Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Двухслойный мембранный сэндвич-метод для сбора слюны Laodelphax striatellus

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

Настоящий протокол описывает способ сбора достаточного количества слюны от прокалывающих сосущих насекомых с использованием искусственной среды. Это удобный метод сбора слюны насекомых и изучения функции слюны на питание насекомых и передачу вируса-переносчика.

Abstract

Вирус рисовых полос (РСВ), который приводит к значительным экономическим потерям в сельском хозяйстве в Восточной Азии, полностью зависит от насекомых-переносчиков для его эффективной передачи среди риса-хозяина. Laodelphax striatellus (маленький коричневый плантхоппер, SBPH) является основным насекомым-переносчиком, который горизонтально передает RSV, всасывая сок из флоэмы. Слюна играет значительную роль в пищевом поведении насекомых. Здесь описан удобный метод, который будет полезен для исследования слюны насекомых с пронзительно-сосущим пищевым поведением. В этом методе насекомым разрешалось питаться на искусственной диете, зажатой между двумя растянутыми слоями парафиновой пленки. Диету, содержащую слюну, собирали каждый день, фильтровали и концентрировали для дальнейшего анализа. Наконец, качество собранной слюны исследовали путем окрашивания белка и иммуноблоттинга. Этот метод был проиллюстрирован обнаружением присутствия RSV и муцин-подобного белка в слюне SBPH. Эти методы искусственного вскармливания и сбора слюны заложат основу для дальнейших исследований факторов слюны насекомых, связанных с пищевым поведением и передачей вируса.

Introduction

Вирус рисовой полосы (RSV), отрицательно-цепочечный РНК-вирус рода Tenuivirus,вызывает тяжелые заболевания в производстве риса в Восточной Азии1,2,3. Передача РСВ от зараженных рисовых растений здоровым растениям зависит от насекомых-переносчиков, главным образом Laodelphax striatellus, которые передают РСВ стойко-размножающимся образом. SBPH приобретает вирус после питания растениями, инфицированными RSV. Попав внутрь насекомого, RSV заражает эпителиальную клетку средней кишки через день после кормления, а затем проходит через барьер средней кишки, чтобы проникнуть в гемолимфу. Впоследствии РСВ распространяется в различные ткани через гемолимфу, а затем распространяется. После латентного периода около 10-14 дней после приобретения вирус внутри слюнной железы может передаваться здоровым растениям-хозяевам через секретируемую слюну, в то время как SBPH высасывает сок из флоэмы4,5,6,7,8,9,10 . Эффективный процесс кормления и различные факторы в слюне необходимы для распространения РСВ от насекомого к растению-хозяину.

Считается, что слюна насекомых, выделяемая слюнными железами, опосредует насекомых, вирусы и растения-хозяева. Гемиптерановые насекомые обычно производят два типа слюны: желющую слюну и водянистую слюну11,12,13. Гелеобразующая слюна в основном секретируется в апоплазму для поддержания движения стайлета среди клеток-хозяев, а также связана с преодолением устойчивости растений и иммунных реакций14,15,16,17. На стадии зондирования кормления насекомые периодически выделяют желую слюну, которая сразу же окисляется с образованием поверхностного фланца. Затем одиночные или разветвленные оболочки обволакивают стильет для резервирования трубчатого канала18,19,20. Предполагается, что поверхностный фланец на эпидермисе облегчает проникновение в стилет, служа опорной точкой, в то время как оболочки вокруг стиля могут обеспечивать механическую стабильность и смазку16,21,22,23. Nlshp был идентифицирован как необходимый белок для образования слюнной оболочки и успешного питания бурого плантхоппера(Nilaparvata lugens,ДГПЖ). Ингибирование экспрессии белка структурной оболочки (SHP), секретируемого тлей Acyrthosiphon pisum, уменьшало ее размножение, нарушая питание из ситовых трубок хозяина24. Более того, у некоторых видов насекомых гелевые факторы слюны должны вызывать иммунные реакции растений, формируя так называемые травоядные молекулярные паттерны (HAMP). В N. lugensNlMLP, муциноподобный белок, связанный с образованием оболочки, индуцирует защиту растений от кормления, включая гибель клеток, экспрессию генов, связанных с защитой, и отложение каллозы 25,26. Кроме того, было доказано, что некоторые факторы слюны геля у тли вызывают реакции защиты растений через взаимодействия генов с геном, аналогичные патоген-ассоциированным молекулярным паттернам12,15,27.

Для изучения факторов слюны, необходимых для питания насекомых и/или передачи патогена, необходимо проанализировать секретируемую слюну. Здесь описаны методы искусственного вскармливания и сбора для получения достаточного количества слюны для дальнейшего анализа. Используя среду, содержащую только один питательный элемент, многие белки слюны были собраны и проанализированы путем окрашивания серебром и вестерн-блоттинга. Этот метод будет полезен в дальнейших исследованиях факторов в слюне, которые необходимы для передачи РСВ SBPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Обслуживание SBPH

  1. Выращивайте вирулиферных и свободных от РСВ особей SBPH в стеклянном инкубаторе (65 х 200 мм) с 5-6 саженцамириса (Oryza sativa cv. Nipponbare) на стеклянную камеру в лаборатории. Выращивайте растения риса при 25 °C при 16-часовом освещении / 8 ч темного фотопериода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирулифированные и свободные от RSV особи SBPH были первоначально пойманы в провинции Цзянсу, Китай.
  2. Обнаружение РСВ в SBPH с помощью точечно-фермент-связанного иммуносорбентного анализа (dot-ELISA) с помощью РСВ-специфического поликлонального антитела кролика (см. Таблицу материалов), поднятогопротив рибонуклеопротеинов RSV (RNP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения высокой эффективности заражения потомства вирулифированные самки содержались отдельно, и 15% их потомства были случайным образом протестированы на инфекцию RSV. Подробности точечного ИФА описаны в шагах 1.3-1.7.
  3. Гомогенизировать одиночный SBPH в 20 мкл буфера покрытия (0,05 MNa2CO3-NaHCO3,рН 9,5). Нанесите 3 мкл каждого на нейлоновую мембрану (см. Таблицу материалов),а затем высушите мембрану при комнатной температуре (RT).
  4. Инкубировать мембрану с 15 мл блокирующего буфера (PBS + 3% обезжиренного молока) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  5. Инкубируют мембрану с разбавленными первичными антителами кролика против РСВ (1:10000) в 15 мл PBS в течение 1 ч при RT и трижды промывают мембрану PBS в течение 5 мин инкубации каждый раз.
  6. Инкубируйте мембрану с 1,5 мкл пероксидазно-конъюгированных козьих анти-кроликовых антител хрена (см. Таблицу материалов)в 15 мл PBS и промывайте три раза PBS в течение 5 мин инкубации каждый раз.
  7. Разработка иммуноблотов с помощью усовершенствованного хромогенного набора HRP-DAB (см. Таблицу материалов)в соответствии с протоколами, предоставленными производителем.

2. Подготовка камеры кормления и искусственной диеты

  1. Взвесьте 2 г порошка сахарозы и растворите его в 40 мл ddH2Oдля приготовления 5% водного раствора сахарозы в качестве искусственной диеты.
  2. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм (см. Таблицу материалов)для удаления бактериальных загрязнений и примесей.
  3. Голодайте 2003-5-хличинок SBPH в течение 3-5 ч, прежде чем ввести их в камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 200 SBPH подготовлены для одной камеры; больше SBPH должно быть подготовлено для нескольких камер.
  4. Подготовьте стеклянные цилиндры в качестве подающих камер(рисунок 1А). Закройте один открытый конец камеры парафиновой мембраной (см. Таблицу материалов)перед введением экспериментальных насекомых.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый цилиндр имеет длину 15,0 см и диаметр 2,5 см. Эти стеклянные цилиндры изготавливаются на заказ в соответствии с экспериментальными требованиями.
  5. Переложите насекомых в стеклянный цилиндр.
  6. Накройте другой конец камеры растянутой парафиновой мембраной (в частности, Parafilm M). Затем добавьте к нему 200 мкл искусственной диеты. Наконец, накройте жидкость еще одним слоем растянутой парафиновой мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновая мембрана растягивается примерно в два раза по сравнению с исходной площадью.
  7. Накройте камеру алюминиевой фольгой, но оставьте конец с устройством искусственной диеты, подверженным воздействию света.

3. Сбор слюны SBPH

  1. Собирают искусственную диету из РСВ-без и вирулифентного СБПГ отдельно в конце 24 ч периода.
  2. Охладите цилиндр при 4 °C, чтобы обездвижить насекомых.
  3. Раскройте внешнюю пленку и соберите искусственную диетическую жидкость с помощью стерильной пипетки в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Держите собранную слюну при -80 °C до анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранная слюна может храниться при -80 °C в течение 1 года.
  4. Промыть внутреннюю мембрану 50 мкл свежей искусственной диеты три раза путем мягкой пипетки и собрать диету искусственного мытья, как описано в шаге 3.3. Поместите новую искусственную диету на внутреннюю мембрану и держите сверху только что растянутую парафиновую мембрану.
  5. Повторяйте шаги 3.2 и 3.3 в течение 5-2 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте выживаемость при искусственном вскармливании SBPH и обеспечьте достаточное добавление свежего SBPH в соответствии с выживаемостью.
  6. Фильтруйте собранные образцы через фильтрующий блок 0,22 мкм для удаления микробов и других загрязняющих веществ.

4. Концентрация собранной слюны

  1. Переложите собранные образцы слюны в центробежный фильтр объемом 0,5 мл 10 кД (см. Таблицу материалов)и вращайте при 5 500 х г при 4 °C в течение 20 мин. Соберите супернатант и сделайте конечный объем до 100 мкл.
  2. Измерьте концентрацию собранной слюны с помощью соответствующего спектрофотометра UV-Vis, выполнив шаги 4,3-4,6.
  3. Включите спектрофотометр и трижды промойте тумбы ddH2O.
  4. Выберите следующие параметры на экране в правильном порядке: Белки | Белок A280 | Выберите тип | 1 Abs = 1 мг/мл. Затем установите флажок Базовая коррекция 340 нм.
  5. Загрузите 2 мкл 5% раствора сахарозы в виде заготовки, нажмите Blank в нижней части экрана.
  6. После установки эталонов нагрузите 2 мкл собранной слюны для измерения. Считывайте и записывайте концентрацию белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мг белков слюны были, наконец, собраны в общей сложности, по крайней мере.

5. Серебряное окрашивание белков слюны

  1. Извлеките белок из образцов слюны насекомых, используя буфер загрузки образца (50 мМ Tris-HCl pH 6,8, 10% глицерина, 2% SDS, 0,1% бромфенол-синего и 1% β-меркаптоэтанола). Затем фракционировать его на 10% SDS-PAGE (см. Таблицу материалов). Загружают 5% сахарозеаводный раствор, обработанный таким же образом, как и отрицательный контрольный.
  2. Загрузите аликвоту образца объемом 20 мкл на гель SDS-PAGE вместе с предварительно окрашенным маркером. Запускайте гель в течение 15 минут при 90 В, а затем 50 минут при 140 В.
  3. Зафиксируйте гель в 30% (об/об) этаноле, 10% (об/об)уксусной кислоты в течение не менее 30 мин после электрофореза.
  4. Промывайте гель дважды 20% (об/об)этанолом и воду отдельно в течение 10 мин каждый раз.
  5. Сенсибилизируйте гель в 0,8 мМ тиосульфата натрия в течение 1 мин, а затем дважды смывайте в воде в течение 1 мин каждый раз.
  6. Погрузите гель в нитрат серебра 12 мМ не менее чем на 1 ч, а затем окуните его в деионизированную воду на 10 с, прежде чем перенести его в раствор разработчика.
  7. Когда фон геля потемнеет, погрузите гель в стоп-раствор (5% уксусная кислота) не менее чем на 30 мин, чтобы остановить реакцию.
  8. Дважды смывайте гель водой в течение 30 мин каждый раз. Разработка изображения с помощью системы обнаружения (см. Таблицу материалов).

6. Обнаружение белка с помощью вестерн-блоттинга

  1. Обнаружение муцин-подобного белка слюны SBPH (LssgMP) и RSV с помощью вестерн-блотов с использованием специфических антител соответственно.
  2. Обработайте образцы слюны насекомых в соответствии с этапом 5.1.
  3. Загрузите 20-мкл аликвоту образца на 10% гель SDS-PAGE вместе с предварительно окрашенным маркером и 20-мкл неинфицированного образца слюны RSV в качестве отрицательного контроля. Запускайте гель в течение 15 мин при 90 Вольт, а затем в течение 50 мин при 140 Вольт.
  4. Смешайте 100 мл 10-кратного буфера переноса белка (мокрого) (см. Таблицу материалов)с 900 мл ddH2O с рабочим раствором (1x), а затем перенесите белки на мембрану поливинилидендифторида с помощью буфера переноса белка (1x).
  5. Блокируют мембрану в 5% обезжиренном молоке с 0,01 М Трис-буферным физиологическим раствором с 0,05% Tween 20 (TBST) при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе смешайте 100 мл 10x TBST (см. Таблицу материалов)с 900 мл ddH2O в рабочем растворе.
  6. Инкубируют мембрану с первичными антителами кролика против RSV или LssgMP (оба 1:10000), разведенными в TBST при RT в течение не менее 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Производство первичных антител против РСВ было упомянуто выше. Биотехнологическая компания произвела поликлональное антитело против LssgMP против пептида LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Промывайте мембрану три раза TBST в течение 10 минут инкубации каждый раз.
  8. Инкубируют мембрану пероксидазой хрена-конъюгированными козьими анти-кроликовыми антителами, разведенными в 1:10000 TBST.
  9. Разработка иммуноблотов с усиленной хемилюминесцентной системой обнаружения вестерн-блоттинга.

7. Обнаружение паттерна экспрессии LssgMP в SBPH

  1. Обездвиживают насекомых при 4 °C в течение 5 мин.
  2. Промыть насекомых 75% этанолом и ddH2O по одному, а затем рассечь насекомых в предварительно охлажденном TBS (0,01 M Tris-буферный физиологический раствор).
  3. Рассечение насекомых от брюшка при разрыве передних ног SBPH в кокса-трохантерном суставе щипцами; промыть среднюю кишку и слюнные железы дважды в TBS, чтобы удалить любые загрязнения из гемолимфы.
  4. Поместите пять тканей в трубку без РНКазы объемом 1,5 мл для извлечения РНК. Рассматривайте каждую трубку как один образец.
  5. Выполняют экстракцию РНК по протоколам производителя и обратнотранскрипционной ПЦР (ОТ-ПЦР) (см. Таблицу материалов).
  6. Выполняйте количественную ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) для исследования относительных уровней экспрессии транскриптов LssgMP в экстрактах всего тела или различных тканей L. striatellus.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парами праймеров, используемыми для амплификации генов, были LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, SYBR Green на основе qPCR был выполнен в соответствии с протоколом производителя. Уровень транскрипта коэффициента удлинения трансляции L. striatellus 2 (ef2)количественно определяли парой праймеров ef2-q-F/ef2-q-R для нормализации шаблонов кДНК. А последовательности праймеров присоединены ниже:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схемы установки искусственного вскармливания и сбора слюны
На рисунке 1А изображен стеклянный цилиндр (15 см х 2,5 см), используемый в качестве питательной камеры для сбора слюны. Во-первых, личинок SBPH морили голодом в течение нескольких часов, чтобы улучшить эффективность сбора, а затем обездвиживали путем охлаждения в течение 5 минут. После того, как насекомые были перенесены в стеклянный цилиндр, оба открытых конца камеры были покрыты растянутой парафиновой мембраной. На одном конце 200 мкл 5% сахарозы были зажаты между двумя слоями парафиновой мембраны, простирающейся примерно вдвое по своей первоначальной площади(рисунок 1B). Камера была покрыта фольгой, но конец при искусственной диете подвергался воздействию света. Поскольку SBPH демонстрирует фототропное поведение, голодные насекомые, собранные в конце, подвергались воздействию света и питались искусственным диетическим раствором через растянутую внутреннюю парафиновую мембрану. На его основе в искусственную диету могла выделяться слюна, которая собиралась каждый день. Устройство Parafilm-диета каждый день заменялось на новое. Таким образом, искусственную диету собирали в течение 5 дней до 2 недель, а затем весь образец концентрировали до конечного объема 100 мкл с помощью центробежного фильтра 10 КД(рисунок 1С). Во время сбора слюны подсчитывалась выживаемость СБПГ, питающейся 5% сахарозой. В первые 4 дня выжило более 80% SBPH. Однако с5-го дня смертность быстро возросла до 40%, и менее половины SBPH выжили на7-й день(рисунок 1D). Для сбора достаточного количества слюны свежий SBPH предлагалось поставлять на4-й день.

Проверка собранных белков слюны
Для оценки эффективности данного метода сбора образец слюны подвергали белковому анализу. Сначала белки были разделены SDS-PAGE, а затем обнаружены серебряным окрашиванием(рисунок 2A). По сравнению с отрицательным контролем (5% сахарозы), концентрированные образцы слюны из РСВ-инфицированной слюны SBPH содержали много белков, которые можно было дополнительно проанализировать, например, с помощью масс-спектрометрии. Как основной насекомый-переносчик RSV, SBPH передает вирус растениям через процесс кормления. Успешное высвобождение RSV связано с секрецией слюны, и RSV считается важным фактором в слюне вирулиферных насекомых. Здесь слюну тестировали после сбора неинфицированных и вирулиферных насекомых с антителом против РСВ и успешно обнаружили белок оболочки RSV (CP) в вирулиферном образце(Рисунок 2B). Другое исследование показало, что белки муцина являются необходимыми белками слюны геля у насекомых гемиптерана для медитации на формирование оболочки для кормления23. Для подтверждения того, что SBPH также производит белок муцина, вся открытая рамка чтения предполагаемого гена, кодирующего муцин, была амплифицирована из РНК, извлеченной из слюнной железы SBPH. Его последовательность была использована в качестве запроса в анализе BLAST против последовательности генома SBPH28. Был идентифицирован ген, состоящий из 2175 bp, названный LssgMP. Антитело против этого белка было приготовлено ранее и использовалось для обнаружения белка в собранном образце методом анализа вестерн-блоттинга. Белок 78 KD был обнаружен в неинфицированных и вирулиферных образцах, демонстрируя, что LssgMP является белком слюны(рисунок 2C). Затем уровни транскрипта LssgMP в разных тканях (слюнная железа, кишечник и оставшийся орган) определялись с помощью qRT-PCR. Результаты показали, что уровень транскрипта гена был в 20 раз выше в слюнной железе, чем в кишечнике и других частях тела(рисунок 2D),что подтверждает специфическую экспрессию LssgMP в слюнной железе.

Figure 1
Рисунок 1:Схема камеры кормления с парафиновой мембраной сэндвича, позволяющая кормить SBPH на искусственном питании. (A)Иллюстрация искусственной камеры кормления. Цилиндр имеет длину 15,0 см и диаметр 2,5 см. На одном конце камеры находится сэндвич с парафиновой мембраной; другой конец и стенка цилиндра, покрытая бумагой из оловянной фольги (наклонные линии), представляют собой устройство, покрытое бумагой из оловянной фольги. Источник света был настроен на привлечение SBPH для питания на искусственной диете. (B) Диаграмма парафинового сэндвича, содержащего искусственную диету. 200 мкл 5% водного раствора сахарозы зажимали между двумя слоями парафиновых мембран, растянутых примерно вдвое по своей первоначальной площади. (C)Концентрация собранной слюны с использованием центробежного фильтра 10 КД. (D) Выживаемость SBPH, питающегося 5% сахарозой. Среднее и SEM было рассчитано из четырех биологических реплик с тремя техническими репликами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Проверка собранных белков слюны. (A) Обнаружение белков слюны путем окрашивания серебром. 5% сахарозы является отрицательным контролем. (B)Обнаружение белка оболочки вируса рисовой полосы (CP) в собранной слюне с помощью анализа вестерн-блоттинга. (C)Вестерн-блоттинг для подтверждения наличия LssgMP в собранной слюне. (D) Специфическая экспрессия LssgMP в слюнной железе L. striatellus. ef2: коэффициент удлинения трансляции 2 SBPH. Среднее и SEM было рассчитано из четырех биологических реплик с тремя техническими репликами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Об успешном выращивании насекомых на искусственных диетах впервые сообщалось в 1962году,когда Миттлер и Дадд описали технику парафиновой мембраны для проведения искусственной диеты29,30. И этот метод был исследован во многих аспектах биологии и поведения насекомых, например, в питательных добавках, кормлении дцРНК и приобретении вирусов. Исходя из требований анализа слюны, 5% сахарозы используется в качестве общей искусственной диеты для сбора слюны SBPH в этом исследовании. Для успешного сбора слюны здесь стоит отметить несколько критических шагов. Во-первых, голодание подопытных насекомых перед введением их в камеру необходимо для обеспечения эффективности сбора слюны. Во-вторых, чтобы имитировать стильную среду, делается двухслойный сэндвич с парафином. Когда SBPH питается искусственной диетой, слюнная оболочка образуется на внутреннем конце, обращенном к диете, и водянистая слюна выделяется впоследствии. В-третьих, искусственная среда должна быть собрана и обменена вовремя, чтобы уменьшить микробное загрязнение в собранном образце. Наконец, обезболивание насекомых при 4 ° C в течение 5 минут необходимо, чтобы избежать потери насекомых при изменении искусственной диеты.

В отличие от большинства искусственных диет, которые содержат аминокислоты, витамины и углеводы, преимущества 5% сахарозной среды заслуживают внимания. Во-первых, его легко приготовить. Во-вторых, простой состав рациона означает мало веществ, которые мешают дальнейшему анализу различных факторов в слюне. Тем не менее, коэффициент выживаемости SBPH снизился в последние дни периода кормления, используя 5% сахарозы в качестве общей искусственной диеты(рисунок 1D). Для преодоления этого недостатка свежий SBPH должен быть доставлен вовремя для достаточного количества слюны. А для дальнейшего исследования функции слюны на пищевое поведение или передачу вируса продолжительность сбора слюны должна быть ограничена точным временем до увеличения смертности насекомых из-за недоедания. По-видимому, это общее ограничение искусственной среды. Некоторые другие исследования показали, что выживаемость N. lugens, выращенных на химически определенной диете D-97, уступала выживаемости тех, кто выращивался на восприимчивом рисе TN1, подразумевая, что первоначальный хозяин поставляет больше, чем просто насекомых-переносчиков пищи. И несколько исследований были сосредоточены на оптимизации химически определенных диет для непрерывного кормления насекомых для повышения эффективности выращивания.

Транскриптомный анализ слюнной железы является традиционным методом идентификации белка слюны. Причем разные белки слюны были обнаружены у одних и тех же видов A. pisum и M. persicae14,31,и обилие белков слюны определяет частоту их обнаружения32. Тем не менее, валидный метод исследования предполагаемого белка в слюне отсутствовал. Этот метод сэндвича с парафиновой мембраной обеспечивает инновационный способ подтверждения предполагаемого белка слюны, идентифицированного анализом транскриптома, что дополнительно подтверждается обнаружением LssgMP(рисунок 2C). Более того, белковый анализ подтвердил, что в собранной слюне присутствуют обильные белки(рисунок 2А),что является достаточным количеством для дальнейшего анализа, например, масс-спектрометрией. Протеомический анализ собранной слюны станет прямым и эффективным методом выявления секретируемых факторов, участвующих в стадии питания SBPH, минимизируя риск обнаружения ложноположительных избыточных белков.

Слюна работает как вирусоноситель от насекомого к растениям-хозяевам и является важным компонентом взаимодействия вектор-вирус-растение14,33,34. Титр вируса, высвобождаемого насекомыми-переносчиками, является решающим фактором для заражения хозяина. По сравнению с косвенными методами, которые тестируют вирусный титр у инфицированных растений, этот протокол может непосредственно обнаруживать RSV, высвобождаемый вирулиферным SBPH(рисунок 2B). При поддержке этого метода сэндвичей с парафиновой мембраной дальнейшие сравнительные анализы белков слюны, собранных у насекомых, не содержащих RSV, и насекомых, инфицированных RSV, могут также выявить потенциальных кандидатов, участвующих во взаимодействии вируса, растения и вектора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (No 2019YFC1200503), Национальным научным фондом Китая (No 32072385) и Ассоциацией содействия инновациям молодежи CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).

Tags

Биология выпуск 174
Двухслойный мембранный сэндвич-метод для сбора слюны <em>Laodelphax striatellus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter