Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.

Abstract

וירוס פס האורז (RSV), שגורם לאובדן כלכלי משמעותי של החקלאות במזרח אסיה, תלוי לחלוטין בווקטורים של חרקים להעברתו האפקטיבית בקרב אורז מארח. לאודלפקס סטריאטלוס (באנגלית: Laodelphax striatellus) הוא וקטור החרקים העיקרי המעביר אופקית RSV תוך מציצת שרף מהפלום. הרוק ממלא תפקיד משמעותי בהתנהגות ההאכלה של החרקים. שיטה נוחה שתהיה שימושית למחקר על רוק חרקים עם התנהגות האכלה מוצצת פירסינג מתוארת כאן. בשיטה זו, חרקים הורשו לאכול על דיאטה מלאכותית בין שתי שכבות סרט פרפין מתוח. הדיאטה המכילה את הרוק נאספה מדי יום, מסוננת ומרוכזת לניתוח נוסף. לבסוף, איכות הרוק שנאסף נבדקה על ידי כתמי חלבון וחיסון. שיטה זו באה לידית על ידי זיהוי נוכחות של RSV וחלבון דמוי מוצין ברוק של SBPH. שיטת האכלה מלאכותית ואיסוף רוקים אלה תכשיר בסיס למחקר נוסף על גורמים ברוק חרקים הקשורים להתנהגות האכלה ולהעברת וירוסים.

Introduction

וירוס פסים אורז (RSV), וירוס RNA שלילי תקוע בסוג Tenuivirus, גורם למחלות קשות בייצור אורז במזרח אסיה1,2,3. העברת RSV מצמחי אורז נגועים לבריאים תלויה בווקטורים של חרקים, בעיקר לאודלפקס סטריאטלוס, המעביר RSV באופן מתמשך-מפיץ. SBPH רוכש את הנגיף לאחר האכלה על צמחים נגועים RSV. ברגע שבתוך החרק, RSV מדביק את תא האפיתל midgut יום אחד לאחר האכלה ולאחר מכן עובר דרך מחסום midgut לחדור המולימף. לאחר מכן, RSV מתפשט לתוך רקמות שונות באמצעות ההמולימפה ולאחר מכן מתפשט. לאחר תקופה סמויה של כ 10-14 ימים לאחר הרכישה, הנגיף בתוך בלוטת הרוק יכול להיות מועבר לצמחים המארחים בריאים באמצעות הרוק המופרש בעוד SBPH מוצץ sap מן phloem4,5,6,7,8,9,10 . תהליך האכלה יעיל וגורמים שונים ברוק חיוניים להתפשטות RSV מהחרק לצמח המארח.

רוק חרקים המופרש על ידי בלוטות הרוק הוא האמין לתווך חרקים, וירוסים, צמחים מארחים. חרקים Hemipteran בדרך כלל לייצר שני סוגים של רוק: רוק ג'לינג ורוק מימי11,12,13. רוק גלינג מופרש בעיקר לתוך apoplasm כדי לקיים את התנועה של stylet בין תאים מארחים והוא קשור גם להתגברות על התנגדות הצמח ותגובות חיסוניות14,15,16,17. בשלב החיטוט של האכלה, חרקים מפרישים לסירוגין רוק ג'לינג שמיד מתחמצן ויוצר אוגן על פני השטח. לאחר מכן, נדן יחיד או מסועף עטוף את הסגנון כדי להזמין ערוץ צינורי18,19,20. אוגן פני השטח על האפידרמיס הוא הניח כדי להקל על חדירה של stylet על ידי משמש כנקודת עיגון, בעוד נדן סביב stylet עשוי לספק יציבות מכנית סיכה16,21,22,23. Nlshp זוהה כחלבון חיוני להיווצרות נדן הרוק והאכלה מוצלחת של צמח חום(Nilaparvata lugens,BPH). עיכוב הביטוי של חלבון הנדן המבני (SHP) המופרש על ידי pisum Acyrthosiphon כנימות הפחית את הרבייה שלה על ידי שיבוש האכלה מצינורות מסננת מארח24. יתר על כן, בכמה מינים חרקים, גורמי רוק ג'ל אמורים לעורר תגובות חיסוניות צמח על ידי יצירת מה שנקרא דפוסים מולקולריים הקשורים אוכלי עשב (HAMPs). ב N. lugens, NlMLP, חלבון דמוי מוצין הקשור להיווצרות נדן, גורם להגנות צמחים מפני האכלה, כולל מוות תאים, ביטוי של גנים הקשורים להגנה, ותצהיר callose 25,26. כמו כן, כמה גורמי רוק ג'ל כנימות הוכחו לעורר תגובות הגנה צמחית באמצעות אינטראקציות בין גנים לגן דומה דפוסים מולקולריים הקשוריםפתוגן 12,15,27.

לחקר גורמי הרוק החיוניים להאכלת חרקים ו/או להעברת פתוגן, יש צורך לנתח רוק מופרש. כאן, שיטות האכלה ואיסוף מלאכותיות כדי להשיג כמויות מספיקות של רוק מתוארים לניתוח נוסף. באמצעות מדיום המכיל רק אלמנט תזונתי אחד, חלבוני רוק רבים נאספו ונותחו על ידי כתמי כסף וכתמים מערביים. שיטה זו תהיה מועילה במחקר נוסף על גורמים ברוק כי הם חיוניים להעברת RSV על ידי SBPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תחזוקת SBPH

  1. לגדל את האנשים SBPH ארסיים ללא RSV בחממה זכוכית (65 x 200 מ"מ) עם 5-6 אורז(Oryza sativa cv. Nipponbare) שתילים לכל תא זכוכית במעבדה. לגדל את צמחי האורז ב 25 °C (5 °F) תחת אור 16 שעות / 8 שעות פוטופריוד כהה.
    הערה: האנשים בעלי החיים הנמרצים והפטורים מ- RSV נתפסו בתחילה במחוז ג'יאנגסו, סין.
  2. זהה RSV ב- SBPH על ידי בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (dot-ELISA) עם נוגדן פוליקלונלי ספציפי ל- RSV ארנב (ראה טבלה של חומרים) שהועלה כנגד ריבונוקליאופרוטאינים RSV (RNPs).
    הערה: כדי להבטיח יעילות זיהום גבוהה של צאצאים, נקבות נמרצות נשמרו בנפרד, ו -15% מהצואצאים שלהם נבדקו באופן אקראי לזיהום RSV. הפרטים של dot-ELISA מתוארים בשלבים 1.3-1.7.
  3. הומוגניזציה SBPH יחיד ב 20 μL של חוצץ ציפוי (0.05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9.5). ספוט 3 μL של כל על קרום ניילון (ראה שולחן של חומרים), ולאחר מכן לייבש את הממברנה בטמפרטורת החדר (RT).
  4. לדגור על הממברנה עם 15 מ"ל של חוצץ חסימה (PBS + 3% חלב דל שומן) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לדגור על הממברנה עם ארנב ראשוני מדולל-נוגדנים נגד RSV (1:10000) ב 15 מ"ל של PBS במשך 1 שעה ב RT ולשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות דגירה בכל פעם.
  6. לדגור על הממברנה עם 1.5 μL של חזרת peroxidase-מצומד עיזים נגד ארנב נוגדנים (ראה טבלה של חומרים)ב 15 מ"ל של PBS לשטוף שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות דגירה בכל פעם.
  7. לפתח את אימונובלוטים עם ערכת כרומוגנית HRP-DAB משופרת (ראה טבלת חומרים) על פי הפרוטוקולים שסופקו על ידי היצרן.

2. הכנת תא האכלה ותזונה מלאכותית

  1. שקול 2 גרם של אבקת סוכרוז ולהמיס אותו ב 40 מ"ל של ddH2O כדי להכין 5% תמיסה מימית סוכרוז כמו דיאטה מלאכותית.
  2. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר זיהום חיידקים וזיהומים.
  3. להרעיב 2003 rd-5זחלי SBPH במשך 3-5 שעות לפני הצגתם לתוך התא.
    הערה: 200 SBPH מוכנים לתא אחד; SBPH יותר צריך להיות מוכן למספר תאים.
  4. הכינו את גלילי הזכוכית כתאיהאכלה (איור 1A). לכסות קצה פתוח אחד של התא עם קרום פרפין (ראה שולחן של חומרים) לפני הצגת החרקים הניסיוניים.
    הערה: אורכו של כל גליל הוא 15.0 ס"מ וקוטרו 2.5 ס"מ. גלילי זכוכית אלה מיוצרים בהתאמה אישית בהתאם לדרישה הניסיונית.
  5. מעבירים חרקים לצילינדר זכוכית.
  6. לכסות את הקצה השני של התא עם קרום פרפין מתוח (במיוחד, Parafilm M). לאחר מכן, להוסיף 200 μL של דיאטה מלאכותית אליו. לבסוף, לכסות את הנוזל עם שכבה נוספת של קרום פרפין מתוח.
    הערה: קרום פרפין נמתח בערך להכפיל את האזור המקורי שלה.
  7. לכסות את התא עם רדיד אלומיניום, אבל להשאיר את הסוף עם מכשיר דיאטה מלאכותית חשוף לאור.

3. אוסף רוק SBPH

  1. לאסוף דיאטה מלאכותית מ SBPH ללא RSV וארסי בנפרד בסוף 24 שעות.
  2. מצננים את הגליל ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשתק את החרקים.
  3. לחשוף את הסרט החיצוני ולאסוף את נוזל דיאטה מלאכותית באמצעות pipette סטרילי לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל. שמור את הרוק שנאסף ב -80 מעלות צלזיוס עד ניתוח.
    הערה: הרוק שנאסף יכול להיות מאוחסן ב -80 °C (70 °F) למשך שנה אחת.
  4. יש לשטוף את הממברנה הפנימית ב-50 מיקרו-אל של תזונה מלאכותית טרייה שלוש פעמים על ידי צנרת ברכות, ולאסוף את דיאטת הכביסה המלאכותית כמתואר בשלב 3.3. מניחים את הדיאטה המלאכותית החדשה על הממברנה הפנימית ושומרים על קרום פרפין טרי.
  5. חזור על שלבים 3.2 ו- 3.3 למשך 5 ימים עד שבועיים.
    הערה: לספור את שיעור ההישרדות של האכלה מלאכותית SBPH ולהבטיח תוספת מספקת של SBPH טרי על פי שיעור ההישרדות.
  6. סנן את הדגימות שנאספו באמצעות יחידת סינון 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חיידקים ומזהמים אחרים.

4. ריכוז הרוק שנאסף

  1. העבר את דגימות הרוק שנאספו במסנן צנטריפוגלי 0.5 מ"ל 10 kD (ראה טבלת חומרים) ומסתובב ב 5,500 x גרם ב 4 °C (4 °F) במשך 20 דקות. לאסוף את supernatant ולעשות את הכרך הסופי ל 100 μL.
  2. למדוד את הריכוז של הרוק שנאסף באמצעות ספקטרופוטומטר מתאים UV-Vis בעקבות שלבים 4.3-4.6.
  3. הפעל את הספקטרופוטומטר ושטוף את ההודים שלוש פעמים עם ddH2O.
  4. בחרו באפשרויות הבאות על המסך לפי הסדר הנכון: חלבונים | חלבון A280 | בחירת | סוג 1 שרירי בטן = 1 מ"ג / מ"ל. לאחר מכן, סמן את תיבת הסימון תיקון בסיסי 340 ננומטר.
  5. טען 2 μL של 5% תמיסה מימית סוכרוז ריק, לגעת ריק בתחתית המסך.
  6. לאחר קביעת סטנדרטים, לטעון 2 μL של הרוק שנאסף למדידה. קרא ותיעד את ריכוז החלבון.
    הערה: 1 מ"ג של חלבוני רוק נאספו סוף סוף בסך הכל לפחות.

5. כתמי כסף של חלבוני רוק

  1. לחלץ חלבון מדגימות רוק חרקים באמצעות חוצץ טעינה מדגם (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% גליסול, 2% SDS, 0.1% ברומופנול כחול, ו 1% β-mercaptoethanol). לאחר מכן, חלק אותו ב- 10% SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים). לטעון את הפתרון 5% סוכרוזאקי יטופל באותו אופן כמו שליטה שלילית.
  2. טען aliquot 20 μL של המדגם על ג'ל SDS-PAGE לצד סמן מראש. הפעל את הג'ל במשך 15 דקות ב 90 וולט, ולאחר מכן 50 דקות ב 140 וולט.
  3. תקן את הג'ל ב 30% (vol/vol) אתנול, 10% (vol/vol) חומצה אצטית במשך לפחות 30 דקות לאחר אלקטרופורזה.
  4. לשטוף את הג'ל פעמיים עם 20% (vol/vol) אתנול ומים בנפרד במשך 10 דקות בכל פעם.
  5. רגישים את הג'ל ב 0.8 מ"מ נתרן thiosulfate במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים במים במשך 1 דקות בכל פעם.
  6. לטבול את הג'ל חנקתי כסף 12m לפחות 1 שעות, ולאחר מכן לטבול אותו במים deionized במשך 10 s לפני העברתו לפתרון המפתח.
  7. כאשר הרקע של הג'ל מחשיך, לטבול את הג'ל בתמיסת עצירה (5% חומצה אצטית) במשך 30 דקות לפחות כדי לעצור את התגובה.
  8. לשטוף את הג'ל פעמיים עם מים במשך 30 דקות בכל פעם. פיתוח התמונה באמצעות מערכת הזיהוי (ראה טבלת חומרים).

6. זיהוי חלבונים על ידי סופג מערבי

  1. לזהות את החלבון דמוי mucin הרוק של SBPH (LssgMP) ו RSV על ידי כתמים מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים, בהתאמה.
  2. לטפל דגימות רוק חרקים בעקבות שלב 5.1.
  3. לטעון aliquot 20 μL של המדגם על ג'ל SDS-PAGE 10% לצד סמן prestained ו 20 μL RSV דגימת רוק לא נגוע כמו שליטה שלילית. הפעל את הג'ל במשך 15 דקות ב 90 וולט, ולאחר מכן במשך 50 דקות ב 140 וולט.
  4. יש לערבב 100 מ"ל של חיץ העברת חלבונים 10x (רטוב) (ראה טבלת חומרים)עם 900 מ"ל של ddH2O לתמיסת עבודה (1x), ולאחר מכן להעביר חלבונים לקרום דיפלואוריד פוליווינילידן באמצעות מאגר העברת חלבונים (1x).
  5. לחסום את הממברנה ב 5% חלב רזה עם 0.01 M תמיסת מלח חוצצת טריס עם 0.05% Tween 20 (TBST) בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 שעה.
    הערה: בפרוטוקול זה, לערבב 100 מ"ל של 10x TBST (ראה טבלת חומרים) עם 900 מ"ל של ddH2O לתוך פתרון העבודה.
  6. לדגור על הממברנה עם נוגדני ארנב ראשוניים נגד RSV או LssgMP (שניהם 1:10000) מדולל ב- TBST ב- RT לפחות 2 שעות.
    הערה: הייצור של נוגדנים ראשוניים נגד RSV הוזכר לעיל. חברת ביוטכנולוגיה ייצרה את הנוגדן הפוציקלוני נגד LssgMP נגד פפטיד LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST במשך 10 דקות של דגירה בכל פעם.
  8. לדגור על הממברנה עם נוגדני עזים מצומדים נגד ארנבות מחוסלבים ב-1:10000 TBST.
  9. לפתח את החיסון עם מערכת זיהוי סופג מערבית chemiluminescence משופרת.

7. זיהוי תבנית ביטוי LssgMP ב- SBPH

  1. לשתק את החרקים ב 4 °C (5 דקות).
  2. לשטוף את החרקים עם 75% אתנול ו ddH2O אחד אחד, ולאחר מכן לנתח את החרקים TBS צונן מראש (0.01 M טריס חוצץ מלוחים).
  3. לנתח את החרקים מהבטן תוך ניתוק הבחירה של SBPH במפרק קוקסה-טרוכנוטר על ידי מלקחיים; לשטוף את midgut ואת בלוטות הרוק פעמיים ב TBS כדי להסיר כל זיהום מן ההמולימפה.
  4. שים חמש רקמות לתוך צינור 1.5 מ"ל ללא RNase כדי לחלץ RNA. שקול כל צינור כדוגמה אחת.
  5. בצע מיצוי RNA בהתאם לפרוטוקולי היצרן ו- PCR הפוך-תמלול (RT-PCR) (ראה טבלת חומרים).
  6. בצע כמותית בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לחקור את רמות ביטוי התמליל היחסי של LssgMP בתמציות של כל הגוף או רקמות שונות של L. striatellus.
    הערה: זוגות פריימר המשמשים להגברת גנים היו LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, QPCR מבוסס ירוק SYBR בוצע על פי פרוטוקול היצרן. רמת התמליל של גורם התארכות התרגום של L. striatellus 2 (ef2) כותמה עם זוג פריימר ef2-q-F/ef2-q-R לנורמליזציה של תבניות cDNA. ורצפי הפריימר מצורפים להלן:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שרטוטים של התקנת הזנה מלאכותית ואיסוף רוק
איור 1A מתאר את גליל הזכוכית (15 ס"מ על 2.5 ס"מ) המשמש כתא האכלה לאיסוף הרוק. ראשית, זחלי SBPH היו מורעבים במשך כמה שעות כדי לשפר את יעילות האיסוף ולאחר מכן משותק על ידי צינון במשך 5 דקות. לאחר החרקים הועברו לתוך גליל זכוכית, שני הקצוות הפתוחים של התא היו מכוסים קרום פרפין מתוח. בקצה אחד, 200 μL של 5% סוכרוז היה תקוע בין שתי שכבות של קרום פרפין מורחב לכפול השטח המקורי שלה(איור 1B). התא היה מכוסה בנייר כסף, אבל הסוף בתזונה המלאכותית נחשף לאור. מכיוון ש- SBPH מציג התנהגות פוטוטרופית, החרקים המורעבים שנאספו בסוף נחשפו לאור וניזונים מתמיסת הדיאטה המלאכותית דרך קרום פרפין הפנימי המתוח. בהתבסס על זה, רוק יכול להשתחרר לתוך הדיאטה המלאכותית, אשר נאסף מדי יום. מכשיר דיאטת Parafilm הוחלף עם אחד חדש בכל יום. בדרך זו, הדיאטה המלאכותית נאספה במשך 5 ימים עד שבועיים, ואז המדגם כולו התרכז לנפח סופי של 100 μL באמצעות מסנן צנטריפוגלי 10 KD (איור 1C). במהלך איסוף הרוק, שיעור ההישרדות של SBPH האכלת סוכרוז 5% נספר. ב-4 הימים הראשונים, יותר מ-80% SBPH שרדו. עם זאת, מהיוםהחמישי ואילך, התמותה עלתה במהירות ל -40%, ופחות ממחצית SBPH שרד ביוםהשביעי (איור 1D). כדי לאסוף רוק מספיק, SBPH טרי הוצע לספק ביום4.

אימות חלבוני רוק שנאספו
להערכת האפקטיביות של שיטת איסוף זו, דגימת הרוק הייתה נתונה לניתוח חלבון. ראשית, חלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, ולאחר מכן זוהו על ידי כתמי כסף(איור 2A). בהשוואה לשליטה השלילית (5% סוכרוז), דגימות הרוק המרוכזות מרוק SBPH הנגוע ב- RSV הכילו חלבונים רבים שניתן לנתח עוד יותר, למשל, על ידי ספקטרומטריית מסה. כווקטור החרקים העיקרי של RSV, SBPH מעביר את הנגיף לצמחים באמצעות תהליך ההאכלה החודר שלו. השחרור המוצלח של RSV קשור להפרישת רוק, ו- RSV נחשב לגורם חיוני ברוק חרקים נמרץ. כאן, הרוק נבדק לאחר איסוף חרקים שאינם נגועים ונמרצים עם נוגדן נגד RSV וזיהה בהצלחה את חלבון מעיל RSV (CP) במדגם הנמרץ(איור 2B). מחקר אחר מצא כי חלבוני מוצין הם חלבוני רוק ג'ל חיוניים בחרקים hemipteran כדי לעשות מדיטציה על היווצרות של נדן להאכלה23. לאישור כי SBPH מייצר גם חלבון מוצין, כל מסגרת הקריאה הפתוחה של גן קידוד מוצין פואטי הוגברה מ- RNA שחולץ מבלוטת הרוק של SBPH. הרצף שלה שימש כשאילתה ב- BLAST מנתחים נגד רצף הגנום של SBPH28. גן המורכב מ- 2175 bp, הנקרא LssgMP, זוהה. נוגדן נגד חלבון זה הוכן בעבר ושימש לזיהוי החלבון במדגם שנאסף על ידי ניתוח כתם מערבי. חלבון 78 KD זוהה בדגימות לא נגועות ונמרצות, מה שמוכיח כי LssgMP הוא חלבון רוק(איור 2C). לאחר מכן, רמות התמליל של LssgMP ברקמות שונות (בלוטת רוק, מעיים, והגוף הנותר) נקבעו על ידי qRT-PCR. התוצאות הראו כי רמת תעתיק הגן הייתה גבוהה פי 20 בבלוטת הרוק מאשר במעיים ובחלקי גוף אחרים (איור 2D), המאשר את הביטוי הספציפי של LssgMP בבלוטת הרוק.

Figure 1
איור 1: תרשים של תא האכלה עם כריך קרום פרפין כדי לאפשר האכלה של SBPH בתזונה מלאכותית. (A)איור של תא האכלה מלאכותי. אורך הגליל הוא 15.0 ס"מ וקוטרו 2.5 ס"מ. בקצה אחד של התא נמצא כריך קרום פרפין; הקצה השני וקיר הגליל המכוסה בנייר נייר כסף (קווים מלוכסנים) מייצגים את ההתקן המכוסה בנייר נייר כסף. מקור האור היה אמור למשוך SBPH להאכיל על הדיאטה המלאכותית. (ב)דיאגרמה של כריך פרפין המכיל תזונה מלאכותית. 200 μL של 5% תמיסה מימית סוכרוז היה תקוע בין שתי שכבות של קרום פרפין נמתח בערך כפול השטח המקורי שלה. (ג)ריכוז הרוק שנאסף באמצעות מסנן צנטריפוגלי 10 KD. (ד)שיעור ההישרדות של SBPH האכלה על 5% סוכרוז. Mean ו- SEM חושבו מארבעה שכפולים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אימות חלבוני רוק שנאספו. (א)חלבוני רוק לזיהוי על ידי כתמי כסף. 5% סוכרוז הוא שליטה שלילית. (B)זיהוי חלבון מעיל נגיף פסים אורז (CP) ברוק שנאסף על ידי ניתוח כתם מערבי. (C)סופג מערבי כדי לאשר את נוכחותו של LssgMP ברוק שנאסף. (D)ביטוי ספציפי של LssgMP בבלוטת הרוק של L. striatellus. ef2: תרגום מקדם התארכות 2 של SBPH. Mean ו- SEM חושבו מארבעה שכפולים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גידול מוצלח של חרקים על דיאטות מלאכותיות דווח לראשונה בשנת 1962 כאשר מיטלר ואבא תיארו את טכניקת קרום פרפין להחזיק דיאטה מלאכותית29,30. שיטה זו נחקרה בהיבטים רבים של ביולוגיה והתנהגות חרקים, למשל, תוספת תזונתית, האכלת dsRNA, ורכישת וירוסים. בהתבסס על הדרישות של ניתוח רוק, 5% סוכרוז משמש דיאטה מלאכותית כללית כדי לאסוף רוק של SBPH במחקר זה. עבור איסוף רוק מוצלח, כמה צעדים קריטיים ראויים לציין כאן. ראשית, להרעיב את החרקים הניסיוניים לפני החדרתם לתא יש צורך להבטיח את היעילות של איסוף הרוק. שנית, כדי לחקות את הסביבה stylet, כריך פרפין דו שכבתי נעשה. כאשר SBPH ניזון מהתזונה המלאכותית, נדן הרוק נוצר בקצה הפנימי מול הדיאטה, והרוק המימי מופרש לאחר מכן. שלישית, יש לאסוף מדיום מלאכותי ולהחליף אותו בזמן כדי להפחית את הזיהום המיקרוביאלי במדגם שנאסף. לבסוף, מרדים את החרקים ב 4 °C (5 דקות) הוא חיוני כדי למנוע אובדן של חרקים תוך שינוי התזונה המלאכותית.

בניגוד לרוב הדיאטות המלאכותיות המכילות חומצות אמינו, ויטמינים ופחמימות, היתרונות של 5% סוכרוז בינוני ראויים לציון. ראשית, קל להתכונן. שנית, ההרכב הפשוט של הדיאטה פירושו חומרים מעטים להפריע לניתוח נוסף של הגורמים השונים ברוק. עם זאת, יחס ההישרדות של SBPH ירד בימים האחרונים של תקופת ההאכלה באמצעות 5% סוכרוז כתזונה המלאכותית הכללית (איור 1D). להתגבר על פגם זה, SBPH טרי צריך להיות מסופק בזמן מספיק רוק. ולמחקר נוסף על תפקוד הרוק על התנהגות האכלה או העברת וירוסים, משך איסוף הרוק צריך להיות מוגבל לזמן המדויק לפני שתמותת החרקים גדלה בשל רמיזה. נראה שזו מגבלה נפוצה של המדיום המלאכותי. כמה מחקרים אחרים מצאו כי ההישרדות של N. lugens גדל על דיאטה מוגדרת כימית D-97 היה נחות מזה של אלה שגדלו על מגוון האורז רגיש TN1, רומז כי המארח המקורי מספק יותר מאשר רק חרקים וקטור מזון. ומספר מחקרים התמקדו באופטימיזציה של דיאטות המוגדרות כימית להאכלה מתמשכת של חרקים כדי לשפר את יעילות הגידול.

ניתוח Transcriptome של בלוטת הרוק היא שיטה מסורתית לזיהוי חלבון רוק. וחלבוני רוק שונים זוהו באותו מין של A. pisum ו- M. persicae14,31, ושפע חלבוני הרוק קובע את תדירות הזיהוי שלהם32. עם זאת, חסרה שיטה תקפה לחקור את החלבון החשוד ברוק. שיטת כריך קרום פרפין זו מספקת אופן חדשני כדי לאשר חלבון רוק חשוד שזוהה על ידי ניתוח transcriptome, אשר הוכח עוד יותר על ידי גילוי LssgMP (איור 2C). יתר על כן, ניתוח חלבונים אישר כי חלבונים בשפע נמצאים ברוק שנאסף (איור 2A), שהוא כמות מספקת לניתוח נוסף על ידי, למשל, ספקטרומטריית מסה. ניתוח פרוטאומיקה של רוק שנאסף יהיה שיטה ישירה ויעילה לזיהוי גורמים מופרשים המעורבים בשלב ההאכלה של SBPH, תוך מזעור הסיכון לגילוי חלבונים יתירים חיוביים כוזבים.

הרוק עובד כמו נשא הנגיף מחרק לצמחים מארחים והוא מרכיב חיוני של אינטראקציה וקטור-וירוס-צמח14,33,34. טיטר של וירוס ששוחרר מווקטורים חרקים הוא גורם מכריע עבור הזיהום למארח. בהשוואה לשיטות עקיפות שבודקות את הטיטר הנגיפי בצמחים נגועים, פרוטוקול זה יכול לזהות ישירות RSV ששוחרר על ידי SBPH נמרץ (איור 2B). נתמך בשיטת כריך קרום פרפין זו, ניתוחים השוואתיים נוספים של חלבוני רוק שנאספו מחרקים ללא RSV ו- RSV עשויים גם לחשוף מועמדים פוטנציאליים המעורבים באינטראקציה בין וירוס לצמח-וקטור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס '2019YFC1200503), על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס '32072385), ועל ידי האגודה לקידום חדשנות נוער CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 174
שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק <em>של לאודלפקס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter