Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Método sanduíche de membrana de duas camadas para laodelphax striatellus saliva collection

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.

Abstract

O vírus da tarja de arroz (RSV), que causa perda econômica significativa da agricultura no leste da Ásia, depende inteiramente de vetores de insetos para sua transmissão efetiva entre o arroz hospedeiro. Laodelphax striatellus (pequeno planthopper marrom, SBPH) é o vetor de insetos primário que transmite horizontalmente RSV enquanto suga seiva do phloem. A saliva desempenha um papel significativo no comportamento alimentar dos insetos. Um método conveniente que será útil para pesquisas sobre a saliva de insetos com comportamento de alimentação sugador de piercings é descrito aqui. Neste método, os insetos foram autorizados a se alimentar de uma dieta artificial sanduíche entre duas camadas de filme de parafina esticadas. A dieta contendo a saliva era coletada todos os dias, filtrada e concentrada para análise posterior. Por fim, a qualidade da saliva coletada foi examinada por manchas de proteína e imunoblotting. Este método foi exemplificado pela detecção da presença de RSV e de uma proteína semelhante à mucina na saliva de SBPH. Estes métodos artificiais de alimentação e coleta de saliva estabelecerão uma base para novas pesquisas sobre fatores na saliva de insetos relacionados ao comportamento alimentar e transmissão do vírus.

Introduction

O vírus da tarja de arroz (RSV), um vírus de RNA de ram-tease com fios negativos no gênero Tenuivirus,causa doenças graves na produção de arroz na Ásia Oriental1,2,3. A transmissão de RSV de plantas de arroz infectadas para as saudáveis depende de vetores de insetos, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite RSV de forma persistente-propagativa. A SBPH adquire o vírus após se alimentar de plantas infectadas pelo RSV. Uma vez dentro do inseto, o RSV infecta a célula epitelial midgut um dia após a alimentação e, em seguida, passa através da barreira midgut para penetrar o hemolífio. Posteriormente, o RSV se espalha em diferentes tecidos através do hemoglifo e, em seguida, se propaga. Após um período latente de cerca de 10-14 dias após a aquisição, o vírus dentro da glândula salivar pode ser transmitido para as plantas hospedeiras saudáveis através da saliva secretada enquanto a SBPH suga a seiva do phloem4,5,6,7,8,9,10 . Um processo de alimentação eficiente e vários fatores na saliva são essenciais para a disseminação do RSV do inseto para a planta hospedeira.

Acredita-se que a saliva de insetos secretada por glândulas salivares media insetos, vírus e plantas hospedeiras. Insetos hemipteranos geralmente produzem dois tipos de saliva: saliva de gelagem e saliva a aguada11,12,13. A saliva de gelagem é principalmente secretada no apoplasmo para sustentar o movimento do estilo entre as células hospedeiras e também está relacionada à superação da resistência vegetal e respostas imunes14,15,16,17. Na fase de sondagem da alimentação, os insetos secretam intermitentemente a saliva de gelagem que imediatamente é oxidada para formar uma flange superficial. Em seguida, baias simples ou ramificadas envolvem o estilo para reservar um canal tubular18,19,20. Presume-se que a flange superficial na epiderme facilite a penetração do estonte com o estopi, servindo como ponto de ancoragem, enquanto as baias ao redor do estilo podem proporcionar estabilidade mecânica e lubrificação16,21,22,23. A NISHP foi identificada como uma proteína essencial para a formação da baia salivar e a alimentação bem sucedida do planthopper marrom (Nilaparvata lugens, BPH). A inibição da expressão da proteína de baia estrutural (PCH) secretada pelo mímpo acyrthosiphon phid reduziu sua reprodução interrompendo a alimentação dos tubos de peneira hospedeira24. Além disso, em algumas espécies de insetos, fatores de saliva de gel devem desencadear respostas imunes às plantas, formando os chamados padrões moleculares associados ao herbívoro (HAMPs). Em N. lugens, NLMLP, uma proteína semelhante à mucina relacionada à formação de baia, induz defesas vegetais contra a alimentação, incluindo morte celular, expressão de genes relacionados à defesa, e callose deposição 25,26. Além disso, alguns fatores de saliva de gel em pulgões têm sido provados para desencadear respostas de defesa vegetal através de interações gene-gene-gene semelhantes aos padrões moleculares associados ao patógeno12,15,27.

Para estudar os fatores salivares essenciais para a alimentação de insetos e/ou transmissão de patógenos, é necessário analisar a saliva secretada. Aqui, métodos de alimentação artificial e coleta para obter quantidades suficientes de saliva são descritos para análise posterior. Utilizando um meio contendo apenas um único elemento nutricional, muitas proteínas salivares foram coletadas e analisadas por manchas de prata e manchas ocidentais. Este método será útil em mais pesquisas sobre fatores na saliva que são essenciais para a transmissão de RSV pela SBPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Manutenção da SBPH

  1. Crie os viruliferosos e isentas de RSV SBPH em uma incubadora de vidro (65 x 200 mm) com 5-6 mudas de arroz(Oryza sativa cv. Nipponbare) por câmara de vidro no laboratório. Cultivar as plantas de arroz a 25 °C sob uma luz de 16 h / 8 h fotoperíodo escuro.
    NOTA: Os viruliferosos e os indivíduos SBPH livres de RSV foram inicialmente capturados na província de Jiangsu, china.
  2. Detecte o RSV no SBPH por um ensaio imunosorbente ligado a enzimas (ponto-ELISA) com um anticorpo policlonal específico rsv de coelho (ver Tabela de Materiais) levantado contra as ribonucleoproteínas RSV (RNPs).
    NOTA: Para garantir alta eficiência da infecção da prole, as fêmeas viruliferosas foram mantidas separadamente, e 15% de seus descendentes foram testados aleatoriamente para infecção por RSV. Os detalhes do ponto-ELISA são descritos nas etapas 1.3-1.7.
  3. Homogeneize sbph único em 20 μL de tampão de revestimento (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9.5). Local 3 μL de cada uma na membrana de nylon (ver Tabela de Materiais), e depois seque a membrana à temperatura ambiente (RT).
  4. Incubar a membrana com 15 mL de tampão de bloqueio (PBS + 3% de leite desnatado) por 30 min a temperatura ambiente.
  5. Incubar a membrana com anticorpos-coelho primários diluídos contra RSV (1:10000) em 15 mL de PBS por 1 h em RT e lavar a membrana três vezes com PBS para incubação de 5 minutos cada vez.
  6. Incubar a membrana com 1,5 μL de anticorpos anti-coelho conjugados por peroxidase de rabanete (ver Tabela de Materiais) em 15 mL de PBS e lavar três vezes com PBS para incubação de 5 minutos cada vez.
  7. Desenvolver os imunoblots com Kit Cromogênico HRP-DAB Aprimorado (ver Tabela de Materiais) de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante.

2. Preparação da câmara de alimentação e dieta artificial

  1. Pese 2 g de pó de sacarose e dissolva-o em 40 mL de ddH2O para preparar 5% de solução aquosa de sacarose como a dieta artificial.
  2. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) para remover contaminação bacteriana e impurezas.
  3. Arama 200 3-5ª larvas SBPH por 3-5 h antes de introduzi-las na câmara.
    NOTA: 200 SBPH estão preparados para uma câmara; mais SBPH deve ser preparado para várias câmaras.
  4. Prepare os cilindros de vidro como câmaras de alimentação(Figura 1A). Cubra uma extremidade aberta da câmara com uma membrana de parafina (ver Tabela de Materiais) antes de introduzir os insetos experimentais.
    NOTA: Cada cilindro tem 15,0 cm de comprimento e 2,5 cm de diâmetro. Estes cilindros de vidro são feitos sob medida de acordo com a exigência experimental.
  5. Transfira insetos para um cilindro de vidro.
  6. Cubra a outra extremidade da câmara com membrana de parafina esticada (especificamente, Parafilm M). Em seguida, adicione 200 μL de dieta artificial a ele. Por fim, cubra o líquido com outra camada de membrana de parafina esticada.
    NOTA: A membrana de parafina é esticada para cerca de o dobro de sua área original.
  7. Cubra a câmara com papel alumínio, mas deixe a extremidade com o dispositivo de dieta artificial exposto à luz.

3. Coleção de saliva SBPH

  1. Colete dieta artificial da SBPH livre de RSV e viruliferosa separadamente no final do período de 24h.
  2. Esfrie o cilindro a 4 °C para imobilizar os insetos.
  3. Descubra o filme externo e colete o líquido da dieta artificial usando uma pipeta estéril em tubos estéreis de 1,5 mL. Mantenha a saliva coletada a -80 °C até a análise.
    NOTA: A saliva coletada pode ser armazenada a -80 °C durante 1 ano.
  4. Enxágüe a membrana interna com 50 μL de dieta artificial fresca três vezes por pipetar suavemente, e colete a dieta de lavagem artificial como descrito na etapa 3.3. Coloque a nova dieta artificial na membrana interna e mantenha uma membrana parafina recém-esticada por cima.
  5. Repita as etapas 3.2 e 3.3 por 5 dias a 2 semanas.
    NOTA: Conte a taxa de sobrevivência da alimentação artificial SBPH e garanta o suplemento suficiente de SBPH fresco de acordo com a taxa de sobrevivência.
  6. Filtre as amostras coletadas através de uma unidade de filtro de 0,22 μm para remover micróbios e outros contaminantes.

4. Concentração da saliva coletada

  1. Transfira as amostras de saliva coletadas em um filtro centrífugo de 0,5 mL 10 kD (ver Tabela de Materiais) e gire a 5.500 x g a 4 °C por 20 min. Colete o supernante e faça o volume final a 100 μL.
  2. Meça a concentração da saliva coletada utilizando um espectrofotômetro UV-Vis apropriado seguindo as etapas 4.3-4.6.
  3. Ligue o espectrômetro e lave os pedestais três vezes com ddH2O.
  4. Selecione as seguintes opções na tela em ordem adequada: Proteínas | Proteína A280 | Selecione | tipo 1 Abdômen = 1 mg/mL. Em seguida, verifique a caixa de seleção Correção de linha de base 340 nm.
  5. Carregar 2 μL de solução aquosa de 5% de sacarose como em branco, toque em branco na parte inferior da tela.
  6. Após a definição dos padrões, carregue 2 μL da saliva coletada para medição. Leia e regisse a concentração de proteínas.
    NOTA: 1 mg de proteínas salivares foram finalmente coletadas no total, pelo menos.

5. Coloração de prata de proteínas salivares

  1. Extrair proteína das amostras de saliva de inseto usando tampão de carga de amostra (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glicerol, 2% SDS, 0,1% azul bromofenol e 1% β-mercaptoethanol). Em seguida, fracione-o em 10% de SDS-PAGE (ver Tabela de Materiais). Carregue a solução sucrosesa de 5% tratada da mesma forma que um controle negativo.
  2. Carregue uma alíquota de 20 μL da amostra em um gel SDS-PAGE ao lado de um marcador presumado. Corra o gel por 15 min a 90 Volt, e depois 50 min a 140 Volt.
  3. Fixar o gel em 30% (vol/vol) de etanol, 10% (vol/vol) ácido acético por pelo menos 30 minutos após a eletroforese.
  4. Enxágüe o gel duas vezes com 20% (vol/vol) de etanol e água separadamente por 10 minutos cada vez.
  5. Sensibilize o gel em 0,8 mM de tiossulfito de sódio por 1 min e enxágue duas vezes em água por 1 min cada vez.
  6. Mergulhe o gel em nitrato de prata de 12 mM por pelo menos 1 h, e depois mergulhe-o em água desionizada por 10 s antes de transferi-lo para a solução do desenvolvedor.
  7. Quando o fundo do gel estiver ficando escuro, mergulhe o gel em uma solução stop (5% de ácido acético) por pelo menos 30 minutos para parar a reação.
  8. Lave o gel duas vezes com água por 30 minutos cada vez. Desenvolver a imagem com o Sistema de Detecção (ver Tabela de Materiais).

6. Detecção de proteínas por manchas ocidentais

  1. Detecte a proteína saliva semelhante à mucina de SBPH (LssgMP) e RSV por manchas ocidentais usando anticorpos específicos, respectivamente.
  2. Trate amostras de saliva de insetos após o passo 5.1.
  3. Carregue uma alíquota de 20 μL da amostra em um gel SDS-PAGE de 10% ao lado de um marcador prestained e uma amostra de saliva não infectada de 20 μL RSV como um controle negativo. Corra o gel por 15 min a 90 Volt, e depois por 50 min a 140 Volt.
  4. Misture 100 mL de tampão de transferência de proteína de 10x (molhado) (ver Tabela de Materiais) com 900 mL de ddH2O para uma solução de trabalho (1x), e depois transfira proteínas para uma membrana de difluoreto polivinídeno usando tampão de transferência de proteína (1x).
  5. Bloqueie a membrana em 5% de leite desnatado com soro fisiológico tamponado por 0,01 M Tris com 0,05% Tween 20 (TBST) à temperatura ambiente (RT) por 1 h.
    NOTA: Neste protocolo, misture 100 mL de 10x TBST (ver Tabela de Materiais) com 900 mL de ddH2O na solução de trabalho.
  6. Incubar a membrana com anticorpos de coelho primário contra RSV ou LssgMP (ambos 1:10000) diluídos em TBST no RT por pelo menos 2 h.
    NOTA: A produção de anticorpos primários contra o RSV foi mencionada acima. Uma empresa de biotecnologia produziu o anticorpo policlonal anti-LssgMP contra o peptídeo LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Lave a membrana três vezes com TBST por 10 minutos de incubação cada vez.
  8. Incubar a membrana com anticorpos anti-coelho conjugados por peroxidase conjugados de rabanete diluídos em 1:10000 TBST.
  9. Desenvolva os imunoblots com o sistema de detecção de manchas ocidentais de chemiluminescência aprimorada.

7. Detecção do padrão de expressão LssgMP no SBPH

  1. Imobilize os insetos a 4 °C por 5 min.
  2. Lave os insetos com 75% de etanol e ddH2O um por um, e depois disseca os insetos em TBS pré-refrigerado (salina tampão de tris de 0,01 M).
  3. Dissecar os insetos do abdômen enquanto corta as pernas dianteiras da SBPH na articulação coxa-trochanter por fórceps; lave o midgut e as glândulas salivares duas vezes em TBS para remover qualquer contaminação do hemisfão.
  4. Coloque cinco tecidos em um tubo de 1,5 mL RNase livre para extrair RNA. Considere cada tubo como uma amostra.
  5. Realize a extração de RNA de acordo com os protocolos do fabricante e PCR transcricional reverso (RT-PCR) (ver Tabela de Materiais).
  6. Realize pcr quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para investigar os níveis relativos de expressão da transcrição de LssgMP em extratos de todo o corpo ou vários tecidos de L. striatellus.
    NOTA: Os pares de primer utilizados para amplificação genética foram LssgMP-q-F/LssgMP-q-R, SYBR Green-based qPCR foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. O nível de transcrição do fator de alongamento da tradução L. striatellus 2 (ef2) foi quantificado com par de primer ef2-q-F/ef2-q-R para a normalização dos modelos cDNA. E as sequências de primer estão anexadas abaixo:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Esquemas de instalação de alimentação artificial e coleta de saliva
A Figura 1A retrata o cilindro de vidro (15 cm x 2,5 cm) usado como câmara de alimentação para coletar a saliva. Em primeiro lugar, as larvas SBPH ficaram famintas por várias horas para melhorar a eficiência da coleta e depois imobilizadas por resfriamento por 5 minutos. Depois que os insetos foram transferidos para o cilindro de vidro, ambas as extremidades abertas da câmara foram cobertas com membrana parafina esticada. Em uma extremidade, 200 μL de 5% de sacarose foram sanduíches entre duas camadas de membrana parafina estendidas para cerca de o dobro de sua área original(Figura 1B). A câmara estava coberta de papel alumínio, mas o fim com a dieta artificial foi exposto à luz. Como a SBPH exibe comportamento fototrópico, os insetos famintos reunidos no final foram expostos à luz e alimentados com a solução de dieta artificial através da membrana interior esticada parafina. Com base nisso, a saliva poderia ser liberada na dieta artificial, que era coletada todos os dias. O dispositivo de dieta parafilm foi substituído por um novo todos os dias. Dessa forma, a dieta artificial foi coletada por 5 dias a 2 semanas, e então toda a amostra se concentrou em um volume final de 100 μL utilizando um filtro centrífugo de 10 KD(Figura 1C). Durante a coleta de saliva, foi contabilizada a taxa de sobrevivência da alimentação da SBPH com a sacarose de 5%. Nos primeiros 4 dias, mais de 80% da SBPH sobreviveu. No entanto, a partir do quintodia em diante, a mortalidade aumentou rapidamente para 40%, e menos da metade da SBPH sobreviveu no7º dia(Figura 1D). Para coletar saliva suficiente, foi sugerido o fornecimento de SBPH fresco no4º dia.

Verificação das proteínas de saliva coletadas
Para avaliar a eficácia deste método de coleta, a amostra de saliva foi submetida à análise proteica. Em primeiro lugar, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE e, em seguida, detectadas por coloração de prata(Figura 2A). Em comparação com o controle negativo (5% de sacarose), as amostras concentradas de saliva da saliva SBPH infectada pelo RSV continham muitas proteínas que poderiam ser analisadas, por exemplo, pela espectrometria de massa. Como vetor de insetos primário do RSV, a SBPH transmite o vírus para as plantas através de seu processo de alimentação de sucção. A liberação bem sucedida do RSV está relacionada à secreção da saliva, e o RSV é considerado um fator essencial na saliva dos insetos viruliferosos. Aqui, a saliva foi testada após a coleta de insetos não infectados e viruliferosos com um anticorpo contra o RSV e detectou com sucesso a proteína do casaco RSV (CP) na amostra viruliferosa(Figura 2B). Outro estudo descobriu que as proteínas de mucina são proteínas essenciais da saliva de gel em insetos hemipteranos para meditar a formação de uma baia para alimentação23. Para confirmar que a SBPH também produz uma proteína de mucina, toda a estrutura de leitura aberta de um gene de codificação de mucina putativa foi amplificada a partir do RNA extraído da glândula salivar da SBPH. Sua sequência foi usada como uma consulta em análises BLAST contra a sequência de genoma de SBPH28. Foi identificado um gene de 2175 bp, chamado LssgMP. Um anticorpo contra essa proteína foi preparado anteriormente e foi utilizado para detectar a proteína na amostra coletada pela análise de manchas ocidentais. Uma proteína de 78 KD foi detectada em amostras não infectadas e virulviras, demonstrando que o LssgMP é uma proteína saliva(Figura 2C). Em seguida, os níveis de transcrição de LssgMP em diferentes tecidos (glândula salivar, intestino e corpo remanescente) foram determinados por qRT-PCR. Os resultados mostraram que o nível de transcrição genética foi 20 vezes maior na glândula salivar do que no intestino e outras partes do corpo(Figura 2D),confirmando a expressão específica de LssgMP na glândula salivar.

Figure 1
Figura 1: Diagrama da câmara de alimentação com sanduíche de membrana parafina para permitir a alimentação de SBPH em dieta artificial. (A) Ilustração da câmara de alimentação artificial. O cilindro tem 15,0 cm de comprimento e 2,5 cm de diâmetro. Em uma extremidade da câmara está o sanduíche de membrana parafina; a outra extremidade e a parede do cilindro coberta com papel alumínio de estanho (linhas inclinadas) representam o dispositivo coberto com papel alumínio. A fonte de luz foi definida para atrair SBPH para se alimentar da dieta artificial. (B) Diagrama de sanduíche de parafina contendo dieta artificial. 200 μL de 5% de solução aquosa de sacarose foi sanduíche entre duas camadas de membranas parafina estendidas para cerca de o dobro de sua área original. (C) A concentração de saliva coletada utilizando um filtro centrífugo de 10 KD. (D) A taxa de sobrevivência da SBPH alimentando-se de 5% de sacarose. A média e a SEM foram calculadas a partir de quatro réplicas biológicas com três réplicas técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Verificação das proteínas de saliva coletadas. (A) Detecção de proteínas salivares por coloração de prata. A sacarose de 5% é controle negativo. (B) Detecção de proteína do vírus da camada de listra de arroz (CP) na saliva coletada pela análise da mancha ocidental. (C) Mancha ocidental para confirmar a presença de LssgMP na saliva coletada. (D) Expressão específica de LssgMP na glândula salivar de L. striatellus. ef2: fator de alongamento de tradução 2 da SBPH. A média e a SEM foram calculadas a partir de quatro réplicas biológicas com três réplicas técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A criação bem sucedida de insetos em dietas artificiais foi relatada pela primeira vez em 1962, quando Mittler e Dadd descreveram a técnica de membrana parafina para manter uma dieta artificial29,30. E esse método tem sido explorado em muitos aspectos da biologia e comportamento de insetos, por exemplo, suplemento de nutrientes, alimentação de dsRNA e aquisição de vírus. Com base nos requisitos da análise da saliva, 5% da sacarose é utilizada como dieta artificial geral para coletar saliva de SBPH neste estudo. Para uma coleção de saliva bem sucedida, vários passos críticos valem a pena notar aqui. Em primeiro lugar, passar fome pelos insetos experimentais antes de introduzi-los na câmara é necessário para garantir a eficiência da coleta de saliva. Em segundo lugar, para imitar o ambiente de estilo, um sanduíche de parafina de duas camadas é feito. Quando a SBPH se alimenta da dieta artificial, a baia salivar se forma na extremidade interna voltada para a dieta, e a saliva aguada é secretada posteriormente. Em terceiro lugar, deve ser coletado e trocado um meio artificial a tempo de reduzir a contaminação microbiana na amostra coletada. Finalmente, anestesiar os insetos a 4 °C por 5 min é essencial para evitar a perda de insetos enquanto muda a dieta artificial.

Ao contrário da maioria das dietas artificiais que contêm aminoácidos, vitaminas e carboidratos, destacam-se as vantagens de 5% do meio de sacarose. Primeiro, é fácil de preparar. Em segundo lugar, a simples composição da dieta significa poucas substâncias para interferir na análise mais aprofundada dos vários fatores na saliva. No entanto, a razão de sobrevivência da SBPH diminuiu nos últimos dias do período alimentar utilizando 5% de sacarose como dieta artificial geral(Figura 1D). Para superar essa falha, o SBPH fresco deve ser fornecido a tempo de saliva suficiente. E para mais pesquisas sobre a função salivar sobre comportamento alimentar ou transmissão de vírus, a duração da coleta de saliva deve limitar-se ao tempo exato antes que a mortalidade dos insetos aumente devido à desnutrição. Parece ser uma limitação comum do meio artificial. Alguns outros estudos descobriram que a sobrevivência de N. lugens criados na dieta quimicamente definida D-97 era inferior à daqueles criados na variedade de arroz suscetível TN1, implicando que o hospedeiro original fornece mais do que apenas insetos vetores alimentares. E vários estudos têm focado na otimização de dietas quimicamente definidas para alimentação contínua de insetos para melhorar a eficiência da criação.

A análise transcriptome da glândula salivar é um método tradicional para identificação de proteína saliva. E diferentes proteínas salivares foram detectadas nas mesmas espécies de A. pisum e M. persicae14,31, e a abundância de proteínas salivares determina a frequência de sua detecção32. No entanto, faltava um método válido para investigar a suspeita de proteína na saliva. Este método de sanduíche de membrana parafina fornece uma maneira inovadora de confirmar uma suspeita de proteína saliva identificada pela análise transcriptome, o que é ainda comprovado pela detecção de LssgMP (Figura 2C). Além disso, a análise proteica confirmou que proteínas abundantes estão presentes na saliva coletada (Figura 2A), quantidade suficiente para análise suplementar por, por exemplo, espectrometria de massa. A análise proteômica da saliva coletada será um método direto e eficaz para identificar fatores secretados envolvidos na fase de alimentação da SBPH, minimizando o risco de detecção de proteínas redundantes falso-positivas.

A saliva funciona como portadora de vírus de insetos a plantas hospedeiras e é um componente essencial da interação vetorial-vírus-planta14,33,34. O título de vírus liberado dos vetores de insetos é um fator crucial para a infecção para o hospedeiro. Comparado com métodos indiretos que testam o título viral em plantas infectadas, este protocolo pode detectar diretamente o RSV liberado pela viruliferosa SBPH(Figura 2B). Apoiadas por este método de sanduíche de membrana parafina, análises comparativas adicionais de proteínas saliva coletadas de insetos infectados pelo RSV e infectados pelo RSV também podem revelar potenciais candidatos envolvidos na interação vírus-vegetal-vetor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2019YFC1200503), pela Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072385) e pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).

Tags

Biologia Edição 174
Método sanduíche de membrana de duas camadas para <em>laodelphax striatellus</em> saliva collection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter