Summary
Automatiserede assays ved hjælp af mikroplader med flere brønde er fordelagtige tilgange til identifikation af vejregulatorer ved at muliggøre vurdering af en lang række betingelser i et enkelt eksperiment. Her har vi tilpasset den veletablerede makropinosombilleddannelses- og kvantificeringsprotokol til et 96-brønds mikropladeformat og giver en omfattende oversigt over automatisering ved hjælp af en multi-mode pladelæser.
Abstract
Makropinocytose er en ikke-specifik væskefaseoptagelsesvej, der gør det muligt for celler at internalisere stor ekstracellulær last, såsom proteiner, patogener og celleaffald, gennem bulkendocytose. Denne vej spiller en væsentlig rolle i en række cellulære processer, herunder regulering af immunresponser og kræftcellemetabolisme. I betragtning af denne betydning i biologisk funktion kan undersøgelse af cellekulturbetingelser give værdifuld information ved at identificere regulatorer af denne vej og optimere betingelser, der skal anvendes i opdagelsen af nye terapeutiske tilgange. Undersøgelsen beskriver en automatiseret billeddannelses- og analyseteknik ved hjælp af standard laboratorieudstyr og en cellebilleddannelse multi-mode pladelæser til hurtig kvantificering af det makropinocytiske indeks i klæbende celler. Den automatiserede metode er baseret på optagelse af fluorescerende dextran med høj molekylvægt og kan anvendes på mikroplader med 96 brønde for at lette vurderinger af flere forhold i et eksperiment eller faste prøver monteret på glasdæksler. Denne tilgang sigter mod at maksimere reproducerbarheden og reducere eksperimentel variation, samtidig med at den er både tidsbesparende og omkostningseffektiv.
Introduction
Den ikke-specifikke endocytiske vej for makropinocytose gør det muligt for celler at internalisere en række ekstracellulære komponenter, herunder næringsstoffer, proteiner, antigener og patogener, gennem bulkoptagelse af ekstracellulær væske og dets bestanddele1. Selvom det er vigtigt for biologien hos mange celletyper, beskrives makropinocytosevejen i stigende grad at spille en væsentlig rolle i tumorbiologi, hvor tumorceller gennem makropinocytisk optagelse er i stand til at overleve og sprede sig i nærvær af et næringsstofudtømt mikromiljø2,3. Optagelsen af ekstracellulære makromolekyler, herunder albumin og ekstracellulær matrix og nekrotisk celleaffald, giver en alternativ næringskilde til biomasseproduktion ved at skabe aminosyrer, sukkerarter, lipider og nukleotider gennem makropinosom og lysosomfusionsmedieret lastkatabolisme4,5,6,7,8.
Induktion og regulering af makropinocytose er kompleks og kan variere afhængigt af cellulær kontekst. Indtil videre er flere inducere af makropinocytose blevet identificeret og omfatter ligander, såsom epidermal vækstfaktor (EGF), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), galectin-3 og Wnt3A9,10,11,12,13. Derudover kan dyrkningsbetingelser, der efterligner tumormikromiljøet, udløse aktivering af vejen. Pankreas duktal adenocarcinom (PDAC) tumorer er næringsstofberøvet, især for aminosyren glutamin, hvilket får både kræftceller og kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) til at stole på makropinocytose for overlevelse7,13,14,15. Desuden kan tumorspændinger, såsom hypoxi og oxidativ stress, aktivere denne ådselsvej16. Ud over de mange ydre påvirkere, der kan inducere makropinocytose, styrer en række intracellulære veje makropinosomdannelse. Onkogen Ras-medieret transformation er tilstrækkelig til at starte det makropinocytiske maskineri, og flere kræfttyper udviser onkogen Ras-drevet konstitutiv makropinocytose4,5,9,17. Alternativt er vildtype Ras-aktivering og Ras-uafhængige veje blevet identificeret for at aktivere makropinocytose i kræftceller og CAF'er10,11,15,18. Anvendelsen af forskellige in vitro-modeller i kombination med inhibitorbehandlinger har resulteret i identifikation af flere makropinocytosemodulatorer, som omfatter natrium-hydrogenbyttere, den lille GTPase Rac1, phosphoinositid 3-kinase (PI3K), p21-aktiveret kinase (Pak) og AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK)4,13,15 . I betragtning af de mange beskrevne faktorer og tilstande, der regulerer makropinocytose, er det imidlertid tænkeligt, at mange flere modulatorer og stimuli forbliver uopdagede. Identifikationen af nye modulatorer og stimuli kan lettes ved automatiseret vurdering af en lang række forhold i et enkelt eksperiment. Denne metode kan kaste lys over de faktorer, der er involveret i makropinosomdannelse og kan muliggøre opdagelsen af nye små molekyler eller biologiske lægemidler, der er målrettet mod denne vej.
Her har vi tilpasset vores tidligere etablerede protokol til bestemmelse af omfanget af makropinocytose i kræftceller in vitro til et 96-brønds mikropladeformat og automatiseret billeddannelse og kvantificering19,20. Denne protokol er baseret på fluorescerende mikroskopi, som er blevet en standard på området til bestemmelse af makropinocytose in vitro og in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Makropinosomer kan skelnes fra andre endocytiske veje gennem deres evne til at internalisere store makromolekyler, såsom højmolekylær dextran (dvs. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Således kan makropinosomer defineres ved optagelse af ekstracellulært administreret fluorofor-mærket 70 kDa dextran. Som et resultat manifesterer makropinocytiske vesikler sig som intracellulære klynger af fluorescerende puncta med størrelser fra 0,2-5 μm. Disse puncta kan mikroskopisk afbildes og efterfølgende kvantificeres for at bestemme omfanget af makropinocytose i cellen - 'det makropinocytiske indeks'.
I denne protokol beskrives de væsentlige trin til visualisering af makropinosomer i klæbende celler in vitro på en 96-brønds mikroplade og dæksedler ved hjælp af standard laboratorieudstyr (figur 1). Derudover gives anvisningerne til automatisering af billedindsamling og kvantificering af det makropinocytiske indeks ved hjælp af en cellebilleddannelsespladelæser med flere tilstande. Denne automatisering reducerer tid, omkostninger og kræfter sammenlignet med vores tidligere beskrevne protokoller19,20. Derudover undgår det utilsigtet forudindtaget billedindsamling og analyse og forbedrer derved reproducerbarheden og pålideligheden. Denne metode kan let tilpasses forskellige celletyper eller pladelæsere eller bruges til at bestemme alternative makropinosomfunktioner, såsom størrelse, antal og placering. Den heri beskrevne metode er især velegnet til screening af cellekulturbetingelser, der inducerer makropinocytose, identifikation af nye modulatorer eller optimering af lægemiddelkoncentrationer af kendte hæmmere.
Figur 1: Skematisk over det automatiserede assay til bestemmelse af det 'makropinocytiske indeks' i klæbende celler. Oprettet ved hjælp af BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af materialer
- 70 kDa dextran mærket med FITC eller tetramethylrhodamin (TMR) opløses i PBS for at opnå en 20 mg/ml opløsning. Aliquoterne opbevares ved -20 °C.
- DAPI opløses i ddH2O for at opnå en 1 mg/ml opløsning. Aliquoterne opbevares ved -20 °C.
FORSIGTIG: DAPI er et potentielt kræftfremkaldende stof og bør håndteres med forsigtighed. - På fikseringsdagen skal du forberede frisk 3,7% ACS-formaldehyd i PBS.
FORSIGTIG: Formaldehyd er et fikseringsmiddel, kendt kræftfremkaldende stof og er giftigt ved indånding. Lav opløsningen i en kemisk stinkhætte for at undgå indånding og håndter med omhu. - Forbered syrevaskede dæksler.
- Brug et 500 ml bægerglas og vandbad til at opvarme 28 g borosilikatglasdæksler med en diameter på 12 mm og en tykkelse på 24 timer ved 56 °C i 100 ml 1 M HCl. Forsegl bægerglasset med plastfolie for at undgå omfattende fordampning.
FORSIGTIG: HCI er en stærk syre, der er stærkt ætsende og bør derfor håndteres med omhu og anvendes i en kemisk røghætte for at undgå indånding. - Vask dæksedlerne med destilleret vand. Gentag vasken 4 gange. Vask derefter dæksedlerne med 95% ethanol. Gentag vasken 4 gange.
- Opbevar de syrevaskede dæksedler i en cellekulturskål ved stuetemperatur til fremtidig brug ved at opretholde sterilitet gennem nedsænkning i 95% ethanol. Forsegl fadet med parafilm for at undgå omfattende fordampning.
- Brug et 500 ml bægerglas og vandbad til at opvarme 28 g borosilikatglasdæksler med en diameter på 12 mm og en tykkelse på 24 timer ved 56 °C i 100 ml 1 M HCl. Forsegl bægerglasset med plastfolie for at undgå omfattende fordampning.
2. Forberedelse af celler
- Ved hjælp af en sammenflydende 10 cm vævskulturplade med de klæbende celler af interesse aspirerer mediet og skyller cellerne med 5 ml DPBS, forvarmet ved 37 °C.
- Fjern cellerne fra pladen ved at tilsætte 1,5 ml forvarmet 0,25% trypsin og inkubere ved 37 °C.
BEMÆRK: Den trypsininkubationstid, der kræves for at løsne cellerne af interesse, bør bestemmes empirisk og kan bekræftes ved at observere løsrivelse under et konventionelt lysmikroskop. - Saml cellerne i et 15 ml centrifugerør og tilsæt 4,5 ml komplette medier for at slukke trypsinen.
- Pellet cellerne ved centrifugering i 3 min ved 200 x g og aspirere supernatanten.
- Resuspend cellepillen i et tilstrækkeligt volumen af forvarmede komplette medier for at opnå en enkeltcellesuspension til såning.
- Fortsæt med at frø cellerne på en 24-brønds plade med dæksedler eller et 96-brønds mikropladeformat (figur 1).
BEMÆRK: Antallet af celler, der skal podes, bør bestemmes empirisk for hver cellelinje, da spredningshastigheder og størrelse varierer mellem cellelinjer. Denne protokol er optimeret til klæbende kræftceller med 80% cellesammenløb på dagen for makropinosommærkning. Cellesammenløb kan påvirke makropinocytisk kapacitet, og dette bør også bestemmes empirisk.- 24-brønds plade med coverslip format
- Tilsæt dæksedler til en 24-brønds vævskulturplade, brug tang til at gribe fat i et enkelt dækslip fra ethanolbadet. Tryk på dækslippen til pladens indvendige væg for at fjerne overskydende ethanol og placere dækslen fladt på bunden af en brønd.
- Lad ethanolen fordampe og vask dæksedlen 2 gange med DPBS.
- Frø cellerne oven på dækslen ved at tilsætte 500 μL af cellesuspensionen til hver brønd. Placer cellerne i en 37 ° C celleinkubator med 5% CO2 , indtil cellesammenløbet når 60% -80% dagen før makropinosommærkning.
- Dagen før makropinosommærkning aspirerer medierne fra brøndene og tilsættes 500 μL forvarmede serumfrie medier til hver brønd og placeres cellerne i en 37 °C celleinkubator med 5 % CO2 i 16-24 timer.
BEMÆRK: Afhængigt af de betingelser, der skal undersøges, anbefales serumfrie medier for at reducere virkningerne af vækstfaktorer, der kan inducere makropinocytose, og som normalt er til stede i serum. Det bør dog overvejes, at serum sult kan påvirke andre cellulære processer, såsom proliferation og autofagi. Da resterende serum kan påvirke cellernes makropinocytiske kapacitet såvel som inhibitoraktivitet, kan fjernelse af serum forbedres ved forsigtigt at skylle cellerne 1 eller 2 gange med 500 μL forvarmet DPBS.
- Mikropladeformat med 96 brønde
- Overfør cellesuspensionen til et 25 ml reagensreservoir. Ved hjælp af en flerkanalspipette (8 eller 12 kanaler) frø 100 μL af cellesuspensionen til hver brønd i en sort 96-brønds screeningsmikroplade med højt indhold med optisk klar cyklisk olefin eller glasbund.
- Placer cellerne i en 37 ° C celleinkubator med 5% CO2 , indtil cellesammenløbet når 60% -80% dagen før makropinosommærkning.
- Dagen før makropinosommærkning skal du fjerne og kassere mediet fra hver brønd ved hjælp af en flerkanalspipette (8 eller 12 kanaler) eller en multikanals aspirationsadapter til standardspidser, der er fastgjort til en vakuumpumpe.
- Brug et reagensreservoir og en flerkanalspipette (8 eller 12 kanaler) til forsigtigt at tilsætte 100 μL forvarmede serumfrie medier til hver brønd. Placer cellerne i en 37 °C celleinkubator med 5 % CO2 i 16-24 timer.
BEMÆRK: Afhængigt af de betingelser, der skal undersøges, anbefales serumfrie medier for at reducere virkningerne af vækstfaktorer, der kan inducere makropinocytose, og som normalt er til stede i serum. Det bør dog overvejes, at serum sult kan påvirke andre cellulære processer, såsom proliferation og autofagi. Da resterende serum kan påvirke cellernes makropinocytiske kapacitet såvel som inhibitoraktivitet, kan fjernelse af serum forbedres ved forsigtigt at skylle cellerne 1 eller 2 gange med 100 μL forvarmet DPBS.
- 24-brønds plade med coverslip format
3. Mærkning af makropinosom
- 24-brønds plade med coverslip format
- Aspirer brøndene og tilsæt 200 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluoroformærket højmolekylvægt (70 kDa) dextran. Placer cellerne i en celleinkubator på 37 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: Afhængigt af de betingelser, der skal undersøges, kan genbrug af det konditionerede medie til dextranbelastning i stedet for at anvende friske medier foretrækkes, da det ville indeholde udskillede eller supplerede faktorer, såsom henholdsvis EGF eller inhibitorforbindelser, der kan påvirke cellernes makropinocytiske kapacitet. - Aspirer medierne og vask forsigtigt, men hurtigt cellerne 5 gange med iskold PBS ved hjælp af en forkølet vaskeflaske. Ryst pladen fast i hånden under vask for at hjælpe med at fjerne dextranaggregater, der sidder fast på dæksedlerne.
- Fastgør cellerne ved at tilsætte 350 μL 3,7% formaldehyd og inkubere i 20 minutter. Aspirer derefter fikseringsopløsningen og vask cellerne med PBS to gange.
- Pletter kernerne med 350 μL 2 μg/ml DAPI i PBS. Efter 20 minutter aspirerer DAPI-opløsningen og vaskes cellerne med PBS tre gange.
- Adhæk silikoneisolatorer side om side på et mikroskopdias for at opnå jævn afstand og reproducerbar lokalisering af dæksedlerne, der kræves til billedautomatisering (figur 2A, B).
BEMÆRK: Hele mikroskopdiaset kan udfyldes med i alt 3 isolatorer. - For hvert dækslip tilsættes en dråbe hærdende fluorescensmonteringsmedier på mikroskopets dias inden for isolatorens åbne rum (figur 2C). Tag et dækslip op ved hjælp af tang, og fjern overskydende PBS ved forsigtigt at trykke på siden af dækslipsene på en fnugfri aftørring.
- Placer dæksedlen på hovedet på dråben af monteringsmedier (figur 2D). Tryk forsigtigt på dæksedlen ved hjælp af lukkede tang for at fjerne bobler fra monteringsmediet (figur 2E).
- Opbevar lysbillederne i mørke omgivelser, og lad monteringsmediet tørre ved stuetemperatur, hvilket typisk tager 16-24 timer. Dias kan nu afbildes eller opbevares ved -20 °C i op til 2 uger.
- Før billeddannelse skal du fjerne isolatorerne fra mikroskopdiaset. Lad lysbillederne udligne til stuetemperatur, og rengør dæksedlerne ved hjælp af en applikator med bomuldsspidser, der er befugtet med ammoniakfri glasrens. Brug derefter en ren applikator med bomuldstippe, der er befugtet med 70% ethanol, til rengøring og lad dæksedlen være tør.
- Aspirer brøndene og tilsæt 200 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluoroformærket højmolekylvægt (70 kDa) dextran. Placer cellerne i en celleinkubator på 37 °C i 30 minutter.
Figur 2: Placering af dæksler på et mikroskop dias med silikone isolatorer. (A) Silikone isolatorer presses og klæbes til et mikroskop dias. (B) Hele mikroskopdiaset kan udfyldes med i alt 3 isolatorer, hvilket resulterer i jævn afstand og reproducerbar lokalisering af dæksedlerne. (C) For hvert dækslip tilsættes en dråbe fluorescensmonteringsmedier på mikroskopets dias inden for isolatorens åbne rum. (D) Brug tang til at tage et dækslip op fra pladen med 24 brønde og placere det på hovedet på dråben af monteringsmediet. (E) Når der er bobler mellem dæksedlen og mikroskopets dias, skal du forsigtigt trykke på dæksedlen ved hjælp af lukkede tang for at fjerne bobler. Oprettet ved hjælp af BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Mikropladeformat med 96 brønde
- Aspirer brøndene ved hjælp af en multikanals aspirationsadapter, der er fastgjort til et vakuum, og tilsæt 40 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluoroformærket højmolekylær vægt (70 kDa) dextran tilbage til brøndene. Inkuber cellerne i en 37 °C celleinkubator i 30 min.
BEMÆRK: Afhængigt af de betingelser, der skal undersøges, kan genbrug af det konditionerede medie til dextranbelastning i stedet for at anvende friske medier foretrækkes, da det ville indeholde udskillede eller supplerede faktorer, såsom henholdsvis EGF eller inhibitorforbindelser, der kan påvirke cellernes makropinocytiske kapacitet. - Bortskaf mediet i mikropladen ved manuelt at svirpe pladen på hovedet i et tomt 5 L bægerglas (figur 3A).
- Skyl cellerne i mikropladen ved langsomt at nedsænke pladen lodret i en lille vinkel i et 2 L bægerglas fyldt med iskold PBS (figur 3B) og bortskaf derefter PBS i mikropladen ved at svirpe pladen på hovedet ned i 5 L bægerglasset (figur 3C). Gentag 2 gange.
BEMÆRK: Celler, der svagt fastgøres til billedmikropladen, kan løsne sig under denne proces. Om nødvendigt kan brønde også aspireres med en multikanals aspirationsadapter eller mere forsigtigt vaskes med PBS ved hjælp af en flerkanalspipette. Behandling af en 96-brønds mikroplade kræver ca. 2 liter iskold PBS. Hvis flere plader skal analyseres, skal du bruge et større bægerglas og tilføje 1 liter iskold PBS for hver ekstra plade eller opdatere den iskolde PBS efter behov. - Efter bortskaffelse af PBS fra den sidste skylning fastgøres cellerne i 20 minutter ved stuetemperatur ved at tilsætte 100 μL 3,7% formaldehyd i PBS til hver brønd ved hjælp af et 25 ml reagensreservoir og en flerkanalspipette (figur 3D).
- Fjern fikseringsopløsningen, og vask cellerne med PBS to gange ved hjælp af nedsænknings- og flicking-teknikken. Plet kernerne med 100 μL 2 μg/ml DAPI i PBS pr. brønd.
- Efter 20 minutter skylles cellerne tre gange med iskold PBS ved hjælp af nedsænknings- og flickingteknikken beskrevet ovenfor (trin 3.2.3). Fjern eventuelle resterende PBS ved at banke mikropladen på hovedet på en fnugfri aftørring, og tilsæt 100 μL frisk PBS til hver brønd ved hjælp af en 25 ml reagensbeholder og flerkanalspipette. Forestil dig cellerne nu, eller opbevar dem dækket af lys ved 4 °C i op til en uge.
BEMÆRK: Alternativt kan en opløsning af glycerol i PBS (i stedet for PBS) anvendes til billeddannelse og opbevaring for bedre at stabilisere fluorescensen (figur 4A). - Før billeddannelse skal pladen ligestilles til stuetemperatur. Tør mikropladen tør med en fnugfri aftørring.
- Aspirer brøndene ved hjælp af en multikanals aspirationsadapter, der er fastgjort til et vakuum, og tilsæt 40 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluoroformærket højmolekylær vægt (70 kDa) dextran tilbage til brøndene. Inkuber cellerne i en 37 °C celleinkubator i 30 min.
Figur 3: Skylning af mikropladen med 96 brønde for at forberede sig på fiksering. (A) Tøm mikropladen af medier i et 5 L bægerglas ved manuelt at svirpe. (B) Lodret og i en lille vinkel nedsænkes mikropladen langsomt i et 2 L bægerglas fyldt med iskold PBS. (C) Tøm PBS's mikroplade i bægerglasset på 5 L ved manuelt at svirpe. Gentag vasketrinnene som beskrevet i B to gange. (D) Efter tømning af PBS i mikropladen for sidste gang tilsættes 100 μL 3,7% formaldehyd til brøndene ved hjælp af en flerkanalspipette. Oprettet ved hjælp af BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Automatiseret makropinosombilleddannelse
Billeder af makropinosomer kan tages ved hjælp af et standard fluorescerende mikroskop, som tidligere beskrevet19,20. En sådan procedure kan imidlertid forbedres med hensyn til effektivitet gennem automatisering, især ved vurdering af mange forskellige cellekulturforhold. Automatisering af billedoptagelse kan opnås via en cellebilleddannelse multi-mode pladelæser, hvilket reducerer indsatsen ved at reducere håndteringsprocedurer og, vigtigst af alt, øger datareproducerbarheden og pålideligheden ved at erhverve billeder på en upartisk måde. Flere billedbehandlingssystemer er kommercielt tilgængelige, og anvisningerne vil variere mellem instrumenterne. Her beskrives erhvervelse af billeder ved hjælp af en Cytation 5. Protokollen nedenfor kan dog skræddersys til hvert enkelt instrument ved at overholde følgende retningslinjer:
- Opret en automatiseringsprotokol for at erhverve billederne med et 40x luftmål i bølgelængdekanalen for dextranfluoroforen (FITC / TMR) og DAPI.
BEMÆRK: Den almindeligt anvendte makropinocytosehæmmer EIPA udviser autofluorescens i FITC-kanalen, især når den tidligere er ophidset i DAPI-kanalen. Andre forbindelser, der testes, kan også vise autofluorescens. For at omgå dette problem hjælper indstilling af billedoptagelsen til at ske først i kanalen med den højeste excitationsbølgelængde (FITC/TMR) og den anden i DAPI-kanalen for at undgå denne forekomst. - Optimer eksponeringsindstillingerne ved hjælp af en prøve, der forventes at have det højeste niveau af makropinocytose for at undgå overeksponering, hvilket kan resultere i mætning af signalet og tab af intensitetsdata. Brug fokusindstillinger, der let og konsekvent finder eksemplet, til at producere billeder i høj kvalitet.
- Få flere billeder på tværs af hver brønd eller dæksel for at tage højde for prøvevariation og opnå en nøjagtig repræsentation af prøven.
- Når billedbehandlingsindstillingerne er blevet bestemt, skal du bruge de samme indstillinger for hver prøve i eksperimentet.
- Følg disse instruktioner for makropinosombilledindsamling, når du bruger en Cytation 5- og Gen5-software:
- 24-brønds plade med coverslip format
- Start pladelæseren, og indsæt mikroskopets dias på hovedet ved hjælp af diasholderen.
- Åbn mikropladelæseren og billedbehandlingssoftwaren, opret en ny protokol ved at klikke på Protokoller og Opret ny. Dobbeltklik på Procedure , og vælg pladetypen.
BEMÆRK: Hvis pladetypen ikke er tilgængelig, skal du tilføje pladetypen til softwaren ved at klikke på System > Plate Types > Add Plate og bruge pladedimensionerne som angivet af producenten. For nem brug findes skabelonen til to mikroskopdias med tre dæksedler fordelt ved hjælp af silikoneisolatorerne i Supplerende fil 1. - For at få adgang til billedbehandlingsindstillingerne skal du vælge Handlinger > Billede > Omvendt billeddanne og klikke på OK. Brug målsætningen 40x, PL FL Phase med Wide FOV og Autofocus Binning.
- For den første kanal skal du vælge den LED-terning, der svarer til dextran fluorophore-mærket (GFP eller RFP). Fjern klik på Auto Exposure, og klik på knappen mikroskopikon for at optimere eksponeringsindstillingerne. Når de relevante eksponeringsindstillinger er bestemt, skal du klikke på Gem indstillinger.
BEMÆRK: Juster eksponeringsindstillingerne ved hjælp af en prøve, der forventes at have det højeste niveau af makropinocytose for at undgå overeksponerede billeder, hvilket kan resultere i mætning af signalet og tab af intensitetsdata. - Gentag det forrige trin for den anden kanal ved hjælp af DAPI LED-terningen.
- Indstil indstillingerne for autofokus for hver fluorescenskanal, vælg Fokusindstillinger. Fjern markeringen af standardfokusmetoden, og brug Autofokus med Valgfri scanning og Autofokus uden valgfri scanning for henholdsvis dextran-fluorofor- og DAPI-kanalen. Klik på OK for at gemme indstillingerne.
BEMÆRK: Scanningsafstanden kan reduceres til 200 μm og stigningen til 20 μm for at øge autofokuseffektiviteten. Den valgfri scanning er nødvendig for tilstrækkelig autofokus på prøver, der har lav fluorescens. Dette sker normalt, når man analyserer tilstande med lav makropinocytose, såsom når makropinocytose hæmmes eller ikke medfødt til stede. - Brug indstillingen Definer Beacons til at automatisere erhvervelsen af billeder i forskellige regioner på coverslip. Klik på mikroskopikonet, og tilføj beacons ved at klikke i billedvinduet og flytte scenen til det næste område. Når det passende antal områder er valgt, skal du gå til næste forsider og gentage processen. For at afslutte skal du klikke på Gem indstillinger.
BEMÆRK: For at opnå en god repræsentation af makropinocytose på tværs af prøven skal du vælge ca. 20 beacons, der er jævnt fordelt over dæksedlen (figur 4B). Mindre beacons kan bruges, men nogle billeder skal muligvis udelukkes fra billedanalyse efter erhvervelse på grund af kvalitetsforskelle, såsom når billedet er ude af fokus eller indeholder bobler eller fluorescerende pletter og pletter. - For at fuldføre justeringen af billedbehandlingsindstillingerne skal du klikke på OK. Hvis du vil afbilde omslagene, skal du vælge Opret et nyt eksperiment og Læs nu fra protokolværktøjerne. Gem protokollen og eksperimentet, når du bliver bedt om det.
- 24-brønds plade med coverslip format
Figur 4: Optimering af betingelserne for billedoptagelse. (A) Forøgelse af glycerolkoncentrationen øger TMR-dextranfluorescens, som bestemt i AsPC-1-celler behandlet med EGF. (B) Eksempel på koordinater for billedfyr til automatisk billedoptagelse, når du bruger pladen med 24 brønde med dæksedler. Søjlediagrammet viser den gennemsnitlige relative fluorescens med SEM på 5 eksperimenter. Statistisk signifikans blev bestemt af tovejs ANOVA i forhold til PBS. ** p < 0,01; p < 0.001. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Mikropladeformat med 96 brønde
- Start pladelæseren, og indsæt mikropladen.
- Åbn mikropladelæseren og billedbehandlingssoftwaren, opret en ny protokol ved at klikke på Protokoller og Opret ny. Dobbeltklik på Procedure , og vælg pladetypen.
BEMÆRK: Hvis pladetypen ikke er tilgængelig, skal du tilføje pladetypen til softwaren ved at klikke på System > Plate Types > Add Plate og bruge pladedimensionerne som angivet af producenten. For nemheds skyld findes skabelonen til CellCarrier-96 Ultra Microplates fra PerkinElmer i Supplementary File 2. - For at få adgang til billedbehandlingsindstillingerne skal du vælge Handlinger > Billede > Inverted Imager og klikke på OK. Brug målsætningen 40x PL FL-fase med Wide FOV og Autofocus Binning.
- For den første kanal skal du vælge den LED-terning, der svarer til dextran fluorophore-mærket (GFP eller RFP). Fjern klik på Auto Exposure, og klik på knappen mikroskopikon for at optimere eksponeringsindstillingerne. Når de relevante eksponeringsindstillinger er bestemt, skal du klikke på Gem indstillinger.
BEMÆRK: Under optimeringen af eksponeringsindstillingerne kan der forekomme betydelig fluorescensblegning. Dette kan resultere i indstillinger, der forårsager overeksponering, når et nyt felt afbildes. Valider derfor eksponeringsindstillingerne ved at kontrollere et endnu ikke eksponeret felt og sikre, at der ikke sker nogen mætning af signalet ved de valgte indstillinger. Medtag ikke de brønde, der anvendes til optimering af eksponeringsindstillingen, i makropinosomkvantificeringen, da fluorescensen er faldet som følge af blegning under optimeringen. Juster eksponeringsindstillingerne ved hjælp af en prøve, der forventes at have det højeste niveau af makropinocytose for at undgå overeksponerede billeder, hvilket kan resultere i mætning af signalet og tab af intensitetsdata. - Gentag det forrige trin for den anden kanal ved hjælp af DAPI LED-terningen.
- Indstil indstillingerne for autofokus for hver fluorescenskanal, vælg Fokusindstillinger. Fjern markeringen af standardfokusmetoden, og brug Laserautofokus. Optag en referencescanning efter bestemmelse af brændplanet for optimal visualisering af makropinosomer og kerner. Klik på OK for at gemme indstillingerne.
BEMÆRK: Scanningsafstanden kan reduceres til 400 μm og stigningen til 3 μm for at øge autofokuseffektiviteten. For at laserautofokusindstillingen skal fungere korrekt, skal du rengøre bunden af pladen, tørre og tørre pladen af med en fnugfri aftørring inden billeddannelse. Laserautofokus er en overlegen metode til fokus, da det kræver minimal tid at finde brændplanet. Der kan anvendes andre fokusmetoder, men da der ikke er tilsat nogen antifade til brøndene, kan disse metoder forårsage betydelig blegning af prøverne, hvilket vil have en negativ indvirkning på indsamlingen af data. - Indstil den vandrette og lodrette forskydning til nul, og vælg Montage uden overlapning under Enkelt billede, og brug 3 x 3 billeder, afhængigt af hvor mange celler der ønskes medtaget i analysen.
BEMÆRK: Afhængigt af cellernes størrelse og densitet kan der tages mere eller mindre billeder for at opnå en repræsentativ vurdering af makropinocytose i hele prøven. Ved at vurdere makropinocytose i AsPC-1- eller MIA PaCa-2-celler under forskellige forhold observeres ingen forskelle i datafortolkning mellem en 2 x 2 eller 4 x 4 fotoramme, selvom variationen mellem replikatprøver kan øges, når der tages færre billeder (figur 5A, B). Forøgelse eller formindskelse af rammens størrelse vil påvirke den tid, det tager at scanne pladen. Afhængigt af eksponeringstiden vil en fuld 96-brønds mikroplade tage omkring 1-1,5 timer at scanne fuldstændigt ved hjælp af en 3 x 3 ramme. En ramme på henholdsvis 2 x 2 og 4 x 4 vil halvere eller fordoble den tid. - For at fuldføre justeringen af billedbehandlingsindstillingerne skal du klikke på OK.
- Hvis du vil afbilde pladen, skal du vælge Opret et nyt eksperiment og Læs nu fra protokolværktøjerne. Gem protokollen og eksperimentet, når du bliver bedt om det.
Figur 5: Kontrolbetingelser for vurdering af makropinocytose i PDAC-celler. (A) AsPC-1-celler viser makropinocytose som reaktion på 100 ng / ml EGF-stimulering i 5 minutter eller glutaminmangel i 24 timer. Til billedoptagelse blev der taget billedrammer på 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 eller 2 x 2 for at bestemme indflydelsen af antallet af fotos på datakvaliteten. (B) MIA PaCa-2-celler viser konstitutiv makropinocytose, der hæmmes af 30 minutters behandling med 75 μM EIPA eller 2-timers behandling med 10 μM EHop-016. Billedrammer blev taget som i A. Skalastang = 25 μm. Søjlediagrammer viser det gennemsnitlige relative makropinocytiske indeks med SD for 1 eksperiment med 4 replikater. Statistisk signifikans blev bestemt af tovejs ANOVA i forhold til +Q eller køretøjets tilstand. p < 0.001 Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Bestemmelse af det makropinocytiske indeks
Det 'makropinocytiske indeks' er omfanget af cellulær makropinocytose, der bestemmes ved at kvantificere fluorescerende dextranoptagelse pr. celle ved hjælp af mikroskopisk billeddannelse19. Til dette formål anvendes de erhvervede billeder til at bestemme mængden af internaliseret dextran ved at måle den samlede fluorescensintensitet eller fluorescens-positive område og det samlede antal celler som bestemt ved DAPI-farvning. Denne analyse kan udføres med open source billedbehandlings- og analysesoftware, såsom Cell Profiler eller FIJI/ImageJ, som tidligere beskrevet19,20. Når du arbejder med en multi-mode pladelæser, kan softwaren, der følger med instrumentet, dog omfatte indbyggede analyseapplikationer, der kan bruges til beregning af det makropinocytiske indeks. I nogle tilfælde er den indbyggede softwareanalysepipeline muligvis ikke helt synlig for brugeren. Det anbefales derfor at validere softwaren på et tidligt tidspunkt ved sammenligning med en ikke-automatiseret procedure, såsom Cell Profiler eller FIJI/ImageJ. Denne protokol kan tilpasses andre billedbehandlings- og analysesoftwareværktøjer ved at overholde følgende generelle instruktioner:
- For DAPI og det tilsvarende dextran-billede skal du trække baggrunden fra ved at anvende den relevante funktion, ofte kaldet rullekuglefunktionen. Juster indstillingerne, så baggrundsstøjen minimeres, og der er minimal eller ingen subtraktionseffekt på DAPI- og dextran-signalet.
- Brug et felt med højt dextran-signal til at bestemme intensitetssignalindstillingerne, ofte kaldet tærskelfunktionen, for at vælge kernerne og bestemme den mindste intensitetssignalindstilling, der kræves for kun at vælge makropinosomerne.
- For dextran-billedet skal du beregne den samlede fluorescens inden for det oprettede makropinosomvalg eller bruge markeringen til at bestemme det samlede areal, der er positivt for dextran.
- For DAPI-billedet skal du bruge markeringen til at bestemme antallet af kerner i billedet for at afspejle antallet af celler, der er til stede.
- For at bestemme det makropinocytiske indeks divideres den samlede dextranfluorescens eller areal med antallet af celler bestemt af DAPI.
- Gentag disse analysetrin for alle de erhvervede billeder, der anvender de samme numeriske indstillinger hele vejen igennem.
- Følg disse instruktioner for at bestemme det makropinocytiske indeks, når du bruger Gen5-software:
BEMÆRK: Den indbyggede analysepipeline blev valideret og registrerede ingen forskelle i beregning i forhold til Fiji/ImageJ (Figur 6A).- Når billeddannelsen er afsluttet, skal du vælge et billede med et højt niveau af makropinocytose. Fjern baggrundssignalet, klik på Behandl (supplerende figur 1A), og vælg indstillingen Billedforbehandling .
- For dextran-kanalen skal du fravælge Auto og bruge en rullekuglediameter på 5 μm, prioritere fine resultater og udjævne billedet med 1 cyklus.
- For DAPI-kanalen skal du bruge Automatisk forbehandling og 1 glat cyklus. Klik på OK, og tilføj billedforbehandlingstrinnet til protokollen; klik på TILFØJ TRIN. Vælg derefter det behandlede billede under Billedudrulningen (supplerende figur 1B), og klik på knappen Analysér (supplerende figur 1C).
- Under ANALYSEINDSTILLINGER skal du indstille Type til Mobilanalyse. Vælg DAPI-kanalen, og klik på Indstillinger (supplerende figur 2A).
- For den primære maske skal du ved hjælp af det behandlede DAPI-billede oprette en maske for at vælge enkeltkerner. Brug den mørke baggrund og indstillingen Auto . Bestem desuden, hvilke indstillinger der tillader maskevalg af enkeltkerner, og når du er færdig, skal du klikke på knappen Anvend for at afgøre, om masken anvendes korrekt.
BEMÆRK: Aktivering af indstillingerne Split Touching Objects og Fill Holes in Masks fungerer muligvis bedst til valg af enkeltkerner. Mindste og maksimale objektstørrelser skal muligvis justeres afhængigt af cellelinjen og indstilles oftest i området 5-40 μm. Primære kantobjekter kan medtages, og hele billedet skal analyseres. Skyderen kan anvendes til at justere maskevalget til signalintensiteten. - Anvend derefter en sekundær maske for at optimere indstillingerne for valg af makropinosom fluorescerende puncta. Brug funktionen Måling i en sekundær maske , og udvid den primære maske med 40 μm afhængigt af cellernes størrelse.
- Brug funktionen Tærskel og Tærskel i maske til at vælge de positive dextran-områder. Klik på Anvend for at afgøre, om indstillingerne anvendes korrekt.
BEMÆRK: For at bestemme tærskelværdien skal du bruge værktøjet Vis linjeprofil (supplerende figur 2B) og tegne en linje over et dextran-positivt område (supplerende figur 2C). Brug den målte intensitet til at bestemme den bedste indstilling for at oprette en maske, der vælger makropinosomer og udelukker baggrundssignal (supplerende figur 2D). - Når du har oprettet passende masker til at vælge kerner og makropinosomer, skal du klikke på fanen Beregnede metrics og vælge Vælg eller Opret metrics af interesse på objektniveau.
- Fjern alle de metrics, der findes, og tilføj metrics for integreret og område til analyse af den sekundære maske. Klik på OK , og vælg Beregn og vis for de nye metrics. Når du er færdig, skal du klikke på OK og vælge TILFØJ TRIN for at tilføje analysen og beregningerne til protokollen.
- Gem den færdige protokol til fremtidig brug, klik på Filer og Gem protokol som.
- Når dataanalysen er afsluttet, skal du vælge de målepunkter, der er af interesse, og eksportere dataene for at bestemme det makropinocytiske indeks. Bestem det makropinocytiske indeks som følger:
Dextran fluorescens pr. celle = Objekt Int_2[Dextran fluorophore]
Dextran areal pr. celle = Objekt Area_2[Dextran fluorofor]
BEMÆRK: For pladen med 24 brønde med coverslips-format afspejler målingerne gennemsnittet af det gennemsnitlige makropinocytiske indeks pr. Billede. Alternativt kan det makropinocytiske indeks beregnes manuelt for hele prøven ved at dividere summen af 'Area' eller 'Integral' for alle billeder med det samlede 'Cell Count'. Forskellen mellem disse tilgange til beregning af det makropinocytiske indeks er minimal i de fleste indstillinger. For mikropladeformatet med 96 brønde beregnes det makropinocytiske indeks som gennemsnittet for hele prøven. - Gem protokollen til billeddannelse og den efterfølgende automatiserede analyse. Genbrug protokollen til fremtidige eksperimenter med de samme fluoroforer.
BEMÆRK: Ved brug af laserautofokusfunktionen skal der foretages en ny referencescanning, når en anden cellelinje skal analyseres, da kerner og makropinosomer muligvis er lokaliseret til et andet plan. Hver gang et nyt eksperiment udføres ved hjælp af en tidligere bestemt protokol, skal eksponeringsindstillingerne for det pågældende eksperiment optimeres.
6. Tilføjelse af behandlinger
Cellebehandlinger (små molekyler, biologiske stoffer, vækstfaktorer, metabolitter osv.) kan indarbejdes på ethvert trin i protokollen, og den præcise timing afhænger af undersøgelsens mål og mål.
- Forbered cellerne som i afsnit 2.
- Lige før du tilføjer de behandlinger, der er af interesse, skal du forberede behandlingerne og de relevante kontroller ved to gange deres endelige koncentrationer i serumfrie medier. Forbered behandlingerne i et volumen svarende til volumenet af antallet af replikatbrønde, der vurderes.
BEMÆRK: I betragtning af den rolle, som udskillede faktorer kan spille i styringen af cellulære funktioner, kan det foretrækkes at fortynde behandlingerne af interesse for konditionerede medier. Til disse formål kan det være nyttigt at så yderligere plader, såsom 6 cm eller 10 cm cellekulturfade, når der forberedes celler som beskrevet i punkt 2 til at generere de konditionerede medier til fremstilling af behandlingsopløsningerne. - Uden at fjerne medierne fra brønden, tilsæt et godt volumen behandlingsopløsning til hver brønd. Ryst pladen for at sikre korrekt blanding. Inkuber cellerne i den ønskede tid.
- Fortsæt med afsnit 3.
BEMÆRK: Ved tilsætning af dextran forårsager brugen af friske medier fjernelse af de tilsatte behandlinger, hvilket kan påvirke niveauet af makropinocytose. Derfor kan det foretrækkes at tilføje dextran direkte til brøndene uden at aspirere eller alternativt gentilføje behandlingerne eller genbruge de konditionerede medier til fremstilling af dextran-opløsningen.
Figur 6: Udførelse af en dosis-responskurve for makropinocytosehæmmere. Eksempel på data opnået ved test af kendte makropinocytosehæmmere i en ny cellelinje. PATU8998T-celler blev anvendt til mikropladeformatet med 96 brønde og behandlet i 2 timer og 30 minutter med de angivne koncentrationer af henholdsvis (A) EHop-16 og (B) EIPA. Sammenligning af resultater opnået gennem billedanalyse af Gen5-softwaren eller ImageJ viser ingen signifikante forskelle mellem de to tilgange som angivet af ns i (A). Skalastang = 25 μm. Søjlediagrammer viser gennemsnittet og SD for et enkelt eksperiment med 4 replikater. Statistisk signifikans blev bestemt af en- eller tovejs ANOVA sammenlignet med ubehandlede tilstande. * p < 0,05; p < 0.001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når trinnene og justeringen af den ovenfor beskrevne protokol følges i overensstemmelse hermed, bør de endelige eksperimentelle resultater give oplysninger om, hvorvidt de undersøgte cellekulturbetingelser eller hæmmere inducerer eller reducerer makropinocytose i cellelinjen af interesse. For at styrke gyldigheden af disse resultater vil inddragelsen af kontrolbetingelser gøre det muligt at undersøge resultaterne for at afgøre, om eksperimentet er afsluttet med succes. Makropinocytoseinduktionskontroller vil give information om det relative niveau af makropinocytose. Til dette formål anvendes liganden EGF mest13. I AsPC-1 PDAC-celler aktiverer makropinocytose (figur 5A) ved tilsætning af EGF ved 100 ng/ml i 5 minutter, før dextran tilsættes. Desuden kan autokrin EGF-aktivering af makropinocytose induceres ved at fratage cellerne glutamin i 16-24 timer (figur 5A). Alternativt kan andre induktorer inkorporeres afhængigt af celletypen og tilgængelig litteratur; disse kan omfatte PDGF eller Wnt3A10,11,12. Ikke alle celler opfører sig ens, og KRAS-mutante celler kan udvise konstitutiv makropinocytose13. Et eksempel er MIA PaCa-2 PDAC-cellelinjen, som ikke reagerer på EGF-behandling. Her vil tilsætningen af kendte makropinocytosehæmmere validere, at de observerede og kvantificerede fluorescerende puncta faktisk er makropinosomer. De hæmmende kontroller, der oftest anvendes, omfatter natrium-hydrogenbytterhæmmeren EIPA, som er en specifik makropinocytosehæmmer (figur 5B)4. Andre kontroller kan også være inkluderet, såsom Rac1-hæmmeren EHop-016 (figur 5B), Pak-hæmmeren FRAX597 eller PI3K-hæmmeren LY294002; deres virkning på makropinocytose kan dog være modelspecifik13.
For cellelinjer, der tidligere ikke er blevet vurderet for makropinocytose og hæmmere, er dosis-responskurver en glimrende tilgang til at bekræfte makropinocytose og til at bestemme optimal lægemiddelkoncentration til fremtidig brug. Til disse formål blev 96-brønds mikropladeformatprotokollen brugt til at bestemme konstitutiv makropinocytose i en cellelinje, der tidligere ikke blev vurderet i laboratoriet, PATU8998T PDAC-cellerne. For at afgøre, om disse celler udviser makropinocytose, blev effekten af to kendte hæmmere af dextranoptagelse (EHop-016 og EIPA) undersøgt. Som illustreret reducerede dosis-respons-eksperimentet gradvist det makropinocytiske indeks ved højere lægemiddelkoncentrationer (figur 6A,B), hvilket bekræftede eksistensen af konstitutiv Rac1-afhængig makropinocytose i disse celler. Derudover giver resultaterne information om optimale lægemiddelkoncentrationer, der skal bruges til fremtidige eksperimenter, når man studerer makropinocytose i denne cellelinje.
Figur 7: Fejlfindingsforhold, der kan opstå. (A) Billedet er overeksponeret, som angivet med lyserødt. (B) Billedet er ude af fokus. (C) Billedet indeholder dextran pletter eller pletter. (D) Billedet indeholder rester. (E) Billedet indeholder en boble. (F) Cellerne viser lægemiddelinduceret autofluorescens. Skalabjælke = 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Skærmbillede af billedforbehandling. (A) Knappen Proces . (B) Udrulning af billeder. (C) Knappen Analysér . Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Skærmbillede af billedkvantificeringsindstillinger. A) ANALYSEINDSTILLINGER. (B) Værktøjet Vis linjeprofil. (C) Linje over dextran positivt område. (D) Se linjeprofilresultater Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sagsmappe 1. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sagsmappe 2. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvaliteten af eksperimenterne og dataindsamlingen afhænger i høj grad af reagensernes kvalitet, optimeringen af indstillingerne og renheden af dæksedlerne og mikropladen. De endelige resultater bør give minimal variation mellem replikater; biologiske variationer forekommer dog naturligt eller kan på anden måde skyldes en række faktorer. Celletæthed kan få celler til at reagere mere eller mindre på makropinocytoseinducere eller hæmmere. Det er derfor afgørende at overholde 80% sammenløbet som foreslået her i protokollen. Alternativt er det veldokumenteret af mikropladeproducenter, at mediefordampning sker på en 96-brønds mikroplade. Her udsættes de ydre brønde for mere fordampning i forhold til de indre brønde og kan derved påvirke makropinocytose. Man kan således vælge ikke at medtage de ydre brønde i analysen og i stedet fylde disse brønde med PBS for at bygge en 'buffervæg' for at beskytte de indre brønde mod omfattende fordampning.
Det anbefales stærkt at visuelt inspicere billeder for hver betingelse for at afgøre, om erhvervelsen blev gennemført med succes. Dette kan gøres under billeddannelsen af det første sæt betingelser for at sikre, at de anvendte indstillinger faktisk er korrekte og giver mulighed for intervention, hvis det er nødvendigt. Specifikke problemer, der kan opstå, er som følger; billederne er overeksponerede (figur 7A), billederne er ude af fokus (figur 7B), billederne indeholder pletter af fluorescerende dextran (figur 7C) eller rester (figur 7D), billederne indeholder bobler (figur 7E), eller autofluorescens er synlig i dextran- eller DAPI-kanalen (figur 7F). For de to første problemer, overeksponering og ude af fokus (figur 7A,B), skal billedoptagelsesindstillingerne justeres, og erhvervelsen skal gentages. Derudover skal pladen og dæksedlerne rengøres, så autofokus fungerer korrekt. Hvis kun få billeder er ude af fokus, kan de specifikke billeder eller hele brønden også udelukkes fra analysen ved hjælp af billedfunktionen 'Maske'. Den samme funktion kan anvendes til at udelukke billeder, der indeholder pletter i dextrankanalen (figur 7C), urenheder (figur 7D) eller bobler (figur 7E). Sørg desuden for, at prøverne er blevet vasket godt, at dextran er helt opløst, hvilket kan forbedres ved opvarmning af dextranopløsningen ved 37 °C og hvirvelstrømning, og at forsøget udføres med frisklavede og rene reagenser. Endelig kan lægemiddelinduceret autofluorescens forekomme og er ret almindelig for makropinocytosehæmmeren EIPA, som fluorescerer i FITC- og DAPI-kanalen, især når den tidligere er ophidset i DAPI-kanalen. En løsning er erhvervelsen af FITC-kanalen før DAPI. Alternativt kan TMR-dextran bruges i stedet for FITC-dextran, eller for eksponeringsindstillingerne kan lysintensiteten og eksponeringstiden sænkes, samtidig med at gevinsten øges.
For at beregne det makropinocytiske indeks bruges nuklear DAPI-farvning til at bestemme cellenummeret i hvert billede. Denne farvningsprocedure er let at anvende og er en pålidelig aflæsning for antallet af celler og dermed for beregningen af den relative dextranoptagelse pr. Celle. En advarsel mod denne tilgang er, at den ikke overvejer forskelle i cellestørrelse, som kan forekomme, når man sammenligner forskellige cellelinjer eller som reaktion på farmakologiske behandlinger. I disse tilfælde, hvor cellestørrelse mistænkes for at påvirke det makropinocytiske indeks, kan celleområdet anvendes til normalisering af dextranoptagelsen, som tidligere beskrevet4. Dette kan opnås ved lidt at ændre protokollen til at omfatte en cellemaskeplet efter fiksering eller inkorporere fasekontrast eller lysfeltbilleddannelse. Det anbefales også stærkt at følge op på eventuelle fund ved hjælp af det beskrevne assay for at vurdere, om makropinocytose er en næringsforsyningsvej, der bidrager til cellulær kondition i det bestemte cellebaserede system, der anvendes. Dette kan opnås ved at vurdere proliferativ kapacitet, overlevelse eller levedygtighed under næringsstofudtømte forhold med og uden tilsætning af ekstracellulært albumin4,7. Derudover kan et DQ-BSA pulsjagtassay give bevis for, om ændringerne i makropinocytose oversættes til ændringer i albuminnedbrydning i lysosomer. Ligesom dextran med høj molekylvægt internaliseres DQ-BSA gennem makropinocytose og leveres til lysosomerne, hvor det fluorescerer efter proteolytisk fordøjelse4. I betragtning af lighederne med fluorescerende dextranoptagelse kan den beskrevne metode tilpasses til at vurdere DQ-BSA-optagelsen. Ligeledes kan denne protokol bruges til at evaluere optagelsen af anden fluorescerende mærket last, såsom albumin, lipider eller nekrotisk celleaffald, der vides at komme ind i celler gennem makropinocytose. Ved alle lejligheder bør disse tilpasninger være i overensstemmelse med fabrikantens protokoller, og der bør anvendes eksperimentelle kontroller til validering af assayet.
Mikroskopisk billedanalyse og kvantificering er en foretrukken tilgang til vurdering af makropinocytose og er blevet standarden på området4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20 ,21,22. Det giver mulighed for visuel inspektion af prøverne og kan give yderligere oplysninger om makropinosomnummer, størrelse og placering. Desuden tillader muligheden for visuelt at inspicere billeder vurdering af celleegnethed og levedygtighed og identifikation af artefakter og / eller autofluorescens forårsaget af lægemiddeladministration. Sammenlignet med andre foreslåede kvantificeringsmetoder, såsom flowcytometri, kan disse data ellers gå tabt eller overses og kan forårsage falske positive eller negativer23. Billeddannelse er imidlertid mere arbejdskrævende og mere tilbøjelig til forudindtaget dataindsamling som flowcytometri. Her har vi overvundet disse forhindringer gennem automatisering af protokollen og derved reduceret bias, arbejdskraft, omkostninger og tid.
Mange modulatorer af makropinocytose forbliver sandsynligvis uopdagede, og i betragtning af betydningen af den makropinocytiske vej i visse patologier, såsom kræft, kan deres opdagelse potentielt være af stor betydning for udviklingen af nye terapeutiske tilgange2,3. Identifikationen af disse modulatorer kan opnås gennem screening af forbindelser med højt indhold, for hvilke den heri foreslåede metode kan fungere som en hjørnesten. Den skitserede protokol tager sigte på at udføre eksperimenterne med standard laboratorieudstyr. Pladeformatet med 96 brønde kan dog optimeres og tilpasses til screening med højt indhold. Forøgelse af brøndformatet til 384 eller 1536-brønd mikroplader ville give brugeren mulighed for at øge antallet af forbindelser, der kan testes på en plade. Desuden vil robotisering af cellesåning, pladevask, forbindelse og dextran-administration reducere manuel håndtering og vel-til-brønd-variabilitet og derved forbedre skalerbarheden. I sidste ende vil en tilpasning af denne protokol til screening med højt indhold i høj grad gøre det lettere at identificere nye faktorer, der regulerer makropinocytose.
Alt i alt er den heri foreslåede metode en glimrende tilgang til at bestemme niveauet af makropinocytose i celler af interesse, identifikation af regulatorer af processen og optimering af lægemiddelkoncentrationer for kendte hæmmere. Protokollen kan også tjene som udgangspunkt for vurdering af makropinocytisk optagelse af anden last ud over dextran og screening med højt indhold med det formål at identificere blyforbindelser, der potentielt kan resultere i udvikling af nye terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.C. er opfinder på et udstedt patent med titlen '' Kræftdiagnostik, terapi og lægemiddelopdagelse forbundet med makropinocytose,'' Patent nr.: 9.983.194.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH/NCI-tilskud (R01CA207189, R21CA243701) til C.C. KMO.G. er modtager af en TRDRP Postdoc Fellowship Award (T30FT0952). BioTek Cytation 5 er en del af Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, som modtager økonomisk støtte fra NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Figur 1-3 blev oprettet ved hjælp af BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
References
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21 (2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
- Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
- Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
- Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
- Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
- Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
- Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
- Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).
- Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).
- Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
