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Summary
Ce travail décrit la préparation de l’extrait cellulaire d’Escherichia coli (E. coli) suivie de réactions de synthèse de protéines sans cellules (CFPS) en moins de 24 heures. L’explication du protocole d’auto-induction sans cellule (CFAI) détaille les améliorations apportées pour réduire la surveillance des chercheurs et augmenter les quantités d’extrait cellulaire obtenues.
Abstract
La synthèse de protéines sans cellules (CFPS) s’est développée en tant que plate-forme biotechnologique qui capture les mécanismes de transcription et de traduction in vitro. De nombreux développements ont rendu la plate-forme CFPS plus accessible aux nouveaux utilisateurs et ont élargi la gamme d’applications. Pour les systèmes CFPS à base de lysat, des extraits cellulaires peuvent être générés à partir d’une variété d’organismes, exploitant la biochimie unique de cet hôte pour augmenter la synthèse des protéines. Au cours des 20 dernières années, Escherichia coli (E. coli) est devenu l’un des organismes les plus largement utilisés pour soutenir le SFC en raison de son prix abordable et de sa polyvalence. Malgré de nombreuses avancées clés, le flux de travail pour la préparation de l’extrait de cellules d’E. coli est resté un goulot d’étranglement clé pour les nouveaux utilisateurs qui souhaitent mettre en œuvre CFPS pour leurs applications. Le flux de travail de préparation des extraits prend beaucoup de temps et nécessite une expertise technique pour obtenir des résultats reproductibles. Pour surmonter ces obstacles, nous avons déjà signalé le développement d’un flux de travail d’auto-induction sans cellule (CFAI) 24 heures sur 24 qui réduit les entrées des utilisateurs et l’expertise technique requise. Le flux de travail CFAI minimise le travail et les compétences techniques nécessaires pour générer des extraits de cellules tout en augmentant les quantités totales d’extraits de cellules obtenues. Nous décrivons ici ce flux de travail étape par étape afin d’améliorer l’accès et de soutenir la mise en œuvre à grande échelle du CFPS basé sur E. coli .
Introduction
L’utilisation de la synthèse de protéines sans cellules (CFPS) pour les applications biotechnologiques a considérablement augmenté au cours des dernières années 1,2,3. Cette évolution peut être attribuée en partie aux efforts accrus déployés pour comprendre les processus qui se produisent dans le SCFFC et le rôle de chaque composante 4,5. En outre, la réduction des coûts attribuée aux configurations optimisées et aux sources d’énergie alternatives a rendu la technologie sans cellules plus facile à mettre en œuvre pour les nouveaux utilisateurs 6,7,8,9. Afin de mettre en œuvre les facteurs de transcription et de traduction nécessaires à la synthèse des protéines, l’extrait cellulaire est souvent utilisé pour conduire des réactions sans cellules10. Les guides d’utilisation récemment publiés ont fourni des protocoles simples pour produire un extrait fonctionnel, ce qui le rend plus facile à mettre en œuvre pour les utilisateurs nouveaux et expérimentés 1,11,12,13,14. L’extrait cellulaire est généralement obtenu par la lyse d’une culture cellulaire, qui peut être cultivée en utilisant différents organismes en fonction de l’utilisation spécifique souhaitée 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) est rapidement devenu l’un des organismes hôtes les plus couramment utilisés pour produire des extraits fonctionnels17. La souche BL21 Star (DE3) est préférée car elle élimine les protéases de la membrane externe (protéase OmpT) et du cytoplasme (protéase Lon), fournissant un environnement optimal pour l’expression de la protéine recombinante. De plus, le DE3 contient l’λDE3 qui porte le gène de l’ARN polymérase T7 (T7 RNAP) sous le contrôle du promoteur lacUV5; la composante étoile contient un gène RNaseE muté qui empêche le clivage de l’ARNm 4,14,18,19. Sous le promoteur lacUV5, l’induction isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) permet l’expression de T7 RNAP20,21. Ces souches sont utilisées pour cultiver et récolter des cellules, qui donnent de la matière première pour la préparation de l’extrait. La lyse cellulaire peut être effectuée à l’aide de diverses méthodes, y compris le battage des billes, la presse à Français, l’homogénéisation, la sonication et la cavitation de l’azote 1,11,12,22.
Le processus de culture et de récolte bactériennes est cohérent sur la plupart des plates-formes lors de l’utilisation d’E. coli, mais nécessite plusieurs jours et une surveillance intensedes chercheurs 1,11,13. Ce processus commence généralement par une culture de graines pendant la nuit dans un bouillon LB, qui, après une croissance nocturne, est ensuite inoculée dans une culture plus grande de 2xYTPG (levure, tryptone, tampon phosphate, glucose) le lendemain. La croissance de cette culture plus grande est surveillée jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase logarithmique précoce à moyenne, à une densité optique (OD) de 2,514,20. Une mesure constante est nécessaire car il a déjà été démontré que les composants de la transcription et de la traduction sont très actifs dans la phase logarithmique23,24 du début au milieu de la phase. Bien que ce processus puisse créer un extrait reproductible, notre laboratoire a récemment mis au point une nouvelle méthode utilisant des milieux d’auto-induction sans cellules (CFAI), qui réduit la surveillance des chercheurs, augmente le rendement global de l’extrait pour un litre donné de culture cellulaire et améliore l’accès à la préparation d’extraits à base d’E. coli pour les utilisateurs expérimentés et nouveaux (Figure 1 ). Nous fournissons ici le guide étape par étape pour la mise en œuvre du flux de travail CFAI, pour passer d’une plaque striée de cellules à une réaction CFPS terminée dans les 24 heures.
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Protocol
1. Croissance des médias
- Préparer 960 mL de milieu CFAI comme décrit dans le tableau 1 et ajuster le pH à 7,2 à l’aide de KOH.
- Transférer le milieu de culture dans une fiole et un autoclave déconcertés de 2,5 L pendant 30 min à 121 °C.
- Préparer une solution de sucre de 40 ml comme décrit dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution dans un récipient en verre autoclavé séparé.
REMARQUE: La solution de sucre peut être stockée dans un incubateur à 30 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure. - Laisser le fluide refroidir complètement à moins de 40 °C après l’autoclavage.
- Avant l’inoculation du milieu CFAI, ajouter la solution de sucre directement au milieu CFAI.
- Pour inoculer le média, balayez une boucle de colonies à partir d’une plaque E. coli BL21 Star (DE3) précédemment striée et insérez-la directement dans le support. Faites tourbillonner la boucle dans le support, mais évitez de toucher les côtés du récipient. Assurez-vous que la plaque de traînée est fraîche, avec des cellules viables.
- Placer la fiole avec le milieu inoculé dans un incubateur à 30 °C tout en agitant à 200 tr/min. Permettez à la culture de se développer du jour au lendemain. Si les cellules sont inoculées le soir, la culture atteindra une densité optique approximative, mesurée à 600 nm (OD600), de 10 le lendemain matin. Les temps d’inoculation et de récolte peuvent être ajustés au besoin.
2. Récolte cellulaire
- Préparez le tampon S30 à l’avance et gardez-le au froid. Préparer le tampon S30 conformément au tableau 2, à un pH final de 8,2.
REMARQUE: Le tampon S30 peut être préparé des jours avant la récolte cellulaire. Si cela est fait, préparer sans dithiothréitol et conserver à 4 °C. Ajouter le dithiothréitol juste avant utilisation. - À partir de ce moment, gardez toutes les solutions et tous les matériaux sur la glace. Transférer 1 L de média dans une bouteille de centrifugeuse de 1 L et centrifuger à 5 000 x g entre 4 et 10 °C pendant 10 min. Décantez et éliminez le surnageant. À l’aide d’une spatule stérile, transférer la pastille dans un tube conique de 50 mL pré-refroidi et préalablement pesé.
- Laver une fois avec 30-40 mL de tampon S30 froid en remettant en suspension la pastille par vortex en rafales de 30 s avec des périodes de repos sur la glace.
REMARQUE: En raison d’un volume plus élevé de granulés, la division de la pastille de cellule en deux tubes coniques de 50 mL peut être utile pour l’étape de lavage. Le stockage des cellules dans des aliquotes plus petites offre également une flexibilité pour le traitement en aval. - Centrifuger la remise en suspension de la cellule à 5000 x g entre 4-10 °C pendant 10 min.
- Jetez le surnageant et essuyez tout excès des parois intérieures du tube conique de 50 mL à l’aide d’un mouchoir propre, évitez de toucher la pastille elle-même. Peser et congeler la pastille dans de l’azote liquide. Conserver à -80 °C jusqu’à nouvel usage.
REMARQUE: Les granulés peuvent ne pas nécessiter de congélation éclair si l’utilisateur prévoit de poursuivre le protocole de préparation de l’extrait.
3. Préparation de l’extrait
- Mélanger la pastille congelée avec 1 mL de tampon S30 pour chaque 1 g de la pastille cellulaire et laisser décongeler sur la glace pendant environ 30 à 60 min. Remettre en suspension les granulés décongelés par vortex en rafales de 30 s avec des périodes de repos sur la glace. Vortex jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas visibles de cellules.
REMARQUE: Les touffes plus petites peuvent être remises en suspension en mélangeant à l’aide d’une pipette. - Transférer des aliquotes de 1,4 mL de remise en suspension cellulaire dans des tubes de microfuge de 1,5 mL pour la lyse cellulaire. Soniquer chaque tube avec une fréquence de 20 kHz et une amplitude de 50% pendant trois rafales de 45 s avec 59 s de repos par cycle entouré d’un bain de glace. Inverser le tube entre les cycles et ajouter immédiatement 4,5 μL de 1 M de dithiothréitol après le dernier cycle de sonication.
REMARQUE: En raison de la chaleur libérée par la sonication, il est extrêmement important de s’assurer que toutes les aliquotes sont conservées sur la glace lorsqu’elles ne sont pas soniquées. Le bain de glace doit être constamment réapprovisionné ou suffisamment grand pour rester au frais tout au long du processus de sonication. - Centrifuger chaque tube à 18 000 x g et 4 °C pendant 10 min. Récupérer le surnageant et l’aliquote dans des tubes de microfuge de 1,5 mL dans des aliquotes de 600 μL. Congeler les aliquotes et les conserver à -80 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure. Il faut veiller à ne pipeter que le surnageant.
4. Synthèse de protéines sans cellules
- Décongeler une aliquote d’extrait de l’étape précédente pour effectuer 15 μL de réactions de synthèse de protéines sans cellules dans des tubes de microfuge de 1,5 mL dans un quadruplicate.
- Préparer chaque réaction en combinant 240 ng d’ADN (concentration finale de 16 μg/mL), 2,20 μL de solution A, 2,10 μL de solution B, 5,0 μL d’extrait et un volume variable d’eau de qualité moléculaire pour remplir la réaction à 15 μL. Cette réaction peut être mise à l’échelle à des volumes plus élevés. Voir le tableau 3 pour les ratios.
- Préparer les solutions A et B conformément au tableau 4. Chaque solution peut être préparée par lots de 100 μL à 1 mL, aliquoted, et conservée à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
REMARQUE: La quantité d’ADN peut varier en fonction de la protéine d’intérêt. Dans ce cas, le plasmide utilisé, pJL1-sfGFP, a été optimisé pour fonctionner à 16 μg/mL, soit 597 μM.
- Préparer les solutions A et B conformément au tableau 4. Chaque solution peut être préparée par lots de 100 μL à 1 mL, aliquoted, et conservée à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
- Laisser les réactions fonctionner pendant au moins 4 h à 37 °C.
5. Quantification de la protéine rapporteure, super dossier protéine fluorescente verte (sfGFP)
- À l’aide d’une plaque de polystyrène noir à 96 puits d’une demi-surface, combiner 2 μL de chaque produit de réaction de synthèse de protéines sans cellule avec 48 μL de tampon HEPES de 0,05 M à pH 7,2. Trois à quatre répétitions de chaque tube de réaction sont recommandées.
- Quantifier l’intensité de fluorescence du sfGFP avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 528 nm.
- Pour la conversion des unités de fluorescence relatives en rendement volumétrique (μg/mL) de sfGFP, établissez une courbe standard en utilisant pJL1-sfGFP purifié.
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Representative Results
Lors de la préparation des milieux CFAI, le glucose a été échangé contre une augmentation du lactose et du glycérol en tant que principal substrat énergétique dans le milieu. De plus, la capacité de mise en mémoire tampon des médias CFAI a également été augmentée. Ces composantes spécifiques sont données dans le tableau 1.
Les cellules ont ensuite été cultivées à la fois à un OD600 de 10 et à la norme 2,5 dans les milieux CFAI pour montrer une cohérence avec la qualité de l’extrait malgré des quantités d’extrait variables. Le milieu CFAI de 2,5 OD600 a été cultivé après inoculation à partir d’une culture de semences dans un bouillon LB à 37 °C, 200 tr/min, tandis que la culture OD600 10 a été inoculée directement à partir d’une plaque. Chaque lot de milieux CFAI a ensuite été surveillé et récolté à leur OD600 respectif. La croissance à une OD600 de 10 a entraîné une augmentation de la quantité plus élevée de granulés cellulaires et d’extrait global obtenu, car il a produit 9,60 mL d’extrait contre 2,10 mL d’extrait obtenu à partir de la croissance à 2,5 OD600 (Figure 2). Une analyse plus approfondie de la concentration totale en protéines n’a révélé aucune différence significative dans les protéines globales de chaque extrait (tableau 5). Même s’ils ont été cultivés à différents niveaux de densité optique, les deux lots d’extrait ont démontré des résultats similaires dans les réactions sans cellules utilisant sfGFP (Figure 3). Cela suggère que la combinaison de la capacité tampon accrue, de l’utilisation du lactose et du glycérol comme principale source de carbone et de la mise en œuvre du lactose au lieu de l’IPTG pour l’induction T7RNAP aide à stabiliser les excroissances d’extrait à n’importe quel OD600 inférieur à 10.
| Supports CFAI autoclavés : | |
| Composants | Quantité |
| Chlorure de sodium | 5,0 g |
| Tryptone | 20,0 g |
| Extrait de levure | 5,0 g |
| Phosphate de potassium monobasique | 6,0 g |
| Phosphate de potassium, dibasique | 14,0 g |
| NanopureTM Eau | Remplir jusqu’à un total de 960 mL |
| Filtrer la solution de sucre stérilisé: | |
| Composants | Quantité |
| D-Glucose | 0,50 g |
| D-Lactose | 4,0 g |
| 80% v/v Glycérol | 7,5 mL |
| NanopureTM Eau | 28,0 mL |
Tableau 1 : Composantes de l’IFC. Composants pour milieux CFAI et solutions de sucre avec leurs quantités respectives. Le milieu doit être agité tout au long de l’ajout de chaque composant et le filtre de la solution de sucre stérilisé. Chaque solution doit être ajoutée dans un récipient stérile séparé avant l’inoculation.
| Tampon S30 | |
| Composants | Concentration |
| Acétate de tris pH 8,2 à température ambiante | 10 mM |
| Acétate de magnésium | 14 mM |
| Acétate de potassium | 60 mM |
| Dithiothréitol | 2 mM |
Tableau 2 : Composants de la mémoire tampon S30 : Des composants pour le tampon S30 ont été ajoutés avec leurs quantités respectives dans un tube conique stérile de 50 mL.
| Composant | Quantité |
| Solution A | 2,20 μL |
| Solution B | 2,1 μL |
| Extraire | 5 μL |
| Modèle ADN | Volume pour 16 μg/mL final |
| Eau | Remplir jusqu’à un total de 15 μL |
Tableau 3 : Rapports de réaction CFPS : pourcentages relatifs en volume pour la solution A, la solution B et l’extrait. Le volume d’ADN peut varier en fonction de la concentration du plasmide spécifique et peut devoir être optimisé pour le plasmide spécifique de l’utilisateur utilisé.
| Solution A | Solution B | ||
| Composants | Concentration | Composants | Concentration |
| ATP | 1,2 mM | Glutamate de magnésium | 10 mM |
| Le | 0,850 mM | Glutamate d’ammonium | 10 mM |
| Utp | 0,850 mM | Potassium Glutamate | 130 mM |
| Le | 0,850 mM | Phosphoénolpyruvate (PPE) | 30 mM |
| Acide folinique | 31,50 μg/mL | L-Valine | 2 mM |
| Trna | 170,60 μg/mL | L-tryptophane | 2 mM |
| Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) | 0,40 mM | L-Isoleucine | 2 mM |
| Coenzyme A | 0,27 mM | L-Leucine | 2 mM |
| Acide oxalique | 4,00 mM | L-Cystéine | 2 mM |
| Putrescine | 1,00 mM | L-méthionine | 2 mM |
| Spermidine | 1,50 mM | L-Alanine | 2 mM |
| Tampon HEPES pH 7,5 | 57,33 mM | L-Arginine | 2 mM |
| L-Asparagine | 2 mM | ||
| Acide L-aspartique | 2 mM | ||
| Acide L-glutamique | 2 mM | ||
| L-Glycine | 2 mM | ||
| L-Glutamine | 2 mM | ||
| L-Histidine | 2 mM | ||
| L-Lysine | 2 mM | ||
| L-Proline | 2 mM | ||
| L-Sérine | 2 mM | ||
| L-Thréonine | 2 mM | ||
| L-phénylalanine | 2 mM | ||
| L-Tyrosine | 2 mM | ||
Tableau 4 : Composants des solutions A et B. Les concentrations en stock des composants des solutions A et B ont été ajoutées avec leurs quantités respectives, chacune dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
| Extraire | Concentration protéique totale (μg/mL) | Écart type |
| 2xYTPG 2.5 OD | 30617 | 3745 |
| CFAI 2.5 OD | 30895 | 2254 |
| CFAI 10.0 OD | 27905 | 3582 |
Tableau 5 : Rendements totaux en protéines de l’extrait. Analyse de la protéine totale de différentes croissances d’extraits cellulaires. La concentration totale en protéines a été déterminée à l’aide d’un test de Bradford. Chaque concentration a été déterminée à partir de triples à l’aide d’une dilution de 1:40.
Figure 1 : Comparaison de l’IAFC et du flux de travail typique des cellules au SFC : Comparaison de la chronologie globale des cellules au PFC à l’aide du flux de travail (A) de l’IAFC (gauche, rouge) par rapport à la méthode (B) précédemment établie (vert, droite). La comparaison démontre la réduction de la surveillance et du calendrier des chercheurs lors de l’exécution du CFPS à l’aide du flux de travail CFAI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison de la taille des granulés CFAI. Comparaison des granulés de milieu CFAI après récolte cellulaire à différents OD600. Le milieu atteint un OD600 de 2,5 a produit une pastille cellulaire de 2,23 g (à gauche) et le milieu atteint une OD600 de 10 a produit une pastille cellulaire de 9,49 g (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Effets de la croissance sur les rendements de réaction cfps. (A) Comparaison des rendements de réaction CFPS entre les croissances à 2,5 OD600 et 10 OD600, avec (B) des images de chaque réaction CFPS au-dessus de leur rendement respectif. Les réactions sans cellules ont été réalisées dans un tube de microfuge de 1,5 mL et quantifiées après 24 h d’incubation à 37 °C à l’aide d’une courbe standard pour corréler la fluorescence à la concentration de SFGFP. Le « négatif » correspond à l’ensemble des réactions de contrôle négatives dans lesquelles aucun modèle d’ADN n’a été ajouté. Les milieux traditionnels 2xYTPG (le témoin positif) et les extraits CFAI sont de qualité similaire, comme en témoignent leurs rendements élevés en CFPS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La surveillance des chercheurs est traditionnellement nécessaire pour deux actions clés au cours de la croissance cellulaire : l’induction de l’ARNR T7 et la récolte de cellules à un OD600 spécifique. CFAI élimine ces deux exigences pour réduire le temps du chercheur et la formation technique requise pour préparer des extraits cellulaires de haute qualité. L’auto-induction de l’ARNR T7 est obtenue en remplaçant le glucose par du lactose comme sucre primaire dans le milieu, éliminant ainsi le besoin précédent de surveiller activement la croissance et d’induire ensuite avec IPTG à un point précis de la croissance cellulaire. La nécessité de surveiller activement les cultures cellulaires pour les récolter à un OD600 spécifique est également évitée, libérant le chercheur de la culture cellulaire. Cela s’ajoute aux travaux récents qui ont également démontré la production d’extraits de qualité récoltés à des moments non traditionnels 13,25,26. La nouvelle formulation de milieu améliore la capacité tampon et les sources de carbone pour soutenir le métabolisme énergétique actif même lorsque la culture cellulaire approche de la phase stationnaire. La capacité d’obtenir des extraits cellulaires robustes à partir de cultures à OD600 élevé permet au chercheur de récolter les cultures à leurconvenance 27. Le flux de travail que nous préférons et recommandons est d’inoculer la culture le soir et de retourner à la récolte le lendemain matin.
La récolte de cellules à un OD600 plus élevé entraîne également une quantité significativement plus grande de cellules obtenues pour la préparation de l’extrait. Pour les chercheurs expérimentés, il convient de noter que la pastille cellulaire est de couleur beaucoup plus foncée que les cellules cultivées dans des milieux 2xYTPG, même lorsqu’elles sont récoltées à un OD600 de 2,5. Il est également important de noter que si la pastille cellulaire entière est traitée en même temps, la grande quantité de remise en suspension obtenue par pastille cellulaire lors de la lyse par sonication prendra un certain temps. Par conséquent, il est important de garder toutes les aliquotes froides pendant ce processus 11,13,14. L’augmentation du volume d’extrait par croissance diminue proportionnellement les coûts et soutient les applications de biofabrication. Avec les améliorations démontrées, le flux de travail CFAI fournit un protocole plus facile pour les utilisateurs nouveaux et expérimentés de la technologie sans cellules pour produire de l’extrait d’E. coli reproductible et fonctionnel.
Malgré les avantages des supports CFAI fournis, cette méthode présente des limites. Le principal défi est la nature naissante du flux de travail. Bien que l’analyse métabolomique ait mis en lumière les différences entre les extraits de CFAI OD600 10 ainsi que les produits de réaction par rapport au 2xYTPG, les implications de ces différences sur des applications spécifiques restent non caractérisées27. De plus, ce flux de travail a été développé pour le lysat à base de BL21 E. coli. Il n’est pas clair si la reformulation du milieu soutiendrait une préparation robuste de l’extrait d’autres souches d’E. coli, telles que les souches codées génomiquement d’E. coli28,29. Il est possible que l’approche CFAI puisse être utilisée pour générer des extraits d’autres organismes bactériens, mais il est peu probable qu’elle soutienne la préparation d’extraits pour des organismes eucaryotes tels que l’ovaire de hamster chinois ou le réticulocyte de lapin; cependant, ceux-ci ont leurs propres méthodesétablies 30,31. Nous prévoyons que la simplicité du flux de travail CFAI réduira les obstacles et incitera la communauté sans cellules à caractériser et à évaluer son utilité pour le large éventail d’applications prises en charge par CFPS.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier jennifer VanderKelen et Andrea Laubscher pour leur soutien technique. Les auteurs tiennent également à remercier Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington et Jillian Kasman pour leurs discussions utiles. Les auteurs reconnaissent également le soutien financier du Bill and Linda Frost Fund, de la Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant du Center for Applications in Biotechnology, de Cal Poly Research, Scholarly et de la National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
References
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- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
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Bioingénierie numéro 173Erratum
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
