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Biology

Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo per raccogliere una quantità sufficiente di saliva dagli insetti che succhiano il piercing usando un mezzo artificiale. Questo è un metodo conveniente per raccogliere la saliva degli insetti e studiare la funzione salivare sul comportamento di alimentazione degli insetti e sulla trasmissione del virus trasmesso da vettori.

Abstract

Il virus della striscia di riso (RSV), che causa una significativa perdita economica dell'agricoltura in Asia orientale, dipende interamente dagli insetti vettori per la sua efficace trasmissione tra il riso ospite. Laodelphax striatellus (piccola planthopper marrone, SBPH) è il principale insetto vettore che trasmette orizzontalmente RSV mentre succhia la linfa dal floema. La saliva svolge un ruolo significativo nel comportamento alimentare degli insetti. Un metodo conveniente che sarà utile per la ricerca sulla saliva degli insetti con comportamento alimentare piercing-sucking è descritto qui. In questo metodo, agli insetti è stato permesso di nutrirsi di una dieta artificiale inserita tra due strati di film di paraffina allungati. La dieta contenente la saliva è stata raccolta ogni giorno, filtrata e concentrata per ulteriori analisi. Infine, la qualità della saliva raccolta è stata esaminata mediante colorazione proteica e immunoblotting. Questo metodo è stato esemplificato rilevando la presenza di RSV e di una proteina simile alla mucina nella saliva di SBPH. Questi metodi di alimentazione artificiale e di raccolta della saliva getteranno le basi per ulteriori ricerche sui fattori nella saliva degli insetti legati al comportamento alimentare e alla trasmissione del virus.

Introduction

Il virus della striscia di riso (RSV), un virus a RNA a filamento negativo nel genere Tenuivirus,causa gravi malattie nella produzione di riso in Asia orientale1,2,3. La trasmissione di RSV da piante di riso infette a quelle sane dipende da insetti vettori, principalmente Laodelphax striatellus, che trasmette RSV in modo persistente-propagativo. SBPH acquisisce il virus dopo essersi nutrito di piante infette da RSV. Una volta all'interno dell'insetto, RSV infetta la cellula epiteliale dell'intestino medio un giorno dopo l'alimentazione e poi passa attraverso la barriera dell'intestino medio per penetrare nell'emolinfa. Successivamente, RSV si diffonde in diversi tessuti attraverso l'emolinfa e poi si propaga. Dopo un periodo latente di circa 10-14 giorni dopo l'acquisizione, il virus all'interno della ghiandola salivare può essere trasmesso alle piante ospiti sane attraverso la saliva secreta mentre SBPH succhia la linfa dal floema4,5,6,7,8,9,10 . Un processo di alimentazione efficiente e vari fattori nella saliva sono essenziali per la diffusione di RSV dall'insetto alla pianta ospite.

Si ritiene che la saliva degli insetti secreta dalle ghiandole salivari mediti insetti, virus e piante ospiti. Gli insetti emitteri di solito producono due tipi di saliva: saliva gelificante e saliva acquosa11,12,13. La saliva gelificante è principalmente secreta nell'apoplasma per sostenere il movimento dello stylet tra le cellule ospiti ed è anche correlata al superamento della resistenza delle piante e delle risposte immunitarie14,15,16,17. Nella fase di sondaggio dell'alimentazione, gli insetti secernono a intermittenza saliva gelificante che viene immediatamente ossidata per formare una flangia superficiale. Quindi, guaine singole o ramificate racchiudono lo stylet per riservare un canale tubolare18,19,20. Si presume che la flangia superficiale sull'epidermide faciliti la penetrazione dello stylet fungendo da punto di ancoraggio, mentre le guaine attorno allo stylet possono fornire stabilità meccanica e lubrificazione16,21,22,23. Nlshp è stato identificato come una proteina essenziale per la formazione della guaina salivare e l'alimentazione di successo della ceppa marrone (Nilaparvata lugens, BPH). L'inibizione dell'espressione della proteina guaina strutturale (SHP) secreta dall'afide Acyrthosiphon pisum ha ridotto la sua riproduzione interrompendo l'alimentazione dai tubi del setaccio ospite24. Inoltre, in alcune specie di insetti, si suppone che i fattori della saliva gel inneschino le risposte immunitarie delle piante formando i cosiddetti modelli molecolari associati agli erbivori (HAMPs). In N. lugens,NlMLP, una proteina simile alla mucina correlata alla formazione di guaina, induce difese vegetali contro l'alimentazione, tra cui la morte cellulare, l'espressione di geni legati alla difesa e la deposizione di callosio 25,26. Inoltre, alcuni fattori di saliva gel negli afidi hanno dimostrato di innescare risposte di difesa delle piante attraverso interazioni gene-to-gene simili ai modelli molecolari associati ai patogeni12,15,27.

Per studiare i fattori salivari essenziali per l'alimentazione degli insetti e/o la trasmissione di agenti patogeni, è necessario analizzare la saliva secreta. Qui, l'alimentazione artificiale e i metodi di raccolta per ottenere quantità sufficienti di saliva sono descritti per ulteriori analisi. Utilizzando un mezzo contenente un solo elemento nutrizionale, molte proteine della saliva sono state raccolte e analizzate mediante colorazione dell'argento e western blotting. Questo metodo sarà utile in ulteriori ricerche sui fattori nella saliva che sono essenziali per la trasmissione di RSV da parte di SBPH.

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Protocol

1. Manutenzione SBPH

  1. Allevare gli individui SBPH virulifero e privi di RSV in un incubatore di vetro (65 x 200 mm) con 5-6 piantine di riso(Oryza sativa cv. Nipponbare) per camera di vetro in laboratorio. Coltivare le piante di riso a 25 °C sotto un fotoperiodo luminoso di 16 ore / 8 ore di buio.
    NOTA: Gli individui SBPH viruliferosi e privi di RSV sono stati inizialmente catturati nella provincia di Jiangsu, in Cina.
  2. Rileva l'RSV in SBPH mediante un saggio immunoassorbinte legato a punti enzimatici (dot-ELISA) con un anticorpo policlonale RSV specifico per coniglio (vedi Tabella dei materiali)sollevato contro le ribonucleoproteine RSV (RNP).
    NOTA: Per garantire un'elevata efficienza dell'infezione della prole, le femmine virulifere sono state mantenute separatamente e il 15% della loro prole è stato testato in modo casuale per l'infezione da RSV. I dettagli di dot-ELISA sono descritti nei passaggi 1.3-1.7.
  3. Omogeneizzare un singolo SBPH in 20 μL di tampone di rivestimento (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Individuare 3 μL di ciascuno su membrana di nylon (vedere Tabella dei materiali), quindi asciugare la membrana a temperatura ambiente (RT).
  4. Incubare la membrana con 15 mL di tampone bloccante (PBS + 3% di latte scremato) per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Incubare la membrana con anticorpi primari diluiti contro RSV (1:10000) in 15 mL di PBS per 1 ora a RT e lavare la membrana tre volte con PBS per 5 minuti di incubazione ogni volta.
  6. Incubare la membrana con 1,5 μL di anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano (vedi Tabella dei materiali)in 15 mL di PBS e lavare tre volte con PBS per 5 minuti di incubazione ogni volta.
  7. Sviluppare gli immunoblot con Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (vedi Tabella dei Materiali)secondo i protocolli forniti dal produttore.

2. Preparazione della camera di alimentazione e dieta artificiale

  1. Pesare 2 g di saccarosio in polvere e scioglierlo in 40 ml di ddH2O per preparare la soluzione acquosa al 5% di saccarosio come dieta artificiale.
  2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali)per rimuovere la contaminazione batterica e le impurità.
  3. Affamate 200 3°-5° larve SBPH per 3-5 ore prima di introdurle nella camera.
    NOTA: 200 SBPH sono preparati per una camera; più SBPH dovrebbe essere preparato per diverse camere.
  4. Preparare i cilindri di vetro come camere di alimentazione (Figura 1A). Coprire un'estremità aperta della camera con una membrana di paraffina (vedi Tabella dei materiali)prima di introdurre gli insetti sperimentali.
    NOTA: Ogni cilindro è lungo 15,0 cm e ha un diametro di 2,5 cm. Questi cilindri in vetro sono realizzati su misura in base alle esigenze sperimentali.
  5. Trasferisci gli insetti in un cilindro di vetro.
  6. Coprire l'altra estremità della camera con membrana di paraffina allungata (in particolare, Parafilm M). Quindi, aggiungi 200 μL di dieta artificiale ad esso. Infine, coprire il liquido con un altro strato di membrana di paraffina allungata.
    NOTA: La membrana di paraffina è allungata a circa il doppio della sua area originale.
  7. Coprire la camera con un foglio di alluminio, ma lasciare la fine con il dispositivo dietetico artificiale esposto alla luce.

3. Raccolta della saliva SBPH

  1. Raccogliere la dieta artificiale da SBPH senza RSV e viruliferoso separatamente alla fine del periodo di 24 ore.
  2. Raffreddare il cilindro a 4 °C per immobilizzare gli insetti.
  3. Scoprire il film esterno e raccogliere il liquido dietetico artificiale utilizzando una pipetta sterile in tubi sterili da 1,5 ml. Mantenere la saliva raccolta a -80 °C fino all'analisi.
    NOTA: La saliva raccolta potrebbe essere conservata a -80 °C per 1 anno.
  4. Risciacquare la membrana interna con 50 μL di dieta artificiale fresca tre volte pipettando delicatamente e raccogliere la dieta di lavaggio artificiale come descritto nel passaggio 3.3. Posizionare la nuova dieta artificiale sulla membrana interna e mantenere una membrana di paraffina appena tesa sulla parte superiore.
  5. Ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 per 5 giorni a 2 settimane.
    NOTA: Contare il tasso di sopravvivenza dell'alimentazione artificiale SBPH e garantire un supplemento sufficiente di SBPH fresco in base al tasso di sopravvivenza.
  6. Filtrare i campioni raccolti attraverso un'unità filtrante da 0,22 μm per rimuovere microbi e altri contaminanti.

4. Concentrazione della saliva raccolta

  1. Trasferire i campioni di saliva raccolti in un filtro centrifugo da 0,5 mL 10 kD (vedi Tabella dei materiali)e ruotare a 5.500 x g a 4 °C per 20 minuti. Raccogliere il surnatante e portare il volume finale a 100 μL.
  2. Misurare la concentrazione della saliva raccolta utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis appropriato seguendo i passaggi 4.3-4.6.
  3. Accendere lo spettrofotometro e lavare i piedistalli tre volte con ddH2O.
  4. Selezionare le seguenti opzioni sullo schermo nell'ordine corretto: Proteine | Proteina A280 | Seleziona Tipo | 1 Abs = 1 mg/mL. Quindi, selezionare la casella di controllo Correzione baseline 340 nm.
  5. Caricare 2 μL di soluzione acquosa di saccarosio al 5% come vuoto, toccare Blank nella parte inferiore dello schermo.
  6. Dopo aver impostato gli standard, caricare 2 μL della saliva raccolta per la misurazione. Leggere e registrare la concentrazione proteica.
    NOTA: 1 mg di proteine della saliva sono stati finalmente raccolti in totale almeno.

5. Colorazione dell'argento delle proteine della saliva

  1. Estrarre proteine dai campioni di saliva degli insetti utilizzando il tampone di carico del campione (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glicerolo, 2% SDS, 0,1% blu bromofenolo e 1% β-mercaptoetanolo). Quindi, frazionarlo del 10% SDS-PAGE (vedi Tabella dei materiali). Caricare la soluzione saccarosaque al 5% trattata allo stesso modo di un controllo negativo.
  2. Caricare un'aliquota di 20 μL del campione su un gel SDS-PAGE insieme a un marcatore prestained. Eseguire il gel per 15 minuti a 90 Volt e poi 50 minuti a 140 Volt.
  3. Fissare il gel in etanolo al 30% (vol/vol), al 10% (vol/vol) di acido acetico per almeno 30 minuti dopo l'elettroforesi.
  4. Risciacquare il gel due volte con etanolo al 20% (vol/vol) e acqua separatamente per 10 minuti ogni volta.
  5. Sensibilizzare il gel in 0,8 mM di tiosolfato di sodio per 1 minuto, quindi risciacquare due volte in acqua per 1 minuto ogni volta.
  6. Immergere il gel in 12 mM di nitrato d'argento per almeno 1 ora, quindi immergerlo in acqua deionizzata per 10 s prima di trasferirlo alla soluzione dello sviluppatore.
  7. Quando lo sfondo del gel si sta oscurando, immergere il gel in una soluzione di arresto (acido acetico al 5%) per almeno 30 minuti per interrompere la reazione.
  8. Lavare il gel due volte con acqua per 30 minuti ogni volta. Sviluppare l'immagine con il Sistema di Rilevamento (vedi Tabella dei Materiali).

6. Rilevamento delle proteine mediante western blotting

  1. Rileva la proteina simile alla mucina della saliva di SBPH (LssgMP) e RSV da western blots usando anticorpi specifici, rispettivamente.
  2. Trattare i campioni di saliva degli insetti seguendo il passaggio 5.1.
  3. Caricare un'aliquota di 20 μL del campione su un gel SDS-PAGE al 10% insieme a un marcatore prestained e un campione di saliva non infetta RSV da 20 μL come controllo negativo. Eseguire il gel per 15 minuti a 90 Volt e poi per 50 minuti a 140 Volt.
  4. Mescolare 100 mL di tampone di trasferimento proteico 10x (umido) (vedere Tabella dei materiali)con 900 mL di ddH 2 O in unasoluzionedi lavoro (1x), quindi trasferire le proteine a una membrana di polivinilidene difluoruro utilizzando il tampone di trasferimento proteico (1x).
  5. Bloccare la membrana in latte scremato al 5% con soluzione salina tamponata Tris da 0,01 M con Tween 20 (TBST) allo 0,05% a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
    NOTA: In questo protocollo, mescolare 100 mL di 10x TBST (vedi Tabella dei materiali)con 900 mL di ddH 2 O nellasoluzionedi lavoro.
  6. Incubare la membrana con anticorpi primari di coniglio contro RSV o LssgMP (entrambi 1:10000) diluiti in TBST a RT per almeno 2 ore.
    NOTA: La produzione di anticorpi primari contro RSV è stata menzionata sopra. Un'azienda biotecnologica ha prodotto l'anticorpo policlonale anti-LssgMP del coniglio contro il peptide LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Lavare la membrana tre volte con TBST per 10 minuti di incubazione ogni volta.
  8. Incubare la membrana con anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano diluiti in 1:10000 TBST.
  9. Sviluppare gli immunoblot con il sistema di rilevamento Western Blotting a chemiluminescenza potenziato.

7. Rilevamento del modello di espressione LssgMP in SBPH

  1. Immobilizzare gli insetti a 4 °C per 5 min.
  2. Lavare gli insetti con etanolo al 75% e ddH2O uno per uno, quindi sezionare gli insetti in TBS pre-refrigerato (0,01 M soluzione salina tamponata con Tris).
  3. Sezionare gli insetti dall'addome mentre si tagliano le zampe anteriori di SBPH nell'articolazione coxa-trocantere con una pinza; lavare il midgut e le ghiandole salivari due volte in TBS per rimuovere qualsiasi contaminazione dall'emolinfa.
  4. Metti cinque tessuti in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml per estrarre l'RNA. Considerare ogni provetta come un campione.
  5. Eseguire l'estrazione dell'RNA secondo i protocolli del produttore e la PCR trascrizionale inversa (RT-PCR) (vedi Tabella dei materiali).
  6. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) per indagare i relativi livelli di espressione del trascritto di LssgMP in estratti di tutto il corpo o vari tessuti di L. striatellus.
    NOTA: Le coppie di primer utilizzate per l'amplificazione genica erano LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, la qPCR basata su SYBR Green è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. Il livello di trascrizione del fattore di allungamento della traslazione di L. striatellus 2 (ef2) è stato quantificato con la coppia di primer ef2-q-F/ef2-q-R per la normalizzazione dei modelli di cDNA. E le sequenze di primer sono allegate di seguito:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

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Representative Results

Schemi di installazione di alimentazione artificiale e raccolta della saliva
La figura 1A raffigura il cilindro di vetro (15 cm x 2,5 cm) utilizzato come camera di alimentazione per raccogliere la saliva. In primo luogo, le larve SBPH sono state affamate per diverse ore per migliorare l'efficienza di raccolta e poi immobilizzate raffreddando per 5 minuti. Dopo che gli insetti sono stati trasferiti nel cilindro di vetro, entrambe le estremità aperte della camera sono state coperte con membrana di paraffina allungata. Ad un'estremità, 200 μL di saccarosio al 5% sono stati inseriti tra due strati di membrana di paraffina estesi a circa il doppio della sua area originale (Figura 1B). La camera era coperta di lamina, ma la fine con la dieta artificiale era esposta alla luce. Poiché SBPH mostra un comportamento fototropico, gli insetti affamati riuniti alla fine sono stati esposti alla luce e nutriti con la soluzione dietetica artificiale attraverso la membrana interna di paraffina allungata. Sulla base di esso, la saliva potrebbe essere rilasciata nella dieta artificiale, che è stata raccolta ogni giorno. Il dispositivo Parafilm-diet è stato sostituito con uno nuovo ogni giorno. In questo modo, la dieta artificiale è stata raccolta per 5 giorni a 2 settimane, quindi l'intero campione è stato concentrato ad un volume finale di 100 μL utilizzando un filtro centrifugo da 10 KD (Figura 1C). Durante la raccolta della saliva, è stato contato il tasso di sopravvivenza di SBPH che alimenta il saccarosio al 5%. Nei primi 4 giorni, oltre l'80% di SBPH è sopravvissuto. Tuttavia, dal 5° giorno in poi, la mortalità è aumentata rapidamente al 40% e meno della metà dell'SBPH è sopravvissuta il7 ° giorno (Figura 1D). Per raccogliere abbastanza saliva, SBPH fresco è stato suggerito di fornire il4 ° giorno.

Verifica delle proteine della saliva raccolte
Per valutare l'efficacia di questo metodo di raccolta, il campione di saliva è stato sottoposto ad analisi proteica. In primo luogo, le proteine sono state separate da SDS-PAGE e quindi rilevate mediante colorazione dell'argento (Figura 2A). Rispetto al controllo negativo (5% di saccarosio), i campioni di saliva concentrata dalla saliva SBPH infetta da RSV contenevano molte proteine che potevano essere ulteriormente analizzate, ad esempio, mediante spettrometria di massa. Come insetto vettore primario di RSV, SBPH trasmette il virus alle piante attraverso il suo processo di alimentazione succhiante-penetrante. Il rilascio riuscito di RSV è correlato alla secrezione di saliva e RSV è considerato un fattore essenziale nella saliva degli insetti viruliferi. Qui, la saliva è stata testata dopo aver raccolto insetti non infetti e viruliferosi con un anticorpo contro RSV e ha rilevato con successo la proteina del mantello RSV (CP) nel campione viruliferoso (Figura 2B). Un altro studio ha scoperto che le proteine della mucina sono proteine essenziali della saliva del gel negli insetti emitteri per meditare la formazione di una guaina per l'alimentazione23. Per confermare che SBPH produce anche una proteina mucina, l'intero quadro di lettura aperto di un presunto gene che codifica per la mucina è stato amplificato dall'RNA estratto dalla ghiandola salivare di SBPH. La sua sequenza è stata utilizzata come query nelle analisi BLAST contro la sequenza del genoma di SBPH28. È stato identificato un gene costituito da 2175 bp, chiamato LssgMP. Un anticorpo contro questa proteina è stato preparato in precedenza ed è stato utilizzato per rilevare la proteina nel campione raccolto mediante analisi western blot. Una proteina 78 KD è stata rilevata in campioni non infetti e viruliferosi, dimostrando che LssgMP è una proteina della saliva (Figura 2C). Successivamente, i livelli di trascrizione di LssgMP in diversi tessuti (ghiandola salivare, intestino e corpo rimanente) sono stati determinati dalla qRT-PCR. I risultati hanno mostrato che il livello di trascrizione genica era 20 volte più alto nella ghiandola salivare rispetto all'intestino e ad altre parti del corpo (Figura 2D), confermando l'espressione specifica di LssgMP nella ghiandola salivare.

Figure 1
Figura 1: Diagramma della camera di alimentazione con sandwich di membrana di paraffina per consentire l'alimentazione di SBPH con dieta artificiale. (A) Illustrazione della camera di alimentazione artificiale. Il cilindro è lungo 15,0 cm e ha un diametro di 2,5 cm. Ad un'estremità della camera c'è il sandwich della membrana di paraffina; l'altra estremità e la parete del cilindro ricoperta di carta stagnola (linee inclinate) rappresentano il dispositivo coperto con carta stagnola. La fonte di luce è stata impostata per attirare SBPH a nutrirsi della dieta artificiale. (B) Diagramma del sandwich di paraffina contenente dieta artificiale. 200 μL di soluzione acquosa di saccarosio al 5% sono stati inseriti tra due strati di membrane di paraffina tese a circa il doppio della sua area originale. (C) La concentrazione di saliva raccolta utilizzando un filtro centrifugo da 10 KD. (D) Il tasso di sopravvivenza di SBPH che si nutre di saccarosio al 5%. La media e la SEM sono state calcolate da quattro repliche biologiche con tre repliche tecniche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Verifica delle proteine della saliva raccolte. (A) Rilevazione delle proteine della saliva mediante colorazione dell'argento. Il 5% di saccarosio è un controllo negativo. (B) Rilevazione della proteina del rivestimento del virus della striscia di riso (CP) nella saliva raccolta mediante analisi western blot. (C) Western blotting per confermare la presenza di LssgMP nella saliva raccolta. (D) Espressione specifica di LssgMP nella ghiandola salivare di L. striatellus. ef2: fattore di allungamento della traslazione 2 di SBPH. La media e la SEM sono state calcolate da quattro repliche biologiche con tre repliche tecniche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il successo dell'allevamento di insetti con diete artificiali è stato segnalato per la prima volta nel 1962 quando Mittler e Dadd hanno descritto la tecnica della membrana di paraffina per tenere una dieta artificiale29,30. E questo metodo è stato esplorato in molti aspetti della biologia e del comportamento degli insetti, ad esempio l'integrazione di nutrienti, l'alimentazione di dsRNA e l'acquisizione di virus. Sulla base dei requisiti dell'analisi della saliva, il 5% di saccarosio viene utilizzato come dieta artificiale generale per raccogliere la saliva di SBPH in questo studio. Per una raccolta della saliva di successo, vale la pena notare diversi passaggi critici qui. In primo luogo, affamare gli insetti sperimentali prima di introdurli nella camera è necessario per garantire l'efficienza della raccolta della saliva. In secondo luogo, per imitare l'ambiente stylet, viene realizzato un sandwich di paraffina a due strati. Quando SBPH si nutre della dieta artificiale, la guaina salivare si forma all'estremità interna di fronte alla dieta e la saliva acquosa viene secreta successivamente. In terzo luogo, un mezzo artificiale dovrebbe essere raccolto e scambiato in tempo per ridurre la contaminazione microbica nel campione raccolto. Infine, anestetizzare gli insetti a 4 °C per 5 minuti è essenziale per evitare la perdita di insetti mentre si modifica la dieta artificiale.

In contrasto con la maggior parte delle diete artificiali che contengono aminoacidi, vitamine e carboidrati, i vantaggi del mezzo di saccarosio al 5% sono degni di nota. Innanzitutto, è facile da preparare. In secondo luogo, la semplice composizione della dieta significa poche sostanze che interferiscono con un'ulteriore analisi dei vari fattori nella saliva. Tuttavia, il rapporto di sopravvivenza dell'SBPH è diminuito negli ultimi giorni del periodo di alimentazione utilizzando il 5% di saccarosio come dieta artificiale generale (Figura 1D). Per superare questo difetto, SBPH fresco dovrebbe essere fornito in tempo per abbastanza saliva. E per ulteriori ricerche sulla funzione salivare sul comportamento alimentare o sulla trasmissione del virus, la durata della raccolta della saliva dovrebbe essere limitata al tempo preciso prima che la mortalità degli insetti aumenti a causa dell'innutrizione. Sembra essere una limitazione comune del mezzo artificiale. Alcuni altri studi hanno scoperto che la sopravvivenza di N. lugens allevati con la dieta chimicamente definita D-97 era inferiore a quella di quelli allevati sulla varietà di riso suscettibile TN1, il che implica che l'ospite originale fornisce più di semplici insetti vettori alimentari. E diversi studi si sono concentrati sull'ottimizzazione delle diete chimicamente definite per l'alimentazione continua degli insetti per migliorare l'efficienza di allevamento.

L'analisi del trascrittoma della ghiandola salivare è un metodo tradizionale per l'identificazione delle proteine della saliva. E diverse proteine della saliva sono state rilevate nelle stesse specie di A. pisum e M. persicae14,31, e l'abbondanza di proteine della saliva determina la frequenza della loro rilevazione32. Tuttavia, mancava un metodo valido per indagare sulla proteina sospetta nella saliva. Questo metodo sandwich a membrana di paraffina fornisce un modo innovativo per confermare una sospetta proteina della saliva identificata dall'analisi del trascrittoma, che è ulteriormente dimostrata rilevando LssgMP (Figura 2C). Inoltre, l'analisi delle proteine ha confermato che nella saliva raccolta sono presenti proteine abbondanti (Figura 2A), che è una quantità sufficiente per ulteriori analisi, ad esempio, mediante spettrometria di massa. L'analisi proteomica della saliva raccolta sarà un metodo diretto ed efficace per identificare i fattori secreti coinvolti nella fase di alimentazione di SBPH, riducendo al minimo il rischio di rilevare proteine ridondanti false positive.

La saliva funziona come portatrice di virus dall'insetto alle piante ospiti ed è una componente essenziale dell'interazione vettore-virus-pianta14,33,34. Il titolo del virus rilasciato dagli insetti vettori è un fattore cruciale per l'infezione all'ospite. Rispetto ai metodi indiretti che testano il titolo virale nelle piante infette, questo protocollo può rilevare direttamente l'RSV rilasciato da SBPH virulifero (Figura 2B). Supportate da questo metodo sandwich a membrana di paraffina, ulteriori analisi comparative delle proteine della saliva raccolte da insetti privi di RSV e infetti da RSV possono anche rivelare potenziali candidati coinvolti nell'interazione virus-pianta-vettore.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2019YFC1200503), dalla National Science Foundation of China (n. 32072385) e dalla Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Numero 174
Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva <em>di Laodelphax striatellus</em>
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Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

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