Summary
Detta manuskript beskriver en metod för att använda encellig fluorescensmikroskopi för att visualisera och kvantifiera bakteriekonkurrens i kokultur.
Abstract
Interbacterial konkurrens kan direkt påverka strukturen och funktionen hos mikrobiom. Detta arbete beskriver en fluorescensmikroskopimetod som kan användas för att visualisera och kvantifiera konkurrensinteraktioner mellan olika bakteriestammar på encellsnivå. Protokollet som beskrivs här innehåller metoder för avancerade metoder vid bildberedning på både upprätt och inverterade epifluorescensmikroskop, live-cell- och timelapse-bildtekniker och kvantitativ bildanalys med hjälp av open source-programvaran FIJI. Tillvägagångssättet i detta manuskript beskriver kvantifieringen av konkurrensinteraktioner mellan symbiotiska Vibrio fischeri-populationer genom att mäta förändringen i området över tid för två myntbuberade stammar som uttrycker olika fluorescerande proteiner från stabila plasmider. Alternativa metoder beskrivs för att optimera detta protokoll i bakteriella modellsystem som kräver olika tillväxtförhållanden. Även om den analys som beskrivs här använder villkor optimerade för V. fischeri, är detta tillvägagångssätt mycket reproducerbart och kan enkelt anpassas för att studera konkurrens bland odlingsbara isolat från olika mikrobiom.
Introduction
Denna artikel beskriver en metod för kvantifiering av bakteriell konkurrens på encellsnivå med fluorescensmikroskopi. Strukturen och funktionen hos mikrobiella samhällen formas ofta av konkurrensinteraktioner mellan mikrober, och i många fall kräver karakterisering av dessa interaktioner att observera olika bakteriestammar i coincubation1,2,3,4,5,6,7,8 . Traditionellt kvantifieras bakteriekonkurrens på befolkningsnivå genom att räkna kolonibildande enheter (CFUs) av inhibitor- och målstammar före och efter en coincubation period2,9. Mekanismer för mikrobiell konkurrens är brett fördelade mellan bakterier och kan förlita sig på antingen diffusion eller cellcellskontakt för att hämmamålcellerna 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.
Även om bakteriestammar ofta observeras i coincubation på befolkningsnivå, beskriver detta manuskript en analys för encells kvantifiering av bakteriell konkurrens. Vidare innehåller detta arbete förslag på hur protokollet för användning med andra bakteriearter ska anpassas. Medan de specifika teknikerna i denna artikel används för att studera kontaktberoende intraspecifik konkurrens mellan stammar av den symbiotiska bakterien Vibrio fischeri20,21,22, kan de anpassas för konkurrens mellan många organismer. Den här artikeln innehåller instruktioner för bildinställningar på både upprätt och inverterade mikroskop, och all analys beskrivs med hjälp av programvaran FIJI23 med öppen källkod så att metoden kan användas av forskare med tillgång till olika bildinställningar och analysprogram. Med tanke på vikten av att studera mikrobiell konkurrens på både befolkningsnivå och encellsnivå kommer denna metod att vara en värdefull resurs för forskare att kvantifiera konkurrensinteraktioner, särskilt de som inte har tillgång till egenutvecklad analysprogramvara.
Protocol
1. Optimering av bakteriestammar
- Välj två bakteriestammar för encelliga bakteriekonkurrensanalyser. Här används två stammar av V. fischeri: en målstam (ES11424) och en hämmarstam (MJ1125) som är känd för att döda målstammen med hjälp av typ VI-utsöndringssystemet på kromosom II (T6SS2)1, som är en kontaktberoende avlivningsmekanism.
- Bestäm lämpliga kontroller för experimentet. I det här exemplet är lämplig kontroll att inkubera både vildtyp och T6SS-mutanthämmarstammar med målstammen för att kvantifiera effekten av T6SS-medierad avlivning.
OBS: Ytterligare kontroller kan inkludera en målstam som uttrycker den nödvändiga immunitetsgenen(erna) för att förhindra T6SS-beroende avlivning eller en hämmare mutant stam som uttrycker vilda kopior av de muterade generna i trans för att återställa T6SS aktivitet1. - Omvandla om möjligt stammar med stabila plasmider kodningsgener för olika fluorescerande proteiner (t.ex. GFP eller RFP) för att visuellt skilja stamtyper på mikroskopet. Här är inhibitorstammen märkt med en GFP-kodningsplasmid (pVSV102), och målstammen är märkt med en dsRed-kodning plasmid (pVSV208)26.
OBS: Om det inte är möjligt att använda stabila plasmider kan fluorescerande taggar föras in på bakteriekromosomen för visualisering27,28. - Under den första optimeringsperioden, bild clonal kulturer av de taggade stammarna under vart och ett av fluorescerande filter som kommer att användas under experimentet för att säkerställa att celler endast är synliga i den avsedda kanalen. Se till exempel till att en GFP-märkt stam bara är synlig i FITC-kanalen.
2. Agarose pad förberedelse
- Förbered agarose pad lösning genom att lösa upp 2% lågsmält agarose (w/v) i mPBS. Värm lösningen en kort stund i mikrovågsugnen och virveln tills agarosen är helt upplöst. Håll denna lösning varm genom att placera den i ett 55°C vattenbad tills den är klar att användas. Mer information om hur du förbereder agarosakuddar finns i avsnittet Diskussion.
OBS: Här förbereddes mPBS genom att lägga till 20 g/ L NaCl till standard 1x PBS. - Linda en bit labbtejp runt en glasrutschbana fem gånger. Upprepa denna process en andra gång på samma bild så att avståndet mellan de två tejpstyckena är något mindre än bredden på ett täckskydd (figur 1A). Om du till exempel använder 25 mm2 täcken ska tejpbitarna vara fördelade med ca 20 mm mellanrum.
OBS: Även om antalet gånger tejpen är lindad runt bilden kan ändras för att justera tjockleken på agarose pad, är det viktigt att tejpskikten är lika höga på båda sidor av bilden så att agarose pad förblir platt. - Pipett varm agarose lösning mellan de två tejpbitarna och omedelbart toppa med en täckglas så att den vilar på tejpbitarna. Detta säkerställer att ytan på agarose pad förblir platt. Volymen av agaroselösning som rörs i detta steg bör vara tillräckligt för att täckglaset kommer i kontakt med vätskan och trycker ut eventuella bubblor i agarosalösningen. För just denna inställning är 200 μL varm agarosa tillräcklig.
- Låt agarosdynan stelna vid rumstemperatur i minst 1 timme före myntbubationsanalysen. Steg 2.2 kommer att producera en agarose pad på ca 20 mm2.
- Skär denna agarose pad med ett rakblad i fyra, 5 mm2 kuddar som ska användas för avbildning.
OBS: Agarose pads kan göras upp till en vecka före experimentet och lagras vid 4°C i en tom, steril Petriplatta förseglad med parafilm för att förhindra torkning.
3. Förbered stammar för saminkubation
- Strecka ut varje stam som ska användas i coincubation-analysen från -80 °C-bestånden på LBS agarplattor kompletterade med lämpliga antibiotika och inkubera över natten vid 24 °C. I det här exemplet används tre stammar: den vilda hämmarstammen, typ VI-utsöndringssystemet mutant och målstammen.
- Nästa dag, börja över natten kulturer i biologisk duplicering genom att välja två kolonier från varje stam och återanvända dem i LBS medium kompletteras med lämpliga antibiotika och inkubera över natten vid 24 °C med skakningar vid 200 rpm.
- Följande morgon replikerar subkulturen varje biologisk replikat 1:1000 till färskt LBS-medium utan antibiotika och inkuberar vid 24 °C med skakningar i 4-5 h eller tills cellerna når en OD600 på ~ 1,5.
OBS: Tidpunkten för steg 3.1, 3.2 och 3.3 kan behöva optimeras för olika bakteriearter eftersom deras tillväxttakt kan variera avsevärt. För denna analys syftade cellerna till att vara i mitten av log-fasen i början av coincubation-analysen.
4. Coincubate bakteriestammar
- Börja med mittloggkulturer från steg 3.3, mät och registrera den optiska densiteten vid 600 nm (OD600)för alla prover.
- Normalisera varje prov till en OD600 = 1,0, vilket motsvarar cirka 109 CFU/ml för V. fischeri, genom att späda ut kulturen med LBS-medium.
- Blanda de två konkurrerande stammarna med ett 1:1-förhållande baserat på volym genom att tillsätta 30 μL av varje normaliserad stam till ett märkt 1,5 ml-rör. Virvel den blandade stamkulturen för 1-2 s.
OBS: I vissa fall kan det vara lämpligt att blanda kokulturer i olika förhållanden. Till exempel, när den ena stammen växer mycket snabbare än den andra, kan det vara nödvändigt att starta den långsammare växande stammen med en numerisk fördel för att observera tävlingen. Optimering kan också krävas om OD600 inte motsvarar liknande CFU/ml för båda stammarna. - Upprepa steg 4.3 för varje biologisk replikat och behandling. I exemplet som visas här kommer detta att resultera i totalt fyra rör med blandad stam: två biologiska replikat med den vilda hämmarstammen blandad med målstammen och två biologiska replikat med mutantstammen typ VI-utsöndringssystemet blandat med målstammen.
- För att säkerställa att konkurrerande celler är tillräckligt täta för kontaktberoende avlivning i coincubation på agardynan, koncentrera varje blandad kultur 3-faldig genom att centrifugera den blandade kulturen i ett standard 1,5 mL centrifugeringsrör i 1 min vid 21 130 x g, kassera supernaten och återanvända varje pellet i 20 μL LBS-medium. Upprepa för varje prov.
OBS: Vissa bakterieceller är känsliga för skador genom centrifugation vid hög rcf; I sådana fall kan den blandade kulturen centrifugeras i 3 min vid 4600 x g29. Vid kvantifiering av kontaktberoende konkurrens är det dessutom viktigt att säkerställa tillräcklig celltäthet på glidningen för att observera avlivning. I denna artikel hade "trånga" behandlingar, där avlivning observeras, cirka 10 celler/20 μm2; se avsnittet Diskussion för mer information.
5. Bildinställningar
- När du använder ett upprätt mikroskop, placera en ~ 5 mm2 agarose pad på en standard 1 mm glasbild. Punkt 2 μL av en blandad kultur på agarosdynan och placera ett #1,5 täckskydd (25 mm2)över platsen. Se figur 1B för ett exempel.
- När du använder ett inverterat mikroskop, punkt 2 μL av en blandad kultur på #1,5 täckslipbotten på en 35 mm Petri-skål och placera en ~ 5 mm2 agarose pad över myntkubationsplatsen. Placera ett 12 mm cirkulärt glaslock över agarosplattan. Se figur 1C för ett exempel.
- Upprepa steg 5.1 eller 5.2, beroende på vilken mikroskopinställning som används, för de återstående tre blandade kulturerna, vilket resulterar i fyra bilder eller rätter som ska avbildas.
- Låt rutschkanorna sitta på bänkskivan i ca 5 min innan du går vidare till steg 6. Detta gör det möjligt för celler att bosätta sig på agardynan och eliminerar rörelse under bildprocessen.
6. Fluorescensmikroskopi
- Börja med att fokusera på celler som använder vitt ljus (faskontrast eller DIC) för att minimera effekterna av fotoblekning. Baserat på den genomsnittliga storleken på en enda bakteriecell, använd ett 60x eller 100x oljemål.
- Justera exponeringstiden och anskaffningsinställningarna för varje kanal så att cellerna visas i lämplig kanal med minimal bakgrundsidentifiering.
OBS: Det är lämpligt att använda olika exponeringstider för olika kanaler, men samma exponeringstid bör användas för alla biologiska replikat och behandlingar för en viss kanal. - För varje exempel väljer du minst fem synfält (FOV) och hämtar bilder i varje lämplig kanal med hjälp av anskaffningsinställningarna från steg 6.2 (Se exempel i figur 2). Spara XY-punkterna från varje FOV så att samma FOV kan avbildas under den sista tidspunkten. Avbildning av samma FOV vid varje tidpunkt är nödvändigt för att bestämma andelen område som upptas av mål- eller hämmarceller under analysstegen.
OBS: I det här exemplet detekteras GFP:s fluorescens med hjälp av ett filter med en excitationsvåglängd på 467 - 498 nm och ett emissionsfilter på 513 - 556 nm och är falskt färgat grönt. Fluorescens av dsRed detekteras med hjälp av ett filter med en excitation våglängd på 542 - 582 nm och ett emissionsfilter på 603 - 678 nm och är falskt färgad magenta. - Efter 2 timmar, upprepa steg 6.3 för varje prov med hjälp av de tidigare sparade XY-punkterna(Fig 2).
OBS: Tidpunkten för efterföljande bilder kan behöva optimeras för organismer med olika tillväxthastigheter eller konkurrenskraftiga mekanismer.
7. Bildanalys i FIJI
- Ladda ner och installera FIJI bildbehandlingsprogram med hjälp av instruktionerna som finns här: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- Öppna FIJI och importera bildfiler för analys.
OBS: I de flesta fall . TIFF filer kommer att användas för bild analys, även om vissa bild förvärv programvara kommer att exportera med proprietära filtyper. FIJI kan känna igen de flesta proprietära filtyper och bilder kan importeras och analyseras enligt följande. - För varje bild som förvärvas i steg 6.3 och 6.4 konverterar du bilden till gråskala, separerar kanalerna och börjar med att tröskelvärde (Ctrl + Skift + T) och skapar en binär mask av den förbehandlade bilden (Bild 3A, B).
Obs: Här används standardtröskelinställningarna i FIJI. I vissa fall kan det vara nödvändigt att ändra dessa inställningar, i vilket fall samma inställningar ska användas för alla bilder i det experimentet. - Ställ in skala på bilden (Analysera | Ställ inskala ) med lämpliga värden för mikroskopiinställningen23.
- Ställ in mått (Analysera | Ställ inmått ) och välj Område.
OBS: Andra mätningar kan läggas till om de är lämpliga för experimentet. Endast objektområdesmätningen krävs för exempelanalysen som visas här. - Analysera partiklar (Analysera | Analysera partiklar )med standardinställningarna (Bild 3C). Om det finns skräp i provet kan det vara nödvändigt att justera storleken eller cirkulariteten för att filtrera bort icke-cellpartiklar. Välj Visa | Konturer så att resultatet av denna analys kommer att innehålla en numrerad kontur av alla analyserade partiklar (figur 3D).
OBS: Att jämföra konturen i figur 3D med den första bilden är särskilt viktigt i optimeringssteget för att säkerställa att (1) alla celler analyseras och (2) att skräp utesluts från analysen. - Exportera mätningarna från steg 7.4(figur 3E)till ett kalkylbladsprogram för vidare analys och grafering.
- Upprepa steg 7.1 - 7.5 för alla kanaler och bilder som förvärvats under experimentet.
8. Beräkna procenten av det ursprungliga målområdet över tid
- För varje synfält som analyseras i avsnitt 7, se till att den exporterade filen innehåller en individuell områdesmätning för varje partikel som analyserades. Börja med målstammens fluorescenskanal, beräkna summapartikelområdet för varje enskilt synfält. För två biologiska replikat med fem FOV vardera bör detta resultera i tio sumområden per behandling vid varje tidpunkt.
- Beräkna procenten av det ursprungliga målområdet över tid för varje FOV med hjälp av följande ekvation: (
) - Upprepa denna beräkning för alla behandlingar och grafera procenten av det ursprungliga målområdet (resultatet av ekvationen från steg 8.2) för varje behandling (figur 4A).
- Bestäm om det finns en nettoökning av målpopulationen (vilket indikerar tillväxt), en nettominskning av målgruppen (som indikerar dödsfall) eller ingen förändring (vilket indikerar ingen tillväxt eller död) för varje behandling.
OBS: Procent av det ursprungliga målområdet med värden över 100 indikerar nettomåltillväxt och värden lägre än 100 indikerar nettomåldöd. Procent av de ursprungliga målvärdena som ligger kvar på 100 anger ingen nettoförändring av målgruppen. Se diskussion för föreslagna uppföljningsexperiment.
)9. Beräkna procenten av initialhämmarområdet över tid
- Upprepa steg 8.1 till 8.3, denna gång med hjälp av mätningar som samlats in från inhibitorstammens fluorescenskanal i avsnitt 7 (Figur 4B).
- Avgöra om det fanns en nettoökning av inhibitorpopulationen (tillväxt); en nettominskning av inhibitorpopulationen (dödsfall) eller ingen förändring för varje behandling. Värden större än 100 indikerar nettohämmartillväxt och värden lägre än 100 indikerar nettohämmare död.
Representative Results
För att visualisera och kvantifiera konkurrensinteraktioner mellan bakterier på encellsnivå utvecklades och optimerades ett protokoll för V. fischeri genom att modifiera vår väletablerade CFU-baserade analys1,2. Denna metod använder GFP- och dsRed-kodning stabila plasmider för att visuellt skilja olika stammar av V. fischeri. Det konkurrenskraftiga resultatet av dessa interaktioner kan kvantifieras genom att analysera de bilder som förvärvats från denna analys med hjälp av open source-programvaran FIJI. Som ett exempel utfördes följande experiment med V. fischeri isolat. En hämmarstam hyste en plasmid som kodar GFP, och en målstam hyste en plasmid som kodar dsRed. Med tanke på att T6SS2 som kodas av hämmaren är en kontaktberoende avlivningsmekanism, inkluderades behandlingar där celler antingen var trånga (hög cellcellskontakt) eller dispergering (låg cellcellskontakt) på en bild för att belysa effekten av experimentell installation på de slutliga resultaten av denna analys. I provdata blandades konkurrerande stammar med ett 1:1-förhållande och inkuberades på en agarose pad i 2 h, och både inledande och slutliga (2 h) bilder togs. Som en kontroll myntades också en T6SS2 mutant stam med målstammen i både trånga och dispergeringsförhållanden. Kulturer av varje stam förbereddes och myntades enligt beskrivningen ovan och bilder förbereddes enligt figur 1.
Figur 2 visar representativa fluorescensmikroskopibilder av varje experimentell behandling med samma synfält avbildat vid en inledande och sista tidpunkt. För varje behandling blandades antingen en vild typ hämmare eller T6SS mutant stam som hyser en GFP-kodning plasmid vid ett 1:1-förhållande med målstammen som hyser en dsRed-kodning plasmid. Under en 2 h coincubation period med denna experimentella inställning, växande V. fischeri celler kan gå igenom 1-2 divisioner (Figur 2; grå pilar). I figur 2Atvingades cellcellskontakten mellan målet och hämmaren genom att koncentrera den blandade kulturen innan den upptäcktes på bilden. Flera målceller observeras bli rundade och/eller försvinna under loppet av 2 timmar, i överensstämmelse med att målceller elimineras av hämmaren (figur 2, vita pilar). Mer information om tolkning av avrundnings- eller lysande målceller finns i avsnittet Diskussion. I figur 2Bupptäcktes samma coincubation på en bild, denna gång utan att koncentrera den blandade kulturen så att cellerna förblev dispergerade och det fanns minimal kontakt mellan stammar på bilden. Här observeras inga målceller försvinna eller runda, vilket tyder på att målstammen inte hämmades i denna behandling. Figur 2C och figur 2D visar samma trånga och dispergerade behandlingar som beskrivs ovan, denna gång med en T6SS-mutant som hämmarstam. Målceller observerades inte försvinna eller runda när de myntades med en T6SS-mutant under antingen trånga eller dispergeringsförhållanden, vilket återigen tyder på att målet inte hämmades i någon av behandlingarna.
Figur 3 visar det arbetsflöde för FIJI-analys som används för att kvantifiera konkurrensen i detta protokoll. En representativ bild från målkanalen valdes (figur 3A) och en binär mask skapades med standardtröskelinställningarna i FIJI (figur 3B). Avbildningsskalan har ställts in på lämpligt sätt för den här mikroskopiinställningen. Partiklar analyserades med hjälp av storleksparametern = 0 - oändlighet, cirkularitetsparameter = 0,00 - 1,00 och Visa konturer valdes (Figur 3C). Resultaten av denna partikelanalys visas som både en numrerad kontur av varje partikel (figur 3D), och som en tabell med kolumner för partikelnummer, filnamn (etikett) och partikelområde i μm2 (område) (Figur 3E).
I figur 4graferas och analyseras data från figur 3E. I figur 4Apresenteras procenten av det ursprungliga målområdet vid den slutliga tidpunkten för varje behandling enligt steg 8.2. Om procenten av det ursprungliga målområdet är större än 100 innebär detta en nettoökning av målet (dvs. tillväxt) och observeras under förhållanden där målgruppen inte hämmas nämnvärt. Om procenten av det ursprungliga målområdet är lägre än 100 tyder detta resultat dock på en nettominskning av målet (dvs. dödsfall) och observeras under förhållanden där målgruppen är kraftigt hämmad. När målet myntades med en vild typ av hämmare under trånga förhållanden visar data en nettominskning i målområdet. När målet däremot myntades med antingen en vild typ av hämmare under spridningsförhållanden eller en T6SS-mutant under trånga eller dispergerade förhållanden, visar data en nettoökning i målområdet. Procenten av det ursprungliga målområdet när målet myntades med en vild typhämmare under trånga förhållanden var under 100 och betydligt lägre än alla andra behandlingar enligt en enkelriktad ANOVA följt av en Tukeys flera jämförelsetest över alla behandlingar (p < 0,0001). Dessa data indikerar att målcellsdöd är beroende av en funktionell T6SS i hämmaren och understryker vikten av en experimentell inställning som möjliggör tillräcklig cellcellskontakt för att upptäcka celldöd från en kontaktberoende dödande mekanism.
Figur 4B presenterar procenten av det ursprungliga hämmarområdet vid den slutliga tidpunkten för varje behandling. I detta exempel observerades nettotillväxt av inhibitorstammen över alla behandlingar. Procenten av det ursprungliga hämmarområdet var dock betydligt högre när en vild typ av hämmare myntades med målet under trånga förhållanden jämfört med alla andra behandlingar enligt en enkelriktad ANOVA följt av en Tukeys flera jämförelsetest över alla behandlingar (p < 0,0001). Inledningsvis ansåg vi att nettoökningen av inhibitorområdet kan drivas av ökningen av tillgängligt utrymme att växa in i när målceller elimineras. Samma ökning av inhibitortillväxten observerades dock inte vid dispersion av behandlingar, där hämmarceller hade utrymme att växa från början av coincubationen. Alternativt kan detta resultat föreslå att näringsämnen som frigörs från lysande målceller möjliggör en större ökning av inhibitorpopulationen. Sammantaget tyder dessa resultat på att inhibitorstammen eliminerar målet på ett T6SS-beroende sätt endast när hög cellcellskontakt tvingas av trängselceller på bilden.
Bild 1:Förberedelse av agarosedynor och bildinställningar för myntbubationsanalyser. Fem lager labbtejp (grön) lindas runt en täcksping vid två punkter med ungefär 20 mm mellanrum. Därefter är varm 2% agarose i mPBS (gul) pipetted mellan tejpbitarna och omedelbart täckt med en 25 mm2 täckspjälm och får stelna i minst 1 timme vid rumstemperatur. Använd ett rakblad för att skära agarosdynan i ~5 mm2 bitar och använd pincett för att överföra dynan till en ny bild för avbildning. B) Vid avbildning på upprätt mikroskop, placera 5 mm2 agarose pad direkt på bilden, följt den blandade kulturen (blå) och en 12 mm cirkulär #1,5 täckspill. (C) När du avbildar på ett inverterat mikroskop, upptäck den blandade kulturen direkt på glaskåpan #1,5 på en 35 mm Petri-skål och placera en agarosaplatta ovanpå kulturen följt av en andra 12 mm cirkulär täckspillning för att platta till agarosdynan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Tidsfördröjningsbilder av myntbubationsfläckar i antingen trånga eller dispergerande förhållanden. (A) Representativa bilder vid inledande och sista tidpunkter där en blandad kultur av mål- och vildtypshämmare koncentrerades 3x innan de upptäcktes på bilden för att tvinga cellcellskontakt mellan stammar. Vita pilar i TRITC-kanalen visar exempel på målceller som rundar eller lyser under hela experimentet. B)Representativa bilder där en blandad kultur av mål- och vildtypshämmare upptäcktes utan att koncentreras så att cellerna skingras och cellcellskontakten mellan stammarna är minimal. Grå pilar i FITC- och TRITC-kanaler visar exempel på celldelning under experimentet. (C) Representativa bilder där blandad kultur av mål och T6SS- mutant var koncentrerad 3x innan spotting på bilden för att tvinga cell-cell kontakt mellan stammar. (D) Representativa bilder där blandad kultur av mål och T6SS- mutant upptäcktes utan koncentration så att cellerna sprids och det finns minimal cellcellskontakt mellan stammar. Skalstänger = 5 μm och är konsekventa i alla bilder; TRITC-kanalen är falskfärgad magenta, FITC-kanalen är falskfärgad grön. Dekonvolution utfördes på alla bilder; subtraherades och ljusstyrkan/kontrasten justerades jämnt över alla bilder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Fijis analysarbetsflöde. (A) Representativ bild för analys. Det här arbetsflödet upprepas för båda kanalerna i alla synfält och exempel. Skalstänger = 5 μm och är konsekventa i alla bilder; TRITC-kanalen är falskfärgad magenta, FITC-kanalen är falskfärgad grön. (B) Binär mask skapad genom att tröskelvärdet för bilden med hjälp av standardinställningarna i FIJI. (C) Exempel på inställningar för partikelanalys som används i detta manuskript. Storleksområde = 0 - oändlighet μm2; cirkularitet = 0,00 - 1,00; visa = konturer. d)Partikelkontur skapad som en produktion av partikelanalys iC. Partikelkonturen i (D) bör jämföras med den ursprungliga bilden (A) för att säkerställa att alla celler fångades i partikelanalysen. e)Resultattabell skapad som en utgång från partikelanalys i (C). Objektnummer (kolumn 1) motsvarar enskilda partiklar (en eller flera celler) som beskrivs och märks med rött på panelen (D). Etikett = filnamn på analyserad bild; Yta = total partikelareal i μm2. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Ta prov på uppgifter för att bedöma om målstammen hämmas. Procenten av det ursprungliga området vid de sista tidpunkterna för målstammen (A) och inhibitorstammen (B), vid olika initiala celltätheter. Bildtätheten anger antingen en startcellstäthet som är trång (hög cellkontakt mellan stammar) eller mer spridning (låg cellkontakt mellan stammar) enligt beskrivningen i figur 2. Inhibitor genotyp indikerar att antingen en vild typ eller T6SS mutant (T6SS-) stam myntades med målstammen. Asterisker indikerar en betydande skillnad i % förändring jämfört med alla behandlingar (enkelvägs ANOVA följt av en Tukeys flera jämförelsetest som jämför alla behandlingar; p< 0.0001). Streckad linje indikerar ingen nettoförändring i belastningsområdet mellan den ursprungliga och sista tidsgränsen. En förändring i % > 100 tyder på nettoökning (dvs. tillväxt) och % förändring < 100 tyder på nettominskning (dvs. celldöd). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Protokollet som beskrivs ovan ger ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera och karakterisera interbacterial konkurrens på encellsnivå. Denna analys, som utvecklades genom att modifiera vår CFU-baserade konkurrensanalys påagarplattor 1,2, tillät visualisering av encellskonkurrens bland V. fischeri-isolat och förslag tillhandahålls för att optimera metoden för ett brett spektrum av system och mikroskopiinställningar. Även om metoden som beskrivs här var optimerad för ljusorgan symbiont V. fischeri, kan den lätt modifieras för att rymma många olika, odlingsbara mikrober. Det är viktigt att notera att konkurrenskraftiga mekanismer kan regleras av valfritt antal miljövariabler, inklusive temperatur, salthalt och viskositet30,31,32,33,34. Tidigare arbete har bekräftat att V. fischeri tävlar med hjälp av ett kontaktberoende typ VI-utsöndringssystem som är aktivt påytor 30, vilket gör de villkor som beskrivs i denna analys lämpliga för att studera konkurrens mellan exempelstammarna. Det är också viktigt att överväga den ursprungliga densiteten hos celler på glidningen när man kvantifierar bakteriekonkurrens. Med tanke på att kontakt mellan mål- och hämmarceller ofta krävs för att dödande bör den blandade kulturen koncentreras så att cellcellskontakten maximeras och cellerna förblir i ett enda plan på bilden. Cellkulturer bör odlas till en liknande optisk densitet (mitten av loggfasen) och sedan koncentreras för att tvinga kontakt snarare än att bara växa kulturer till en högre optisk densitet på grund av de fysiologiska förändringarna av celler i olika tillväxtfaser. I andra system kan odlingsförhållanden och försöksinställningar behöva ändras för att säkerställa att konkurrensmekanismen är aktiv och kan detekteras i myntkubationstillstånd.
Agarose pads som används i denna analys ger flera fördelar: de ger stabilisering så att celler inte rör sig fritt, och de hindrar kulturen från att torka ut under experimentet. Dessutom, om kemiska inducerare, såsom isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), krävs för experimentet, kan de enkelt läggas till agaroslösningen. Det är dock viktigt att notera att agaroseberedningen sannolikt kommer att behöva justeras för olika system. I exemplet som beskrivs ovan, agarose pad förbereddes genom att lösa upp 2% agarose (w/v) i 20 psu mPBS, vilket är standard salthalt som används i V. fischeri tillväxt medium. Dessutom kan i vissa fall en kolkälla behöva läggas till agarosplattan för att cellerna ska kunna växa och konkurrera om längre experiment. I sådana fall kan mPBS i agarose pads ersättas med något tillväxtmedium, även om näringsämnena i tillväxtmedium kan komma med kompromissen av ytterligare bakgrund fluorescens.
Utan egenutvecklad bildanalysprogramvara kan det vara mycket svårt att få enskilda cellantal när cellcellskontakten är hög, vilket som vi visar här krävs för att observera kontaktberoende dödande. Denna analys utformades för att tillhandahålla en alternativ metod för kvantifiering som inte förlitar sig på enskilda cellantal. Istället används den totala cellytan för varje fluorescenskanal för att kvantifiera omfattningen av avlivning mellan myntkuberade stammar. Eftersom den här metoden förlitar sig på områdes- snarare än enskilda cellantal är standardtröskelinställningar vanligtvis tillräckliga för att beskriva det totala cellområdet. Tröskelvärdets noggrannhet kan verifieras genom att dividera den totala objektytan för ett representativt synfält med den genomsnittliga cellstorleken för modellorganismen och jämföra detta uppskattade cellnummer med ett manuellt cellantal för samma bild.
I coincubations mellan en hämmare och en mål (icke-mördare) stam, nettotillväxt av inhibitoren förutspås. Som ses i figur 4kan inhibitortillväxten vara betydligt högre i behandlingar där avlivning observeras, jämfört med behandlingar där avlivning inte observeras, kanske för att näringsämnen som frigörs genom lysande målceller gör att inhibitorstammen kan växa snabbare. I exemplet som visas här observeras nettomåldöd eftersom T6SS-medierad konkurrens resulterar i målcellslys där målet fysiskt elimineras. Det är dock viktigt att notera att inte alla konkurrensmekanismer leder till fysisk eliminering av målceller. Om ett mål är oförmöget av ett toxin som orsakar tillväxthämning, kan protokollet som beskrivs här resultera i att den synliga målpopulationen förblir stabil över tiden eftersom målcellerna inte längre växer men inte heller lysar. I ett sådant fall skulle det vara lämpligt att jämföra resultaten av denna analys med uppföljningstester för målcellens livskraft, såsom plätering för kolonibildande enheter (CFUs) eller genom att utföra levande döda analyser genom färgning med propidiumid eller SYTOX grön35,36.
Jämfört med myntkubationsmedel som förlitar sig på CFU-räkningar, gör denna analys det möjligt att observera och kvantifiera den rumsliga strukturen av konkurrens mellan stammar och spårförändringar i målcellsmorfologi över tid. Till exempel är hämmarceller som dödar med hjälp av en T6SS kända för att koda LysM-domänproteiner som försämrar målcellväggen, vilket resulterar i inledande cellavrundning och sedanlysis 13, som vi observerade i exemplet som visas i figur 2A. Dessutom kan detta protokoll användas för att spåra konkurrens med hög upplösning över mycket korta tidsskalor. I exemplet som visas här observeras en betydande minskning av målområdet efter bara två timmar när celler är trångbodda och cellcellskontakt tvingas mellan stammar (figur 4). Den bildanalys som beskrivs här skulle också kunna utföras med konfokal mikroskopi, vilket skulle göra det möjligt att studera bakteriell konkurrens in vivo eller i komplexa biofilmer, utan att störa den rumsliga fördelningen av myntbuberade stammar.
Sammanfattningsvis syftar den analys som beskrivs här till att ge ett tillgängligt och lätt modifierat tillvägagångssätt för att visualisera och kvantifiera bakteriell konkurrens på encellsnivå med fluorescensmikroskopi. Denna metod kan tillämpas på olika bakterieisolat och kan användas för att visualisera bakteriell konkurrens även i komplexa miljöer som inom en värd- eller biofilmmatris.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
A.N.S stöddes av NIGMS-stipendiet R35 GM137886 och S.N.S stöddes av National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 uL single channel pipette | |||
| 1000 uL single channel pipette | |||
| 20 uL single channel pipette | |||
| 200 uL single channel pipette | |||
| Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
| Calculator | |||
| Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
| FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Razor Blades | Fisher | S65921 | |
| Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| Spectrophotometer | |||
| SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
| Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
| Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
| Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
| Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
| Vortex | |||
| Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
| mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
| 10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
| Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
| Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |
References
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (36), 8528-8537 (2018).
- Speare, L., Septer, A. N. Coincubation assay for quantifying competitive interactions between Vibrio fischeri isolates. Journal of Visualized Experiments. (149), e59759 (2019).
- Frost, I., et al. Cooperation, competition and antibiotic resistance in bacterial colonies. The ISME journal. 12 (6), 1582-1593 (2018).
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial communities: interactions to scale. Frontiers in Microbiology. 7, 1234 (2016).
- Souza, D. P., et al. Bacterial killing via a type IV secretion system. Nature Communications. 6 (1), 1-9 (2015).
- Anderson, M. C., Vonaesch, P., Saffarian, A., Marteyn, B. S., Sansonetti, P. J. Shigella sonnei encodes a functional T6SS used for interbacterial competition and niche occupancy. Cell Host and Microbe. 21 (6), 769-776 (2017).
- Basler, M., Ho, B., Mekalanos, J. Tit-for-tat: Type VI secretion system counterattack during bacterial cell-cell interactions. Cell. 152 (4), 884-894 (2013).
- Guillemette, R., Ushijima, B., Jalan, M., Häse, C. C., Azam, F. Insight into the resilience and susceptibility of marine bacteria to T6SS attack by Vibrio cholerae and Vibrio coralliilyticus. PloS One. 15 (1), 0227864 (2020).
- Hachani, A., Lossi, N. S., Filloux, A. A visual assay to monitor T6SS-mediated bacterial competition. Journal of Visualized Experiments. (73), e50103 (2013).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Ruhe, Z. C., Low, D. A., Hayes, C. S. Bacterial contact-dependent growth inhibition. Trends in Microbiology. 21 (5), 230-237 (2013).
- Wood, D. W., Pierson, L. S. The phzI gene of Pseudomonas aureofaciens 30-84 is responsible for the production of a diffusible signal required for phenazine antibiotic production. Gene. 168 (1), 49-53 (1996).
- Smith, W. P., et al. The evolution of the type VI secretion system as a disintegration weapon. PLoS Biology. 18 (5), 3000720 (2020).
- Chen, L., Zou, Y., She, P., Wu, Y. Composition, function, and regulation of T6SS in Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research. 172, 19-25 (2015).
- Sana, T. G., Lugo, K. A., Monack, D. M. T6SS: The bacterial "fight club" in the host gut. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006325 (2017).
- Basler, M. Type VI secretion system: secretion by a contractile nanomachine. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1679), 20150021 (2015).
- Joshi, A., et al. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in Microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 589-600 (2016).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of Bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Septer, A. N. The Vibrio-squid symbiosis as a model for studying interbacterial competition. Msystems. 4 (3), (2019).
- Tischler, A. H., Hodge-Hanson, K. M., Visick, K. L. Vibrio fischeri-squid symbiosis. eLS. , 1-9 (2019).
- Mandel, M. J., Dunn, A. K. Impact and influence of the natural Vibrio-squid symbiosis in understanding bacterial-animal interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1982 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Boettcher, K., Ruby, E. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna Scolopes. Journal of Bacteriology. 172 (7), 3701-3706 (1990).
- Doino, J. A., McFall-Ngai, M. J. A transient exposure to symbiosis-competent bacteria induces light organ morphogenesis in the host squid. The Biological Bulletin. 189 (3), 347-355 (1995).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environmental Microbiology. 6 (7), 726-732 (2004).
- Koch, B., Jensen, L. E., Nybroe, O. A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. Journal of Microbiological Methods. 45 (3), 187-195 (2001).
- Peterson, B. W., Sharma, P. K., Van Der Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial cell surface damage due to centrifugal compaction. Applied and Environmental Microbiology. 78 (1), 120-125 (2012).
- Speare, L., Smith, S., Salvato, F., Kleiner, M., Septer, A. N. Environmental viscosity modulates interbacterial killing during habitat transition. MBio. 11 (1), (2020).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), 61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (34), 5044-5051 (2016).
- Bachmann, V., et al. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (8), 0004031 (2015).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and Immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15 (1), 36 (2015).
