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Bioengineering

सेल मुक्त ऑटोइंडक्शन वर्कफ़्लो का उपयोग कर 24 घंटे के भीतर सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण के लिए कोशिकाओं से

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

यह काम एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) से सेल निकालने की तैयारी का वर्णन करता है, इसके बाद 24 घंटे से कम समय में सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रतिक्रियाएं होती हैं। सेल मुक्त ऑटोइंडक्शन (सीएफएआई) प्रोटोकॉल का स्पष्टीकरण शोधकर्ता निरीक्षण को कम करने और प्राप्त सेल निकालने की मात्रा में वृद्धि करने के लिए किए गए सुधारों का विवरण देता है।

Abstract

सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) एक जैव प्रौद्योगिकी मंच के रूप में विकसित हुआ है जो इन विट्रो में प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी को कैप्चर करता है। कई विकासों ने सीएफपीएस प्लेटफॉर्म को नए उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ बना दिया है और अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार किया है। लाइसेट आधारित सीएफपीएस सिस्टम के लिए, सेल अर्क को विभिन्न जीवों से उत्पन्न किया जा सकता है, प्रोटीन संश्लेषण को बढ़ाने के लिए उस मेजबान की अद्वितीय जैव रसायन का उपयोग करना। पिछले 20 वर्षों के भीतर, एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) अपनी सामर्थ्य और बहुमुखी प्रतिभा के कारण सीएफपीएस का समर्थन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले जीवों में से एक बन गया है। कई प्रमुख प्रगति के बावजूद, ई कोलाई सेल निकालने की तैयारी के लिए वर्कफ़्लो नए उपयोगकर्ताओं के लिए अपने अनुप्रयोगों के लिए सीएफपीएस को लागू करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। निकालने की तैयारी वर्कफ़्लो समय-गहन है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने पहले 24 घंटे के सेल-फ्री ऑटोइंडक्शन (सीएफएआई) वर्कफ़्लो के विकास की सूचना दी थी जो उपयोगकर्ता इनपुट और आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता को कम करता है। सीएफएआई वर्कफ़्लो सेल अर्क उत्पन्न करने के लिए आवश्यक श्रम और तकनीकी कौशल को कम करता है जबकि प्राप्त सेल अर्क की कुल मात्रा में भी वृद्धि करता है। यहां हम उस वर्कफ़्लो का वर्णन चरण-दर-चरण तरीके से करते हैं ताकि ई कोलाई आधारित सीएफपीएस के व्यापक कार्यान्वयन तक पहुंच में सुधार और समर्थन किया जा सके।

Introduction

जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) का उपयोग पिछले कुछ वर्षों में 1,2,3 में काफी वृद्धि हुई है। इस विकास को सीएफपीएस में होने वाली प्रक्रियाओं और प्रत्येक घटक 4,5 की भूमिका को समझने में बढ़े हुए प्रयासों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, अनुकूलित सेट-अप और वैकल्पिक ऊर्जा स्रोतों के लिए जिम्मेदार कम लागत ने नए उपयोगकर्ताओं 6,7,8,9 के लिए सेल-मुक्त तकनीक को लागू करना आसान बना दिया है। प्रोटीन संश्लेषण के लिए आवश्यक प्रतिलेखन और अनुवाद कारकों को लागू करने के लिए, सेल निकालने का उपयोग अक्सर सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं10 को चलाने के लिए किया जाता है। हाल ही में प्रकाशित उपयोगकर्ता मार्गदर्शिकाओं ने कार्यात्मक निकालने के उत्पादन के लिए सरल प्रोटोकॉल प्रदान किए हैं, जिससे नए और अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए समान रूप से 1,11,12,13,14 को लागू करना आसान हो गया है। सेल निकालने को आमतौर पर एक सेल संस्कृति के लाइसिस के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, जिसे विशिष्ट उपयोग वांछित 1,15,16 के आधार पर विभिन्नजीवों का उपयोग करके उगाया जा सकता है।

एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) तेजी से कार्यात्मक अर्क17 के उत्पादन के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले मेजबान जीवों में से एक बन गया है। बीएल 21 स्टार (डीई 3) तनाव को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि यह बाहरी झिल्ली (ओएमपीटी प्रोटीज) और साइटोप्लाज्म (लोन प्रोटीज) से प्रोटीज को हटा देता है, जो पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, डीई 3 में λDE3 होता है जो लैकयूवी 5 प्रमोटर के नियंत्रण में टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ (टी 7 आरएनएपी) के लिए जीन को वहन करता है; स्टार घटक में एक उत्परिवर्तित आरएनएएसईई जीन होता है जो एमआरएनए 4,14,18,19 के दरार को रोकता है। लैकयूवी 5 प्रमोटर के तहत, आइसोप्रोपाइल-थियोगैलेक्टोपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) प्रेरण टी 7 आरएनएपी20,21 की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। इन उपभेदों का उपयोग कोशिकाओं को विकसित करने और फसल करने के लिए किया जाता है, जो निकालने की तैयारी के लिए कच्चा माल देते हैं। सेल लिसिस को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें मनका पिटाई, फ्रांसीसी प्रेस, समरूपता, सोनिकेशन और नाइट्रोजन गुहिकायन 1,11,12,22 शामिल हैं।

ई कोलाई का उपयोग करते समय बैक्टीरियल संस्कृति और कटाई की प्रक्रिया अधिकांश प्लेटफार्मों में सुसंगत है, लेकिन कई दिनों और गहन शोधकर्ता निरीक्षण 1,11,13 की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया आम तौर पर एलबी शोरबा में रात भर की बीज संस्कृति के साथ शुरू होती है, जो रात भर के विकास पर अगले दिन 2xYTPG (खमीर, ट्रिप्टोन, फॉस्फेट बफर, ग्लूकोज) की एक बड़ी संस्कृति में टीका लगाया जाता है। इस बड़ी संस्कृति के विकास की निगरानी तब तक की जाती है जब तक कि यह 2.514,20 के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) पर शुरुआती-से-मध्य लॉग चरण तक नहीं पहुंच जाता है। निरंतर माप की आवश्यकता होती है क्योंकि प्रतिलेखन और अनुवाद के घटकों को पहले प्रारंभिक-से-मध्य लॉग चरण23,24 में अत्यधिक सक्रिय होने के लिए प्रदर्शित किया गया है। हालांकि यह प्रक्रिया प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निकालने का निर्माण कर सकती है, हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में सेल-फ्री ऑटोइंडक्शन (सीएफएआई) मीडिया का उपयोग करके एक नई विधि विकसित की है, जो शोधकर्ता निरीक्षण को कम करती है, सेल संस्कृति के किसी दिए गए लीटर के लिए निकालने की समग्र उपज को बढ़ाती है, और अनुभवी और नए दोनों उपयोगकर्ताओं के लिए ई कोलाई-आधारित निकालने की तैयारी तक पहुंच में सुधार करती है (चित्रा 1) ). यहां हम सीएफएआई वर्कफ़्लो को लागू करने के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं, कोशिकाओं की एक लकीर वाली प्लेट से 24 घंटों के भीतर एक पूर्ण सीएफपीएस प्रतिक्रिया में जाने के लिए।

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Protocol

1. मीडिया विकास

  1. तालिका 1 में वर्णित सीएफएआई मीडिया के 960 एमएल तैयार करें और कोह का उपयोग करके पीएच को 7.2 में समायोजित करें।
  2. 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2.5 एल चकित फ्लास्क और आटोक्लेव में संस्कृति मीडिया स्थानांतरण।
  3. तालिका 1 में वर्णित 40 मिलीलीटर चीनी समाधान तैयार करें। फ़िल्टर-एक अलग आटोक्लेव ग्लास कंटेनर में समाधान को निष्फल करें।
    नोट: चीनी समाधान को आगे के उपयोग तक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. ऑटोक्लेविंग के बाद मीडिया को 40 डिग्री सेल्सियस से नीचे पूरी तरह से ठंडा करने की अनुमति दें।
  5. सीएफएआई मीडिया के टीकाकरण से पहले, चीनी समाधान को सीधे सीएफएआई मीडिया में जोड़ें।
  6. मीडिया को टीका लगाने के लिए, पहले से लकीर वाले ई कोलाई बीएल 21 स्टार (डीई 3) प्लेट से कालोनियों का एक लूपफुल स्वाइप करें और सीधे मीडिया में डालें। लूप को मीडिया में घुमाएं लेकिन कंटेनर के किनारों को छूने से बचें। सुनिश्चित करें कि लकीर प्लेट ताजा है, व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ।
  7. 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में टीका लगाए गए मीडिया के साथ फ्लास्क रखें। संस्कृति को रातोंरात बढ़ने दें। यदि कोशिकाओं को शाम को टीका लगाया जाता है, तो संस्कृति एक अनुमानित ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंच जाएगी, जिसे बाद की सुबह 10 के600 एनएम (ओडी 600) पर मापा जाता है। इनोक्यूलेशन और फसल के समय को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है।

2. सेल फसल

  1. एस 30 बफर को पहले से तैयार करें और इसे ठंडा रखें। तालिका 2 के अनुसार एस 30 बफर तैयार करें, 8.2 के अंतिम पीएच के लिए।
    नोट: एस 30 बफर सेल फसल से पहले दिन तैयार किया जा सकता है। यदि ऐसा किया जाता है, तो डिथियोथ्रिटोल के बिना तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने से ठीक पहले डिथियोथ्रेइटोल जोड़ें।
  2. इस बिंदु से आगे, बर्फ पर सभी समाधान और सामग्री रखें। 10 मिनट के लिए 4-10 डिग्री सेल्सियस के बीच 5,000 एक्स जी पर 1 एल अपकेंद्रित्र बोतल और अपकेंद्रित्र में मीडिया के 1 एल स्थानांतरण। decant और सतह पर तैरनेवाला का निपटान। एक बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके, गोली को पूर्व-ठंडा और पहले वजन 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. बर्फ पर आराम की अवधि के साथ 30 एस फटने में भंवर के माध्यम से गोली को फिर से निलंबित करके ठंडे एस 30 बफर के 30-40 एमएल के साथ एक बार धो लें।
    नोट: गोली की एक उच्च मात्रा के कारण, सेल गोली को दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करना धोने के चरण के लिए सहायक हो सकता है। छोटे एलिकोट में कोशिकाओं को संग्रहीत करना भी डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए लचीलापन प्रदान करता है।
  4. 10 मिनट के लिए 4-10 डिग्री सेल्सियस के बीच 5000 एक्स जी पर सेल रिसस्पेंशन को अपकेंद्रित्र करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला का निपटान करें और एक साफ ऊतक का उपयोग करके 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब की अंदर की दीवारों से किसी भी अतिरिक्त को पोंछ लें, गोली को छूने से बचें। वजन और फ्लैश तरल नाइट्रोजन में गोली फ्रीज। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यदि उपयोगकर्ता निकालने की तैयारी प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने की योजना बना रहा है तो छर्रों को फ्लैश-फ्रीजिंग की आवश्यकता नहीं हो सकती है।

3. तैयारी निकालें

  1. सेल गोली के हर 1 ग्राम के लिए एस 30 बफर के 1 एमएल के साथ जमे हुए गोली को मिलाएं और लगभग 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर पिघलना अनुमति दें। बर्फ पर आराम की अवधि के साथ 30 एस के फटने में भंवर के माध्यम से फिर से निलंबित गोली पिघला हुआ। भंवर जब तक कि शेष कोशिकाओं के कोई दृश्यमान झुरमुट नहीं होते हैं।
    नोट: एक विंदुक का उपयोग करके मिश्रण करके छोटे झुरमुट को फिर से निलंबित किया जा सकता है।
  2. सेल लिसिस के लिए 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में सेल रिसस्पेंशन के 1.4 एमएल के एलिकोट्स को स्थानांतरित करें। 45 एस के तीन फटने के लिए 20 किलोहर्ट्ज़ और 50% आयाम की आवृत्ति के साथ प्रत्येक ट्यूब को सोनिकेट करें, जिसमें बर्फ स्नान से घिरे चक्र प्रति चक्र 59 एस आराम होता है। चक्रों के बीच ट्यूब को उलटें और तुरंत अंतिम सोनिकेशन चक्र के बाद 1 एम डिथियोथ्रिटोल के 4.5 μL जोड़ें।
    नोट: सोनिकेशन से जारी गर्मी के कारण, यह सुनिश्चित करना बेहद महत्वपूर्ण है कि सोनिकेटेड नहीं होने पर सभी एलिकोट्स को बर्फ पर रखा जाता है। बर्फ स्नान को पूरी सोनिकेशन प्रक्रिया के दौरान ठंडा रहने के लिए लगातार फिर से भर दिया जाना चाहिए या काफी बड़ा होना चाहिए।
  3. 10 मिनट के लिए 18,000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला और विभाज्य को 600 μL एलिकोट में 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में पुनः प्राप्त करें। फ्लैश फ्रीज एलिकोट और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। देखभाल केवल सतह पर तैरनेवाला विंदुक करने के लिए लिया जाना चाहिए।

4. सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण

  1. क्वाड्रुप्लिकेट में 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के 15 μL प्रदर्शन करने के लिए पिछले चरण से निकालने का एक विभाज्य पिघलना।
  2. एमएल अंतिम एकाग्रता), समाधान ए के 2.20 μL, समाधान बी के 2.10 μL, निकालने के 5.0 μL, और 15 μL की प्रतिक्रिया को भरने के लिए आणविक ग्रेड पानी की एक अलग मात्रा के संयोजन से प्रत्येक प्रतिक्रिया तैयार करें। इस प्रतिक्रिया को उच्च मात्रा में बढ़ाया जा सकता है। अनुपात के लिए तालिका 3 देखें।
    1. तालिका 4 के अनुसार समाधान ए और बी तैयार करें। प्रत्येक समाधान को 100 μL से 1 एमएल के बैचों में तैयार किया जा सकता है, विभाज्य, और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: ब्याज के प्रोटीन के आधार पर डीएनए राशि भिन्न हो सकती है। इस मामले में, इस्तेमाल किए गए प्लाज्मिड, पीजेएल 1-एसएफजीएफपी को 16 μg / एमएल, या 597 μM पर प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
  3. प्रतिक्रियाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे तक चलने दें।

5. रिपोर्टर प्रोटीन, सुपर फ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एसएफजीएफपी) की मात्रा का ठहराव

  1. आधे क्षेत्र 96-अच्छी तरह से काले पॉलीस्टीरिन प्लेट का उपयोग करके, पीएच 7.2 पर 0.05 एम एचईपीईएस बफर के 48 μL के साथ प्रत्येक सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रिया उत्पाद के 2 μL को मिलाएं। प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के तीन से चार प्रतिकृति की सिफारिश की जाती है।
  2. 485 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 528 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एसएफजीएफपी की प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  3. एमएल) के सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूपांतरण के लिए, शुद्ध पीजेएल 1-एसएफजीएफपी का उपयोग करके एक मानक वक्र स्थापित करें।

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Representative Results

सीएफएआई मीडिया तैयार करते समय, मीडिया में मुख्य ऊर्जा सब्सट्रेट के रूप में लैक्टोज और ग्लिसरॉल में वृद्धि के लिए ग्लूकोज का आदान-प्रदान किया गया था। इसके अतिरिक्त, सीएफएआई मीडिया की बफरिंग क्षमता में भी वृद्धि की गई थी। ये विशिष्ट घटक तालिका 1 में दिए गए हैं।

कोशिकाओं को तब अलग-अलग निकालने की मात्रा के बावजूद निकालने की गुणवत्ता के साथ स्थिरता दिखाने के लिए सीएफएआई मीडिया में 10 के ओडी600 और मानक 2.5 दोनों के लिए उगाया गया था। 2.5 आयुध डिपो 600 सीएफएआई मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस,200 आरपीएम पर एलबी शोरबा में एक बीज संस्कृति से टीका लगाने के बाद उगाया गया था, जबकिआयुध डिपो 600 10 संस्कृति को सीधे एक प्लेट से टीका लगाया गया था। सीएफएआई मीडिया के प्रत्येक बैच की निगरानी की गई और उनके संबंधित ओडी600 पर काटा गया। 10 के आयुध डिपो600 के विकास ने सेल गोली और समग्र निकालने की उच्च मात्रा में वृद्धि का नेतृत्व किया, क्योंकि यह 2.5 आयुध डिपो 600 (चित्रा 2) के विकास से प्राप्त निकालने के 2.10 एमएल बनाम निकालने के9.60 एमएल का उत्पादन करता है। कुल प्रोटीन एकाग्रता के आगे के विश्लेषण ने प्रत्येक निकालने (तालिका 5) में समग्र प्रोटीन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। भले ही वे ऑप्टिकल घनत्व के विभिन्न स्तरों के लिए उगाए गए थे, निकालने के दोनों बैचों ने एसएफजीएफपी (चित्रा 3) का उपयोग करके सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं में समान परिणामों का प्रदर्शन किया। इससे पता चलता है कि बढ़ी हुई बफरिंग क्षमता का संयोजन, मुख्य कार्बन स्रोत के रूप में लैक्टोज और ग्लिसरॉल का उपयोग और टी 7 आरएनएपी प्रेरण के लिए आईपीटीजी के बजाय लैक्टोज को लागू करने से 10 से नीचे किसी भी ओडी600 के लिए निकालने के विकास को स्थिर करने में मदद मिलती है।

आटोक्लेव सीएफएआई मीडिया:
घटक राशि
सोडियम क्लोराइड 5.0 ग्राम
Tryptone 20.0 ग्राम
खमीर निकालें 5.0 ग्राम
पोटेशियम फॉस्फेट, मोनोबेसिक 6.0 ग्राम
पोटेशियम फॉस्फेट, डाइबेसिक 14.0 ग्राम
नैनोप्योरटीएम पानी कुल 960 एमएल तक भरें
फ़िल्टर निष्फल चीनी समाधान:
घटक राशि
डी-ग्लूकोज 0.50 ग्राम
डी-लैक्टोज 4.0 ग्राम
80% v/v ग्लिसरॉल 7.5 एमएल
नैनोप्योरटीएम पानी 28.0 एमएल

तालिका 1: सीएफएआई घटक। सीएफएआई मीडिया और चीनी समाधान के लिए घटक उनकी संबंधित मात्रा के साथ। मीडिया को प्रत्येक घटक के अलावा और चीनी समाधान फ़िल्टर निष्फल होने के दौरान उभारा जाना चाहिए। प्रत्येक समाधान को टीकाकरण से पहले एक अलग बाँझ कंटेनर में जोड़ा जाना चाहिए।

S30 बफ़र
घटक एकाग्रता
कमरे के तापमान पर ट्रिस एसीटेट पीएच 8.2 10 mM
मैग्नीशियम एसीटेट 14 mM
पोटेशियम एसीटेट 60 mM
Dithiothreitol 2 mM

तालिका 2: S30 बफ़र घटक: एस 30 बफर के लिए घटकों को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में उनकी संबंधित मात्रा के साथ जोड़ा गया था।

घटक राशि
समाधान A 2.20 μL
समाधान B 2.1 μL
निकालना 5 μL
डीएनए टेम्पलेट 16 μg/mL अंतिम के लिए आयतन
पानी कुल 15 μL को भरें

तालिका 3: सीएफपीएस प्रतिक्रिया अनुपात: समाधान ए, समाधान बी और निकालने के लिए सापेक्ष मात्रा प्रतिशत। डीएनए की मात्रा विशिष्ट प्लाज्मिड की एकाग्रता के आधार पर भिन्न हो सकती है और उपयोग किए जा रहे उपयोगकर्ता के विशिष्ट प्लाज्मिड के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

समाधान A समाधान B
घटक एकाग्रता घटक एकाग्रता
एटीपी 1.2 mM मैग्नीशियम ग्लूटामेट 10 mM
जीटीपी 0.850 m MM अमोनियम ग्लूटामेट 10 mM
यूटीपी 0.850 m MM पोटेशियम ग्लूटामेट 130 mM
सीटीपी 0.850 m MM फॉस्फोएनॉलपाइरूवेट (पीईपी) 30 mM
फोलिक एसिड 31.50 μg/mL L-Valine 2 mM
टीआरएनए 170.60 μg/mL एल-ट्रिप्टोफैन 2 mM
निकोटिनामाइड एडेनिन डिन्यूक्लियोटाइड (एनएडी) 0.40 m M एल-आइसोल्यूसीन 2 mM
Coenzyme A 0.27 m M एल-ल्यूसीन 2 mM
ऑक्सीलिक एसिड 4.00 m M एल-सिस्टीन 2 mM
Putrescine 1.00 mM एल-मेथियोनीन 2 mM
स्पर्मिडीन 1.50 m M एल-अलैनिन 2 mM
एचईपीईएस बफर पीएच 7.5 57.33 m M M एल-आर्जिनिन 2 mM
एल-शतावरी 2 mM
एल-एस्पार्टिक एसिड 2 mM
एल-ग्लूटामिक एसिड 2 mM
एल-ग्लाइसिन 2 mM
एल-ग्लूटामाइन 2 mM
एल-हिस्टिडाइन 2 mM
एल-लाइसिन 2 mM
एल-प्रोलाइन 2 mM
एल-सेरीन 2 mM
एल-थ्रेओनिन 2 mM
एल-फेनिलएलनिन 2 mM
एल-टायरोसिन 2 mM

तालिका 4: समाधान ए और बी घटक। समाधान ए और बी के लिए घटकों के लिए स्टॉक सांद्रता को उनकी संबंधित मात्रा के साथ जोड़ा गया था, प्रत्येक 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में।

निकालना कुल प्रोटीन एकाग्रता (μg / मानक विचलन
2xYTPG 2.5 OD 30617 3745
सीएफएआई 2.5 OD 30895 2254
CFAI 10.0 OD 27905 3582

तालिका 5: कुल निकालने प्रोटीन पैदावार। विभिन्न सेल निकालने के विकास के कुल प्रोटीन का विश्लेषण। कुल प्रोटीन एकाग्रता एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। प्रत्येक एकाग्रता एक 1:40 कमजोर पड़ने का उपयोग कर तीन प्रतियों से निर्धारित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: सीएफएआई की तुलना और कोशिकाओं से सीएफपीएस तक विशिष्ट वर्कफ़्लो: (ए) सीएफएआई वर्कफ़्लो (बाएं, लाल) बनाम (बी) पहले से स्थापित विधि (हरा, दाएं) का उपयोग करके कोशिकाओं से सीएफपीएस तक समग्र समयरेखा की तुलना। सीएफएआई वर्कफ़्लो का उपयोग करके सीएफपीएस करते समय तुलना कम शोधकर्ता निरीक्षण और समयरेखा को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीएफएआई गोली आकार की तुलना। विभिन्न आयुध डिपो600 पर सेल फसल के बाद सीएफएआई मीडिया छर्रों की तुलना। 2.5 के ओडी600 में उगाए गए मीडिया ने 2.23 ग्राम सेल गोली (बाएं) का उत्पादन किया और10 के ओडी 600 में उगाए गए मीडिया ने 9.49 ग्राम सेल गोली (दाएं) का उत्पादन किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीएफपीएस प्रतिक्रिया पैदावार पर विकास के प्रभाव (ए) 2.5 ओडी600 और 10 ओडी 600 के विकास के बीच सीएफपीएस प्रतिक्रिया पैदावार की तुलना, (बी) प्रत्येक सीएफपीएस प्रतिक्रिया की छवियों के साथ उनकी संबंधित उपज के ऊपर। सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं को 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में किया गया था और एसएफजीएफपी एकाग्रता के लिए प्रतिदीप्ति को सहसंबंधित करने के लिए एक मानक वक्र का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद मात्रा निर्धारित की गई थी। "नकारात्मक" नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के सेट से मेल खाती है जिसमें कोई टेम्पलेट डीएनए नहीं जोड़ा गया था। पारंपरिक 2xYTPG मीडिया (सकारात्मक नियंत्रण) और CFAI अर्क समान गुणवत्ता के हैं जैसा कि उनके उच्च सीएफपीएस पैदावार के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

शोधकर्ता निरीक्षण पारंपरिक रूप से सेल विकास के दौरान दो प्रमुख कार्यों के लिए आवश्यक है: टी 7 आरएनएपी का प्रेरण और एक विशिष्टआयुध डिपो 600 पर कोशिकाओं की कटाई। सीएफएआई उच्च गुणवत्ता वाले सेल अर्क तैयार करने के लिए आवश्यक शोधकर्ता के समय और तकनीकी प्रशिक्षण को कम करने के लिए उन दोनों आवश्यकताओं को समाप्त करता है। टी 7 आरएनएपी का ऑटो-प्रेरण मीडिया में प्राथमिक चीनी के रूप में लैक्टोज के साथ ग्लूकोज को बदलकर प्राप्त किया जाता है, जिससे विकास की सक्रिय रूप से निगरानी करने की पिछली आवश्यकता को समाप्त किया जाता है और फिर सेल विकास के दौरान एक सटीक बिंदु पर आईपीटीजी के साथ प्रेरित किया जाता है। एक विशिष्टआयुध डिपो 600 पर फसल के लिए सेल संस्कृतियों की सक्रिय रूप से निगरानी करने की आवश्यकता भी समाप्त हो जाती है, सेल संस्कृति से शोधकर्ता को खोलती है। यह हाल के काम में जोड़ता है जिसने गैर-पारंपरिक समय13,25,26 पर काटे गए गुणवत्ता वाले अर्क के उत्पादन का भी प्रदर्शन किया है। नया मीडिया फॉर्मूलेशन सक्रिय ऊर्जा चयापचय का समर्थन करने के लिए बफरिंग क्षमता और कार्बन स्रोतों में सुधार करता है, भले ही सेल संस्कृति स्थिर चरण तक पहुंचती है। उच्च आयुध डिपो600 संस्कृतियों से मजबूत सेल अर्क प्राप्त करने की क्षमता शोधकर्ता को उनकी सुविधा27 पर संस्कृतियों की कटाई करने की अनुमति देती है। हम जिस वर्कफ़्लो को पसंद करते हैं और सुझाते हैं वह शाम को संस्कृति को टीका लगाना और अगली सुबह फसल पर लौटना है।

एक उच्चआयुध डिपो 600 पर कोशिकाओं की कटाई भी निकालने की तैयारी के लिए प्राप्त कोशिकाओं की एक काफी बड़ी मात्रा में परिणाम. अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए, यह ध्यान देने योग्य है कि सेल गोली 2xYTPG मीडिया में उगाई गई कोशिकाओं की तुलना में रंग में बहुत गहरा है, भले ही 2.5 केआयुध डिपो 600 पर काटा गया हो। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यदि पूरे सेल गोली को एक बार में संसाधित किया जा रहा है, तो सोनिकेशन के माध्यम से लाइसिस करते समय प्रति सेल गोली प्राप्त बड़ी मात्रा में पुन: निलंबन में कुछ समय लगेगा। इसलिए, इस प्रक्रिया11,13,14 के दौरान सभी एलिकोट को ठंडा रखना महत्वपूर्ण है। प्रति वृद्धि निकालने की मात्रा में वृद्धि आनुपातिक रूप से लागत को कम करती है और बायोमैनुफैक्चरिंग अनुप्रयोगों का समर्थन करती है। प्रदर्शन किए गए सुधारों के साथ, सीएफएआई वर्कफ़्लो सेल-फ्री तकनीक के नए और अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, कार्यात्मक ई कोलाई निकालने का उत्पादन करने के लिए एक आसान प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

प्रदान किए गए सीएफएआई मीडिया के फायदों के बावजूद, इस विधि की सीमाएं हैं। प्राथमिक चुनौती वर्कफ़्लो की नवजात प्रकृति है। जबकि मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण ने सीएफएआई ओडी600 10 अर्क के साथ-साथ 2एक्सवाईटीपीजी की तुलना में प्रतिक्रिया उत्पादों में अंतर पर प्रकाश डाला है, विशिष्ट अनुप्रयोगों पर इन मतभेदों के निहितार्थ27 अपरिवर्तित रहते हैं। इसके अतिरिक्त, यह वर्कफ़्लो बीएल 21 ई कोलाई-आधारित लाइसेट के लिए विकसित किया गया है। यह स्पष्ट नहीं है कि क्या मीडिया पुनर्निर्माण अन्य ई कोलाई उपभेदों से मजबूत निकालने की तैयारी का समर्थन करेगा, जैसे कि ई कोलाई28,29 के जीनोमिक रूप से पुन: कोडित उपभेद। यह संभव है कि सीएफएआई दृष्टिकोण का उपयोग अन्य जीवाणु जीवों से अर्क उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन चीनी हैम्स्टर अंडाशय या खरगोश रेटिकुलोसाइट जैसे यूकेरियोटिक जीवों के लिए निकालने की तैयारी का समर्थन करने की संभावना नहीं है; हालांकि, इनके पास अपने स्वयं के स्थापित तरीके30,31 हैं। हम आशा करते हैं कि सीएफएआई वर्कफ़्लो की सादगी बाधाओं को कम करेगी और सेल-मुक्त समुदाय को सीएफपीएस का समर्थन करने वाले अनुप्रयोगों की व्यापक श्रृंखला के लिए इसकी उपयोगिता को चिह्नित करने और मूल्यांकन करने के लिए प्रोत्साहित करेगी।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास ब्याज का कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखक तकनीकी सहायता के लिए डॉ जेनिफर वेंडरकेलेन और एंड्रिया लॉबशर को स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक निकोल ग्रेगोरियो, मैक्स लेविन, एलिसा मुलिन, ब्यूंगचियोल सो, अगस्त ब्रुकवेल, एलिजाबेथ (लिज़ी) वोजवोडा, लोगान बरिंगटन और जिलियन कासमैन को उपयोगी चर्चाओं के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक बिल और लिंडा फ्रॉस्ट फंड, जैव प्रौद्योगिकी के शेवरॉन बायोटेक्नोलॉजी एप्लाइड रिसर्च एंडोमेंट ग्रांट, कैल पॉली रिसर्च, स्कॉलरली और नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ -1708919) में अनुप्रयोगों के लिए केंद्र से वित्त पोषण समर्थन भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 173

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

सेल मुक्त ऑटोइंडक्शन वर्कफ़्लो का उपयोग कर 24 घंटे के भीतर सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण के लिए कोशिकाओं से
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Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, … More

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

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