Summary
La cryo-microscopie électronique à particule unique exige un progiciel approprié et un pipeline convivial pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Nous présentons ici l’application d’un logiciel d’acquisition d’images entièrement automatisé, Latitude-S, et un pipeline pratique pour la collecte de données de biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.
Abstract
Au cours des dernières années, les progrès technologiques et méthodologiques de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) ont ouvert une nouvelle voie pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules biologiques. Malgré les progrès remarquables de la cryo-EM, il est encore possible d’améliorer divers aspects du flux de travail d’analyse d’une seule particule. L’analyse monoparticule exige un progiciel approprié pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Plusieurs progiciels d’acquisition automatique de données ont été développés pour l’imagerie automatique pour la cryo-EM monoparticule au cours des huit dernières années. Cet article présente une application d’un pipeline d’acquisition d’images entièrement automatisé pour les biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.
Il présente un progiciel capable de collecter des données cryo-EM de manière complète, automatique et précise. De plus, divers paramètres microscopiques sont facilement contrôlés par ce progiciel. Ce protocole démontre le potentiel de ce progiciel dans l’imagerie automatisée de la protéine de pointe du syndrome respiratoire aigu sévère-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) avec un cryomicroscope électronique de 200 keV équipé d’un détecteur d’électrons direct (DED). Environ 3 000 images de films cryo-EM ont été acquises en une seule session (48 h) de collecte de données, ce qui a donné une structure de résolution atomique de la protéine de pointe du SARS-CoV-2. De plus, cette étude structurale indique que la protéine de pointe adopte deux conformations majeures, 1-RBD (domaine de liaison aux récepteurs) ouverte et toutes les conformations RBD fermées.
Introduction
La cryo-EM monoparticule est devenue une technique de biologie structurale courante pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules biologiques1. La reconstruction d’une seule particule dépend de l’acquisition d’un grand nombre de micrographies d’échantillons vitrifiés pour extraire des images de particules bidimensionnelles (2D), qui sont ensuite utilisées pour reconstruire une structure tridimensionnelle (3D) d’une macromolécule biologique2,3. Avant le développement des DED, la résolution obtenue à partir de la reconstruction d’une seule particule variait entre 4 et 30 Å4,5. Récemment, la résolution réalisable de la cryo-EM à particule unique a dépassé 1,8 Å6. Le DED et les logiciels automatisés d’acquisition de données ont largement contribué à cette révolution de résolution7, où l’intervention humaine pour la collecte de données est minime. En règle générale, l’imagerie cryo-EM est réalisée à de faibles débits de dose d’électrons (20-100 e/Å2) pour minimiser les dommages causés par le rayonnement induit par le faisceau d’électrons des échantillons biologiques, ce qui contribue au faible rapport signal/bruit (SNR) de l’image. Ce faible SNR empêche la caractérisation des structures à haute résolution des macromolécules biologiques à l’aide d’une analyse monoparticulaire.
Les détecteurs d’électrons de nouvelle génération sont des détecteurs à base de CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor), qui peuvent surmonter ces obstacles à faible SNR. Ces caméras CMOS à détection directe permettent une lecture rapide du signal, grâce à laquelle la caméra contribue à une meilleure fonction d’étalement de points, à un SNR approprié et à une excellente efficacité quantique de détection (DQE) pour les macromolécules biologiques. Les caméras à détection directe offrent un SNR8 élevé et un faible bruit dans les images enregistrées, ce qui entraîne une augmentation quantitative de l’efficacité quantique du détective (DQE), une mesure de la quantité de bruit qu’un détecteur ajoute à une image. Ces caméras enregistrent également des films à la vitesse de centaines d’images par seconde, ce qui permet une acquisition rapide des données9,10. Toutes ces caractéristiques rendent les caméras à détection directe rapide adaptées aux applications à faible dose.
Les images de pile corrigées du mouvement sont utilisées pour le traitement des données afin de calculer la classification 2D et de reconstruire une carte de densité 3D de macromolécules à l’aide de divers logiciels tels que RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 et EMAN215. Cependant, pour l’analyse d’une seule particule, un énorme ensemble de données est nécessaire pour obtenir une structure à haute résolution. Par conséquent, les péages d’acquisition automatique de données sont très essentiels pour la collecte de données. Pour enregistrer de grands ensembles de données cryo-EM, plusieurs progiciels ont été utilisés au cours de la dernière décennie. Des progiciels dédiés, tels que AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS et EPU, ont été développés pour l’acquisition automatisée de données.
Ces progiciels utilisent des tâches de routine pour trouver automatiquement les positions des trous en corrélant les images à faible grossissement aux images à fort grossissement, ce qui aide à identifier les trous avec de la glace vitreuse d’épaisseur de glace appropriée pour l’acquisition d’images dans des conditions à faible dose. Ces progiciels ont permis de réduire le nombre de tâches répétitives et d’augmenter le débit de la collecte de données cryo-EM en acquérant une grande quantité de données de bonne qualité pendant plusieurs jours en continu, sans aucune interruption et sans la présence physique de l’opérateur. Latitude-S est un progiciel similaire, utilisé pour l’acquisition automatique de données pour l’analyse d’une seule particule. Cependant, ce progiciel ne convient qu’aux DED K2/K3 et est fourni avec ces détecteurs.
Ce protocole démontre le potentiel de Latitude-S dans l’acquisition automatisée d’images de la protéine de pointe SARS-CoV-2 avec un détecteur d’électrons direct équipé d’un cryo-EM de 200 keV (voir le Tableau des matériaux). À l’aide de cet outil de collecte de données, 3 000 fichiers vidéo de la protéine de pointe du SARS-CoV-2 sont automatiquement acquis et un traitement ultérieur des données est effectué pour obtenir une structure protéique de pointe de résolution 3,9-4,4 Å.
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Protocol
REMARQUE: Trois étapes importantes sont nécessaires pour la collecte de données cryo-EM: 1. préparation de la grille cryo-EM, 2. étalonnage et alignement du microscope, 3. collecte automatique de données (Figure 1). En outre, la collecte automatisée de données est subdivisée en a. sélection de zone appropriée, b. optimisation de Latitude-S, c. démarrage automatique de la sélection automatique des trous et d. démarrage automatique de l’acquisition automatique des données (Figure 1).
1. Préparation de la grille Cryo-EM et chargement des échantillons pour l’acquisition automatique de données
- Nettoyez les grilles à l’aide d’un déchargeur de lueur et faites varier les paramètres de décharge de lueur en fonction des exigences expérimentales (ici, 60 s à 20 mA).
- Ajouter un échantillon de protéines fraîchement préparé (3 μL) à la grille luminescente et incuber pendant 10 s.
- Épongez les grilles pendant 3 à 5 s à 100% d’humidité et plongez-les rapidement dans de l’éthane liquide à l’aide d’un cryo-piston.
- Serrez manuellement les grilles dans un anneau de clip pour former la cartouche à l’aide d’un anneau flexible C-clip.
- Chargez les grilles montées sur cartouche congelées dans la cassette du chargeur automatique et transférez la cassette par le nano capuchon vers le chargeur automatique prérefroidi du microscope pour la collecte de données.
2. Réglage du microscope et alignement de base avant l’acquisition automatique des données
- Décalage du faisceau
- Cliquez sur Décalage de la poutre dans l’onglet Alignement direct .
- Réduisez le grossissement et centrez le faisceau sur l’axe optique à l’aide des boutons multifonctions X et Y .
- Alignement du point pivot
- Cliquez sur l’option Inclinaison de la poutre dans Alignement direct pp X dans l’onglet Alignement direct .
- Condensez le faisceau en un endroit et minimisez le mouvement à l’aide du bouton multifonction X et Y .
- Centrage d’ouverture C2
- Sélectionnez l’ouverture du condenseur dans l’onglet Alignement .
- Condensez le faisceau en un point, centrez le faisceau sur l’axe optique, puis élargissez le faisceau pour couvrir le cercle uniformément.
- Répétez ces étapes jusqu’à ce que l’ouverture du condenseur 2 soit ajustée.
- Alignement sans coma
- Cliquez sur Coma-free Alignment X dans l’onglet Alignement direct pour aligner le faisceau sur l’axe optique.
- Utilisez le bouton Multifonction pour minimiser la forme et le mouvement de la FFT (assurez-vous qu’elle est stable).
- Répétez la même procédure pour Coma - alignement libre Y.
- Réglez l’éclairage parallèle avant la collecte des données dans le cryo-EM en raison de la lentille double C.
- Insérez l’ouverture de l’objectif (70 μm) en mode diffraction.
- Focalisez l’ouverture de l’objectif sur le plan focal avant de l’objectif de diffraction en contrôlant le bouton d’intensité de mise au point (objectif et courant de l’objectif C2).
- Assurez-vous que le bord net de l’ouverture de l’objectif est visible après une mise au point appropriée.
- Insérez le bouchon de faisceau et répartissez l’intensité jusqu’à ce que les anneaux de diffraction de la poudre d’or soient minimisés.
REMARQUE: Si le faisceau est correctement réparti, un anneau de diffraction clair de la poudre d’or est visible à l’écran, ce qui indique que le faisceau est parallèle. - Rétractez le bouchon du faisceau après avoir réglé l’éclairage parallèle et changez le mode microscope en Nano sonde.
REMARQUE: Vérifiez le réglage du microscope avant de commencer la collecte de données pour assurer les performances optimales du microscope. Tous ces réglages seraient effectués dans l’onglet GUI d’alignement direct du microscope. Tout le réglage du microscope est effectué à l’aide d’une grille de test avant la collecte des données.
3. Acquisition de données avec Latitude-S
- Démarrez le logiciel d’acquisition de données automatisé Latitude-S.
REMARQUE : L’installation du Latitude-S nécessite également un étalonnage au microscope, qui sera effectué avant la collecte des données, et les paramètres seront stockés en permanence. Cinq états différents pour la collecte de données sont étalonnés avec quatre grossissements différents (Figure 1 et Figure 2). L’état de l’Atlas et l’état de la grille sont dans deux grossissements différents en mode LM (plages de faible grossissement). L’état du trou est en mode SA (plages de grossissement élevé) mais avec un grossissement modéré. La mise au point et l’état des données utilisent le mode SA à fort grossissement.- Cliquez sur DigitalMicrograph dans le menu Démarrer ou double-cliquez sur l’icône DigitalMicrograph sur le bureau.
- Sélectionnez l’icône Gestionnaire de techniques dans DigitalMicrograph.
REMARQUE : ce système affiche les icônes TEM et Latitude-S (Figure 2 et Figure supplémentaire S1). - Sélectionnez l’icône Latitude-S pour la collecte automatisée de données à une seule particule.
REMARQUE: La caméra K2 fonctionne en trois modes: linéaire / intégré, compté et super-résolution. L’utilisateur peut sélectionner n’importe quel mode dans l’interface de DigitalMicrograph. Les images de données peuvent être enregistrées en tant que piles d’images fractionnées par dose ou en tant qu’images additionnées dans des fichiers MRC, TIF ou .dm4 avec des profondeurs de bits différentes. De plus, les données peuvent être enregistrées sous forme d’images corrigées de mouvement pour la caméra K3. Sur une caméra K2, une pile d’images non traitées peut être enregistrée en tant que fichiers MRC 4 bits, TIF 8 bits ou .dm4 8 bits.
- Créez une nouvelle session en fonction des paramètres d’une session précédente.
- Cochez la case Basé sur la session précédente dans la palette.
- Sélectionnez le bouton Nouveau .
- Choisissez le dossier contenant la session sur laquelle les paramètres de la nouvelle session sont basés. Accédez au répertoire de session précédente pour créer la nouvelle session. Choisissez le dossier dans lequel enregistrer la nouvelle session et les données associées.
- Sélectionnez et choisissez le dossier dans lequel la nouvelle session et les données associées seront enregistrées.
REMARQUE : Chaque état et ses paramètres sous-jacents (grossissement, conditions d’éclairage, image ou projecteur) et les paramètres de décalage du faisceau et de caméra (exposition totale, exposition à une seule image et regroupement) seront exportés de la session existante vers la nouvelle session. Le chemin d’accès du dossier est affiché sous forme de chaîne de texte au bas de la palette. Chacun des états et palettes de configuration a un astérisque (*) ajouté au titre pour montrer qu’il a déjà été configuré et qu’il est prêt à l’emploi.
- Poursuivez une session existante.
- Appuyez sur le bouton Continuer de la palette pour poursuivre une session existante.
REMARQUE : Le montage de l’atlas ne peut pas être modifié. - Choisissez et accédez au dossier qui contient la session à poursuivre.
- Appuyez sur le bouton Continuer de la palette pour poursuivre une session existante.
- Commencez une toute nouvelle session.
- Cliquez sur Nouvel onglet dans la palette. Choisissez le dossier qui contient la session à poursuivre. Sélectionnez un dossier pour enregistrer les données.
Remarque : Le nom de dossier par défaut est généré en utilisant la date et l’heure. - Cliquez sur l’icône Paramètres . Dans la zone Gérer l’exploration de l’état qui s’affiche, ajoutez l’état, définissez la condition TEM, la condition de la caméra et l’image/pile, puis nommez l’état.
REMARQUE : Le flux de travail d’acquisition de données automatisé utilise 5 états différents pour la collecte automatisée de données. Ces états sont configurés et stockés dans leurs palettes d’états respectives. Le résumé de l’état est donné dans le tableau 1.
- Cliquez sur Nouvel onglet dans la palette. Choisissez le dossier qui contient la session à poursuivre. Sélectionnez un dossier pour enregistrer les données.
- Configurez l’état de l’atlas.
- Cliquez sur Palette d’états Atlas.
- Configurez l’état de l’atlas avec les paramètres suivants : grossissement 115x mode LM en nano sonde, conditions d’éclairage-taille du spot 8 et luminosité 934400, binning : 1 et temps d’exposition de l’appareil photo : 1,0 s pour l’imagerie à faible grossissement. Reportez-vous au résumé de l’état donné dans le tableau 1.
- Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
REMARQUE: L’état de l’Atlas est l’état de grossissement le plus bas, qui fournit l’étude de l’ensemble de la grille (figure supplémentaire S2). Généralement, cet état nous aide à visualiser les grilles entières à faible grossissement et à juger de l’épaisseur de la glace, de la planéité et du carré brisé des grilles. Il est recommandé de générer l’atlas à différentes zones de la grille pour observer l’épaisseur optimale de la glace et l’épaisseur de glace sous-optimale des grilles (figure supplémentaire S3). Les paramètres mentionnés peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.
- Configurez l’état de la grille.
- Cliquez sur la palette État de la grille.
- Configurez l’état de la grille avec l’optique d’imagerie de microscope suivante (mode grossissement 380x LM dans la sonde Nano), les conditions d’éclairage (taille du spot: 8 et luminosité 626 200), le binning: 1 et le temps d’exposition de l’appareil photo: 1,0 s.
- Reportez-vous au résumé de l’état du système Latitude-S fourni dans le tableau 1.
- Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
REMARQUE : L’état de la grille est défini à un grossissement supérieur à l’état de l’atlas, de sorte que le champ de vision est d’un carré de grille (Figure 2). Dans ce grossissement particulier, un carré de grille est observé. Par conséquent, les trous sont observés correctement dans ce grossissement, ce qui permet de vérifier l’épaisseur de glace des trous (figure supplémentaire S4). Un simple filtre passe-bande est utilisé à l’état de grille pour localiser les trous dans la grille de brevet. Les paramètres mentionnés peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.
- Configurez l’état du trou.
- Cliquez sur la palette de trous.
- Configurez l’état du trou avec les paramètres de microscope suivants: optique d’imagerie (grossissement 4500x mode SM dans la sonde Nano), conditions d’éclairage (taille du spot: 7 et diamètre du faisceau 8,81 μm), binning: 1 et temps d’exposition de la caméra: 1,0 s.
- Modifiez les paramètres si nécessaire en fonction du type de grille. Voir le résumé de l’état fourni dans le tableau 1.
- Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
REMARQUE: Le mode SA indique une plage de grossissement élevée dans le microscope électronique. L’état du trou est dans la plage de grossissement SA avec un champ de vision de quelques micromètres (10-20 μm) (Figure 2 et Figure supplémentaire S4). Cette plage de grossissement est supérieure à l’état Atlas ou Grille, mais beaucoup plus petite que l’état Focus/Data. Dans ce grossissement, des trous individuels seront visibles. La taille du trou est appropriée pour observer des degrés élevés de contamination, des trous vides et l’épaisseur de glace appropriée des trous. Les trous pour l’imagerie sont sélectionnés en fonction de ces hypothèses. Deux filtres sont utilisés dans l’état du trou : l’un pour la corrélation croisée d’une image de référence de trou avec une nouvelle image de trou et l’autre pour ajuster la hauteur de la scène à la hauteur eucentrique.
- Configurez l’état du focus.
- Cliquez sur Palette focus.
- Configurez l’état de mise au point avec les paramètres de microscope suivants : optique d’imagerie (grossissement 45 000x mode SA en nano sonde), conditions d’éclairage (taille du spot : 8 et luminosité 934400), binning : 1 et temps d’exposition de l’appareil photo : 1,0 s.
- Concentrez-vous sur la zone de carbone amorphe près du trou. Reportez-vous au résumé de l’état du système Latitude-S fourni dans le tableau 1.
- Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
REMARQUE: Le mode SA indique une plage de grossissement élevée dans le microscope électronique. L’état Focus est le grossissement de plage SA le plus élevé. En mode mise au point, le faisceau est déplacé vers une zone de carbone proche du trou cible et effectue automatiquement la mise au point pour collecter les données dans l’état des données. Un filtre passe-bande combiné à un filtre hanning ou rectangulaire souple est utilisé dans l’état de mise au point pour mesurer le décalage entre deux images d’état de mise au point de la même zone (Figure 2). Les paramètres mentionnés peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.
- Configurez l’état des données.
- Cliquez sur Palette de données.
- Configurez l’état des données avec les paramètres de microscope suivants : optique d’imagerie (par exemple, grossissement 28 000x, 45 000x, 54 000x en mode SA en nano sonde), conditions d’éclairage (taille du spot : 8 et luminosité 934400), binning : 1 et temps d’exposition de l’appareil photo : 1,0 s.
- Reportez-vous au résumé de l’état du système Latitude-S présenté dans le tableau 1.
- Cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant.
REMARQUE : L’état des données est le grossissement le plus élevé sélectionné en fonction de la taille des pixels requis et de la résolution cible (Figure 2). Généralement, après la mise au point, le faisceau est automatiquement déplacé vers la zone cible pour collecter les données. Les paramètres mentionnés ci-dessus peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’utilisateur.
4. Configuration du focus
- Cliquez sur La palette de configuration Focus. Spécifiez la plage de valeurs de mise au point et la taille du pas dans l’onglet donné.
- Appuyez sur le bouton Suivant pour passer à l’étape suivante.
REMARQUE : Des valeurs de défocalisation plus faibles peuvent être utilisées pour l’acquisition de données haute résolution. En règle générale, des valeurs de défocalisation de -0,5 à -3,0 μm avec des tailles de pas de mise au point de 0,25 ou 0,5 sont utilisées pour l’acquisition d’images. Les utilisateurs peuvent ignorer l’étape de configuration du focus s’ils souhaitent uniquement filtrer l’exemple. Appuyez simplement sur le bouton Suivant de la palette pour ignorer l’étape de configuration du focus.
5. Alignement fin
- Concentrez-vous sur certaines caractéristiques de la grille (p. ex., la glace hexagonale de contamination de la glace); voir la figure 3.
REMARQUE: Les fonctionnalités ne doivent pas être trop grandes ou trop petites. Ils doivent être visibles à la fois au grossissement de l’état Atlas 115x (mode LA) et au grossissement des données. - Cliquez sur le bouton Capturer . Placez la croix rouge sur la même fonction sur chaque image d’états différents.
- Commencez par les états de mise au point, de données et de trous, car leur champ de vision est beaucoup plus grand que les états de l’atlas et de la grille. Zoomez sur les états de l’atlas et de la grille pour positionner la croix rouge sur la même entité dans les états de l’atlas et de la grille.
- Cliquez sur le bouton Calculer pour calculer les positions de cinq états différents, qui calculera les décalages entre chacun des états et les reflétera dans la fenêtre de sortie.
REMARQUE : Les valeurs de décalage sont intégrées dans les états pour une utilisation ultérieure (Figure 3). Un alignement fin est effectué pour fournir une grande précision de la position de chaque état (Figure 3). Cet alignement fin permet de déterminer la position exacte dans les cinq états. L’alignement fin est essentiel pour l’acquisition de données à une seule particule. Par conséquent, il est fortement recommandé d’effectuer un alignement fin avant l’imagerie.
6. Procédure d’acquisition de données à l’aide de Latitude-S
- Cliquez sur la palette Capture.
REMARQUE: Généralement, les données de l’atlas sont collectées à faible grossissement (115x) pour visualiser la plupart des carrés de la grille. - Choisissez la taille de l’atlas pour couvrir la totalité de la grille ou une partie de la grille en fonction des besoins (par exemple, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 ou 8 x 12).
REMARQUE: La taille de l’atlas 16 par 16 couvre l’ensemble de la grille. - Cliquez sur le bouton Capturer pour capturer l’atlas.
REMARQUE : la fenêtre de navigation principale du Latitude-S s’ouvre et remplit l’espace disponible dans DigitalMicrograph (figure supplémentaire S5). Trois volets d’image dans la fenêtre de navigation principale affichent des images des états du système à trois grossissements différents. L’atlas global est actuellement affiché dans son état actuel d’acquisition dans le volet le plus à gauche. Les tuiles de l’atlas se remplissent à chaque capture. - Sélectionnez le carré de la grille en fonction de l’épaisseur de la glace en naviguant sur l’atlas (figure supplémentaire S5). Une fois que les carrés de grille souhaités sont sélectionnés, cliquez sur le bouton Planifier et observez les tuiles du carré de la grille se remplir au fur et à mesure que chaque carré de grille est capturé.
- Cliquez sur le bouton Planifier une fois les carrés de la grille sélectionnés.
- Sélectionnez un trou représentatif dans le carré de la grille en ajoutant sa position. Une fois qu’une image de trou est acquise, définissez les positions des données et de la mise au point et enregistrez la mise en page en tant que modèle (figure supplémentaire S6).
- Cliquez sur Recherche automatique, donnez la taille du trou (par exemple, R1.2 / 1.3) et cliquez sur le bouton Rechercher dans le programme, ce qui entraînera le programme Rechercher à trouver automatiquement les trous en fonction du diamètre du trou. Ensuite, cliquez sur le bouton Marquer pour ajouter le modèle (Figure 4) et ajouter des marques de cercle rouge dans tous les trous d’une grille ou d’un carré de grille partiel.
- Configurez l’intensité pour enlever les trous du carré de la grille et la contamination par la glace (Figure 4).
REMARQUE: Enfin, les trous sélectionnés seront marqués en jaune pour planifier la collecte de données. - Cliquez sur le bouton Planifier dans les tâches Latitude après avoir ajouté les trous via la recherche automatique.
REMARQUE: Avant de planifier la collecte automatisée de données, assurez-vous que le niveau du réservoir d’azote liquide est suffisant, que la turbopompe du chargeur automatique est éteinte et que l’espace disque RAID est libre. Le gestionnaire de tâches Latitude-S affiche le nombre d’atlas, de carrés de grille, de trous et d’états de données planifiés pour la collecte de données (Figure 5). Dans l’interface graphique de Latitude-S, différents schémas de couleurs seront visibles et la signification des différents schémas de couleurs sera affichée : 1. Le jaune indique qu’il n’est pas planifié ; 2. Le vert indique programmé; 3. Le bleu indique Acquis; 4. Le rouge indique l’échec.
7. Traitement des données Cryo-EM
REMARQUE: Le traitement d’image cryo-EM de la protéine de pointe est décrit en détail dans la littérature récente25.
- Effectuer le traitement d’image de la protéine de pointe du SARS-CoV2 à l’aide de RELION 3.011.
- Filtrez manuellement les images vidéo collectées à l’aide de Latitude-S et effectuez la correction de mouvement induite par le faisceau des films individuels à l’aide du logiciel MotionCor29. Effectuez manuellement le criblage initial des micrographies corrigées du mouvement à l’aide du progiciel cisTEM14.
REMARQUE: Près de 85% des micrographies acquises automatiquement étaient de bonne qualité et les données avaient un signal compris entre 3,7 et 5,2 Å, ce qui est calculé à l’aide du logiciel cisTEM14 (figure supplémentaire S7A, B). - Traitez les données à l’aide du progiciel RELION 3.011.
- Choisissez manuellement les particules de pointe et soumettez-les à une classification de classe 2D (figure supplémentaire S7C). Utilisez la meilleure classe 2D comme référence pour sélectionner automatiquement 3 99 842 particules à pointe unique à partir des micrographies à l’aide de l’outil de sélection automatique RELION11.
NOTE: Trois cycles de classification 2D ont été effectués avant de soumettre les particules à une classification 3D (figure supplémentaire S8). Environ 2 55 982 particules uniques ont été sélectionnées pour la classification 3D, et l’ensemble de données a été classé en six classes. L’auto-raffinement 3D final a été effectué avec la meilleure classe; 85 227 particules de pointe ont été obtenues à partir de la classification 3D. - Après l’affinage automatique, effectuez un raffinement de mise au point par particule avec des paramètres d’inclinaison du faisceau appropriés pour améliorer la résolution. Ensuite, soumettez les particules à un polissage bayésien à l’aide du progiciel RELION 3.011. Enfin, utilisez le jeu de particules polies pour un autre cycle d’auto-raffinement 3D à l’aide de RELION 3.011.
- Choisissez manuellement les particules de pointe et soumettez-les à une classification de classe 2D (figure supplémentaire S7C). Utilisez la meilleure classe 2D comme référence pour sélectionner automatiquement 3 99 842 particules à pointe unique à partir des micrographies à l’aide de l’outil de sélection automatique RELION11.
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Representative Results
Dans la situation pandémique actuelle, la cryo-EM joue un rôle clé dans la caractérisation des structures de diverses protéines du SARS-CoV-226,27,28,29, qui peuvent aider à développer des vaccins et des médicaments contre le virus. Il y a un besoin urgent d’efforts de recherche rapides avec des ressources humaines limitées pour lutter contre la maladie à coronavirus de 2019. L’acquisition de données dans la cryo-EM à particule unique est une étape longue mais cruciale dans la détermination de la structure des macromolécules. Les développements récents dans l’acquisition automatique de données cryo-EM ont permis une interférence humaine limitée dans la collecte de données. Le logiciel Latitude-S est un important logiciel d’acquisition automatique de données utilisé ici pour la collecte automatisée de données sur la protéine de pointe du SARS-CoV2 purifiée.
L’acquisition de données Cryo-EM de la protéine de pointe SARS-CoV-2 a été réalisée avec un cryo-EM de 200 keV équipé d’un DED K2 Summit. Les emplacements d’acquisition de données sur la grille avec l’épaisseur de glace et la distribution des particules souhaitables ont été marqués manuellement. Les positions ont été marquées en parallèle lors de l’acquisition de données en arrière-plan. Aux positions marquées, le logiciel Latitude-S a effectué l’acquisition automatisée de données à un grossissement nominal de 42 200x à la taille de pixel de 1,17 Å au niveau de l’échantillon. La configuration pour la collecte de données à un grossissement de 42 200x a été préréglée et testée déjà. Au total, 40 images ont été enregistrées pendant 8 s avec une dose d’électrons de 2 e−/Å2 par image; ainsi, une dose totale de 80 e−/Å2 a été utilisée pour la collecte de données (figure supplémentaire S9). Les données ont été acquises dans une plage de mise au point de −0,75 μm et −2,25 μm, avec 3 000 fichiers vidéo collectés en deux jours. Toutes les 4 heures, des contrôles et des ajustements périodiques ont été effectués par le logiciel pour s’assurer que tous les fichiers vidéo collectés sur 48 h étaient de bonne qualité et qu’il n’y avait pas de décalage de faisceau ou de décalage d’alignement. Les données ont été recueillies indépendamment sans aucune intervention humaine. De plus, Latitude-S arrête automatiquement l’imagerie au moment du remplissage de l’azote liquide, ce qui réduit les vibrations inutiles ou la dérive mécanique dans les images.
Comme mentionné dans la section du protocole, le dépistage initial des micrographies corrigées du mouvement a été effectué manuellement à l’aide du logiciel cisTEM14. D’après le dépistage, la plupart des données se sont avérées se situer dans la plage de signal de 3,7 à 5,2 Å (figure supplémentaire S7A). Cela suggère que la collecte automatique de données à l’aide de Latitude-S est bonne et que la plupart des données conviennent à la reconstruction 3D haute résolution. De plus, les images ont été collectées à la plage de mise au point (-0,75 à -2,25 μm), et diverses plages de mise au point ont été vérifiées manuellement par cisTEM14. Les données acquises étaient très proches de la plage de mise au point de configuration dans Latitude-S (figure supplémentaire S7A, B).
Le traitement des données a été effectué à l’aide du progiciel RELION 3.011. Les particules de pointe ont été sélectionnées manuellement pour calculer les moyennes de classe 2D. Divers détails structurels (hélice et feuille β) sont visibles dans les moyennes de classe 2D (figure supplémentaire S7C), ce qui suggère fortement que la caractérisation structurelle à haute résolution est possible à l’aide de cet ensemble de données. Cependant, la classification 3D indique également que la protéine spike a un domaine de liaison au récepteur 1 (RBD) ouvert et que tous les RBD vers le bas ferment la conformation (figure supplémentaire S8). La classification 3D indique que la classe 1 a le nombre maximal de particules, qui apparaissent comme une conformation ouverte 1-RBD. En outre, les classes 3 et 4 ont un nombre similaire de particules, et les deux modèles semblaient avoir toutes les RBD de conformation étroite. Cependant, la classe 5 montre une conformation intermédiaire, où 1-RBD est dans une position intermédiaire. Cependant, les conformations ouvertes 1-RBD de la protéine de pointe ont été reconstruites en utilisant la symétrie C1, et la résolution globale est de 4,4 Å (Figure 6 et Figure supplémentaire S10). De même, toutes les conformations rapprochées RBD (classe 3 et classe 4) ont été affinées avec la symétrie C3, et la résolution globale à 0,143 FSC est d’environ 3,9 Å (Figure 7).
Le traitement global de l’image indique que la protéine de pointe adopte tous les RBD de près et la conformation ouverte 1-RBD. De plus, identifier une conformation intermédiaire de la protéine de pointe a été identifiée. La structure cryo-EM à haute résolution du sous-domaine S2 de la protéine de pointe indique les chaînes latérales des résidus d’acides aminés individuels (Figure 6B et Figure 7C). Toutes les reconstructions 3D et les résultats de cryo-EM sont très similaires aux résultats de la littérature récemment publiée25. Cependant, la structure cryo-EM à haute résolution de la protéine de pointe a été caractérisée en 15 jours, ce qui n’est possible que grâce aux protocoles d’acquisition automatique de données cryo-EM et au logiciel de prélèvement automatique des particules. Par conséquent, les progiciels d’acquisition automatique de données, y compris Latitude-S, peuvent contribuer de manière significative à la caractérisation de plusieurs structures cryo-EM à haute résolution de macromolécules biologiques.
Figure 1 : Flux de travail d’acquisition automatisée de données à l’aide de Latitude-S : Étapes générales à suivre avant la collecte des données (préparation de la grille, chargement des échantillons et réglage du microscope). L’acquisition de données est la partie principale de ce manuscrit, et le pipeline à suivre lors de l’acquisition de données est mis en évidence. Abréviations : cryo-EM = cryo-microscopie électronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Configuration de différents états pour la collecte de données monoparticules à l’aide de l’interface graphique Latitude-S. (A) Progiciel Latitude-S pour l’acquisition de données dans la combinaison logicielle DM3. (B) Flux de travail de la procédure d’acquisition de données. C) Élargissement de chaque groupe. Abréviation : GUI = interface utilisateur graphique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Alignement fin pour mettre en place une grande précision pour la mise au point et l’acquisition d’images. L’alignement fin est effectué sur cinq états a. Atlas, b. Trou, c. Données, d. Grille, e. Focus. Concentrez chaque état en plaçant la marque rouge sur la même position. Il est fortement recommandé d’effectuer un alignement fin avant de commencer toute nouvelle session, ce qui aidera à effectuer une imagerie dans une position particulière. L’acquisition d’images dans une position particulière (sans changement majeur) dépend entièrement de la précision de l’alignement fin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : sélection automatique des trous à l’aide de Latitude-S. La recherche automatique des trous pour l’acquisition de données est effectuée automatiquement en fonction de la taille des trous. (A) Indique la position du vecteur de recherche de trous pour la recherche automatique des trous. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Indique le marquage des trous à l’aide du vecteur de recherche de trous et l’ajustement de l’intensité pour retirer le marqueur de la zone frontalière et de la contamination par la glace. Barres d’échelle = 20 μm (à gauche) et 10 μm (au milieu). (C) Affiche l’ajout automatique des trous pour l’imagerie (jaune). Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Vue en direct de l’acquisition de données. (A) Les positions sont marquées en jaune, vert, bleu et rouge en fonction de l’état de l’acquisition de données dans chaque position. (B) Code couleur pour surveiller l’état de l’acquisition des données. Vert : Planifié, Jaune : Non planifié, Bleu : Acquérir, Rouge : Échec. Le panneau de gauche montre plusieurs trous colorés en vert (programmés) et quelques trous marqués en bleu (acquis); barre d’échelle = 10 μm. Le panneau du milieu montre un grossissement de 4 300x d’un trou individuel. Dans cette image d’un trou (panneau du milieu), la zone carrée bleue indique la zone de mise au point et la zone carrée verte indique la région d’imagerie; barre d’échelle = 1000 nm. Le panneau de droite montre l’image acquise. Le panneau d’extrême droite affiche les numéros d’image planifiés, le temps total requis pour l’imagerie et le nombre d’images planifiées pour l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : mode Spike 3D avec 1RBD ouvert. (A) La carte des protéines de pointe auto-affinée et affinée de 1-RBD ouvert est représentée dans les vues latérales, supérieures et inférieures. (B) La carte EM est équipée d’une structure cristalline pour une meilleure visualisation des chaînes latérales. Les régions en surbrillance sur la carte ont des densités pour les chaînes latérales. Abréviations: 3D = tridimensionnel; RBD = domaine de liaison aux récepteurs; EM = microscopie électronique; NTD = N- domaine terminal; S1 = sous-unité 1; S2 = sous-unité 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Toute la rbD vers le bas la conformation de près de la protéine de pointe. (A) Carte de la protéine de pointe auto-affinée et affinée de toute la conformation de fermeture RBD vers le bas représentée dans les vues latérales et supérieures. (B) La carte EM est équipée d’une structure cristalline pour une meilleure visualisation des chaînes latérales. Les flèches indiquent que les régions de la carte ont des densités pour les chaînes latérales (C). Abréviations : RBD = domaine de liaison aux récepteurs ; EM = microscopie électronique; NTD = N- domaine terminal; S1 = sous-unité 1; S2 = sous-unité 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : interface graphique d’acquisition d’images Latitude-S : Divers contrôleurs de microscope (par exemple, ouverture/fermeture de la vanne à colonne, insertion/retrait de l’écran) sont contrôlés par l’interface graphique du Latitude-S. La vanne à colonne, la caméra, l’état de l’écran et le remplissage d’azote liquide peuvent être contrôlés dans le panneau de gauche. Au bas de ce panneau, divers paramètres d’étalonnage apparaissent en vert (par exemple, grossissement, inclinaison du faisceau, mise au point de l’objectif). Si un paramètre apparaît en noir, cela indique qu’il n’est pas optimisé correctement. Par conséquent, tous les paramètres doivent être optimisés avant de commencer toute nouvelle session. Abréviation : GUI = interface utilisateur graphique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Représentation de l’état de l’Atlas. Différents états de l’Atlas montrant les carrés de la grille et le type de glace formé. (A-F) Différentes tailles d’Atlas sont également mises en évidence. (A, B, D, F) Un motif de glace épaisse est mis en évidence. (C, D) Les carrés brisés sont mis en surbrillance. La glace épaisse et les régions brisées (marquées sur la figure) ne conviennent pas à l’imagerie. (E, F) Bons carrés de grille pour l’imagerie; A, B, C, D et F montrent les carrés de grille adaptés à l’imagerie haute résolution. Cependant, les carrés de grille de glace épais et les carrés de grille brisés doivent être exclus. Barres d’échelle = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) et 25 μm (F). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Représentation de l’état de la grille et de l’état du trou. L’état de la grille et l’état du trou correspondant sont affichés dans l’image. (A, E) Un trou vide, (F, G) de la glace épaisse, (E) une contamination par la glace et (A, B, C, D, E et G) une épaisseur de glace appropriée sont marqués sur l’image. Des trous d’épaisseur de glace appropriés sont sélectionnés pour l’acquisition de l’image (A, B, C, D, E et G). Barres d’échelle = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S4 : Référence du trou pour l’imagerie automatique. L’image du trou (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) est capturée et enregistrée pour référence future. La taille de la référence du trou pourrait varier en fonction des différents types de grilles. Il est recommandé de toujours capturer la référence du trou avant de commencer toute nouvelle session. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S5: Panneau de capture d’image à différents grossissements et sélection de trous. (A) Le panneau de capture affiche les paramètres d’acquisition des données. (B) La fenêtre de navigation principale du Latitude-S affiche trois grossissements consécutifs. Dans l’état Atlas (150x), les carrés de la grille sont sélectionnés pour l’acquisition de données (panneau de gauche, barre d’échelle = 50 μm). Dans un grossissement plus élevé (380x), un seul carré est focalisé (panneau du milieu, barre d’échelle = 20 μm). Grossissement plus élevé (4 300x), les trous à l’intérieur de chaque carré sont focalisés (panneau de droite, barre d’échelle = 5 μm). Cependant, ces grossissements changeraient en fonction de la taille et de la forme des grilles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S6 : Création d’un modèle pour la sélection et l’imagerie des trous. La génération de gabarit est effectuée en ajoutant une position sur le trou pour les données, et le foyer est positionné à côté du trou sur la surface du carbone. La mise au point doit être positionnée sur la zone de carbone de sorte que le diamètre du faisceau ne touche aucun trou adjacent. Barres d’échelle = 20 μm (panneau de gauche), 10 μm (panneau du milieu), 1000 nm (panneau de droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S7 : Imagerie cryo-EM du SARS-CoV2 à l’aide de Latitude-S et criblage d’images. (A) Criblage des micrographies acquises : ajustement 1D CTF, ajustement 2D CTF et paramètres CTF; estimation des données sur les protéines de pointe du SRAS-CoV2 à l’aide de cisTEM. L’ajustement CTF 1D et l’anneau de Thon montrent que le signal global est de 4,8 Å. (B) Les micrographies à deux valeurs de défocalisation différentes de la protéine de pointe sont acquises à l’aide de Latitude-S. Barres d’échelle = 50 nm. (C) Moyenne finale de la classe 2D. La moyenne de la classe 2D montre les vues supérieures, inférieures et latérales de la protéine de pointe. Tous les détails haute résolution sont visibles dans les moyennes de classe 2D. Abréviations : cryo-EM = cryo-microscopie électronique ; 1D = unidimensionnel; 2D = bidimensionnel; CTF = fonction de transfert de contraste; SARS-CoV2 = coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S8 : Traitement des données relatives aux protéines de pointe du SRAS-CoV2 acquises à l’aide du logiciel Latitude-S. L’image montre le flux de travail suivi pour le traitement des données cryo-EM de la protéine de pointe. La classification 3D de la protéine de pointe est réalisée à l’aide de Relion 3.0. La classe 1 montre la conformation ouverte 1-RBD up. Les classes 3 et 4 montrent toute la conformation étroite rbD de la protéine spike. La classe 5 montre la conformation intermédiaire de la protéine de pointe. Abréviations : cryo-EM = cryo-microscopie électronique ; 3D = tridimensionnel; RBD = domaine de liaison aux récepteurs; SARS-CoV2 = coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S9 : Image fractionnée par dose capturée comme référence pour l’acquisition finale de l’image. Les images de fractionnement de dose sont capturées avec une exposition de 8,0 s et une exposition de 0,2 s/image. Cliquez sur le bouton Enregistrement automatique près de l’appareil photo pour enregistrer automatiquement les fichiers vidéo. Après l’acquisition de l’image, cliquez sur l’image et enregistrez les paramètres de l’image fractionnée par dose à l’aide du bouton image mise à jour dans l’état de collecte des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S10 : Distribution angulaire et corrélation de la coquille de Fourier de la carte des protéines de pointe de conformation ouverte générée par le SARS-CoV-2 1 RBD. (A) Distribution angulaire du modèle 3D final de 1-RBD jusqu’à la conformation ouverte de la protéine de pointe. Le bleu représente les valeurs inférieures et le rouge représente les valeurs plus élevées de la distribution normalisée des particules. (B) Courbe de corrélation de la coquille de Fourier montrant une résolution de 4,4 Å de la conformation ouverte 1-RBD de la protéine spike, estimée à la coupure. Abréviations: 3D = tridimensionnel; RBD = domaine de liaison aux récepteurs; SARS-CoV2 = coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2; FSC = corrélation de la coquille de Fourier. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| État de l’image atlas | Atlas 115 |
| Grossissement | 115, taille de pixel 34,7 nm |
| Défocalisation indiquée | 4,38 mm |
| Taille du spot | 8 |
| Luminosité | 934400 |
| Mode | IMAGERIEILM |
| Binning | 1 |
| Temps d’exposition | 1,0 s |
| État de l’enquête sur la grille | Grille 380 |
| Grossissement | 380, taille de pixel 11,2 nm |
| Défocalisation indiquée | 2,37 mm |
| Taille du spot | 8 |
| Luminosité | 626200 |
| Mode | IMAGERIEILM |
| Binning | 1 |
| Temps d’exposition | 1,0 s |
| État de l’enquête sur les trous | Trou 3400 |
| Grossissement | 3 400, taille de pixel 1,20 nm |
| Défocalisation indiquée | -0,75 μm |
| Taille du spot | 7 |
| Diamètre du faisceau | 8,81 μm |
| Mode | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Temps d’exposition | 1,0 s |
| État de focalisation | Focus 45k |
| Grossissement | 45 000, taille des pixels 0,0924 nm |
| Défocalisation indiquée | 4,51 μm |
| Taille du spot | 6 |
| Diamètre du faisceau | 0,716 μm |
| Mode | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Temps d’exposition | 1,0 s |
| État d’acqisition | Données 45k |
| Grossissement | 45 000, taille des pixels 0,0924 nm |
| Configuration de La mise au point | Min: -4 500 nm, Max: -1 500 nm, Pas: 250 nm |
| Taille du spot | 6 |
| Diamètre du faisceau | 0,752 μm |
| Mode | IMAGERIEILM,SA,Mh |
| Binning | 1 |
| Temps d’exposition | Exposition totale de 8 s pour 20 images |
| Configuration de la caméra | Compté, Gain normalisé, Défaut corrigé |
| Configuration de l’enregistrement des données | MRC |
Tableau 1 : résumé de la configuration de l’état du système Latitude-S.
| Spécification | K2 Base | Sommet K2 |
| Tension de fonctionnement TEM | 200-400 kV | |
| Zone active du capteur | 19,2 mm × 18,6 mm | |
| Taille du capteur en pixels | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Super- Résolution |
| Taille physique des pixels al | 5 μm | |
| Binning | 1 à 8x | |
| Lecture du capteur | Toute zone arbitraire | |
| Grossissement par rapport au film | 1,3 à 1,5x | |
| Vitesse de lecture du capteur | 50 images par seconde | 400 ips complètes |
| Vitesse de transfert vers l’ordinateur | 8 images par seconde | 40 images par seconde |
| Affichage de l’image | 8 images par seconde | 10 images par seconde |
| Performances DQE (300 kV) | >0,30 (pic) >0,25 à 0,5 de Nyquist physique | >0,7 (pic) >0,50 à 0,5 de Nyquist physique >0,06 à 1,25 de Nyquist physique |
| Logiciel | Gatan Microscopy Suite incluant DigitalMicrograph |
Tableau 2 : Spécifications de l’appareil photo.
| Configuration Option | Valeur |
| Microscope Type | Talos Arctica G2 |
| Haute tension | 200 kV |
| Source | XFEG |
| Lentille | Cryo Jumeau |
| Système de vide | Talos TMP IGP |
| Chargeur d’échantillons | Chargeur automatique |
Tableau 3 : Configuration du microscope.
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Discussion
Latitude-S est une interface utilisateur intuitive qui fournit un environnement permettant de configurer et de collecter automatiquement des milliers de micrographies haute résolution ou de fichiers vidéo en deux jours. Il permet une navigation facile à travers les grilles et maintient la position de l’étage du microscope tout en passant d’un faible grossissement à un grossissement élevé. Chaque étape de l’acquisition de données avec Latitude-S est rapide, avec des fonctionnalités telles qu’une interface utilisateur simple, une diffusion rapide des données à une vitesse allant jusqu’à 4,5 Go/s et l’affichage simultané des données lors de l’acquisition. De plus, les paramètres de fractionnement de dose préétalonnés, de débit de dose, de mise au point et de grossissement ont été facilement rechargés pour démarrer une nouvelle session d’acquisition automatique de données et gagner du temps.
Acquérir des données automatiquement en l’absence de surveillance constante et sans compromettre la qualité de l’ensemble de données est une tâche difficile et chronophage. La collecte automatisée de données à l’aide du logiciel Latitude-S est pratique lorsque le temps et les ressources sont des contraintes majeures, en particulier pendant cette pandémie. Cependant, plusieurs structures cryo-EM de diverses protéines du SARS-CoV-2 ont été résolues au cours des derniers mois, ce qui aidera les sociétés pharmaceutiques à développer des vaccins. Différents laboratoires utilisent différents types de progiciels de collecte automatique de données pour collecter des données. Nous avons utilisé latitude-S avec un DED K2 Summit pour la collecte automatique de données cryo-EM sur des grilles de carbone trouées ou des grilles revêtues GO maison30.
Cette étude a été réalisée en utilisant les paramètres mentionnés ci-dessus dans la section du protocole, ce qui fournit des preuves solides que Latitude-S est un progiciel approprié et idéal pour la collecte automatique de données pour la cryo-EM monoparticule. Cependant, il est fortement recommandé de suivre certains protocoles avant de commencer l’imagerie à l’aide d’une caméra K2. La caméra à détection directe K2 nécessite des routines de maintenance de base pour atteindre les performances les plus élevées. Le recuit régulier de la caméra à 50° pendant 24 h permet au capteur de fonctionner de manière optimale en réduisant le bruit de fond et la contamination au niveau de la surface. Cependant, après le recuit de la caméra, la mise à jour des références de gain et d’obscurité de la caméra est une étape obligatoire (prend environ 45 min) avant d’effectuer toute acquisition d’image.
Bien que Latitude-S soit un progiciel stable et convivial pour la collecte automatique de données cryo-EM, il est essentiel d’optimiser divers paramètres (grossissements, taille du spot, luminosité et débit de dose) dans 5 états différents de Latitude-S au début. Le grossissement des trous ou des états de grille dépend de la taille des trous des grilles trouées ou des types de grille trouée (par exemple, R2/2 ou R1.2/1.3 ou R 0.6/1). Par exemple, la taille du trou de grille de type R0.6/1 est de 0,6 μm et la taille du trou de la grille R2/2 est de 2 μm. Ainsi, deux types de grossissement différents sont nécessaires pour visualiser correctement les trous pour les types de grille R0.6/1 et R2/2 dans les états de grille et de trou dans Latitude-S.
Par conséquent, les paramètres de grossissement pour différents types de grilles dans 5 états différents seront variables. La taille du spot et la luminosité dépendent fortement du grossissement. Par conséquent, ces valeurs peuvent changer à différentes valeurs de grossissement. Par conséquent, il est recommandé d’optimiser les différents paramètres des 5 états différents de Latitude-S en utilisant différents types de grilles cryo-EM avant de commencer l’acquisition automatique de données. Cependant, une fois que tous les paramètres sont optimisés et enregistrés, il est facile de recharger tous les paramètres en fonction des besoins de l’utilisateur et d’utiliser Latitude-S à différents grossissements ou types de grille.
Un avantage important de l’utilisation de K2 avec Latitude-S est que les utilisateurs peuvent facilement régler l’ouverture/fermeture de la vanne de faisceau, insérer/rétracter la caméra, insérer/rétracter l’écran au phosphore du microscope et réguler le remplissage d’azote liquide à l’aide de l’interface graphique de Latitude-S. Toutefois, toutes les autres options (telles que l’inclinaison du pistolet, le décalage du pistolet, le changement de faisceau, les points de pivot, le centrage de l’ouverture C2, le centre de rotation, l’alignement sans coma) ne sont pas accessibles via l’onglet de l’interface graphique K2 Latitude-S (Figure supplémentaire S1 et Figure 2). Pendant les longues heures de collecte des données, la position du faisceau peut changer.
Le Latitude-S peut effectuer des contrôles et des corrections périodiques automatisés pour suivre la stabilité du système tout au long de la période d’acquisition des données. La stabilité du système est maintenue en centrant le faisceau et en mettant à jour les références sombres. Le contrôle constant garantit la haute qualité des données acquises. Dans Latitude-S, la hauteur eucentrique (hauteur Z) n’est corrigée qu’une seule fois avant la collecte des données, et la hauteur eucentrique est calculée automatiquement par Latitude-S lorsqu’elle modifie le carré de la grille. La mise au point est automatiquement mesurée et ajustée en fonction de la plage de mise au point définie par l’utilisateur. Le programme réinitialisera la position de l’étape Z si elle dépasse la valeur de seuil donnée. Cette stabilité est contrôlée par la palette Stabilité du système. Cependant, comme d’autres packages d’acquisition automatique de données, Latitude-S présente également certaines limitations.
Latitude-S ne peut pas calculer la hauteur eucentrique (hauteur Z) si la grille est inégale. Dans ce scénario, il ne peut pas collecter de données, sinon les valeurs de défocalisation seront complètement hors de portée. Par conséquent, les utilisateurs doivent être extrêmement prudents pour préparer leurs grilles sans aucun pli et n’imager que les grilles à surface plane à l’aide de Latitude-S. De plus, contrairement à Leginon, SerialEM et UCSF-Image, Latitude-S n’est pas un progiciel disponible gratuitement. Le Latitude-S est compatible avec les caméras Gatan, y compris les caméras de détection directe de base K2, K3 et K3 filtrées ou autonomes, ainsi que les caméras Rio et OneView. Un autre inconvénient important pour les utilisateurs est qu’il n’est pas compatible avec d’autres DED populaires tels que Falcon DED. Cependant, cela est également vrai pour EPU, un autre logiciel d’acquisition automatique de données, disponible avec des microscopes cryogéniques et uniquement compatible avec la caméra Falcon. Cependant, l’EPU est également fonctionnel avec K2/K3 avec un filtre à énergie (BioQuantum K3 Imaging Filter) mais pas avec une caméra K2/K3 autonome.
Latitude-S est assez similaire à EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation et Leginon, qui sont des progiciels utilisés pour l’acquisition automatique de données pour le cryo-EM à particule unique. Toutefois, le Latitude-S n’est compatible qu’avec le filtre d’imagerie K2 DED, K3 DED ou BioQuantum K3. En outre, le support technique continu est fourni par la société aux utilisateurs de Latitude-S. Ce support technique est bénéfique pour les petits groupes d’utilisateurs, qui ont besoin d’utiliser les dispositifs K2 DED, K3 DED ou BioQuantum K3 Imaging Filter pour l’acquisition de données et qui n’ont aucune connaissance préalable de la configuration ou de l’utilisation de logiciels gratuits tels que SerialEM et Leginon.
Il existe de nombreuses autres fonctionnalités, telles que la diffraction d’électrons microcristallins (microED), la tomographie et la spectrométrie de rayons X à dispersion d’énergie (EDS), qui sont disponibles dans diverses autres versions de Latitude. Par conséquent, les utilisateurs peuvent utiliser le même progiciel pour la collecte de données dans d’autres modes. À notre connaissance, la collecte de données pour la microED, la tomographie et l’EDS n’est pas disponible dans l’EPU ou tout autre progiciel. Par conséquent, ce progiciel Latitude pourrait être utile à différentes fins en plus de l’acquisition automatique de données dans cryoEM à particule unique. Cependant, SerialEM et Leginon, deux logiciels gratuits, conviennent aux caméras Falcon ou K2/K3 et sont extrêmement utiles pour les nouveaux utilisateurs. Cependant, Latitude-S n’est pas disponible gratuitement, ce qui pourrait être un inconvénient de ce progiciel.
En résumé, l’outil d’acquisition automatique de données Latitude-S est aussi performant que d’autres logiciels d’acquisition automatique de données (par exemple, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S est un progiciel d’acquisition de données extrêmement stable et convivial, disponible avec les caméras de détection directe de base K2, K3 et K3 filtrées ou autonomes, ainsi que les caméras Rio et OneView.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts concurrent ou financier à déclarer.
Acknowledgments
Nous remercions le Département de biotechnologie, le Département des sciences et de la technologie (DST) et des Sciences, et le Ministère du développement des ressources humaines (MHRD), Inde, pour le financement et l’installation cryo-EM à IISc-Bangalore. Nous reconnaissons le programme DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) et DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) pour l’installation nationale de Cryo-EM à IISc, Bangalore. Nous reconnaissons le soutien financier du Conseil de la recherche en sciences et en génie (SERB) (subvention n° SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 et SERB-IPA/2020/000094), DBT (subvention n° 2020/000094), DBT (grant no. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Nous remercions Mme Ishika Pramanick d’avoir préparé les grilles cryo-EM, la collecte de données cryo-EM et la préparation de la table des matériaux. Nous remercions également M. Suman Mishra pour le traitement d’image cryo-EM et pour nous avoir aidés à préparer les chiffres. Nous remercions le professeur Raghavan Varadarajan de nous avoir aidés à obtenir l’échantillon de protéine de pointe purifié pour cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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