Summary
本方案描述了一种使用人工介质从穿刺-吸吮昆虫中收集足够唾液的方法。这是一种收集昆虫唾液和研究唾液对昆虫进食行为和媒介传播病毒传播的有用方法。
Abstract
稻条病毒（RSV）在东亚造成农业的重大经济损失，其在宿主水稻之间的有效传播完全依赖于昆虫媒介。 Laodelphax striatellus（ 小型棕色飞虱，SBPH）是主要昆虫媒介，在从韧皮部吸食汁液时水平传播RSV。唾液在昆虫的进食行为中起着重要作用。这里描述了一种方便的方法，可用于研究具有穿刺 - 吸食进食行为的昆虫唾液。在这种方法中，允许昆虫以夹在两个拉伸的石蜡膜层之间的人造饮食为食。每天收集含有唾液的饮食，过滤并浓缩以进行进一步分析。最后，通过蛋白质染色和免疫印迹检查收集的唾液的质量。该方法通过检测SBPH唾液中RSV和粘蛋白样蛋白的存在来举例说明。这些人工摄食和唾液收集方法将为进一步研究昆虫唾液中与摄食行为和病毒传播相关的因素奠定基础。
Introduction
水稻条纹病毒（RSV）是Tenuivirus属中的一种阴性链RNA病毒，在东亚的水稻生产中引起严重疾病1，2，3。RSV从受感染的水稻植物传播到健康的水稻植物取决于昆虫载体，主要是Laodelphax striatellus，它以持久繁殖的方式传播RSV。SBPH在以RSV感染的植物为食后获得病毒。一旦进入昆虫体内，RSV在进食后一天感染中肠上皮细胞，然后穿过中肠屏障穿透血淋巴。随后，RSV通过血淋巴扩散到不同的组织中，然后传播。在获得后约10-14天的潜伏期后，唾液腺内的病毒可以通过分泌的唾液传播给健康的寄主植物，而SBPH则从韧皮部4，5，6，7，8，9，10中吸收汁液.有效的摄食过程和唾液中的各种因素对于RSV从昆虫传播到寄主植物至关重要。
唾液腺分泌的昆虫唾液被认为介导昆虫，病毒和寄主植物。半翅目昆虫通常产生两种类型的唾液：胶状唾液和水性唾液11，12，13。胶凝唾液主要分泌到脑浆中，以维持寄主细胞间的蠕动，也与克服植物抗性和免疫反应有关14、15、16、17。在进食的探测阶段，昆虫间歇性地分泌凝胶状唾液，立即被氧化形成表面法兰。然后，单层或分支鞘包裹样式以保留管状通道18，19，20。表皮上的表面法兰被认为通过充当锚点来促进样式的穿透，而样式周围的护套可以提供机械稳定性和润滑16，21，22，23。Nlshp被确定为唾液鞘形成和成功喂养棕色飞虱（Nilaparvata lugens，BPH）的必需蛋白质。抑制由蚜虫Acyrthosiphon pisum分泌的结构鞘蛋白（SHP）的表达通过破坏宿主筛管24的进食来减少其繁殖。此外，在一些昆虫物种中，凝胶唾液因子应该通过形成所谓的食草动物相关分子模式（HAMPs）来触发植物的免疫反应。在N. lugens中，NlMLP，一种与鞘形成相关的粘蛋白样蛋白质，诱导植物防御进食，包括细胞死亡，防御相关基因的表达和胼脂沉积25，26。 此外，蚜虫中的一些凝胶唾液因子已被证明可以通过类似于病原体相关分子模式的基因间相互作用触发植物防御反应12，15，27。
为了研究昆虫喂养和/或病原体传播所必需的唾液因子，有必要分析分泌的唾液。这里描述了人工喂养和收集方法以获得足够量的唾液，以便进一步分析。使用仅含有单一营养元素的培养基，通过银染和蛋白质印迹收集和分析许多唾液蛋白。该方法将有助于进一步研究唾液中对SBPH传播RSV至关重要的因素。
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Protocol
1. SBPH维护
- 在实验室的每个玻璃室中，将具有毒性和无RSV的SBPH个体置于玻璃培养箱（65 x 200 mm）中，每个玻璃室中含有5-6个大米（Oryza sativa cv. Nipponbare）幼苗。在25°C下在16小时光照/ 8小时黑暗光周期下种植水稻植物。
注：这些有毒和无RSV的SBPH个体最初是在中国江苏省捕获的。 - 通过点酶联免疫吸附测定（dot-ELISA）检测SBPH中的RSV，该测定与针对RSV核糖核蛋白（RNPs）的兔RSV特异性多克隆抗体（见 材料表）。
注意：为确保高后代感染效率，单独维持毒力雌性，并随机检测其15%的后代是否感染RSV。点式酶联免疫吸附测定法的细节在步骤1.3-1.7中有所描述。 - 在20μL包衣缓冲液（0.05M Na 2 CO3-NaHCO3，pH9.5）中均质化单个SBPH。在尼龙膜上点3μL每种膜（见材料表），然后在室温下（RT）干燥膜。
- 在室温下用15mL封闭缓冲液（PBS + 3%脱脂牛奶）孵育膜30分钟。
- 用稀释的一抗RSV的兔原抗抗体（1：10000）在15mL PBS中孵育膜，在室温下孵育1小时，并用PBS洗涤膜三次，每次孵育5分钟。
- 用1.5μL辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体（见 材料表）在15mLPBS中孵育膜，并用PBS洗涤三次，每次孵育5分钟。
- 根据制造商提供的实验方案，使用增强型HRP-DAB显色试剂盒（见 材料表）开发免疫印迹。
2. 喂养室和人工饮食的准备
- 称取2克蔗糖粉并将其溶解在40mL的ddH2O中，以制备5%蔗糖水溶液作为人造日粮。
- 通过0.22μm过滤器过滤溶液（见 材料表）以除去细菌污染和杂质。
- 将200个3rd-5th SBPH幼虫饿死3-5小时，然后将其引入腔室。
注：为一个腔室准备了200个SBPH;应为几个腔室准备更多的SBPH。 - 准备玻璃圆筒作为进料室（图1A）。在引入实验昆虫之前，用石蜡膜覆盖腔室的一个开口端（ 见材料表）。
注：每个圆柱体长 15.0 厘米，直径 2.5 厘米。这些玻璃圆筒是根据实验要求定制的。 - 将昆虫转移到玻璃圆筒中。
- 用拉伸的石蜡膜（特别是Parafilm M）覆盖腔室的另一端。然后，向其中加入200μL人造饮食。最后，用另一层拉伸的石蜡膜覆盖液体。
注意：石蜡膜被拉伸到其原始面积的两倍左右。 - 用铝箔盖住腔室，但将末端的人工节食装置暴露在光线下。
3. 收集SBPH唾液
- 在24小时结束时分别从无RSV和有毒的SBPH收集人造饮食。
- 将圆筒冷却在4°C以固定昆虫。
- 揭开外膜，使用无菌移液管将人工节食液收集到1.5 mL无菌管中。将收集的唾液保持在-80°C直至分析。
注意：收集的唾液可以在-80°C下储存1年。 - 通过轻轻移液，用50μL新鲜人造饮食冲洗内膜三次，并按照步骤3.3所述收集人工洗涤饮食。将新的人造饮食放在内膜上，并在顶部保持新鲜拉伸的石蜡膜。
- 重复步骤 3.2 和 3.3 5 天至 2 周。
注：计算人工喂养SBPH的存活率，并根据存活率保证充分补充新鲜SBPH。 - 通过0.22μm过滤装置过滤收集的样品，以去除微生物和其他污染物。
4. 收集的唾液浓度
- 将收集的唾液样品转移到0.5 mL 10 kD离心过滤器中（见材料表），并在4°C下以5，500×g离心20分钟。收集上清液并使最终体积达到100μL。
- 按照步骤4.3-4.6使用适当的紫外可见分光光度计测量收集的唾液的浓度。
- 打开分光光度计，用ddH2O清洗基座三次。
- 按正确的顺序在屏幕上选择以下选项： 蛋白质|蛋白质 A280 |选择类型|1 Abs = 1 毫克/毫升。然后，选中复选框 基线校正 340 nm。
- 将2μL5%蔗糖水溶液作为空白，触摸屏幕底部的 空白 。
- 设定标准后，加载2μL收集的唾液进行测量。读取并记录蛋白质浓度。
注意：最终至少总共收集了1毫克唾液蛋白。
5. 唾液蛋白的银染
- 使用样品上样缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 6.8，10%甘油，2%SDS，0.1%溴酚蓝和1%β巯基乙醇）从昆虫唾液样品中提取蛋白质。然后，将其分馏成10%SDS-PAGE（见 材料表）。加载以与阴性对照相同的方式处理的5%sucroseasique溶液。
- 将20μL等分试样的样品上样到SDS-PAGE凝胶上，旁边是预先染色的标记物。凝胶在90伏特下运行15分钟，然后在140伏特下运行50分钟。
- 电泳后将凝胶固定在30%（体积/体积）乙醇，10%（体积/体积）乙酸中至少30分钟。
- 用20%（体积/体积）乙醇和水分别冲洗凝胶两次，每次10分钟。
- 将凝胶在0.8mM硫代硫酸钠中敏化1分钟，然后每次在水中冲洗两次1分钟。
- 将凝胶浸入12mM硝酸银中至少1小时，然后将其浸入去离子水中10秒，然后将其转移到显影剂溶液中。
- 当凝胶的背景变暗时，将凝胶浸入停止溶液（5%乙酸）中至少30分钟以停止反应。
- 每次用水洗涤凝胶两次30分钟。使用检测系统开发图像（请参见 材料表）。
6. 通过蛋白质印迹检测蛋白质
- 分别使用特异性抗体通过免疫印迹检测SBPH（LssgMP）和RSV的唾液粘蛋白样蛋白。
- 按照步骤5.1处理昆虫唾液样品。
- 将20μL等分试样的样品上样到10%SDS-PAGE凝胶上，同时加入预染标记物和20μL RSV未感染唾液样品作为阴性对照。在90伏特下运行凝胶15分钟，然后在140伏特下运行50分钟。
- 将100 mL 10x蛋白质转印缓冲液（湿）（见材料表）与900 mL ddH2O混合到工作溶液（1x）中，然后使用蛋白质转移缓冲液（1x）将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜中。
- 在室温（RT）下用0.01M Tris缓冲盐水和0.05%吐温20（TBST）在5%脱脂牛奶中阻断膜1小时。
注意：在本实验方案中，将 100 mL 10x TBST（见材料表）和 900 mL ddH2O 混合到工作溶液中。 - 用抗RSV或LssgMP的一抗兔抗体（均为1：10000）在室温下在TBST中稀释至少2小时孵育膜。
注：上述提到了针对RSV的一抗的产生。一家生物技术公司生产了针对LSSGMP肽GIQFDSYSASDLTRC的兔抗LssgMP多克隆抗体。 - 用TBST洗涤膜三次，每次孵育10分钟。
- 用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体孵育膜，稀释在1：10000 TBST中。
- 使用增强型化学发光蛋白质印迹检测系统开发免疫印迹。
7. 检测SBPH中LSSGMP表达模式
- 将昆虫在4°C下固定5分钟。
- 用75%乙醇和ddH 2O逐个洗涤昆虫，然后在预冷的TBS（0.01M Tris缓冲盐水中）解剖昆虫。
- 从腹部解剖昆虫，同时用镊子切断髋关节处SBPH的前腿;在TBS中洗涤中肠和唾液腺两次，以去除血淋巴中的任何污染物。
- 将五个组织放入1.5 mL无RNase管中以提取RNA。将每个试管视为一个样品。
- 根据制造商的实验方案和逆转录PCR（RT-PCR）进行RNA提取（见 材料表）。
- 执行定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）以研究 LssgMP 在全身或纹 状体的各种组织提取物中的相对转录表达水平。
注意：用于基因扩增的引物对是LssgMP-q-F /LssgMP-q-R，基于SYBR Green的qPCR是根据制造商的协议进行的。纹状体翻译伸长因子2（ef2）的转录本水平用引物对ef2 -q-F/ ef2-q-R进行定量，用于cDNA模板的归一化。引物序列附在下面：LssgMP-q-F：TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG;LssgMP-q-R： GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC;ef2-q-F： GTCTCCACGGATGGGCTTT;ef2-q-R： ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.
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Representative Results
人工饲喂装置及唾液采集示意图
图1A 描绘了用作收集唾液的进食室的玻璃圆筒（15厘米×2.5厘米）。首先，将SBPH幼虫饥饿数小时以提高收集效率，然后通过冷却5 min固定。将昆虫转移到玻璃圆筒中后，腔室的两个开口端都覆盖着拉伸的石蜡膜。在一端，将200μL5%蔗糖夹在两层石蜡膜之间，延伸至其原始面积的约两倍（图1B）。腔室被铝箔覆盖，但与人造饮食的末端暴露在光线下。由于SBPH表现出向光性行为，因此聚集在末端的饥饿昆虫暴露在光线下，并通过拉伸的内部石蜡膜以人造饮食溶液为食。基于此，唾液可以释放到每天收集的人工饮食中。Parafilm-diet设备每天都被新的设备取代。通过这种方式，收集人造饮食5天至2周，然后使用10 KD离心过滤器将整个样品浓缩至最终体积为100μL（图1C）。在收集唾液期间，计算了喂养5%蔗糖的SBPH的存活率。在前4天，超过80%的SBPH存活了下来。然而，从第 5天开始，死亡率迅速增加到40%，并且第 7天存活的SBPH不到一半（图1D）。为了收集足够的唾液，建议在第 4天提供新鲜的SBPH。
验证收集的唾液蛋白
为了评估该收集方法的有效性，对唾液样品进行蛋白质分析。首先，通过SDS-PAGE分离蛋白质，然后通过银染检测（图2A）。与阴性对照（5%蔗糖）相比，来自RSV感染的SBPH唾液的浓缩唾液样品含有许多蛋白质，可以通过质谱法进行进一步分析。作为RSV的主要昆虫媒介，SBPH 通过其 吸吮穿刺进食过程将病毒传播给植物。RSV的成功释放与唾液分泌有关，RSV被认为是毒虫唾液的重要因素。在这里，在用针对RSV的抗体收集未感染和有毒昆虫并成功检测到毒力样品中的RSV涂层蛋白（CP）后，对唾液进行了测试（图2B）。另一项研究发现，粘蛋白是半翅目昆虫中必不可少的凝胶唾液蛋白，用于冥想形成用于喂养的鞘23。为了确认SBPH也产生粘蛋白，从从SBPH唾液腺中提取的RNA中扩增了推定的粘蛋白编码基因的整个开放阅读框。它的序列被用作针对SBPH28基因组序列的BLAST分析中的查询。鉴定出一个由2175 bp组成的基因，名为 LssgMP。 先前制备了针对该蛋白质的抗体，并通过蛋白质印迹分析用于检测收集样品中的蛋白质。在未感染和有毒的样品中检测到78 KD蛋白，表明LssgMP是一种唾液蛋白（图2C）。接下来，通过qRT-PCR测定不同组织（唾液腺，肠道和剩余身体）中 LssgMP 的转录本水平。结果显示，唾液腺的基因转录水平比肠道和其他身体部位高20倍（图2D），证实了 LssgMP 在唾液腺中的具体表达。
图1：带有石蜡膜三明治的喂养室示意图，允许在人工饮食上喂养SBPH。 圆柱体长15.0厘米，直径2.5厘米。在腔室的一端是石蜡膜夹层;另一端和用锡箔纸覆盖的圆柱壁（倾斜的线条）代表用锡箔纸覆盖的设备。光源被设置为吸引SBPH以人造饮食为食。（B） 含有人工饮食的石蜡三明治示意图。将200μL5%蔗糖水溶液夹在两层石蜡膜之间，拉伸至其原始面积的约两倍。（C）使用10 KD离心过滤器收集的唾液的浓度。（D） 以5%蔗糖为食的SBPH的存活率。均值和SEM是从四个生物重复和三个技术重复计算得出的。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：验证收集的唾液蛋白。 （A） 通过银染法检测唾液蛋白。5%蔗糖为阴性对照。（B）通过蛋白质印迹分析检测收集的唾液中的大米条纹病毒涂层蛋白（CP）。（C） 蛋白质印迹以确认收集的唾液中是否存在LssgMP。（D） LssgMP 在 纹状体唾液腺中的特异性表达。 ef2： SBPH 的翻译伸长系数 2。均值和SEM是从四个生物重复和三个技术重复计算得出的。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
1962年首次报道了人工日粮成功饲养昆虫，当时米特勒和爸爸描述了石蜡膜技术来保持人工日粮29，30。这种方法已经在昆虫生物学和行为的许多方面进行了探索，例如营养补充，dsRNA喂养和病毒获取。根据唾液分析的要求，本研究以5%蔗糖作为一般人工饮食，收集SBPH的唾液。为了成功收集唾液，这里有几个关键步骤值得注意。首先，在将实验昆虫引入腔室之前，必须使它们挨饿，以确保唾液收集的效率。其次，为了模仿时尚环境，制作了两层石蜡三明治。当SBPH以人工饮食为食时，唾液鞘在面向饮食的内端形成，随后分泌水样唾液。第三，应及时收集和更换人工培养基，以减少收集样品中的微生物污染。最后，在4°C下麻醉昆虫5分钟对于在改变人工饮食时避免昆虫的损失至关重要。
与大多数含有氨基酸，维生素和碳水化合物的人造饮食相比，5%蔗糖培养基的优势值得注意。首先，它很容易准备。其次，饮食的简单成分意味着很少有物质干扰唾液中各种因素的进一步分析。然而，在使用5%蔗糖作为一般人工饲料的喂养期的最后几天，SBPH的存活率下降（图1D）。为了克服这个缺陷，应该及时提供新鲜的SBPH以获得足够的唾液。为了进一步研究唾液对进食行为或病毒传播的作用，唾液收集持续时间应限制在昆虫因营养不良导致死亡率增加之前的准确时间。这似乎是人工介质的常见限制。其他一些研究发现，在化学定义的饮食D-97上饲养的 N. lugens 的存活率不如在易感水稻品种TN1上饲养的N.lugens的存活率，这意味着原始宿主提供的不仅仅是食物媒介昆虫。一些研究的重点是优化化学定义的饮食，以连续喂养昆虫，以提高饲养效率。
唾液腺的转录组分析是唾液蛋白鉴定的传统方法。而在相同种类的A. pisum和M. persicae14、31中已经检测到不同的唾液蛋白，而唾液蛋白的丰度决定了它们检测频率32。然而，缺乏一种有效的方法来调查唾液中的可疑蛋白质。这种石蜡膜夹层法提供了一种创新的方法，通过转录组分析来确认可疑的唾液蛋白，这通过检测LssgMP进一步证明（图2C）。此外，蛋白质分析证实，收集的唾液中存在丰富的蛋白质（图2A），这足以通过例如质谱法进行进一步分析。对收集的唾液进行蛋白质组学分析将是识别SBPH喂养阶段涉及的分泌因子的直接有效方法，从而最大限度地降低检测假阳性冗余蛋白的风险。
唾液作为病毒携带者从昆虫到寄主植物，是载体 - 病毒 - 植物相互作用的重要组成部分14，33，34。从昆虫载体中释放的病毒滴度是宿主感染的关键因素。与在受感染植物中测试病毒滴度的间接方法相比，该方案可以直接检测由有毒SBPH释放的RSV（图2B）。在这种石蜡膜夹层方法的支持下，对从无RSV和RSV感染昆虫收集的唾液蛋白的进一步比较分析也可能揭示参与病毒 - 植物 - 载体相互作用的潜在候选者。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由国家重点研发计划（编号：2019YFC1200503）、国家自然科学基金（编号：32072385）和中国科学院青年创新促进会（2021084）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
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