Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tolags membransmørbrødmetode for Laodelphax striatellus spyttsamling

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å samle tilstrekkelig spytt fra piercing-sugende insekter ved hjelp av et kunstig medium. Dette er en praktisk metode for å samle insektsspytt og studere spyttfunksjon på insektfôringsadferd og vektorbåren virusoverføring.

Abstract

Ris stripe virus (RSV), som forårsaker betydelig økonomisk tap av landbruk i Øst-Asia, helt avhenger av insektvektorer for sin effektive overføring blant vertsris. Laodelphax striatellus (liten brun plantehopper, SBPH) er den primære insektvektoren som horisontalt overfører RSV mens du suger sap fra phloem. Spytt spiller en betydelig rolle i insekters fôringsadferd. En praktisk metode som vil være nyttig for forskning på insekter spytt med piercing-sugende fôringsadferd er beskrevet her. I denne metoden fikk insekter lov til å mate på et kunstig kosthold smurt mellom to strakte parafinfilmlag. Kostholdet som inneholder spytt ble samlet hver dag, filtrert og konsentrert for videre analyse. Til slutt ble kvaliteten på samlet spytt undersøkt av proteinfarging og immunoblotting. Denne metoden ble eksemplifisert ved å oppdage tilstedeværelsen av RSV og et mucinlignende protein i spytt av SBPH. Disse kunstige fôrings- og spyttinnsamlingsmetodene vil legge grunnlag for videre forskning på faktorer i insektsspytt relatert til fôringsadferd og virusoverføring.

Introduction

Ris stripe virus (RSV), et negativt strandet RNA-virus i slekten Tenuivirus, forårsaker alvorlige sykdommer i risproduksjon i Øst-Asia1,2,3. Overføring av RSV fra infiserte risplanter til friske avhenger av insektvektorer, hovedsakelig Laodelphax striatellus, som overfører RSV på en vedvarende-forplantning. SBPH kjøper viruset etter fôring på RSV-infiserte planter. En gang inne i insektet infiserer RSV midgut epitelcellen en dag etter fôring og passerer deretter gjennom midgutbarrieren for å trenge inn i hemolymfen. Deretter sprer RSV seg inn i forskjellige vev via hemolymfen og forplanter seg deretter. Etter en latent periode på ca 10-14 dager etter oppkjøpet, kan viruset inne i spyttkjertelen overføres til de sunne vertsplantene via utskilt spytt mens SBPH suger sap fra phloem4,5,6,7,8,9,10 . En effektiv fôringsprosess og ulike faktorer i spytt er avgjørende for spredning av RSV fra insektet til vertsanlegget.

Insekt spytt utskilt av spyttkjertler antas å megle insekter, virus og vertsplanter. Hemipteran insekter produserer vanligvis to typer spytt: gelling spytt og vannaktig spytt11,12,13. Gelling spytt utskilles hovedsakelig i apoplasma for å opprettholde bevegelsen av stylet blant vertsceller og er også relatert til å overvinne plantemotstand og immunresponser14,15,16,17. På undersøkelsesstadiet av fôring utskiller insekter periodisk gelling spytt som umiddelbart blir oksidert for å danne en overflateflens. Deretter omslutter enkle eller forgrenede kapper stileten for å reservere en rørformet kanal18,19,20. Overflateflensen på epidermis antas å lette penetrasjon av stylet ved å tjene som et ankerpunkt, mens kappene rundt stilekten kan gi mekanisk stabilitet og smøring16,21,22,23. Nlshp ble identifisert som et essensielt protein for spytthylsedannelse og vellykket fôring av brun plantehopper (Nilaparvata lugens, BPH). Hemming av uttrykket av strukturelt kappeprotein (SHP) utskilt av bladlusen Acyrthosiphon pisum reduserte reproduksjonen ved å forstyrre fôring fra vertssikterør24. Videre, i noen insektarter, gel spytt faktorer er ment å utløse plante immunresponser ved å danne såkalte plantelevende-assosierte molekylære mønstre (HAMPs). I N. lugens, NlMLP, et mucinlignende protein relatert til kappedannelse, induserer planteforsvar mot fôring, inkludert celledød, uttrykk for forsvarsrelaterte gener og calloseavsetning 25,26. Også noen gel spyttfaktorer i bladlus har vist seg å utløse planteforsvarsresponser via gen-til-gen interaksjoner som ligner patogen-tilknyttede molekylære mønstre12,15,27.

For å studere spyttfaktorene som er avgjørende for insektfôring og / eller patogenoverføring, er det nødvendig å analysere utskilt spytt. Her beskrives kunstig fôring og innsamlingsmetoder for å oppnå tilstrekkelige mengder spytt for videre analyse. Ved hjelp av et medium som bare inneholder et enkelt ernæringselement, ble mange spyttproteiner samlet og analysert av sølvfarging og vestlig blotting. Denne metoden vil være nyttig i videre forskning på faktorer i spytt som er avgjørende for RSV overføring av SBPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SBPH vedlikehold

  1. Bak viruliferøse og RSV-frie SBPH individer i en glassinkubator (65 x 200 mm) med 5-6 ris(Oryza sativa cv. Nipponbare) frøplanter per glasskammer i laboratoriet. Dyrk risplantene ved 25 °C under 16 timers lys / 8 t mørk fotoperiod.
    MERK: De viruliferøse og RSV-frie SBPH-individene ble opprinnelig fanget i Jiangsu-provinsen i Kina.
  2. Oppdag RSV i SBPH ved dot-enzymbundet immunosorbentanalyse (dot-ELISA) med en kanin RSV-spesifikt polyklonalt antistoff (se Materialfortegnelser) hevet mot RSV ribonukleoproteiner (HMP).
    MERK: For å sikre høy avkominfeksjonseffektivitet ble viruliferøse kvinner opprettholdt separat, og 15% av deres avkom ble tilfeldig testet for RSV-infeksjon. Detaljene for dot-ELISA er beskrevet i trinn 1.3-1.7.
  3. Homogeniser enkel SBPH i 20 μL beleggbuffer (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Spot 3 μL av hver på nylonmembran (se Tabell over materialer), og tørk deretter membranen ved romtemperatur (RT).
  4. Inkuber membranen med 15 ml blokkeringsbuffer (PBS + 3% skummet melk) i 30 min ved romtemperatur.
  5. Inkuber membranen med fortynnede primære kanin-antistoffer mot RSV (1:10000) i 15 ml PBS i 1 time ved RT og vask membranen tre ganger med PBS i 5 min inkubasjon hver gang.
  6. Inkuber membranen med 1,5 μL pepperrotperoksidasekonjugert geit anti-kanin antistoffer (se Tabell over materialer) i 15 ml PBS og vask tre ganger med PBS i 5 min inkubasjon hver gang.
  7. Utvikle immunoblotene med forbedret HRP-DAB kromogene sett (se materialfortegnelse) i henhold til protokollene fra produsenten.

2. Forberedelse av fôringskammer og kunstig diett

  1. Vei 2 g sukrosepulver og oppløs det i 40 ml ddH2O for å forberede 5% sukrose vandig løsning som det kunstige kostholdet.
  2. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 μm filter (se Materialtabell) for å fjerne bakteriell forurensning og urenheter.
  3. Sult 200 3rd-5th SBPH larver i 3-5 timer før du introduserer dem i kammeret.
    MERK: 200 SBPH er forberedt for ett kammer; mer SBPH bør være forberedt på flere kamre.
  4. Klargjør glasssylindrene som fôringskamre (figur 1A). Dekk en åpen ende av kammeret med en parafinmembran (se Materialtabell) før du introduserer de eksperimentelle insekter.
    MERK: Hver sylinder er 15,0 cm lang og 2,5 cm i diameter. Disse glasssylindrene er skreddersydd i henhold til det eksperimentelle kravet.
  5. Overfør insekter til en glasssylinder.
  6. Dekk den andre enden av kammeret med strukket parafinmembran (spesielt Parafilm M). Deretter legger du til 200 μL kunstig diett til det. Til slutt, dekk væsken med et annet lag av strukket parafinmembran.
    MERK: Parafinmembranen strekkes til omtrent det dobbelte av det opprinnelige området.
  7. Dekk kammeret med aluminiumsfolie, men la enden med den kunstige diettenheten bli utsatt for lyset.

3. Innsamling av SBPH spytt

  1. Samle kunstig kosthold fra RSV-fri og viruliferous SBPH separat på slutten av 24 h perioden.
  2. Avkjøl sylinderen ved 4 °C for å immobilisere insekter.
  3. Avdekk den ytre filmen og samle den kunstige diettvæsken ved hjelp av en steril pipette i 1,5 ml sterile rør. Hold den oppsamlede spytten ved -80 °C til analyse.
    MERK: Den innsamlede spytten kan oppbevares ved -80 °C i ett år.
  4. Skyll den indre membranen med 50 μL fersk kunstig diett tre ganger ved å pipettere mykt, og samle det kunstige vaske dietten som beskrevet i trinn 3.3. Legg det nye kunstige kostholdet på den indre membranen og hold en nystrukket Paraffinmembran på toppen.
  5. Gjenta trinn 3.2 og 3.3 i 5 dager til 2 uker.
    MERK: Tell overlevelsesraten for kunstig fôring av SBPH og sørg for tilstrekkelig tilskudd av fersk SBPH i henhold til overlevelsesraten.
  6. Filtrer de innsamlede prøvene gjennom en 0,22 μm filterenhet for å fjerne mikrober og andre forurensninger.

4. Konsentrasjon av samlet spytt

  1. Overfør de innsamlede spyttprøvene i et 0,5 ml 10 kD sentrifugalfilter (se Materialtabell) og spinn ved 5500 x g ved 4 °C i 20 minutter. Samle supernatanten og gjør det endelige volumet til 100 μL.
  2. Mål konsentrasjonen av den oppsamlede spytten ved hjelp av et passende UV-Vis spektrofotometer i følge trinn 4.3-4.6.
  3. Slå på spektrofotometeret og vask sokkelene tre ganger med ddH2O.
  4. Velg følgende alternativer på skjermen i riktig rekkefølge: Proteiner | Protein A280 | Velg Type | 1 Abs = 1 mg/ml. Merk deretter av for Grunnlinjekorrigering 340 nm.
  5. Last inn 2 μL 5% sukrose vandig løsning som tom, trykk Blank nederst på skjermen.
  6. Etter å ha satt standarder, last 2 μL av den oppsamlede spytt for måling. Les og registrer proteinkonsentrasjonen.
    MERK: 1 mg spyttproteiner ble endelig samlet inn i det minste.

5. Sølvfarging av spyttproteiner

  1. Trekk ut protein fra insektsspyttprøver ved hjelp av prøvelastebuffer (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glyserol, 2% SDS, 0,1% bromofenolblå og 1% β-mercaptoetanol). Deretter fraksjonerer du den med 10% SDS-PAGE (se Tabell over materialer). Last inn den 5 % sucroseaqueous oppløsningen som behandles på samme måte som en negativ kontroll.
  2. Legg en 20 μL aliquot av prøven på en SDS-PAGE gel sammen med en prestained markør. Kjør gelen i 15 min ved 90 Volt, og deretter 50 min ved 140 Volt.
  3. Fest gelen i 30% (vol / vol) etanol, 10% (vol / vol) eddiksyre i minst 30 minutter etter elektroforese.
  4. Skyll gelen to ganger med 20% (vol/vol) etanol og vann separat i 10 min hver gang.
  5. Sensibiliser gelen i 0,8 mM natriumtiosulfat i 1 min, skyll deretter to ganger i vann i 1 min hver gang.
  6. Senk gelen i 12 mM sølvnitrat i minst 1 time, og dypp den deretter i deionisert vann i 10 s før du overfører den til utviklerløsningen.
  7. Når bakgrunnen til gelen blir mørk, senk gelen i en stoppløsning (5% eddiksyre) i minst 30 minutter for å stoppe reaksjonen.
  8. Vask gelen to ganger med vann i 30 min hver gang. Utvikle avbildningen med deteksjonssystemet (se Materialfortegnelse).

6. Proteindeteksjon ved vestlig blotting

  1. Oppdag spytt mucin-lignende protein av SBPH (LssgMP) og RSV av vestlige flekker ved hjelp av spesifikke antistoffer, henholdsvis.
  2. Behandle spyttprøver av insekter etter trinn 5.1.
  3. Legg en 20 μL aliquot av prøven på en 10% SDS-PAGE gel sammen med en prestained markør og en 20 μL RSV ikke-infisert spyttprøve som en negativ kontroll. Kjør gelen i 15 min på 90 Volt, og deretter i 50 min ved 140 Volt.
  4. Bland 100 ml 10x proteinoverføringsbuffer (våt) (se Materialtabell) med 900 ml ddH2O til en arbeidsløsning (1x), og overfør deretter proteiner til en polyvinylliddifluoridmembran ved hjelp av proteinoverføringsbuffer (1x).
  5. Blokker membranen i 5% skummet melk med 0,01 M Tris-bufret saltvann med 0,05% Tween 20 (TBST) ved romtemperatur (RT) i 1 time.
    MERK: Bland i denne protokollen 100 ml 10x TBST (se Materialtabell) med 900 ml ddH2O i arbeidsløsningen.
  6. Inkuber membranen med primære kaninantistoffer mot RSV eller LssgMP (begge 1:10000) fortynnet i TBST ved RT i minst 2 timer.
    MERK: Produksjonen av primære antistoffer mot RSV ble nevnt ovenfor. Et bioteknologisk selskap produserte kaninen anti-LssgMP polyklonalt antistoff mot LssgMP peptid GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Vask membranen tre ganger med TBST i 10 min inkubasjon hver gang.
  8. Inkuber membranen med pepperrotperoksidasekonjugert geit anti-kanin antistoffer fortynnet i 1:10000 TBST.
  9. Utvikle immunoblotene med forbedret chemiluminescence Western Blotting Detection System.

7. Påvisning av LssgMP-uttrykksmønster i SBPH

  1. Immobiliser insekter ved 4 °C i 5 minutter.
  2. Vask insekter med 75% etanol og ddH2O en etter en, og disseker deretter insekter i pre-kjølt TBS (0,01 M Tris-bufret saltvann).
  3. Disseker insekter fra magen mens du kutter forbenene til SBPH ved coxa-trochanter-leddet med tang; vask midgut og spyttkjertlene to ganger i TBS for å fjerne forurensning fra hemolymfen.
  4. Sett fem vev i et 1,5 ml RNase-fritt rør for å trekke ut RNA. Vurder hvert rør som en prøve.
  5. Utfør RNA-ekstraksjon i henhold til produsentens protokoller og omvendt transkripsjons-PCR (RT-PCR) (se Materialfortegnelse).
  6. Utfør kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) for å undersøke de relative transkripsjonsuttrykksnivåene til LssgMP i ekstrakter av hele kroppen eller ulike vev av L. striatellus.
    MERK: Primerparene som ble brukt til genforsterkning var LssgMP-q-F/LssgMP-q-R, SYBR Green-basert qPCR ble utført i henhold til produsentens protokoll. Transkripsjonsnivået til L. striatellus oversettelsesforlengelsesfaktor 2 (ef2) ble kvantifisert med primerpar ef2-q-F /ef2-q-R for normalisering av cDNA-malene. Og primersekvensene er festet nedenfor:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skjemaer for kunstig fôringsinstallasjon og spyttsamling
Figur 1A viser glasssylinderen (15 cm x 2,5 cm) som brukes som fôringskammer for å samle spyttet. For det første ble SBPH-larvene sultet i flere timer for å forbedre innsamlingseffektiviteten og deretter immobilisert ved å kjøle seg ned i 5 minutter. Etter at insektene ble overført til glasssylinderen, ble begge åpne ender av kammeret dekket med strukket Paraffinmembran. I den ene enden ble 200 μL av 5% sukrose smurt mellom to lag parafinmembran utvidet til omtrent det dobbelte av det opprinnelige området (Figur 1B). Kammeret var dekket av folie, men slutten med det kunstige kostholdet ble utsatt for lys. Fordi SBPH viser fototropisk oppførsel, ble de sultne insekter samlet på slutten utsatt for lys og matet på den kunstige diettløsningen gjennom den strakte indre Paraffinmembranen. Basert på det kunne spytt slippes ut i det kunstige kostholdet, som ble samlet hver dag. Parafilm-dietten ble erstattet med en ny hver dag. På denne måten ble det kunstige dietten samlet i 5 dager til 2 uker, og deretter ble hele prøven konsentrert til et sluttvolum på 100 μL ved hjelp av et 10 KD sentrifugalfilter (Figur 1C). Under innsamling av spytt ble overlevelsesraten for SBPH som matet 5% sukrose talt. I løpet av de første 4 dagene overlevde mer enn 80% SBPH. Men fra ogmed den femte dagen økte dødeligheten raskt til 40 %, og mindre enn halvpartenav SBPH overlevde den7. For å samle tilstrekkelig spytt, ble fersk SBPH foreslått å levere på denfjerde dagen.

Verifisering av innsamlede spyttproteiner
For å vurdere effektiviteten av denne innsamlingsmetoden ble spyttprøven utsatt for proteinanalyse. For det første ble proteiner skilt av SDS-PAGE, og deretter oppdaget ved sølvfarging (figur 2A). Sammenlignet med den negative kontrollen (5% sukrose), inneholdt de konsentrerte spyttprøvene fra RSV-infisert SBPH spytt mange proteiner som kunne analyseres ytterligere, for eksempel ved massespektrometri. Som den primære insektvektoren til RSV overfører SBPH viruset til planter via sin sugepiercing-fôringsprosess. Den vellykkede utgivelsen av RSV er relatert til spyttsekresjon, og RSV anses å være en viktig faktor i viruliferøse insekters spytt. Her ble spytt testet etter å ha samlet ikke-infiserte og viruliferøse insekter med et antistoff mot RSV og oppdaget vellykket RSV-frakkproteinet (CP) i viruliferous prøven (Figur 2B). En annen studie fant at mucinproteiner er essensielle gel spyttproteiner i hemipteran insekter for å meditere dannelsen av en kappe for fôring23. For å bekrefte at SBPH også produserer et mucinprotein, ble hele den åpne leserammen til et putativt mucinkodingsgen forsterket fra RNA ekstrahert fra spyttkjertelen til SBPH. Sekvensen ble brukt som en spørring i BLAST-analyser mot genomsekvensen til SBPH28. Et gen bestående av 2175 bp, kalt LssgMP, ble identifisert. Et antistoff mot dette proteinet ble tilberedt tidligere og ble brukt til å oppdage proteinet i den innsamlede prøven ved vestlig blotanalyse. Et 78 KD-protein ble påvist i ikke-infiserte og viruliferøse prøver, noe som viser at LssgMP er et spyttprotein (figur 2C). Deretter ble transkripsjonsnivåene av LssgMP i forskjellige vev (spyttkjertel, tarm og gjenværende kropp) bestemt av qRT-PCR. Resultatene viste at gentranskripsjonsnivået var 20 ganger høyere i spyttkjertelen enn i tarmen og andre kroppsdeler (figur 2D), som bekrefter det spesifikke uttrykket for LssgMP i spyttkjertelen.

Figure 1
Figur 1: Diagram over fôringskammer med parafinmembransmørbrød for å tillate fôring av SBPH på kunstig kosthold. (A) Illustrasjon av kunstig fôringskammer. Sylinderen er 15,0 cm lang og 2,5 cm i diameter. I den ene enden av kammeret er Paraffin membran sandwich; Den andre enden og sylinderveggen dekket med tinnfoliepapir (skrå linjer) representerer enheten dekket med tinnfoliepapir. Lyskilden ble satt til å tiltrekke seg SBPH for å mate på det kunstige kostholdet. (B) Diagram over Paraffin sandwich som inneholder kunstig kosthold. 200 μL 5% sukrose vandig løsning ble smurt mellom to lag parafinmembraner strukket til omtrent dobbelt så mye som det opprinnelige området. (C) Konsentrasjonen av samlet spytt ved hjelp av et 10 KD sentrifugalfilter. (D) Overlevelsesraten for SBPH fôring på 5% sukrose. Mean og SEM ble beregnet fra fire biologiske repliker med tre tekniske replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Verifisering av innsamlede spyttproteiner. (A) Spyttproteiner deteksjon ved sølvfarging. 5% sukrose er negativ kontroll. (B) Påvisning av ris stripe virus frakk protein (CP) i samlet spytt ved vestlig blot analyse. (C) Vestlig blotting for å bekrefte tilstedeværelsen av LssgMP i samlet spytt. (D) Spesifikt uttrykk for LssgMP i spyttkjertelen til L. striatellus. ef2: forlengelsesfaktor for oversettelse 2 av SBPH. Mean og SEM ble beregnet fra fire biologiske repliker med tre tekniske replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vellykket oppdrett av insekter på kunstige dietter ble først rapportert i 1962 da Mittler og Dadd beskrev Paraffinmembranteknikken for å holde et kunstig kosthold29,30. Og denne metoden har blitt utforsket i mange aspekter av insektbiologi og oppførsel, for eksempel næringstilskudd, dsRNA-fôring og virusanskaffelse. Basert på kravene til spyttanalyse brukes 5% sukrose som det generelle kunstige kostholdet for å samle spytt av SBPH i denne studien. For vellykket spyttsamling er flere kritiske trinn verdt å merke seg her. For det første er det nødvendig å sulte de eksperimentelle insekter før du introduserer dem i kammeret for å sikre effektiviteten av spyttsamling. For det andre, for å etterligne stilmiljøet, er det laget et tolags Paraffin-smørbrød. Når SBPH feeds på det kunstige kostholdet, dannes spytthylsen på innsiden av dietten, og den vannfulle spytten utskilles deretter. For det tredje bør et kunstig medium samles og byttes i tide for å redusere mikrobiell forurensning i den innsamlede prøven. Til slutt er bedøvelse av insekter ved 4 °C i 5 minutter viktig for å unngå tap av insekter mens du endrer det kunstige kostholdet.

I motsetning til de fleste kunstige dietter som inneholder aminosyrer, vitaminer og karbohydrater, er fordelene med 5% sukrosemedium bemerkelsesverdige. For det første er det lett å forberede. For det andre betyr den enkle sammensetningen av dietten få stoffer for å forstyrre videre analyse av de ulike faktorene i spytt. Likevel gikk overlevelsesforholdet til SBPH ned i de siste dagene av fôringsperioden ved hjelp av 5% sukrose som det generelle kunstige kostholdet (Figur 1D). For å overvinne denne feilen, bør fersk SBPH leveres i tide for nok spytt. Og for videre forskning på spyttfunksjonen på fôringsadferd eller virusoverføring, bør spyttsamlingsvarigheten begrenses til den nøyaktige tiden før insektenes dødelighet økte på grunn av innutrition. Det ser ut til å være en vanlig begrensning av det kunstige mediet. Noen andre studier fant at overlevelsen til N. lugens oppdrettet på det kjemisk definerte kostholdet D-97 var dårligere enn de som ble oppdratt på den mottakelige risvariet TN1, noe som antyder at den opprinnelige verten leverer mer enn bare matvektorinsekter. Og flere studier har fokusert på å optimalisere kjemisk definerte dietter for kontinuerlig fôring av insekter for å forbedre oppdrettseffektiviteten.

Transkripsjonsanalyse av spyttkjertelen er en tradisjonell metode for spyttproteinidentifikasjon. Og forskjellige spyttproteiner har blitt oppdaget i samme art av A. pisum og M. persicae14,31, og overflod av spyttproteiner bestemmer hyppigheten av deresdeteksjon 32. En gyldig metode for å undersøke det mistenkte proteinet i spytt manglet imidlertid. Denne Paraffin membran sandwich metoden gir en innovativ måte å bekrefte en mistenkt spytt protein identifisert av transcriptome analyse, som er ytterligere bevist ved å oppdage LssgMP (Figur 2C). Videre bekreftet proteinanalyse at rikelige proteiner er tilstede i samlet spytt (Figur 2A), som er tilstrekkelig mengde for videre analyse ved for eksempel massespektrometri. Proteomisk analyse av innsamlet spytt vil være en direkte og effektiv metode for å identifisere utskilte faktorer involvert i Fôringsfasen av SBPH, og minimere risikoen for å oppdage falske positive overflødige proteiner.

Spytt fungerer som virusbærer fra insekt til vertsplanter og er en viktig komponent i vektor-virus-planteinteraksjonen14,33,34. Titeret av virus frigjort fra insektvektorer er en avgjørende faktor for infeksjonen til verten. Sammenlignet med indirekte metoder som tester viraltipperen i infiserte planter, kan denne protokollen direkte oppdage RSV utgitt av viruliferøs SBPH (Figur 2B). Støttet av denne Paraffin membran sandwich metoden, ytterligere komparative analyser av spytt proteiner samlet fra RSV-frie og RSV-infiserte insekter kan også avsløre potensielle kandidater involvert i virus-plante-vektor interaksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Program of China (no. 2019YFC1200503), av National Science Foundation of China (No. 32072385), og av Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).

Tags

Biologi utgave 174
Tolags membransmørbrødmetode for <em>Laodelphax striatellus</em> spyttsamling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter