarda sinyalin doygunluğunun oluşmadığını garanti ederek pozlama ayarlarını doğrulayın. Optimizasyon sırasında ağartma sonucu floresan azaldığından, maruz kalma ayarının optimizasyonu için kullanılan kuyuları makropinozom nicelemesinde dahil etmeyin. Aşırı pozlanmış görüntüleri önlemek için en yüksek makropinositoza sahip olduğu tahmin edilen bir örnek kullanarak pozlama ayarlarını yapın, bu da sinyalin doygunluğuna ve yoğunluk verilerinin kaybına neden olabilir. - DAPI LED küpünü kullanarak ikinci kanal için önceki adımı yineleyin.
- Her floresan kanalı için otomatik netleme ayarlarını yapın, Odak Seçenekleri'ni seçin. Varsayılan odaklama yönteminin seçimini kaldırın ve Lazer Otomatik Netleme'yi kullanın. Makropinozomların ve çekirdeklerin en iyi şekilde görselleştirilmesi için odak düzlemini belirledikten sonra bir referans taraması yakalayın. Ayarları kaydetmek için Tamam'ı tıklatın.
NOT: Otomatik odaklama verimliliğini artırmak için tarama mesafesi 400 μm'ye ve artış 3 μm'ye düşürülebilir. Lazer otomatik odaklama seçeneğinin düzgün çalışması için, plakanın altını temizleyin, görüntülemeden önce plakayı tüy bırakmayan bir mendille kurutun ve silin. Lazer otomatik odaklama, odak düzlemini bulmak için minimum zaman gerektirdiğinden odaklama için üstün bir yöntemdir. Diğer odak yöntemleri kullanılabilir, ancak kuyulara anti-solgunluk eklenmediğinden, bu yöntemler numunelerin önemli ölçüde ağartılmasına neden olabilir ve bu da veri toplamayı olumsuz yönde etkileyebilir. - Yatay ve dikey uzaklığı sıfır olarak ayarlayın ve Tek Görüntü altında Çakışma olmadan Montaj'ı seçin ve analize kaç hücrenin dahil edilmesi istendiğine bağlı olarak 3 x 3 görüntü kullanın.
NOT: Hücrelerin büyüklüğüne ve yoğunluğuna bağlı olarak, örnek boyunca makropinositozun temsili bir değerlendirmesini elde etmek için az ya da çok görüntü alınabilir. Farklı koşullar altında AsPC-1 veya MIA PaCa-2 hücrelerinde makropinositozun değerlendirilmesi, 2 x 2 veya 4 x 4 fotoğraf çerçevesi arasında veri yorumlamada hiçbir fark gözlenmez, ancak daha az fotoğraf çekerken çoğaltma örnekleri arasındaki değişim artabilir (Şekil 5A,B). Çerçevenin boyutunu artırmak veya azaltmak plakayı tarama süresini etkileyecektir. Pozlama süresine bağlı olarak, tam bir 96 kuyu mikro plakasının 3 x 3 kare kullanarak tamamen taranmasının yaklaşık 1-1,5 saat süreceğiz. 2 x 2 ve 4 x 4 kare bu süreyi sırasıyla yarıya veya ikiye yalar. - Görüntüleme ayarlarının ayarını tamamlamak için Tamam'ı tıklatın.
- Plakayı görüntülemek için Protokol Araçlarından Yeni Deneme Oluştur ve Şimdi Oku'u seçin. İstendiğinde protokolü ve denemeyi kaydedin.
Şekil 5: PDAC hücrelerinde makropinositozun değerlendirilmesi için kontrol koşulları. (A) AsPC-1 hücreleri, 5 dakika boyunca 100 ng/mL EGF stimülasyonuna yanıt olarak makropinositoz veya 24 saat glutamin yoksunluğu gösterir. Görüntü alımı için, fotoğraf sayısının veri kalitesi üzerindeki etkisini belirlemek için 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 veya 2 x 2'lik resim çerçeveleri çekildi. (B) MIA PaCa-2 hücreleri, 75 μM EIPA ile 30 dakikalık tedavi veya 10 μM EHop-016 ile 2-h tedavi ile inhibe edilen konsitutive makropinositoz gösterir. Resim çerçeveleri A'daki gibi çekildi. Ölçek çubuğu = 25 μm. Çubuk grafikler, 4 çoğaltma ile 1 denemenin SD'si ile ortalama göreli makropinositik indeksi gösterir. İstatistiksel anlamlılık +Q veya araç durumuna göre iki yönlü ANOVA ile belirlendi. s < 0.001 Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Makropinositik indeksinin belirlenmesi
'Makropinositik indeks', mikroskobik görüntüleme kullanılarak hücre başına floresan dektran alımının ölçülmesi ile belirlenen hücresel makropinositozun kapsamıdır19. Bu amaçla elde edilen görüntüler, toplam floresan yoğunluğunu veya floresan pozitif alanı ve DAPI boyama ile belirlenen toplam hücre sayısını ölçerek içselleştirilmiş dektran miktarını belirlemek için kullanılır. Bu analiz, daha önce açıklandığı gibi Hücre Profil Oluşturucu veya FIJI/ImageJ gibi açık kaynaklı görüntü işleme ve analiz yazılımı ile gerçekleştirilebilir19,20. Bununla birlikte, çok modlu bir plaka okuyucu ile çalışırken, cihazla birlikte sağlanan yazılım, makropinositik indeksi hesaplamak amacıyla kullanılabilecek yerleşik analiz uygulamalarını içerebilir. Bazı durumlarda, yerleşik yazılım analizi ardışık düzeni kullanıcı tarafından tamamen belirgin olmayabilir. Bu nedenle, Yazılımın Hücre Profil Oluşturucu veya FIJI/ImageJ gibi otomatik olmayan bir yordamla karşılaştırıldığında erken bir aşamada doğrulandırılması önerilir. Bu protokol, aşağıdaki genel yönergelere bağlı olarak diğer görüntü işleme ve analiz yazılım araçlarına uyarlanabilir:
- DAPI ve karşılık gelen dektran görüntüsü için, sık sık yuvarlanan top işlevi olarak adlandırılan uygun işlevi uygulayarak arka planı çıkarın. Arka plan gürültüsünün en aza indirilmesi ve DAPI ve dextran sinyalinde minimum veya hiç çıkarma etkisi olmaması için ayarları yapın.
- Yüksek dektran sinyaline sahip bir alan kullanarak, çekirdeği seçmek ve yalnızca makropinozomları seçmek için gereken minimum yoğunluk sinyali ayarını belirlemek için sık sık eşik işlevi olarak adlandırılan yoğunluk sinyali ayarlarını belirleyin.
- Dektran görüntüsü için, oluşturulan makropinozom seçimi içindeki toplam floresan hesaplamayı hesaplayın veya dektran için pozitif olan toplam alanı belirlemek için seçimi kullanın.
- DAPI görüntüsü için, mevcut hücre sayısını yansıtmak üzere görüntüdeki çekirdek sayısını belirlemek için seçimi kullanın.
- Makropinositik indeksi belirlemek için, toplam dektran floresanını veya alanını DAPI tarafından belirlenen hücre sayısına bölün.
- Elde edilen tüm görüntüler için aynı sayısal ayarları uygulayan bu çözümleme adımlarını yineleyin.
- Gen5 yazılımını kullanırken makropinositik dizini belirlemek için şu yönergeleri izleyin:
NOT: Yerleşik analiz ardışık düzeni doğrulandı ve Fiji/ImageJ 'ye göre hesaplamada herhangi bir fark tespit edildi (Şekil 6A).- Görüntüleme tamamlandıktan sonra, yüksek düzeyde makropinositoz içeren bir görüntü seçin. Arka plan sinyalini kaldırın, İşlem 'i (Tamamlayıcı Şekil 1A) tıklatın ve Görüntü Ön İşleme seçeneğini belirleyin.
- Dektran kanalı için Otomatik seçimini kaldırın ve 5 μm'lik bir yuvarlanan top çapı kullanın, ince sonuçlara öncelik ve görüntüyü 1 döngü ile pürüzsüzleştirin.
- DAPI kanalı için Otomatik ön işleme ve 1 düzgün döngü kullanın. Tamam'a tıklayın ve görüntü ön işleme adımını protokole ekleyin; ADIM EKLE'yi tıklatın. Ardından, Görüntü dağıtımının (Tamamlayıcı Şekil 1B) altında işlenen görüntüyü seçin ve Analiz et düğmesini (Tamamlayıcı Şekil 1C) tıklatın.
- ANALİz AYARLARI altında, Tür'ü Hücresel Analiz olarak ayarlayın. DAPI kanalını seçin ve Seçenekler'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 2A).
- Birincil maske için, işlenen DAPI görüntüsünü kullanarak, tek çekirdek seçmek için bir maske oluşturun. Koyu arka plan ve Otomatik seçeneğini kullanın. Ayrıca, tek çekirdekli maske seçimi için hangi ayarların izin verdiğine karar verin ve tamamlandığında, maskenin uygun şekilde uygulanıp uygulanmadığına karar vermek için Uygula düğmesini tıklatın.
NOT: Maskelerdeki Dokunma Nesnelerini Böl ve Delikleri Doldur seçeneklerini etkinleştirmek tek çekirdek seçmek için en iyi şekilde çalışabilir. Minimum ve maksimum nesne boyutlarının hücre çizgisine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ve en sık 5-40 μm aralığında ayarlanır. Birincil Kenar Nesneleri dahil edilebilir ve görüntünün tamamı analiz edilmelidir. Kaydırıcı, maske seçimini sinyal yoğunluğuna ayarlamak için uygulanabilir. - Ardından, makropinozom floresan puncta'yı seçme ayarlarını optimize etmek için ikincil bir maske uygulayın. İkincil Maske işlevi içindeki Ölçü'nün kullanımını kullanın ve hücrelerin boyutuna bağlı olarak birincil maskeyi 40 μm genişletin.
- Pozitif dektran alanlarını seçmek için Maskede Eşik işlevini ve Eşik yöntemini kullanın. Ayarların doğru uygulanıp uygulanmadığını belirlemek için Uygula'yı tıklatın.
NOT: Eşik değerini belirlemek için Çizgi Profilini Görüntüle aracını (Tamamlayıcı Şekil 2B) kullanın ve dektran pozitif bir alanın üzerine bir çizgi çizin (Tamamlayıcı Şekil 2C). Makropinozomları seçen ve arka plan sinyalini dışlayan bir maske oluşturmak için en iyi ayarı belirlemek için ölçülen yoğunluğu kullanın (Tamamlayıcı Şekil 2D). - Çekirdek ve makropinosomes seçmek için uygun maskeler oluşturduktan sonra, Hesaplanan Ölçümler sekmesine tıklayın ve İlgi Çekici Nesne Düzeyi Ölçümleri Seç veya Oluştur'u seçin.
- Mevcut tüm ölçümleri kaldırın ve ikincil maskenin analizi için İntegral ve Alan ölçümlerini ekleyin. Tamam'a tıklayın ve yeni ölçümler için Hesapla ve Göster'i seçin. İşiniz bittiğinde, Tamam'ı tıklatın ve çözümlemeyi ve hesaplamaları protokole eklemek için ADIM EKLE'yi seçin.
- Kesinleşmiş protokolü ileride kullanmak üzere kaydedin, Dosyala ve Protokolü Farklı Kaydet'i tıklatın.
- Veri analizi tamamlandıktan sonra, ilgi alanlarını seçin ve makropinositik dizini belirlemek için verileri dışa aktarın. Makropinositik dizini aşağıdaki gibi belirleyin:
Hücre başına dektran floresan = Nesne Int_2[Dektran florofor]
Hücre başına dektran alanı = Nesne Area_2[Dextran florofor]
NOT: Kapak formatına sahip 24 kuyu plakası için ölçümler, görüntü başına ortalama makropinositik indeks ortalamasını yansıtır. Alternatif olarak, makropinositik indeks, tüm görüntüler için 'Alan' veya 'integral' toplamını toplam 'Hücre Sayısı' ile bölerek tüm örnek için manuel olarak hesaplanabilir. Makropinositik indeksi hesaplamada bu yaklaşımlar arasındaki fark çoğu ayarda minimumdur. 96 kuyulu mikro plaka biçimi için makropinositik indeks tüm numunenin ortalaması olarak hesaplanır. - Protokolü görüntüleme ve sonraki otomatik analiz için kaydedin. Aynı floroforlarla gelecekteki deneyler için protokolü yeniden kullan.
NOT: Lazer otomatik netleme işlevini kullanırken, çekirdek ve makropinozomlar muhtemelen farklı bir düzleme lokalize edildiğinden, farklı bir hücre hattı analiz edilecekse yeni bir referans taraması yapılmalıdır. Daha önce belirlenmiş bir protokol kullanılarak her yeni deneme gerçekleştirilmede, bu denemenin pozlama ayarlarının en iyi duruma getirilmesi gerekir.
6. Tedavilerin eklenmesi
Hücre tedavileri (küçük moleküller, biyolojikler, büyüme faktörleri, metabolitler vb.) protokolün herhangi bir aşamasında dahil edilebilir ve kesin zamanlama çalışmanın amaç ve amaçlarına bağlı olacaktır.
- Hücreleri bölüm 2'deki gibi hazırlayın.
- İlgi çekici tedavileri eklemeden hemen önce, tedavileri ve uygun kontrolleri serumsuz ortamda son konsantrasyonlarının iki katına hazırlayın. Tedavileri, değerlendirilen çoğaltma kuyularının sayısına eşit bir hacimde hazırlayın.
NOT: Salgılanan faktörlerin hücresel fonksiyonların kontrolünde oynayabileceği rol göz önüne alındığında, şartlandırılmış medyadaki ilgi tedavilerini seyreltmek tercih edilebilir. Bu amaçlar için, tedavi çözümlerinin hazırlanması için şartlandırılmış medya oluşturmak için bölüm 2'de açıklandığı gibi hücreleri hazırlarken 6 cm veya 10 cm hücre kültürü yemekleri gibi ek tabakların tohum edilmesi yararlı olabilir. - Medyayı kuyudan çıkarmadan, her kuyuya bir iyi hacimli tedavi çözeltisi ekleyin. Uygun karıştırmayı sağlamak için plakayı sallayın. Hücreleri istediğiniz süre boyunca kuluçkaya yatırın.
- Bölüm 3 ile devam edin.
NOT: Dektran eklenirken, taze medya kullanımı, makropinositoz seviyesini etkileyebilecek ek tedavilerin kaldırılmasına neden olur. Bu nedenle, tedavileri aspire etmeden veya alternatif olarak yeniden eklemeden veya dektran çözeltisini hazırlamak için şartlandırılmış ortamı yeniden kullanmadan doğrudan kuyulara dektran eklemek tercih edilebilir.
Şekil 6: Makropinositoz inhibitörleri için doz-yanıt eğrisi gerçekleştirmek. Bilinen makropinositoz inhibitörleri yeni bir hücre hattında test edilirken elde edilen örnek veriler. PATU8998T hücreleri 96 kuyulu mikro plaka formatı için kullanıldı ve belirtilen (A) EHop-16 ve (B) EIPA konsantrasyonları ile 2 saat 30 dakika boyunca tedavi edildi. Görüntü analizi yoluyla elde edilen sonuçların Gen5 yazılımı veya ImageJ tarafından karşılaştırılması, (A) içinde ns tarafından belirtilen iki yaklaşım arasında önemli bir fark göstermez. Ölçek çubuğu = 25 μm. Çubuk grafikler, 4 çoğaltmalı tek bir denemenin ortalamasını ve SD'sini gösterir. İstatistiksel anlamlılık, tedavi edilmeyen koşullara kıyasla bir veya iki yönlü ANOVA ile belirlendi. * s < 0.05; s < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolün adımları ve ayarlamaları buna göre takip edildiğinde, nihai deneysel sonuçlar, çalışılan hücre kültürü koşullarının veya inhibitörlerinin hücre hattında makropinositozu teşvik edip etmediği veya azaltıp azaltmadığı hakkında bilgi vermelidir. Bu bulguların geçerliliğini güçlendirmek için, kontrol koşullarının dahil edilmesi, deneyin başarıyla tamamlanıp tamamlanmadığını belirlemek için sonuçların incelenmesine izin verecektir. Makropinositoz indüksiyon kontrolleri, makropinositozun göreceli düzeyi hakkında bilgi verecektir. Bu amaçla ligand EGF en sık kullanılmaktadır13. AsPC-1 PDAC hücrelerinde, dektranı eklemeden önce 5 dakika boyunca 100 ng/mL'de EGF eklemek makropinositozu aktive eder (Şekil 5A). Ayrıca makropinositozun otokrin EGF aktivasyonu 16-24 saat glutamin hücrelerinden yoksun bırakılarak indüklenebilir (Şekil 5A). Alternatif olarak, hücre tipine ve mevcut literatüre bağlı olarak diğer indükleyiciler dahil edilebilir; bunlar PDGF veya Wnt3A10,11,12 içerebilir. Tüm hücreler benzer şekilde davranmaz ve KRAS mutant hücreleri konsitutive makropinositoz13 gösterebilir. Örneklerden biri, EGF tedavisine yanıt vermeyen MIA PaCa-2 PDAC hücre hattıdır. Burada, bilinen makropinositoz inhibitörlerinin eklenmesi, gözlemlenen ve ölçülen floresan punctanın gerçekten makropinozom olduğunu doğrulayacaktır. En sık kullanılan inhibitör kontrolleri, spesifik bir makropinositoz inhibitörü olan sodyum-hidrojen eşanjör inhibitörü EIPA'yı içerir (Şekil 5B)4. Rac1 inhibitörü EHop-016 (Şekil 5B), Pak inhibitörü FRAX597 veya PI3K inhibitörü LY294002 gibi diğer denetimler de dahil edilebilir; bununla birlikte, makropinositoz üzerindeki etkileri model spesifik olabilir13.
Daha önce makropinositoz ve inhibitörler için değerlendirilmemiş hücre hatları için, doz-yanıt eğrileri makropinositozu doğrulamak ve gelecekteki kullanım için en uygun ilaç konsantrasyonunu belirlemek için mükemmel bir yaklaşımdır. Bu amaçlar için, 96 kuyulu mikro plaka formatı protokolü, daha önce laboratuvarda değerlendirilmeyen bir hücre hattında, PATU8998T PDAC hücrelerinde konsültatif makropinositozu belirlemek için kullanılmıştır. Bu hücrelerin makropinositoz olup olmadığını belirlemek için, bilinen iki dektran alımı inhibitörünün (EHop-016 ve EIPA) etkisi çalışılmıştır. Gösterildiği gibi, doz-yanıt deneyi makropinositik indeksi giderek daha yüksek ilaç konsantrasyonlarında azalttı (Şekil 6A,B), böylece bu hücrelerde constitutive Rac1 bağımlı makropinositoz varlığını doğruladı. Ek olarak, sonuçlar bu hücre hattında makropinositozu incelerken gelecekteki deneyler için kullanılacak optimal ilaç konsantrasyonları için bilgi sağlar.
Şekil 7: Karşılaşılabilecek sorun-çekim koşulları. (A) Görüntü pembe ile belirtildiği gibi aşırı pozlanmıştır. (B) Görüntü odak dışında. (C) Görüntü dektran lekeleri veya lekeleri içerir. (D) Görüntü kalıntı içeriyor. (E) Görüntü bir kabarcık içerir. (F) Hücreler ilaca bağlı otofluoresans gösterir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Şekil 1: Görüntü ön işlemenin ekran görüntüsü. (A) İşlem düğmesi. (B) Görüntü dağıtımı. (C) Analiz düğmesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: Görüntü niceleme ayarlarının ekran görüntüsü. (A) ANALİz AYARLARI. (B) Çizgi Profili aracını görüntüleyin. (C) Dektran pozitif alan üzerinde çizgi. (D) Çizgi Profili sonuçlarını görüntüle Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Dosya 1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Dosya 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneylerin ve veri toplamanın kalitesi, reaktiflerin kalitesine, ayarların optimizasyonuna ve kapakların ve mikro plakaların temizliğine bağlıdır. Nihai sonuçlar, çoğaltmalar arasında en az varyasyon vermelidir; bununla birlikte, biyolojik varyasyonlar doğal olarak ortaya çıkar veya başka bir şekilde bir dizi faktörden kaynaklanabilir. Hücre yoğunluğu, hücrelerin makropinositoz indükleyicilerine veya inhibitörlerine az çok yanıt vermesine neden olabilir. Bu nedenle, protokolde önerildiği gibi% 80 izdiahine uymak çok önemlidir. Alternatif olarak, mikro plaka üreticileri tarafından 96 kuyulu bir mikro plaka üzerinde medya buharlaşmasının meydana geldiği iyi belgelenmiştir. Burada, dış kuyular iç kuyulara göre daha fazla buharlaşmaya maruz kalır ve böylece makropinositozu etkileyebilir. Bu nedenle, dış kuyuları analize dahil etmemek ve bunun yerine iç kuyuları kapsamlı buharlaşmadan korumak için bir 'tampon duvar' inşa etmek için bu kuyuları PBS ile doldurmak için seçim yapılabilir.
Alma işleminin başarıyla tamamlanıp tamamlandığını belirlemek için her koşul için görüntüleri görsel olarak incelemeniz önerilir. Bu, uygulanan ayarların gerçekten doğru olduğunu tespit etmek ve gerekirse müdahaleye izin vermek için ilk koşul kümesinin görüntülenmesi sırasında yapılabilir. Oluşabilecek belirli sorunlar şunlardır; görüntüler aşırı pozlanmıştır (Şekil 7A), görüntüler odak dışıdır (Şekil 7B), görüntüler floresan dektran (Şekil 7C) veya kalıntı lekeleri içerir (Şekil 7D), görüntüler kabarcıklar içerir (Şekil 7E) veya otofluoresans dekstran veya DAPI kanalında görülebilir (Şekil 7F). İlk iki konu için, aşırı pozlama ve odak dışı (Şekil 7A,B), görüntü alma ayarlarının ayarlanması ve edinmenin tekrarlanması gerekir. Ek olarak, otomatik odaklamanın düzgün çalışması için plaka ve kapak örtüleri temizlenmelidir. Yalnızca birkaç görüntü odak dışındaysa, belirli görüntüler veya kuyunun tamamı da 'Maske' görüntü işlevi kullanılarak analizden çıkarılabilir. Aynı işlev, dektran kanalında (Şekil 7C), safsızlıklarda (Şekil 7D) veya kabarcıklarda (Şekil 7E) lekeler içeren görüntüleri dışlamak için de uygulanabilir. Ek olarak, numunelerin iyi yıkandığından, dektran çözeltisinin 37 °C'de ısıtılarak ve girdaplansla iyileştirilebilen dektranın tamamen çözüldüğünden ve deneyin taze hazırlanmış ve temiz reaktiflerle gerçekleştirildiğinden emin olun. Son olarak, ilaç kaynaklı otofluoresans oluşabilir ve özellikle DAHA önce DAPI kanalında heyecanlandığında FITC ve DAPI kanalında floresan makropinositoz inhibitörü EIPA için oldukça yaygındır. Geçici çözüm, FITC kanalının DAPI'dan önce alınmasıdır. Alternatif olarak, FITC-dektran yerine TMR-dektran kullanılabilir veya pozlama ayarları için ışık yoğunluğu ve pozlama süresi artırılırken azaltılabilir.
Makropinositik indeksi hesaplamak için, her görüntüdeki hücre numarasını belirlemek için nükleer DAPI boyama kullanılır. Bu boyama prosedürünün uygulanması kolaydır ve hücre sayısı ve dolayısıyla hücre başına göreli dektran alımının hesaplanması için güvenilir bir okumadır. Bu yaklaşıma bir uyarı, farklı hücre çizgilerini karşılaştırırken veya farmakolojik tedavilere yanıt olarak ortaya çıkabilecek hücre boyutu farklılıklarını dikkate almamasıdır. Hücre büyüklüğünün makropinositik indeksi etkilediğinden şüphelenilen bu durumlarda, hücre alanı daha önce açıklandığı gibi dektran alımının normalleştirilmesi için kullanılabilir4. Bu, sabitlemeden sonra bir hücre maskesi lekesi içerecek şekilde protokolün biraz değiştirilmesi veya faz kontrastı veya parlak alan görüntülemesinin dahil edilmesiyle elde edilebilir. Makropinositozun, kullanılan belirli hücre tabanlı sistemde hücresel zindeliğe katkıda bulunan bir besin kaynağı yolu olup olmadığını değerlendirmek için açıklanan tahlil kullanılarak herhangi bir bulgunun takip edilmesi de şiddetle tavsiye edilir. Bu, hücre dışı albümin4,7 ilavesi ile ve eklenmeden besin tükenmiş koşullarda proliferatif kapasite, sağkalım veya canlılık değerlendirilerek elde edilebilir. Ek olarak, bir DQ-BSA darbe-kovalama tahlili, makropinositozdaki değişikliklerin lizozomlardaki albümin bozulmasındaki değişikliklere dönüşüp dönüşmediğine dair kanıt sağlayabilir. Yüksek moleküler ağırlıklı dektran gibi, DQ-BSA makropinositoz yoluyla içselleştirilir ve lizozomlara teslim edilir, burada proteolitik sindirimden sonra floresan4. Floresan dektran alımı ile benzerlikler göz önüne alındığında, açıklanan yöntem DQ-BSA alımını değerlendirmek için uyarlanabilir. Aynı şekilde, bu protokol, makropinositoz yoluyla hücrelere girdiği bilinen albümin, lipitler veya nekrotik hücre kalıntıları gibi floresan etiketli diğer kargoların alımını değerlendirmek için kullanılabilir. Her durumda, bu uyarlamalar üreticinin protokollerine uygun olmalı ve tahlilleri doğrulamak için deneysel kontroller kullanılmalıdır.
Mikroskobik görüntü analizi ve nicelleştirme makropinositozu değerlendirmek için tercih edilen bir yaklaşımdır ve alanında standart haline gelmiştir4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20 ,21,22. Örneklerin görsel olarak incelenmesine izin verir ve makropinozom sayısı, boyutu ve konumu hakkında ek bilgi sağlayabilir. Ayrıca, görüntüleri görsel olarak inceleme imkanı, hücre zindeliğinin ve canlılığının değerlendirilmesine ve uyuşturucu kullanımının neden olduğu eserlerin ve/veya otofluoresansların tanımlanmasına izin eder. Akış sitometrisi gibi önerilen diğer niceleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu veriler aksi takdirde kaybolabilir veya göz ardı edilebilir ve yanlış pozitiflere veya negatiflere neden olabilir23. Bununla birlikte, görüntüleme daha emek yoğundur ve akış sitometrisi olarak önyargılı veri alımına daha yatkındır. Burada protokolün otomasyonu ile bu engelleri aşarak önyargıyı, emeği, maliyeti ve zamanı azalttık.
Makropinositozun birçok modülatörü büyük olasılıkla keşfedilmemiştir ve kanser gibi belirli patolojilerde makropinositik yolun önemi göz önüne alındığında, keşifleri potansiyel olarak yeni terapötik yaklaşımların gelişimi için büyük öneme sahip olabilir2,3. Bu modülatörlerin tanımlanması, burada önerilen yöntemin bir köşe taşı olarak işlev görebileceği bileşiklerin yüksek içerikli taranmasıyla elde edilebilir. Özetlenen protokol, deneylerin standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilmesini amaçlamaktadır. Ancak, 96 kuyulu plaka formatı optimize edilebilir ve yüksek içerikli tarama için uyarlanabilir. Kuyu formatını 384 veya 1536 kuyu mikro plakalarına yükseltmek, kullanıcının tek bir plaka üzerinde test edilebilen bileşiklerin sayısını artırmasını sağlar. Ayrıca, hücre tohumlama, plaka yıkama, bileşik ve dektran yönetiminin robotlaştırılması manuel kullanımı ve kuyudan kuyuya değişkenliği azaltacak ve böylece ölçeklenebilirliği artıracaktır. Sonuç olarak, bu protokolün yüksek içerikli taramaya uyarlanması, makropinositozu düzenleyen yeni faktörlerin belirlenmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
Tamamen, burada önerilen yöntem, ilgi çekici hücrelerde makropinositoz seviyesini, sürecin düzenleyicilerinin tanımlanmasını ve bilinen inhibitörler için ilaç konsantrasyonlarının optimizasyonunu belirlemek için mükemmel bir yaklaşımdır. Ayrıca, protokol, dektran dışında diğer kargoların makropinositik alımını değerlendirmek için başlangıç noktası ve potansiyel olarak yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine neden olabilecek kurşun bileşiklerini tanımlamayı amaçlayan yüksek içerik taraması olarak hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.C., ''Makropinositoz ile ilişkili kanser tanıları, terapötikler ve ilaç keşfi'' başlıklı bir patentin mucididir,' Patent No.: 9,983,194.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH/NCI hibeleri (R01CA207189, R21CA243701) tarafından C.C. KMO.G.'ye TRDRP Doktora Sonrası Burs Ödülü (T30FT0952) ile desteklenmiştir. BioTek Cytation 5, NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi'nden (P30 CA030199) finansal destek alan Sanford Burnham Prebys Hücre Görüntüleme Çekirdeği'nin bir parçasıdır. Şekil 1-3 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
References
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21 (2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
- Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
- Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
- Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
- Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
- Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
- Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
- Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).
- Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).
- Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
