Summary
Enpartikel kryoelektronmikroskopi kräver ett lämpligt programvarupaket och användarvänlig pipeline för automatisk datainsamling med hög genomströmning. Här presenterar vi tillämpningen av ett helt automatiserat programpaket för bildförvärv, Latitude-S, och en praktisk pipeline för datainsamling av vitrifierade biomolekyler under lågdosförhållanden.
Abstract
Under de senaste åren har tekniska och metodologiska framsteg inom enpartikel kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) banat en ny väg för högupplöst strukturbestämning av biologiska makromolekyler. Trots de anmärkningsvärda framstegen inom kryo-EM finns det fortfarande utrymme för förbättringar i olika aspekter av arbetsflödet för enpartikelanalys. Enpartikelanalys kräver ett lämpligt programvarupaket för automatisk datainsamling med hög genomströmning. Flera automatiska mjukvarupaket för datainsamling har utvecklats för automatisk avbildning för enpartikel cryo-EM under de senaste åtta åren. Detta dokument presenterar en tillämpning av en helautomatisk bild förvärv pipeline för vitrified biomolecules under låg dos villkor.
Det visar ett mjukvarupaket, som kan samla in cryo-EM-data helt, automatiskt och exakt. Dessutom styrs olika mikroskopiska parametrar enkelt av detta programvarupaket. Detta protokoll visar potentialen i detta mjukvarupaket i automatiserad avbildning av allvarliga akut respiratorisk syndrom-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spik protein med en 200 keV cryo-elektronmikroskop utrustad med en direkt elektrondetektor (DED). Omkring 3 000 cryo-EM-filmbilder förvärvades i en enda session (48 h) av datainsamling, vilket ger en atomupplösningsstruktur av spikproteinet sars-cov-2. Dessutom visar denna strukturella studie att spikproteinet antar två stora konformationer, 1-RBD (receptorbindande domän) öppet och alla RBD-nedlagda konformationer.
Introduction
Single-particle cryo-EM har blivit en vanlig strukturell biologi teknik för högupplöst struktur bestämning av biologiska makromolekyler1. Enpartikelrekonstruktion är beroende av att förvärva ett stort antal mikrografer av vitrifierade prover för att extrahera tvådimensionella (2D) partikelbilder, som sedan används för att rekonstruera en tredimensionell (3D) struktur av en biologisk makromolekylär2,3. Före utvecklingen av DEDs varierade den resolution som uppnåddes från en partikelrekonstruktion mellan 4 och 30 Å4,5. Nyligen har den uppnåeliga upplösningen från enpartikel cryo-EM nått över 1,8 Å6. DED och automatiserad programvara för datainsamling har varit viktiga bidragsgivare till denna upplösningsrevolution7, där mänsklig intervention för datainsamling är minimal. I allmänhet utförs cryo-EM-avbildning vid låga elektrondoshastigheter (20-100 e/Å2) för att minimera elektronstråleinducerad strålningsskada hos biologiska prover, vilket bidrar till det låga signal-till-brus-förhållandet (SNR) i bilden. Denna låga SNR hindrar karakteriseringen av högupplösta strukturer av biologiska makromolekyler med hjälp av enpartikelanalys.
Den nya generationens elektrondetektorer är CMOS-baserade detektorer (complementary metal-oxide-semiconductor), som kan övervinna dessa låga SNR-relaterade hinder. Dessa direktdetekterings-CMOS-kameror möjliggör snabb avläsning av signalen, på grund av vilken kameran bidrar till bättre punktspridningsfunktion, lämplig SNR och utmärkt detektiv kvanteffektivitet (DQE) för biologiska makromolekyler. Direktdetekteringskameror erbjuder hög SNR8 och lågt brus i de inspelade bilderna, vilket resulterar i en kvantitativ ökning av detektivens kvanteffektivitet (DQE) - ett mått på hur mycket brus en detektor lägger till en bild. Dessa kameror spelar också in filmer med en hastighet av hundratals bilder per sekund, vilket möjliggör snabb datainsamling9,10. Alla dessa egenskaper gör snabba direktdetekteringskameror lämpliga för lågdostillämpningar.
Rörelsekorrigerade stackbilder används för databehandling för att beräkna 2D-klassificering och rekonstruera en 3D-densitetskarta över makromolekyler med hjälp av olika programvarupaket som RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 och EMAN215. För en partikelanalys krävs dock en enorm datauppsättning för att uppnå en högupplöst struktur. Därför är automatiska dataförvärvstullar mycket viktiga för datainsamling. För att spela in stora cryo-EM-datauppsättningar har flera programvarupaket använts under det senaste decenniet. Dedikerade programvarupaket, såsom AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS och EPU, har utvecklats för automatiserat datainsamling.
Dessa programvarupaket använder rutinuppgifter för att hitta hålpositioner automatiskt genom att korrelera lågförstoringsbilderna till bilder med hög förstoring, vilket hjälper till att identifiera hål med glaskroppsis av appropriativ istjocklek för bildförvärv under lågdosförhållanden. Dessa programvarupaket har minskat antalet repetitiva uppgifter och ökat genomströmningen för kryo-EM-datainsamlingen genom att förvärva en stor mängd högkvalitativa data under flera dagar kontinuerligt, utan avbrott och operatörens fysiska närvaro. Latitude-S är ett liknande mjukvarupaket som används för automatisk datainsamling för enpartikelanalys. Detta programvarupaket är dock endast lämpligt för K2/ K3-DED och är försett med dessa detektorer.
Detta protokoll visar potentialen hos Latitude-S i det automatiserade bildförvärvet av SARS-CoV-2 spike protein med en direkt elektrondetektor utrustad med en 200 keV cryo-EM (se tabellen över material). Med hjälp av detta datainsamlingsverktyg förvärvas 3 000 filmfiler av SARS-CoV-2 spike protein automatiskt, och ytterligare databehandling utförs för att erhålla en 3,9-4,4 Å upplösning spik proteinstruktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Tre viktiga steg krävs för insamling av kryo-EM-data: 1. kryo-EM-nätberedning, 2. kalibrering och justering av mikroskopet, 3. automatisk datainsamling (figur 1). Dessutom är automatisk datainsamling indelad i ett lämpligt områdesval, b. optimering av Latitude-S, c. starta automatiskt hålval och d. starta automatiskt datainsamling (figur 1).
1. Kryo-EM-nätberedning och provinläsning för automatisk datainsamling
- Rengör gallret med hjälp av en glödurladdningsparametrar och variera glödurladdningsparametrarna baserat på experimentella krav (här 60 s vid 20 mA).
- Tillsätt ett nyberett proteinprov (3 μL) i det glödurladdningsgallret och inkubera i 10 s.
- Fläcka gallret för 3-5 s vid 100% luftfuktighet och kasta dem snabbt i flytande etan med en cryo-kolv.
- Kläm fast gallret manuellt i en klämring för att bilda patronen med hjälp av en flexibel C-klippring.
- Ladda de frysta patronmonterade gallren i autoloaderkassetten och överför kassetten med nanolocket till mikroskopets förkylda autoladdare för datainsamling.
2. Mikroskopjustering och grundläggande justering före automatisk datainsamling
- Stråleförskjutning
- Klicka på Beam-skift från fliken Direktjustering .
- Minska förstoringen och centrera strålen till den optiska axeln med multifunktionS X- och Y-ratten .
- Justering av pivotpunkt
- Klicka på alternativet Beam tilt i Direct Alignment pp X på fliken Direktjustering .
- Kondensera strålen till en plats och minimera rörelsen med hjälp av Multifunction X- och Y-ratten .
- C2 bländare centrera
- Välj kondensoröppningen på fliken Justering .
- Kondensera strålen till en plats, centrera strålen till den optiska axeln och expandera sedan strålen för att täcka cirkeln jämnt.
- Upprepa dessa steg tills bländaren Kondensor 2 har justerats.
- Komfri justering
- Klicka på Komfri justering X från fliken Direktjustering för att justera strålen till den optiska axeln.
- Använd multifunktionsratten för att minimera FFT:s form och rörelse (se till att den är stabil).
- Upprepa samma procedur för Koma - fri justering Y.
- Ställ in parallell belysning före datainsamling i kryo-EM på grund av C-dubbellinsen.
- Sätt in objektivöppningen (70 μm) i diffraktionsläge.
- Fokusera den objektiva bländaren på diffraktionslinsens främre fokalplan genom att styra defokusintensitetsratten (objektiv och C2-linsström).
- Se till att den skarpa kanten på målöppningen ses efter korrekt defokusering.
- Sätt i strålproppen och sprid intensiteten tills guldpulverdiffraktionsringarna är minimerade.
OBS: Om balken sprids ordentligt syns en tydlig diffraktionsring av guldpulvret på skärmen, vilket indikerar att strålen är parallell. - Dra tillbaka strålproppen efter att ha ställt in parallellbelysningen och ändra mikroskopläget till Nanosonden.
OBS: Kontrollera mikroskopjusteringen innan datainsamlingen påbörjas för att säkerställa mikroskopets optimala prestanda. Alla dessa inställningar skulle utföras i mikroskopet Direct Alignment GUI Tab. All mikroskopjustering utförs med hjälp av ett testrutnät före datainsamlingen.
3. Datainsamling med Latitude-S
- Starta automatisk programvara för automatisk datainsamling i Latitude-S.
OBS: Latitude-S-installationen kräver också mikroskopkalibrering, som kommer att utföras före datainsamling, och inställningarna kommer att lagras permanent. Fem olika tillstånd för datainsamling kalibreras med fyra olika förstoringar (figur 1 och figur 2). Atlastillstånd och rutnätstillstånd är i två olika förstoringar i LM-läge (områden med låg förstoring). Håltillståndet är i SA-läge (hög förstoringsområden) men med en måttlig förstoring. Fokus och datatillstånd använder SA-läge med hög förstoring.- Klicka på DigitalMicrograph från Start-menyn eller dubbelklicka på DigitalMicrograph-ikonen på skrivbordet.
- Välj ikonen Teknikhanteraren från DigitalMicrograph.
OBS: Detta system visar TEM - och Latitude-S-ikoner (bild 2 och kompletterande figur S1). - Välj Latitude-S-ikonen för automatisk datainsamling med en partikel.
OBS: K2-kameran fungerar i tre lägen: linjär/integrerad, räknad och superupplösning. Användaren kan välja vilket läge som helst i gränssnittet för DigitalMicrograph. Databilder kan sparas som antingen dosfraktionerade bildstackar eller som summerade bilder i MRC-, TIF- eller .dm4-filer med olika bitdjup. Dessutom kan data sparas som rörelsekorrigerade bilder för K3-kameran. På en K2-kamera kan en obearbetad bildstack sparas som 4-bitars MRC-, 8-bitars TIF- eller 8-bitars .dm4-filer.
- Skapa en ny session baserat på inställningarna från en tidigare session.
- Markera kryssrutan Baserat på föregående session i paletten.
- Välj knappen Ny .
- Välj mappen som innehåller den session som den nya sessionens inställningar baseras på. Gå till föregående sessionskatalog för att skapa den nya sessionen. Välj den mapp som ska spara den nya sessionen och tillhörande data.
- Välj och välj den mapp där den nya sessionen och tillhörande data ska sparas.
OBS: Varje tillstånd och dess underliggande inställningar (förstoring, belysningsförhållanden, bild eller projektor) och strålförskjutnings- och kameraparametrar (total exponering, exponering med en bildruta och binning) exporteras från den befintliga sessionen till den nya sessionen. Mappens sökväg visas som en textsträng längst ned i paletten. Var och en av tillstånden och konfigurationspaletterna har en asterisk (*) som läggs till i titeln för att visa att den redan har konfigurerats och är klar att användas.
- Fortsätt en befintlig session.
- Tryck på knappen Fortsätt i paletten för att fortsätta en befintlig session.
OBS: Atlasmontaget kan inte ändras. - Välj och navigera till mappen som innehåller sessionen som måste fortsätta.
- Tryck på knappen Fortsätt i paletten för att fortsätta en befintlig session.
- Starta en helt ny session.
- Klicka på fliken Ny i paletten. Välj mappen som innehåller den session som ska fortsätta. Välj en mapp för att spara data.
Standardmappnamnet skapas med hjälp av datum och tid. - Klicka på ikonen Inställning . I rutan Utforska tillstånd i hantera tillstånd som visas lägger du till tillstånd, ställer in TEM-villkoret, kameravillkoret och bild/stack och namnger sedan tillståndet.
Det automatiserade arbetsflödet för datainsamling använder 5 olika tillstånd för automatiserad datainsamling. Dessa tillstånd konfigureras och lagras i sina respektive tillståndspaletter. Tillståndssammanfattningen anges i tabell 1.
- Klicka på fliken Ny i paletten. Välj mappen som innehåller den session som ska fortsätta. Välj en mapp för att spara data.
- Konfigurera atlastillståndet.
- Klicka på Atlas tillståndspalett.
- Konfigurera atlastillståndet med följande parametrar: förstoring 115x LM-läge i nanosond, belysningsförhållanden-punktstorlek 8 och ljusstyrka 934400, binning: 1 och kamerans exponeringstid: 1,0 s för avbildning vid låg förstoring. Se den tillståndssammanfattning som anges i tabell 1.
- Klicka på Nästa för att gå vidare till nästa tillstånd.
Atlastillståndet är det lägsta förstoringstillståndet, vilket ger undersökningen av hela rutnätet (Kompletterande figur S2). I allmänhet hjälper detta tillstånd oss att visualisera hela rutnäten vid låg förstoring och bedöma istjockleken, plattheten och den trasiga kvadraten i rutnäten. Det rekommenderas att atlasen genereras vid olika delar av gallret för att observera den optimala istjockleken och den suboptimala istjockleken i gallret (kompletterande figur S3). De nämnda parametrarna kan varieras beroende på användarens behov.
- Konfigurera rutnätstillståndet.
- Klicka på rutnätstillståndspaletten.
- Konfigurera rutnätstillståndet med följande mikroskopavbildningsoptik (förstoring 380x LM-läge i Nanosond), belysningsförhållanden (spotstorlek: 8 och ljusstyrka 626 200), binning: 1 och kamerans exponeringstid: 1,0 s.
- Se sammanfattningen av Latitude-S-tillståndet i tabell 1.
- Klicka på Nästa för att gå vidare till nästa tillstånd.
Anm.: Rutnätstillståndet är inställt på en förstoring som är högre än atlastillståndet så att synfältet är en rutnätsruta (bild 2). I den här förstoringen observeras en rutnätsruta. Därför observeras hål korrekt i denna förstoring, vilket hjälper till att kontrollera hålens istjocklek (Kompletterande figur S4). Ett enkelt bandpassfilter används i rutnätstillståndet för att lokalisera hålen i patentnätet. De nämnda parametrarna kan varieras beroende på användarens behov.
- Konfigurera håltillståndet.
- Klicka på hålpaletten.
- Konfigurera håltillståndet med följande mikroskopinställningar: bildoptik (förstoring 4500x SM-läge i Nanosond), belysningsförhållanden (spotstorlek: 7 och Beam diameter 8,81 μm), binning: 1 och kamerans exponeringstid: 1,0 s.
- Ändra parametrarna om det behövs baserat på rutnätstypen. Se tillståndssammanfattningen i tabell 1.
- Klicka på Nästa för att gå vidare till nästa tillstånd.
OBS: SA-läget indikerar ett område med hög förstoring i elektronmikroskopet. Håltillståndet ligger i SA-förstoringsområdet med ett synfält på några mikrometer (10–20 μm) (figur 2 och kompletterande figur S4). Det här förstoringsområdet är högre än atlas- eller rutnätstillståndet men mycket mindre än läget Fokus/Data. I denna förstoring kommer enskilda hål att vara synliga. Hålstorleken är lämplig för att observera höga grader av föroreningar, tomma hål och rätt istjocklek på hålen. Hålen för avbildning väljs baserat på dessa antaganden. Två filter används i håltillståndet: ett för korskorrelaterande en hålreferensbild med en ny hålbild och ett annat för att justera scenhöjden till den eucentriska höjden.
- Konfigurera fokustillståndet.
- Klicka på Fokuspaletten.
- Konfigurera fokustillståndet med följande mikroskopinställningar: bildoptik (förstoring 45 000x SA-läge i nanosond), belysningsförhållanden (spotstorlek: 8 och ljusstyrka 934400), binning: 1 och kamerans exponeringstid: 1,0 s.
- Fokusera på det amorfa kolområdet nära hålet. Se sammanfattningen av Latitude-S-tillståndet i tabell 1.
- Klicka på Nästa för att gå vidare till nästa tillstånd.
OBS: SA-läget indikerar ett område med hög förstoring i elektronmikroskopet. Fokustillståndet är den högre SA-intervallförstoringen. I fokusläge flyttas strålen till ett närliggande kolområde i målhålet och utför automatiskt fokus för att samla in data i datatillståndet. Ett bandpassfilter kombinerat med en hanning eller ett mjukt rektangulärt filter används i fokusläge för att mäta förskjutningen mellan två fokustillståndsbilder av samma område (bild 2). De nämnda parametrarna kan varieras beroende på användarens behov.
- Konfigurera datatillståndet.
- Klicka på datapaletten.
- Konfigurera datatillståndet med följande mikroskopinställningar: bildoptik (t.ex. förstoring 28 000x, 45 000x, 54 000x i SA-läge i nanosond), belysningsförhållanden (spotstorlek: 8 och ljusstyrka 934400), binning: 1 och kamerans exponeringstid: 1,0 s.
- Se sammanfattningen av Latitude-S-tillståndet i tabell 1.
- Klicka på Nästa för att gå vidare till nästa tillstånd.
Datatillståndet är den högsta förstoringen som valts baserat på pixelstorlekskrav och målupplösning (bild 2). I allmänhet, efter fokusering, flyttas strålen automatiskt till målområdet för att samla in data. Ovanstående parametrar kan ändras baserat på användarens krav.
4. Fokuskonfiguration
- Klicka på Fokuskonfigurationspalett. Ange intervallet för defokusvärden och stegstorleken på den angivna fliken .
- Tryck på knappen Nästa för att gå vidare till nästa steg.
OBSERVERA: Lägre defokusvärden kan användas för datainsamling med hög upplösning. I allmänhet används -0,5 till -3,0 μm defokusvärden med 0,25 eller 0,5 defokusstegstorlekar för bildförvärv. Användare kan hoppa över fokusinställningssteget om de bara vill screena exemplet. Tryck bara på nästa knapp på paletten för att hoppa över fokuskonfigurationssteget.
5. Fin inriktning
- Fokusera på vissa funktioner på gallret (t.ex. isförorening sexkantig is); se figur 3.
Obs: Funktionerna bör inte vara för stora eller för små. De ska vara synliga vid både Atlas tillståndsförstoring 115x (LA-läge) och dataförstoring. - Klicka på knappen Fånga . Placera röda korsmarkeringen på samma funktion på varje bild av olika tillstånd.
- Börja med fokus-, data- och håltillstånd eftersom deras synfält är mycket större än atlas- och rutnätstillstånden. Zooma på atlas- och rutnätstillstånd för att placera röda korsmarkeringen på samma funktion i atlas- och rutnätstillstånden.
- Klicka på knappen Beräkna för att beräkna positionerna för fem olika tillstånd, som beräknar förskjutningarna mellan vart och ett av lägena och reflekterar dessa till utdatafönstret.
OBS: Förskjutningsvärdena är integrerade i tillstånden för vidare användning (bild 3). Finjustering utförs för att ge hög noggrannhet i positionen för varje tillstånd (bild 3). Den här fina justeringen hjälper till att fastställa den exakta positionen i alla fem tillstånden. Fin justering är avgörande för datainsamling med en partikel. Därför rekommenderas det starkt att utföra fin justering före avbildning.
6. Datainsamlingsförfarande med Latitude-S
- Klicka på paletten Fånga.
OBS: I allmänhet samlas atlasdata in vid låg förstoring (115x) för att visualisera de flesta rutnätsrutorna. - Välj atlasens storlek för att täcka hela rutnätet eller en del av rutnätet baserat på kravet (t.ex. 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 eller 8 x 12).
OBS: 16 med 16 atlasstorlek täcker hela gallret. - Klicka på knappen Fånga för att fånga atlasen.
Obs: Det huvudsakliga Latitude-S-navigeringsfönstret öppnas och fyller det tillgängliga utrymmet i DigitalMicrograph (Kompletterande figur S5). Tre bildrutor i huvudnavigeringsfönstret visar bilder av systemtillstånden vid tre olika förstoringar. Den övergripande atlasen visas för närvarande i dess aktuella förvärvstillstånd i fönstret längst till vänster. Paneler i atlasen fylls när varje fångst sker. - Välj rutnätsrutan baserat på istjockleken genom att navigera på atlasen (Kompletterande figur S5). När önskade rutnätsrutor har valts klickar du på knappen Schema och observerar panelerna i rutnätsrutan när varje rutnätsruta fångas.
- Klicka på knappen Schema när rutnätsrutorna har valts.
- Välj ett representativt hål i rutnätstorget genom att lägga till dess position. När en hålbild har förvärvats definierar du data- och fokuspositioner och sparar layouten som en mall (Kompletterande figur S6).
- Klicka på Auto find, ange hålstorleken (t.ex. R1.2/1.3) och klicka på knappen Sök i programmet, vilket gör att Sök-programmet automatiskt hittar hålen baserat på håldiametern. Klicka sedan på knappen Markera för att lägga till mallen (bild 4) och lägga till röda cirkelmarkeringar i alla hål i ett rutnät eller en partiell rutnätsruta.
- Ställ in intensiteten för att ta bort hålen från gallertorget och isföroreningen (figur 4).
OBS: Slutligen markeras de valda hålen i gult för att schemalägga datainsamlingen. - Klicka på knappen Schema i Latitude-aktiviteter när du har lagt till hålen genom Automatisk sök.
OBS: Innan du schemalägger den automatiska datainsamlingen, se till att nivån för den flytande kvävetanken är tillräcklig, att turbopumpen för automatisk laddare är avstängd och att RAID-drivutrymmet är ledigt. Latitude-S aktivitetshanterare visar antalet atlas-, rutnäts kvadrat-, hål- och datatillstånd som är schemalagda för datainsamling (bild 5). I Latitude-S GUI kommer olika färgscheman att vara synliga, och innebörden av de olika färgschemana visas: 1. Gul anger oplanerad; 2. Grönt anger schemalagda; 3. Blått anger förvärvade; 4. Rött indikerar misslyckades.
7. Behandling av Cryo-EM-data
OBS: Cryo-EM bild bearbetning av spik protein beskrivs i detalj i senaste litteraturen25.
- Utför bildbehandling av spikprotein av SARS-CoV2 med RELION 3.011.
- Visa filmbilderna som samlats in med Latitude-S manuellt och utför balkinducerad rörelsekorrigering av de enskilda filmerna med Hjälp av MotionCor2-programvaran9. Utför den första screeningen av de rörelsekorrigerade mikrograferna manuellt med hjälp av cisTEM-programvarupaket14.
OBS: Nästan 85% av de automatiskt förvärvade mikrograferna var av god kvalitet, och data hade signal inom 3,7-5,2 Å, som beräknas med cisTEM-programvara14 (Kompletterande figur S7A,B). - Bearbeta data med hjälp av PROGRAMVARAN RELION 3.011.
- Plocka spikpartiklar manuellt och utsätt dem för 2D-klassklassificering (Kompletterande figur S7C). Använd den bästa 2D-klassen som referens till autopick 3,99,842 single-spike partiklar från mikrograferna med RELION autopick tool11.
OBS: Tre omgångar av 2D-klassificering utfördes innan partiklarna utsattes för 3D-klassificering (kompletterande figur S8). Cirka 2 55 982 enskilda partiklar valdes ut för 3D-klassificering och datauppsättningen klassificerades i sex klasser. Den slutliga 3D-autoförfining utfördes med bästa klass; 85 227 spikpartiklar erhölls från 3D-klassificeringen. - Efter automatisk förfining, utför per partikeldefokusförfining med rätt balklutningsparametrar för upplösningsförbättring. Därefter utsätter du partiklarna för Bayesian polering med hjälp av RELION 3.0-programvarupaketet11. Slutligen, använd den polerade partikeluppsättningen för en annan omgång 3D-automatisk förfining med RELION 3.011.
- Plocka spikpartiklar manuellt och utsätt dem för 2D-klassklassificering (Kompletterande figur S7C). Använd den bästa 2D-klassen som referens till autopick 3,99,842 single-spike partiklar från mikrograferna med RELION autopick tool11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den nuvarande pandemisituationen spelar cryo-EM en nyckelroll för att karakterisera strukturerna hos olika proteiner från SARS-CoV-226,27,28,29, vilket kan hjälpa till att utveckla vacciner och läkemedel mot viruset. Det finns ett trängande behov av snabba forskningsinsatser med begränsade mänskliga resurser för att bekämpa coronavirussjukdomen 2019. Datainsamling i enpartikel cryo-EM är ett tidskrävande men avgörande steg i strukturbestämningen av makromolekyler. Den senaste utvecklingen inom kryo-EM automatisk datainsamling har möjliggjort begränsad mänsklig inblandning i datainsamlingen. Latitude-S-programvaran är ett viktigt automatiskt mjukvarupaket för datainsamling som används här för automatiserad datainsamling av renat SARS-CoV2-spikprotein.
Cryo-EM data förvärv av SARS-CoV-2 spik protein utfördes med en 200 keV cryo-EM utrustad med en K2 Summit DED. Platserna för datainsamling på nätet med önskvärd istjocklek och partikelfördelning markerades manuellt. Positionerna markerades parallellt under datainsamlingen i bakgrunden. I de markerade positionerna genomförde Latitude-S-programvaran automatiserad datainsamling med en nominell förstoring på 42 200x vid pixelstorleken 1,17 Å på provnivå. Konfigurationen för datainsamling vid 42 200x förstoring var redan förinställd och testad. Totalt 40 ramar registrerades för 8 s med elektrondosen 2 e−/Å2 per ram; Således användes en total dos på 80 e−/Å2 för datainsamling (kompletterande figur S9). Data förvärvades med ett defokusintervall på −0,75 μm och −2,25 μm, med 3 000 filmfiler insamlade på två dagar. Var 4 h utfördes periodiska kontroller och justeringar av programvaran för att säkerställa att alla filmfiler som samlats in över 48 timmar var av god kvalitet och det inte fanns någon strålförskjutning eller justeringsförskjutning. Uppgifterna samlades in oberoende utan någon mänsklig intervention. Dessutom slutar Latitude-S automatiskt att avbilda vid tidpunkten för flytande kvävefyllning, vilket minskar onödig vibration eller mekanisk drift i bilderna.
Som nämnts i protokollavsnittet utfördes den första screeningen av rörelsekorrigerade mikrografer manuellt med cisTEM-programvara14. Baserat på screeningen visade det sig att de flesta uppgifterna låg inom signalområdet 3,7-5,2 Å (Kompletterande figur S7A). Detta tyder på att den automatiska datainsamlingen med Latitude-S är bra, och de flesta data är lämpliga för högupplöst 3D-rekonstruktion. Dessutom samlades bilder in på defokusområde (-0,75 till -2,25 μm), och olika defokusområden kontrollerades manuellt av cisTEM14. De förvärvade uppgifterna låg mycket nära inställningsdefokusområdet i Latitude-S (Kompletterande figur S7A,B).
Databehandling utfördes med hjälp av PROGRAMVARAN RELION 3.011. Spikepartiklar plockades manuellt för att beräkna medelvärdena för 2D-klass. Olika strukturella detaljer (helix och β-ark) är synliga i 2D-klassgenomsnittet (Kompletterande figur S7C), vilket starkt tyder på att högupplöst strukturell karakterisering är möjlig med hjälp av denna datauppsättning. 3D-klassificering indikerar dock också att spike protein har 1-receptorbindande domän (RBD) öppen och all RBD ner nära konformation (Kompletterande figur S8). 3D-klassificeringen indikerar att klass-1 har det maximala antalet partiklar, som visas som en 1-RBD upp öppen konformation. Dessutom har klass-3 och klass-4 ett liknande antal partiklar, och båda modellerna verkade ha alla RBD ner nära konformation. Klass-5 visar dock en mellankonformation, där 1-RBD är i mellanliggande position. 1-RBD-upp öppna konformationer av spikproteinet rekonstruerades dock med hjälp av C1-symmetri, och den totala upplösningen är 4,4 Å (figur 6 och kompletterande figur S10). På samma sätt förfinades all RBD-avvikelse (klass-3 och klass-4) tillsammans med C3-symmetri, och den totala upplösningen vid 0,143 FSC är ~3,9 Å (figur 7).
Den övergripande bildbehandlingen indikerar att spikproteinet antar alla RBDs ner nära och 1-RBD upp öppen konformation. Dessutom identifierades en mellanliggande konformation av spik proteinet. Den högupplösta kryo-EM-strukturen hos S2-underdomänen av spikproteinet indikerar sidokedjorna för enskilda aminosyrarester (figur 6B och figur 7C). Alla 3D-rekonstruktioner och cryo-EM resultat är mycket liknar resultaten i nyligen publicerad litteratur25. Den högupplösta kryo-EM strukturen av spik protein karakteriserades dock inom 15 dagar, vilket endast är möjligt på grund av automatisk cryo-EM data förvärv protokoll och automatisk partikelplockning programvara. Därför kan automatiska mjukvarupaket för datainsamling, inklusive Latitude-S, avsevärt bidra till karakteriseringen av flera högupplösta kryo-EM-strukturer av biologiska makromolekyler.
Bild 1: Arbetsflöde för automatiserat datainsamling med Latitude-S: Allmänna steg som ska följas före datainsamling (rutnätsberedning, provinläsning och mikroskopjustering). Datainsamling är huvuddelen av detta manuskript och den pipeline som ska följas vid datainsamling markeras. Förkortningar: cryo-EM = cryo-elektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Installation av olika tillstånd för insamling av engångspartiklar med hjälp av Latitude-S GUI. (A) Latitude-S-programvarupaket för datainsamling i DM3-programvarudräkt. (B) Arbetsflöde för datainsamlingsförfarandet. C) Utvidgning av varje panel. Förkortning: GUI = grafiskt användargränssnitt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Fin justering för att ställa in hög noggrannhet för fokusering och bildförvärv. Finjustering utförs på fem lägen a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Fokusera varje tillstånd genom att placera det röda märket på samma position. Vi rekommenderar starkt att du utför finjustering innan du startar en ny session, vilket hjälper till att utföra avbildning i en viss position. Bildförvärv i en viss position (utan större skift) beror helt på finjusteringens noggrannhet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Automatiskt val av hål med Latitude-S. Automatisk fynd av hål för datainsamling utförs automatiskt baserat på hålstorlek. (A) Visar positionen för hålsökningsvektorn för automatisk placering av hålen. Skalstång = 20 μm. (B) Visar märkning av hål med hjälp av hålsökningsvektorn och justering av intensiteten för att avlägsna markören från gränsområdet och isförorening. Skalstänger = 20 μm (vänster) och 10 μm (mitten). (C) Visar automatisk tillsats av hålen för avbildning (gul). Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Livevy av datainsamling. (A) Positionerna är markerade i gult, grönt, blått och rött baserat på statusen för datainsamling i varje position. (B) Färgkod för övervakning av status för datainsamling. Grön: Schemalagd, Gul: Oplanerad, Blå: Förvärva, Röd: Misslyckades. Den vänstra panelen visar flera hål färgade gröna (schemalagda) och några hål markerade blå (förvärvade); skalstång = 10 μm. Den mellersta panelen visar 4 300x förstoring av ett enskilt hål. I den här bilden av ett hål (mittpanel) visar den blå fyrkantiga rutan fokusområdet och den gröna fyrkantiga rutan visar bildområdet. skalstång = 1000 nm. Den högra panelen visar den förvärvade bilden. Den högerextrema panelen visar schemalagda bildnummer, den totala tid som krävs för avbildning och hur många bilder som är schemalagda för avbildning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 6: Spike 3D-läge med 1RBD öppet. (A) Automatisk raffinerad och vässad spikproteinkarta med öppen 1 RBD representeras i sido-, topp- och bottenvyer. (B) EM-kartan är utrustad med kristallstruktur för bättre visualisering av sidokedjorna. De markerade regionerna på kartan har densitet för sidokedjor. Förkortningar: 3D = tredimensionell; RBD = receptorbindande domän; EM = elektronmikroskopi; NTD = N-terminaldomän; S1 = underenhet 1; S2 = underenhet 2. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: All RBD ner nära konformation av spikprotein. (A) Automatiskt raffinerad och vässad spikproteinkarta över alla RBD ner nära konformation representerade i sido- och toppvyer. (B) EM-kartan är utrustad med kristallstruktur för bättre visualisering av sidokedjorna. Pilarna visar att regionerna på kartan har densitet för sidokedjor (C). Förkortningar: RBD = receptorbindande domän; EM = elektronmikroskopi; NTD = N-terminaldomän; S1 = underenhet 1; S2 = underenhet 2. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande figur S1: Gui för bildförvärv i Latitude-S: Olika mikroskopstyrenheter (t.ex. kolonnventil öppen/stäng, skärminsats/indragning styrs av Latitude-S GUI. Kolonnventil, kamera, skärmstatus och flytande kvävefyllning kan styras i den vänstra panelen. Längst ner på denna panel visas olika kalibreringsparametrar gröna (t.ex. Förstoring, balklutning, objektivt fokus). Om någon parameter visas svart indikerar den att parametern inte är korrekt optimerad. Därför bör alla parametrar optimeras innan du startar en ny session. Förkortning: GUI = grafiskt användargränssnitt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Representation av atlasstaten. Olika Atlas-stater som visar rutnätsrutor och vilken typ av is som bildas. (A-F) Olika Atlasstorlekar markeras också. (A, B, D, F) Ett tjockt ismönster markeras. (C, D) Brutna rutor markeras. Tjock is och trasiga områden (markerade i figuren) är inte lämpliga för avbildning. (E, F) Bra rutnätsrutor för avbildning; A, B, C, D och F visar rutnätsrutorna som är lämpliga för högupplöst avbildning. Tjocka isgallerrutor och trasiga rutnätsrutor måste dock uteslutas. Skalstänger = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) och 25 μm (F). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Representation av rutnätstillstånd och håltillstånd. Rutnätstillstånd och motsvarande håltillstånd visas i bilden. (A, E) Tomt hål, (F, G) tjock is, (E) isförorening och (A, B, C, D, E och G) lämplig istjocklek markeras i bilden. Lämpliga istjocklekhål väljs för bildförvärvet (A, B, C, D, E och G). Skalstänger = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: Hålreferens för automatisk avbildning. Hålbild (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) fångas in och sparas för framtida referens. Storleken på hålreferensen kan varieras beroende på de olika typerna av galler. Vi rekommenderar att du alltid fångar upp hålreferensen innan du startar en ny session. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S5: Bildfångstpanel vid olika förstoringar och hålval. (A) Insamlingspanelen visar inställningarna för datainsamling. (B) Huvudnavigeringsfönstret i Latitude-S visar tre på varandra följande förstoringar. I atlastillstånd (150x) väljs rutnätsrutorna för datainsamling (vänster panel, skalstreck = 50 μm). Vid högre förstoring (380x) fokuseras en enda kvadrat (mittpanel, skalstång = 20 μm). Ytterligare högre förstoring (4 300x), hål inuti varje kvadrat är fokuserade (höger panel, skalstång = 5 μm). Dessa förstoringar skulle dock ändras beroende på rutnätens storlek och form. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S6: Skapa en mall för val och bildbehandling av hål. Mallgenerering utförs genom att lägga till en position på hålet för data, och fokus placeras intill hålet på kolytan. Fokus bör placeras på kolområdet så att stråldiametern inte ska vidröra något intilliggande hål. Skalstänger = 20 μm (vänster panel), 10 μm (mittpanel), 1000 nm (höger panel). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S7: Cryo-EM-avbildning av SARS-CoV2 med Hjälp av Latitude-S och bildvisning. A) Screening av förvärvade mikrografer: 1D CTF-passform, 2D CTF-passform och CTF-parametrar. uppskattning av sars-cov2-spikproteindata med cistEM. 1D CTF-passform och Thon-ring visar att den totala signalen är 4,8 Å. (B) Mikrografer vid två olika defokusvärde för spikproteinet förvärvas med Hjälp av Latitude-S. Skalstänger = 50 nm. C) Slutligt 2D-klassgenomsnitt. 2D-klassgenomsnittet visar topp-, botten- och sidovyer av spikproteinet. Alla högupplösta detaljer är synliga i 2D-klassgenomsnitt. Förkortningar: cryo-EM = kryoelektronmikroskopi; 1D = endimensionell; 2D = tvådimensionell; CTF = kontrastöverföringsfunktion; SARS-CoV2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S8: Databehandling av SARS-CoV2 spike proteindata som förvärvats med hjälp av Latitude-S-programvara. Bilden visar arbetsflödet som följs för bearbetning av kryo-EM-data för spikprotein. 3D-klassificering av spikprotein utförs med Relion 3.0. Klass-1 visar 1-RBD-upp öppen konformation. Klass-3 och klass-4 visar alla RBD ner nära konformation av spike-protein. Klass-5 visar den mellanliggande konformationen av spikproteinet. Förkortningar: cryo-EM = kryoelektronmikroskopi; 3D = tredimensionell; RBD = receptorbindande domän; SARS-CoV2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S9: Dosfraktionerad bild som tagits som referens för slutlig bildförvärv. Dosfraktioneringsbilder tas med exponering på 8,0 s och exponering på 0,2 s/bildruta. Klicka på knappen Spara automatiskt nära kameran för att spara filmfilerna automatiskt. Efter bildförvärv klickar du på bilden och sparar de dosfraktionerade bildparametrarna med hjälp av den bild uppdaterade knappen i datainsamlingstillståndet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S10: Vinkelfördelning och Fourier skalkorrelation av den genererade SARS-CoV-2 1 RBD upp öppen konformation spike protein karta. (A) Vinkelfördelning av den slutliga 3D-modellen av 1-RBD upp öppen konformation av spikproteinet. Blått representerar lägre värden och rött representerar högre värden för den normaliserade partikelfördelningen. (B) Fourier shell korrelationskurva som visar 4.4 Å upplösning av 1-RBD upp öppen konformation av spikprotein, uppskattad vid cut-off. Förkortningar: 3D = tredimensionell; RBD = receptorbindande domän; SARS-CoV2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; FSC = Fourier skalkorrelation. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| Bildtillstånd för Atlas | Atlas 115 |
| Förstoring | 115, Pixel storlek 34,7 nm |
| Indikerad defokus | 4,38 mm |
| Dekorstorlek | 8 |
| Intelligens | 934400 |
| Läge | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Exponeringstid | 1,0 s |
| Tillstånd för grid survey | Rutnät 380 |
| Förstoring | 380, Pixel storlek 11,2 nm |
| Indikerad defokus | 2,37 mm |
| Dekorstorlek | 8 |
| Intelligens | 626200 |
| Läge | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Exponeringstid | 1,0 s |
| Tillstånd för hålundersökning | Hål 3400 |
| Förstoring | 3 400, Pixel storlek 1,20 nm |
| Indikerad defokus | -0,75 μm |
| Dekorstorlek | 7 |
| Stråldiameter | 8.81 μm |
| Läge | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Exponeringstid | 1,0 s |
| Fokustillstånd | Fokus 45k |
| Förstoring | 45 000, Pixel storlek 0,0924 nm |
| Indikerad defokus | 4.51 μm |
| Dekorstorlek | 6 |
| Stråldiameter | 0.716 μm |
| Läge | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Exponeringstid | 1,0 s |
| Tillstånd för acqisition | Data 45k |
| Förstoring | 45 000, Pixel storlek 0,0924 nm |
| Inställningar för defokusering | Min: -4 500 nm, Max: -1 500 nm, Steg: 250 nm |
| Dekorstorlek | 6 |
| Stråldiameter | 0.752 μm |
| Läge | IMAGINGILM,SA,MH |
| Binning | 1 |
| Exponeringstid | Totalt 8 s exponering för 20 ramar |
| Kamerainställning | Räknad, Få normaliserad, Defekt korrigerad |
| Inställningar för datasparing | MRC |
Tabell 1: Sammanfattning av inställningar för Latitude-S-tillstånd.
| Specifikation | K2-bas | K2 Toppmöte |
| TEM driftspänning | 200-400 kV | |
| Sensor aktivt område | 19,2 mm × 18,6 mm | |
| Sensorstorlek i pixlar | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Super- Resolution |
| Fysio al pixel storlek | 5 μm | |
| Binning | 1–8x | |
| Sensor avläsning | Godtyckligt område | |
| Förstoring i förhållande till film | 1,3–1,5x | |
| Sensorns avläsningshastighet | 50 fulla fps | 400 fulla fps |
| Överföringshastighet till dator | 8 fulla fps | 40 fulla fps |
| Bildvisning | 8 fulla fps | 10 fulla fps |
| DQE-prestanda (300 kV) | >0.30 (topp) >0.25 vid 0.5 av fysisk Nyquist | >0,7 (topp) >0,50 vid 0,5 fysiska Nyquist >0,06 vid 1,25 fysiska Nyquist |
| Mjukvara | Gatan Microscopy Suite inklusive DigitalMicrograph |
Tabell 2: Kameraspecifikationer.
| Konfigurationsalternativ | Värde |
| Mikroskop typ | Talos Arctica G2 |
| Hög spänning | 200 kV |
| Källa | XFEG |
| Lins | Cryo Tvilling |
| Vakuumsystem | Talos TMP IGP |
| Provinläsare | Autoloader |
Tabell 3: Mikroskopkonfiguration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Latitude-S är ett intuitivt användargränssnitt som ger en miljö för att automatiskt konfigurera och samla in tusentals högupplösta mikrografer eller filmfiler på två dagar. Det ger enkel navigering över rutnäten och bibehåller positionen för mikroskopsteget medan det går från låg förstoring till hög förstoring. Varje steg i datainsamlingen med Latitude-S är tidseffektivt, med funktioner som ett enkelt användargränssnitt, snabb direktuppspelning av data med upp till 4,5 GB/s hastighet och samtidig visning av data under förvärvet. Dessutom laddades prekalibrerade dosfraktionerings-, doshastighets-, fokus- och förstoringsparametrar enkelt om för att starta en ny session av automatisk datainsamling och spara tid.
Att hämta data automatiskt i avsaknad av konstant övervakning och utan att kompromissa med datauppsättningens kvalitet är en utmanande och tidskrävande uppgift. Automatiserad datainsamling med Latitude-S-programvara är bekvämt när tid och resurser är stora begränsningar, särskilt under den här pandemin. Emellertid, flera cryo-EM strukturer av olika proteiner av SARS-CoV-2 har lösts under de senaste månaderna, vilket kommer att hjälpa läkemedelsföretag att utveckla vacciner. Olika laboratorier använder olika typer av automatiska datainsamlingsprogrampaket för att samla in data. Vi använde Latitude-S med en K2 Summit DED för cryo-EM automatisk datainsamling på håliga kolnät eller hemlagade GO-belagda galler30.
Denna studie utfördes med hjälp av ovannämnda parametrar i protokollavsnittet, vilket ger starka bevis för att Latitude-S är ett lämpligt och idealiskt mjukvarupaket för automatisk datainsamling för enpartikel cryo-EM. Det rekommenderas dock starkt att följa vissa protokoll innan du startar avbildningen med en K2-kamera. K2-direktdetekteringskameran kräver grundläggande underhållsrutiner för att uppnå högsta prestanda. Regelbunden glödgning av kameran till 50° i 24 timmar hjälper sensorn att fungera optimalt genom att minska bakgrundsljudet och föroreningen på ytnivå. Men efter kameraglödning är uppdatering av kamerans förstärkning och mörka referenser ett obligatoriskt steg (tar ~ 45 min) innan du utför något bildförvärv.
Även om Latitude-S är ett stabilt och användarvänligt programvarupaket för automatisk insamling av kryo-EM är det viktigt att optimera olika parametrar (förstoringar, dekorstorlek, ljusstyrka och doshastighet) i 5 olika tillstånd av Latitude-S i början. Förstoringen av hål- eller rutnätstillstånd beror på hålstorlekarna för håliga galler eller håliga gallertyper (t.ex. R2/2 eller R1.2/1.3 eller R 0.6/1). Till exempel är rutnätshålets storlek av R0,6/1-typ 0,6 μm och hålstorleken på R2/2-rutnätet är 2 μm. Således krävs två olika typer av förstoring för att visualisera hålen korrekt för rutnätstyperna R0.6/1 och R2/2 i rutnäts- och håltillstånden i Latitude-S.
Därför varierar förstoringsinställningarna för olika typer av rutnät i 5 olika tillstånd. Dekorstorleken och ljusstyrkan beror i hög grad på förstoringen. Därför kan dessa värden ändras vid olika förstoringsvärden. Därför rekommenderas att optimera de olika parametrarna för de 5 olika tillstånden i Latitude-S med hjälp av olika typer av kryo-EM-rutnät innan du startar automatisk datainsamling. Men när alla parametrar har optimerats och sparats är det enkelt att ladda om alla parametrar baserat på användarens krav och använda Latitude-S vid olika förstoringar eller rutnätstyper.
En viktig fördel med att använda K2 med Latitude-S är att användarna enkelt kan reglera den öppna/stänga strålventilen, sätta in/dra tillbaka kameran, sätta in/dra tillbaka mikroskopets fosforskärm och reglera flytande kvävefyllning med hjälp av Latitud-S-grafiska förlopp. Andra alternativ (t.ex. pistollutning, pistolförskjutning, strålförskjutning, vridpunkter, C2-bländare centrering, rotationscenter, komfri justering) är dock inte tillgängliga via K2 Latitude-S GUI-fliken (kompletterande figur S1 och figur 2). Under de långa timmarna av datainsamling kan strålens position skifta.
Latitude-S kan utföra automatiska periodiska kontroller och korrigeringar för att hålla reda på systemets stabilitet under hela datainsamlingsperioden. Systemets stabilitet upprätthålls genom att centrera strålen och uppdatera de mörka referenserna. Den ständiga kontrollen säkerställer den höga kvaliteten på de förvärvade uppgifterna. I Latitude-S korrigeras eucentrisk höjd (Z-höjd) endast en gång före datainsamlingen, och den eucentriska höjden beräknas automatiskt av Latitude-S när rutnätet ändras. Fokus mäts och justeras automatiskt baserat på det användardefinierade fokusområdet. Programmet återställer fas Z-positionen om den överskrider det angivna tröskelvärdet. Denna stabilitet styrs via paletten Systemstabilitet. Men liksom andra automatiska dataförvärvspaket har Latitude-S också vissa begränsningar.
Latitude-S kan inte beräkna den eucentriska höjden (Z-höjd) om rutnätet är ojämnt. I det här scenariot kan den inte samla in några data, annars kommer defokusvärdena att vara helt utanför intervallet. Därför bör användarna vara extremt försiktiga med att förbereda sina rutnät utan att böja och avbilda endast rutnät med plan yta med Latitude-S. Till skillnad från Leginon, SerialEM och UCSF-Image är Latitude-S inte heller ett fritt tillgängligt programvarupaket. Latitude-S är kompatibel med Gatan-kameror, inklusive filtrerade eller fristående K2-, K3- och K3-baskameror för direktdetektering, samt Rio- och OneView-kameror. En annan viktig nackdel för användare är att den inte är kompatibel med andra populära DEDs som Falcon DED. Detta gäller dock också för EPU, ett annat automatiskt mjukvarupaket för datainsamling, som är tillgängligt med cryo-mikroskop och endast kompatibelt med Falcon-kameran. Men EPU fungerar också med K2/K3 med ett energifilter (BioQuantum K3 Imaging Filter) men inte med en fristående K2/K3-kamera.
Latitude-S är ganska lik EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation och Leginon, som är mjukvarupaket som används för automatisk datainsamling för enpartikel cryo-EM. Latitude-S är dock endast kompatibelt med K2 DED, K3 DED eller BioQuantum K3 Imaging Filter. Dessutom tillhandahålls kontinuerlig teknisk support av företaget för Latitude-S-användare. Denna tekniska support är fördelaktig för små användargrupper, som behöver använda K2 DED, K3 DED eller BioQuantum K3 Imaging Filter enheter för datainsamling och har ingen förkunskap om hur man ställer in eller använder gratis programvarupaket som SerialEM och Leginon.
Det finns många andra funktioner, såsom mikrokristall elektrondiffraktion (microED), tomografi och energidispersiv röntgenspektrometri (EDS), som finns i olika andra versioner av Latitude. Därför kan användare använda samma programvarupaket för datainsamling i andra lägen. Såvitt vi vet är datainsamling för microED, tomografi och EDS inte tillgänglig i EPU eller andra programvarupaket. Därför kan detta Latitude-programvarupaket vara användbart för olika ändamål förutom automatisk datainsamling i cryoEM med en partikel. SerialEM och Leginon, båda gratis mjukvarupaket, är dock lämpliga för Falcon- eller K2/K3-kameror och är extremt användbara för nya användare. Latitude-S är dock inte fritt tillgängligt, vilket kan vara en nackdel med detta programvarupaket.
Sammanfattningsvis är Latitude-S automatiska datainsamlingsverktyg lika bra som andra automatiska dataförvärvsprogrampaket (t.ex. EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S är ett extremt stabilt och användarvänligt mjukvarupaket för datainsamling, som är tillgängligt med filtrerade eller fristående K2-, K3- och K3-baskameror för direktdetektering samt Rio- och OneView-kameror.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande eller ekonomiska intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi uppmärksammar Institutionen för bioteknik, Institutionen för vetenskap och teknik (DST) och vetenskap, och ministeriet för utveckling av mänskliga resurser (MHRD), Indien, för finansiering och kryo-EM-anläggningen vid IISc-Bangalore. Vi bekräftar DBT-BUILDER Program (BT/INF/22/SP22844/2017) och DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) för National Cryo-EM-anläggningen på IISc, Bangalore. Vi bekräftar ekonomiskt stöd från Vetenskaps- och ingenjörsforskningsnämnden (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 och SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Vi tackar Ms. Ishika Pramanick för att ha förberett cryo-EM-rutnät, kryo-EM datainsamling och förberedelse av materialförteckningen. Vi tackar också Suman Mishra för bildbehandlingen av kryo-EM och för att han hjälpte oss att förbereda siffrorna. Vi tackar prof. Raghavan Varadarajan för att hjälpa oss att få det renade spikproteinprovet för denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W.
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al.
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
