Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fra celler til cellefri proteinsyntese innen 24 timer ved hjelp av cellefri arbeidsflyt for autoinduksjon

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

Dette arbeidet beskriver fremstillingen av celleekstrakt fra Escherichia coli (E. coli) etterfulgt av cellefrie proteinsyntesereaksjoner (CFPS) på under 24 timer. Forklaring av den cellefrie autoinduksjonsprotokollen (CFAI) beskriver forbedringer som er gjort for å redusere forskerens tilsyn og øke mengden celleekstrakt oppnådd.

Abstract

Cellefri proteinsyntese (CFPS) har vokst som en bioteknologisk plattform som fanger transkripsjon og oversettelsesmaskiner in vitro. Mange utviklinger har gjort CFPS-plattformen mer tilgjengelig for nye brukere og har utvidet utvalget av applikasjoner. For lysatebaserte CFPS-systemer kan celleekstrakter genereres fra en rekke organismer, og utnytte den unike biokjemien til den verten for å forsterke proteinsyntesen. I løpet av de siste 20 årene har Escherichia coli (E. coli) blitt en av de mest brukte organismene for å støtte CFPS på grunn av sin overkommelighet og allsidighet. Til tross for mange viktige fremskritt, har arbeidsflyten for E. coli-celleekstraktforberedelse forblitt en nøkkelflaskehals for nye brukere å implementere CFPS for sine applikasjoner. Arbeidsflyten for uttrekksforberedelse er tidkrevende og krever teknisk ekspertise for å oppnå reproduserbare resultater. For å overvinne disse barrierene rapporterte vi tidligere utviklingen av en 24-timers cellefri arbeidsflyt for autoinduksjon (CFAI) som reduserer brukerinndata og teknisk ekspertise som kreves. CFAI-arbeidsflyten minimerer arbeids- og tekniske ferdigheter som kreves for å generere celleekstrakter, samtidig som den øker de totale mengdene celleekstrakter som er oppnådd. Her beskriver vi denne arbeidsflyten trinnvis for å forbedre tilgangen og støtte den brede implementeringen av E. coli-basert CFPS.

Introduction

Bruken av cellefri proteinsyntese (CFPS) for bioteknologiske anvendelser har vokst betydelig de siste årene 1,2,3. Denne utviklingen kan delvis tilskrives økt innsats for å forstå prosessene som skjer i CFPS og rollen til hver komponent 4,5. I tillegg har reduserte kostnader knyttet til optimaliserte oppsett og alternative energikilder gjort cellefri teknologi enklere å implementere for nye brukere 6,7,8,9. For å implementere de nødvendige transkripsjons- og oversettelsesfaktorene for proteinsyntese, brukes celleekstrakt ofte til å drive cellefrie reaksjoner10. Nylig publiserte brukerveiledninger har gitt enkle protokoller for å produsere funksjonell ekstrakt, noe som gjør det enklere å implementere for både nye og erfarne brukere 1,11,12,13,14. Celleekstrakt oppnås vanligvis gjennom lysis av en cellekultur, som kan dyrkes ved hjelp av forskjellige organismer avhengig av ønsket bruk 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) har raskt blitt en av de mest brukte vertsorganismer for å produsere funksjonelle ekstrakter17. BL21 Star (DE3)-stammen foretrekkes fordi den fjerner proteasene fra den ytre membranen (OmpT-protease) og cytoplasma (Lon-protease), noe som gir et optimalt miljø for det rekombinante proteinuttrykket. I tillegg inneholder DE3 λDE3 som bærer genet for T7 RNA polymerase (T7 RNAP) under kontroll av lacUV5-promotoren; stjernekomponenten inneholder et mutert RNaseE-gen som forhindrer spalting av mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotoren tillater isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) induksjon uttrykket av T7 RNAP20,21. Disse stammene brukes til å vokse og høste celler, noe som gir råmateriale til ekstraktpreparat. Cellelys kan utføres ved hjelp av en rekke metoder, inkludert perleslag, fransk presse, homogenisering, sonikering og nitrogenkavitasjon 1,11,12,22.

Prosessen med bakteriekultur og høsting er konsistent på tvers av de fleste plattformer når du bruker E. coli, men krever flere dager og intens forskeroppsyn 1,11,13. Denne prosessen starter vanligvis med en over natten frøkultur i LB buljong, som ved nattvekst deretter inokulert til en større kultur på 2xYTPG (gjær, trypton, fosfatbuffer, glukose) neste dag. Veksten av denne større kulturen overvåkes til den når den tidlige til midtre loggfasen, med en optisk tetthet (OD) på 2,514,20. Konstant måling er nødvendig ettersom komponentene i transkripsjon og oversettelse tidligere har vist seg å være svært aktive i den tidlige til midtre loggfasen23,24. Selv om denne prosessen kan skape reproduserbart ekstrakt, har laboratoriet vårt nylig utviklet en ny metode ved hjelp av Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, som reduserer forskeroppsyn, øker det totale utbyttet av ekstrakt for en gitt liter cellekultur, og forbedrer tilgangen til E. coli-basert ekstraktforberedelse for både erfarne og nye brukere (figur 1 ). Her gir vi den trinnvise veiledningen for implementering av CFAI-arbeidsflyten, for å gå fra en stripet plate med celler til en fullført CFPS-reaksjon innen 24 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medievekst

  1. Forbered 960 ml CFAI-medier som beskrevet i tabell 1 , og juster pH til 7.2 ved hjelp av KOH.
  2. Overfør kulturmedier til en 2,5 l forbløffet kolbe og autoklav i 30 min ved 121 °C.
  3. Klargjør en 40 ml sukkeroppløsning som beskrevet i tabell 1. Filtrer steriliser oppløsningen i en separat autoklavert glassbeholder.
    MERK: Sukkeroppløsningen kan oppbevares i en inkubator på 30 °C til videre bruk.
  4. La mediet avkjøles helt til under 40 °C etter autoklavering.
  5. Før inokulering av CFAI-mediet, tilsett sukkerløsningen direkte til CFAI-mediet.
  6. Hvis du vil inokulere mediet, sveiper du en løkke med kolonier fra en tidligere stripet E. coli BL21 Star (DE3)-plate og setter den direkte inn i mediet. Virvle løkken inn i mediet, men unngå å berøre sidene av beholderen. Sørg for at strekplaten er frisk, med levedyktige celler.
  7. Plasser kolben med det inokulerte mediet i en 30 °C inkubator mens du rister ved 200 o/min. La kulturen vokse over natten. Hvis cellene inokuleres om kvelden, vil kulturen nå en omtrentlig optisk tetthet, målt ved 600 nm (OD600), av 10 den påfølgende morgenen. Inokulerings- og høsttider kan justeres etter behov.

2. Cellehøst

  1. Forbered S30-bufferen på forhånd og hold den kald. Klargjør S30-bufferen i henhold til tabell 2, til en endelig pH på 8,2.
    MERK: S30-bufferen kan tilberedes dager før cellehøsten. Hvis dette er gjort, forberede uten dithiothreitol og lagre ved 4 °C. Tilsett dithiothreitol rett før bruk.
  2. Fra dette tidspunktet holder du alle løsninger og materialer på is. Overfør 1 L medier til en 1 L sentrifugeflaske og sentrifuger ved 5000 x g mellom 4-10 °C i 10 minutter. Dekanter og kast supernatanten. Bruk en steril spatel, overfør pellet til et forhåndskjølt og tidligere veid 50 ml konisk rør.
  3. Vask en gang med 30-40 ml kald S30 buffer ved å resuspendere pellet via virvel i 30 s brister med hvileperioder på is.
    MERK: På grunn av et høyere volum pellets kan det være nyttig å dele cellepellet i to koniske rør på 50 ml for vasketrinnet. Lagring av celler i mindre aliquots gir også fleksibilitet for nedstrømsbehandlingen.
  4. Sentrifuger cellerefusjonen ved 5000 x g mellom 4-10 °C i 10 minutter.
  5. Kast supernatanten og tørk eventuelt overskudd fra innsiden av det koniske røret på 50 ml ved hjelp av et rent vev, unngå å berøre selve pelletsen. Vei og blits frys pelletsen i flytende nitrogen. Oppbevars ved -80 °C til videre bruk.
    MERK: Pellets krever kanskje ikke flash-frysing hvis brukeren planlegger å fortsette med ekstraktforberedelsesprotokollen.

3. Ekstrakt forberedelse

  1. Kombiner den frosne pelletsen med 1 ml S30 buffer for hver 1 g cellepellet og la den tine på is i ca. 30-60 min. Resuspend tint pellet via virveling i eksplosjoner på 30 s med hvileperioder på is. Virvel til det ikke er synlige klumper av celler igjen.
    MERK: Mindre klumper kan brukes på nytt ved å blande med en pipette.
  2. Overfør aliquots på 1,4 ml celle resuspension til 1,5 ml mikrofusjonsrør for cellelys. Soniker hvert rør med en frekvens på 20 kHz og 50% amplitude for tre utbrudd på 45 s med 59 s hvile per syklus omgitt av et isbad. Snu røret mellom sykluser og tilsett umiddelbart 4,5 μL 1 M dithiothreitol etter den siste sonikeringssyklusen.
    MERK: På grunn av varmen som frigjøres fra sonikering, er det ekstremt viktig å sørge for at alle aliquots holdes på is når de ikke blir sonikert. Isbadet skal stadig etterfylles eller være stort nok til å holde seg kjølig gjennom hele sonikeringsprosessen.
  3. Sentrifuger hvert rør ved 18 000 x g og 4 °C i 10 minutter. Hent supernatant og aliquot i 1,5 ml mikrofugerør i 600 μL aliquots. Blink fryse aliquots og lagre ved -80 °C til videre bruk. Det må kun utvises forsiktighet ved pipette supernatanten.

4. Cellefri proteinsyntese

  1. Tine en aliquot av ekstrakt fra forrige trinn for å utføre 15 μL cellefrie proteinsyntesereaksjoner i 1,5 ml mikrofugerør i firedoblet.
  2. Forbered hver reaksjon ved å kombinere 240 ng DNA (16 μg/ml endelig konsentrasjon), 2,20 μL oppløsning A, 2,10 μL oppløsning B, 5,0 μL ekstrakt og et varierende volum molekylært vann for å fylle reaksjonen på 15 μL. Denne reaksjonen kan skaleres til høyere volumer. Se tabell 3 for forhold.
    1. Klargjør løsning A og B i henhold til tabell 4. Hver løsning kan fremstilles i grupper på 100 μL til 1 ml, alisitert og lagres ved -80 °C til videre bruk.
      MERK: DNA-mengden kan variere avhengig av proteinet av interesse. I dette tilfellet har plasmidet som brukes, pJL1-sfGFP, blitt optimalisert for å utføre ved 16 μg / ml, eller 597 μM.
  3. La reaksjonene renne i minst 4 timer ved 37 °C.

5. Kvantifisering av reporterprotein, supermappe grønt fluorescerende protein (sfGFP)

  1. Bruk et halvt område 96-brønns svart polystyrenplate, kombiner 2 μL av hvert cellefrie proteinsyntesereaksjonsprodukt med 48 μL 0,05 M HEPES-buffer ved pH 7,2. Tre til fire replikeringer av hvert reaksjonsrør anbefales.
  2. Kvantifisere fluorescensintensiteten til sfGFP med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en utslippsbølgelengde på 528 nm.
  3. For konvertering av relative fluorescensenheter til volumetrisk utbytte (μg/ml) av sfGFP, etablere en standardkurve ved hjelp av renset pJL1-sfGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved tilberedning av CFAI-medier ble glukose byttet mot en økning i laktose og glyserol som det viktigste energisubstratet i media. I tillegg ble bufferkapasiteten til CFAI-mediet også økt. Disse spesifikke komponentene er gitt i tabell 1.

Cellene ble deretter dyrket til både en OD600 av 10 og standard 2.5 i CFAI-medier for å vise konsistens med ekstraktkvalitet til tross for varierende ekstraktmengder. 2,5 OD600 CFAI-mediene ble dyrket etter å ha inokulert fra en frøkultur i LB-kjøttkraft ved 37 °C, 200 o/min, mens OD600 10-kulturen ble inokulert direkte fra en tallerken. Hver gruppe CFAI-medier ble deretter overvåket og høstet på deres respektive OD600. Veksten til en OD600 av 10 førte til en økning i høyere mengde cellepellet og samlet ekstrakt oppnådd, da den produserte 9,60 ml ekstrakt versus 2,10 ml ekstrakt oppnådd fra veksten til 2,5 OD600 (figur 2). Videre analyse av total proteinkonsentrasjon viste ingen signifikant forskjell i det totale proteinet i hvert ekstrakt (tabell 5). Selv om de ble dyrket til forskjellige nivåer av optisk tetthet, viste begge ekstraktpartiene lignende resultater i cellefrie reaksjoner ved hjelp av sfGFP (figur 3). Dette antyder at kombinasjonen av økt bufferkapasitet, bruk av laktose og glyserol som hovedkarbonkilde og implementering av laktose i stedet for IPTG for T7RNAP-induksjon bidrar til å stabilisere ekstraktveksten til noen OD600 under 10.

Autoklavert CFAI-medium:
Komponenter Beløp
Natriumklorid 5,0 g
Tryptone 20,0 g
Gjærekstrakt 5,0 g
Kaliumfosfat, monobasisk 6,0 g
Kaliumfosfat, dibasisk 14,0 g
NanopureTM Vann Fyll til totalt 960 ml
Filter sterilisert sukkeroppløsning:
Komponenter Beløp
D-glukose 0,50 g
D-Laktose 4,0 g
80% v / v Glyserol 7,5 ml
NanopureTM Vann 28,0 ml

Tabell 1: CFAI-komponenter. Komponenter for CFAI-medie- og sukkerløsninger med sine respektive mengder. Mediet skal omrøres gjennom hele tilsetningen av hver komponent og sukkeroppløsningsfilteret steriliseres. Hver løsning skal legges til en separat steril beholder før inokulering.

S30-buffer
Komponenter Konsentrasjon
Tris Acetate pH 8.2 ved romtemperatur 10 mM
Magnesiumacetat 14 mM
Kaliumacetat 60 mM
Dithiothreitol 2 mM

Tabell 2: S30-bufferkomponenter: Komponenter for S30 buffer ble tilsatt med sine respektive mengder i et sterilt 50 ml konisk rør.

Komponent Beløp
Løsning A 2,20 μL
Løsning B 2,1 μL
Ekstrakt 5 μL
DNA-mal Volum for 16 μg/ml finale
Vann Fyll til totalt 15 μL

Tabell 3: CFPS-reaksjonsforhold: Relative volumprosenter for løsning A, løsning B og ekstrakt. DNA-volumet kan variere avhengig av den spesifikke plasmidkonsentrasjonen og må kanskje optimaliseres for at brukerens spesifikke plasmid brukes.

Løsning A Løsning B
Komponenter Konsentrasjon Komponenter Konsentrasjon
Atp 1,2 mM Magnesium glutamat 10 mM
GTP 0,850 mM Ammonium glutamat 10 mM
Utp 0,850 mM Kalium glutamat 130 mM
CTP 0,850 mM Fosfoenolpyruvat (PEP) 30 mM
Folinsyre 31,50 μg/ml L-Valine 2 mM
tRNA 170,60 μg/ml L-Tryptofan 2 mM
Nikotinamid Adenine Dinucleotide (NAD) 0,40 mM L-Isoleucine 2 mM
Koenzym A 0,27 mM L-Leucine 2 mM
Oksalsyre 4,00 mM L-Cysteine 2 mM
Putrescine 1,00 mM L-Methionine 2 mM
Spermidin 1,50 mM L-Alanine 2 mM
HEPES Buffer pH 7.5 57,33 mM L-Arginine 2 mM
L-Asparagine 2 mM
L-Aspartic Syre 2 mM
L-glutaminsyre 2 mM
L-Glycin 2 mM
L-Glutamin 2 mM
L-Histidin 2 mM
L-Lysine 2 mM
L-Proline 2 mM
L-Serine 2 mM
L-Threonine 2 mM
L-Fenylalanin 2 mM
L-Tyrosin 2 mM

Tabell 4: Løsning A- og B-komponenter. Lagerkonsentrasjoner for komponentene for løsning A og B ble tilsatt med sine respektive mengder, hver i et 1,5 ml mikrofugerør.

Ekstrakt Total proteinkonsentrasjon (μg/ml) Standardavvik
2xYTPG 2,5 OD 30617 3745
CFAI 2,5 OD 30895 2254
CFAI 10,0 OD 27905 3582

Tabell 5: Totalt utbytte av ekstraktprotein. Analyse av det totale proteinet av forskjellige celleekstraktvekster. Total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved hjelp av en Bradford Assay. Hver konsentrasjon ble bestemt fra triplikater ved hjelp av en 1:40 fortynning.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning av CFAI og typisk arbeidsflyt fra celler til CFPS: Sammenligning av den totale tidslinjen fra celler til CFPS ved hjelp av (A) CFAI-arbeidsflyten (venstre, rød) i forhold til (B) tidligere etablert metode (grønn, høyre). Sammenligningen viser redusert forskeroppsyn og tidslinje ved utførelse av CFPS ved hjelp av CFAI-arbeidsflyten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av CFAI pelletsstørrelse. Sammenligning av CFAI-mediepellets etter cellehøsting ved forskjellig OD600. Mediene som vokste til en OD600 av 2,5 produserte en 2,23 g cellepellet (venstre) og media vokst til en OD600 av 10 produserte en 9,49 g cellepellet (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekter av vekst på CFPS-reaksjonsutbytter. (A) Sammenligning av CFPS-reaksjon gir mellom vekst til 2,5 OD600 og 10 OD600, med (B) bilder av hver CFPS-reaksjon over deres respektive avkastning. Cellefrie reaksjoner ble utført i et 1,5 ml mikrofugerør og kvantifisert etter 24 timers inkubasjon ved 37 °C ved hjelp av en standardkurve for å korrelere fluorescens med sfGFP-konsentrasjon. "Negativ" tilsvarer settet med negative kontrollreaksjoner der ingen mal-DNA ble lagt til. De tradisjonelle 2xYTPG-mediene (den positive kontrollen) og CFAI-ekstraktene er av lignende kvalitet som demonstrert gjennom deres høye CFPS-utbytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskeroppsyn er tradisjonelt nødvendig for to viktige handlinger under cellevekst: induksjon av T7 RNAP og høsting av celler ved en bestemt OD600. CFAI hindrer begge disse kravene til å redusere forskerens tid og tekniske opplæring som kreves for å forberede celleekstrakter av høy kvalitet. Automatisk induksjon av T7 RNAP oppnås ved å erstatte glukose med laktose som det primære sukkeret i media, noe som hindrer det forrige behovet for å aktivt overvåke veksten og deretter indusere med IPTG på et presist punkt under cellevekst. Behovet for å aktivt overvåke cellekulturer for å høste ved en bestemt OD600 er også obviated, untethering forskeren fra cellekulturen. Dette bidrar til det nylige arbeidet som også har vist produksjon av kvalitetsekstrakter høstet på ikke-tradisjonelle tider 13,25,26. Den nye medieformuleringen forbedrer bufferkapasiteten og karbonkildene for å støtte aktiv energimetabolisme selv når cellekulturen nærmer seg den stasjonære fasen. Kapasiteten til å oppnå robuste celleekstrakter fra høye OD600-kulturer gjør det mulig for forskeren å høste kulturene når det passerdem 27 år. Arbeidsflyten vi foretrekker og anbefaler er å inokulere kulturen om kvelden og komme tilbake for å høste neste morgen.

Høsting av celler ved en høyere OD600 resulterer også i en betydelig større mengde celler oppnådd for ekstraktpreparat. For erfarne forskere er det verdt å merke seg at cellepellet er mye mørkere i fargen sammenlignet med celler som vokser i 2xYTPG-medier, selv når de høstes ved en OD600 av 2,5. Det er også viktig å merke seg at hvis hele cellepellet behandles samtidig, vil den store mengden resuspension oppnådd per cellepellet når du utfører lysis via sonikering ta litt tid. Derfor er det viktig å holde alle aliquots kalde under denne prosessen 11,13,14. Økningen i ekstraktvolum per vekst reduserer kostnadene proporsjonalt og støtter bioproduksjonsapplikasjoner. Med forbedringene demonstrert, gir CFAI-arbeidsflyten en enklere protokoll for nye og erfarne brukere av cellefri teknologi for å produsere reproduserbar, funksjonell E. coli-ekstrakt.

Til tross for fordelene med de medfølgende CFAI-mediene, er det begrensninger for denne metoden. Hovedutfordringen er arbeidsflytens gryende natur. Mens metabolomics analyse har kastet lys over forskjellene i CFAI OD600 10 ekstrakter samt reaksjonsprodukter sammenlignet med 2xYTPG, implikasjonene av disse forskjellene på spesifikke applikasjoner forblir ukarakterisert27. I tillegg er denne arbeidsflyten utviklet for BL21 E. coli-basert lysate. Det er uklart om mediereformen vil støtte robust ekstraktforberedelse fra andre E. coli-stammer, som de genomisk omkodede stammene til E. coli28,29. Det er mulig at CFAI-tilnærmingen kan brukes til å generere ekstrakter fra andre bakterielle organismer, men det er usannsynlig å støtte ekstraktpreparat for eukaryote organismer som kinesisk Hamster eggstokk eller kanin retikulosytt; Disse har imidlertid sine egne etablerte metoder30,31. Vi forventer at enkelheten i CFAI-arbeidsflyten vil redusere barrierene og stimulere det cellefrie samfunnet til å karakterisere og evaluere verktøyet for det brede spekteret av applikasjoner som CFPS støtter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfattere vil gjerne anerkjenne Dr. Jennifer VanderKelen og Andrea Laubscher for teknisk støtte. Forfattere vil også takke Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington og Jillian Kasman for nyttige diskusjoner. Forfattere anerkjenner også støtte fra Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly og National Science Foundation (NSF-1708919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Tags

Bioingeniør utgave 173

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Fra celler til cellefri proteinsyntese innen 24 timer ved hjelp av cellefri arbeidsflyt for autoinduksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, … More

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter