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Summary
Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von Zellextrakt aus Escherichia coli (E. coli ) gefolgt von zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) in weniger als 24 Stunden. Die Erläuterung des CFAI-Protokolls (Cell-Free Autoinduction) beschreibt Verbesserungen, die vorgenommen wurden, um die Aufsicht der Forscher zu reduzieren und die Mengen des erhaltenen Zellextrakts zu erhöhen.
Abstract
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) hat sich zu einer biotechnologischen Plattform entwickelt, die Transkriptions- und Translationsmaschinen in vitro erfasst. Zahlreiche Entwicklungen haben die CFPS-Plattform für neue Anwender zugänglicher gemacht und das Anwendungsspektrum erweitert. Für lysatbasierte CFPS-Systeme können Zellextrakte aus einer Vielzahl von Organismen erzeugt werden, wobei die einzigartige Biochemie dieses Wirts genutzt wird, um die Proteinsynthese zu verstärken. In den letzten 20 Jahren hat sich Escherichia coli (E. coli) aufgrund seiner Erschwinglichkeit und Vielseitigkeit zu einem der am häufigsten verwendeten Organismen zur Unterstützung von CFPS entwickelt. Trotz zahlreicher wichtiger Fortschritte ist der Workflow für die Herstellung von E. coli-Zellextrakten nach wie vor ein wichtiger Engpass für neue Anwender bei der Implementierung von CFPS für ihre Anwendungen . Der Workflow der Extraktaufbereitung ist zeitintensiv und erfordert technisches Know-how, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Um diese Barrieren zu überwinden, haben wir bereits über die Entwicklung eines 24-Stunden-CFAI-Workflows (Cell-Free Autoinduction) berichtet, der den Benutzeraufwand und das erforderliche technische Fachwissen reduziert. Der CFAI-Workflow minimiert den Arbeitsaufwand und die technischen Fähigkeiten, die für die Erzeugung von Zellextrakten erforderlich sind, und erhöht gleichzeitig die Gesamtmenge der erhaltenen Zellextrakte. Hier beschreiben wir diesen Workflow Schritt für Schritt, um den Zugang zu verbessern und die breite Implementierung von E. coli-basiertem CFPS zu unterstützen.
Introduction
Der Einsatz der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) für biotechnologische Anwendungen hat in den letzten Jahren erheblich zugenommen 1,2,3. Diese Entwicklung ist zum Teil auf verstärkte Anstrengungen zum Verständnis der in CFPS auftretenden Prozesse und der Rolle jeder Komponentezurückzuführen 4,5. Darüber hinaus haben reduzierte Kosten, die auf optimierte Setups und alternative Energiequellen zurückzuführen sind, die Implementierung der zellfreien Technologie für neue Benutzer erleichtert 6,7,8,9. Um die notwendigen Transkriptions- und Translationsfaktoren für die Proteinsynthese zu implementieren, wird Zellextrakt häufig verwendet, um zellfreie Reaktionen anzutreiben10. Kürzlich veröffentlichte Benutzerhandbücher haben einfache Protokolle für die Erstellung von Funktionsextrakten bereitgestellt, die die Implementierung für neue und erfahreneBenutzer erleichtern 1,11,12,13,14. Zellextrakt wird normalerweise durch die Lyse einer Zellkultur gewonnen, die je nach gewünschter spezifischer Verwendung mit verschiedenen Organismen gezüchtet werden kann 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) hat sich schnell zu einem der am häufigsten verwendeten Wirtsorganismen für die Herstellung funktioneller Extrakteentwickelt 17. Der Stamm BL21 Star (DE3) wird bevorzugt, da er die Proteasen von der äußeren Membran (OmpT-Protease) und dem Zytoplasma (Lon-Protease) entfernt und eine optimale Umgebung für die rekombinante Proteinexpression bietet. Darüber hinaus enthält das DE3 das λDE3, das das Gen für die T7-RNA-Polymerase (T7-RNAP) unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors trägt; Die Sternkomponente enthält ein mutiertes RNaseE-Gen, das die Spaltung der mRNA 4,14,18,19 verhindert. Unter dem lacUV5-Promotor ermöglicht die Induktion von Isopropyl-Thiogalactopyranosid (IPTG) die Expression von T7-RNAP20,21. Diese Stämme werden verwendet, um Zellen zu züchten und zu ernten, die Rohstoffe für die Extraktherstellung liefern. Die Zelllyse kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden, einschließlich Perlenschlagen, French Press, Homogenisierung, Beschallung und Stickstoffkavitation 1,11,12,22.
Der Prozess der Bakterienkultur und -ernte ist bei der Verwendung von E. coli auf den meisten Plattformen konsistent, erfordert jedoch mehrere Tage und eine intensive Aufsicht durch die Forscher 1,11,13. Dieser Prozess beginnt im Allgemeinen mit einer Samenkultur über Nacht in LB-Brühe, die dann bei Wachstum über Nacht am nächsten Tag in eine größere Kultur von 2xYTPG (Hefe, Trypton, Phosphatpuffer, Glukose) eingeimpft wird. Das Wachstum dieser größeren Kultur wird überwacht, bis sie die frühe bis mittlere Log-Phase mit einer optischen Dichte (OD) von 2,514,20 erreicht. Eine konstante Messung ist erforderlich, da sich die Komponenten der Transkription und Translation bereits in der frühen bis mittleren Log-Phase23,24 als hochaktiv erwiesen haben. Während dieser Prozess reproduzierbaren Extrakt erzeugen kann, hat unser Labor kürzlich eine neue Methode mit Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media entwickelt, die die Aufsicht der Forscher reduziert, die Gesamtausbeute an Extrakt für einen bestimmten Liter Zellkultur erhöht und den Zugang zu E. coli-basierter Extraktvorbereitung für erfahrene und neue Benutzer verbessert (Abbildung 1 ). Hier bieten wir die Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Implementierung des CFAI-Workflows, um innerhalb von 24 Stunden von einer gestreiften Zellplatte zu einer abgeschlossenen CFPS-Reaktion zu gelangen.
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Protocol
1. Medienwachstum
- Bereiten Sie 960 ml CFAI-Medien wie in Tabelle 1 beschrieben vor und stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein.
- Übertragen Sie Kulturmedien für 30 min bei 121 °C auf einen 2,5 l verblüfften Kolben und Autoklaven.
- Bereiten Sie eine 40 ml Zuckerlösung vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Sterilisieren Sie die Lösung in einen separaten Autoklavglasbehälter.
HINWEIS: Die Zuckerlösung kann bis zur weiteren Verwendung in einem 30 °C Inkubator gelagert werden. - Lassen Sie die Medien nach dem Autoklavieren vollständig auf unter 40 °C abkühlen.
- Vor der Beimpfung der CFAI-Medien die Zuckerlösung direkt in die CFAI-Medien geben.
- Um das Medium zu impfen, streichen Sie eine Schleife voller Kolonien von einer zuvor gestreiften E. coli BL21 Star (DE3) -Platte und legen Sie sie direkt in das Medium ein. Schwenken Sie die Schlaufe in das Medium, aber vermeiden Sie es, die Seiten des Behälters zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Streifenplatte frisch ist und lebensfähige Zellen enthält.
- Legen Sie den Kolben mit den geimpften Medien in einen 30 °C Inkubator, während Sie bei 200 U / min schütteln. Lassen Sie die Kultur über Nacht wachsen. Wenn die Zellen abends geimpft werden, erreicht die Kultur eine ungefähre optische Dichte, gemessen bei 600 nm (OD600), von 10 am folgenden Morgen. Impf- und Erntezeiten können nach Bedarf angepasst werden.
2. Zellernte
- Bereiten Sie den S30-Puffer im Voraus vor und halten Sie ihn kalt. Der S30-Puffer wird gemäß Tabelle 2 auf einen endgültigen pH-Wert von 8,2 vorbereitet.
HINWEIS: Der S30-Puffer kann Tage vor der Zellernte vorbereitet werden. Wenn dies geschieht, bereiten Sie ohne Dithiothreitol vor und lagern Sie es bei 4 ° C. Dithiothreitol kurz vor Gebrauch hinzufügen. - Halten Sie ab diesem Zeitpunkt alle Lösungen und Materialien auf Eis. 1 L Medien in eine 1 L Zentrifugenflasche geben und bei 5.000 x g zwischen 4-10 °C für 10 min zentrifugieren. Dekantieren und entsorgen Sie den Überstand. Mit einem sterilen Spatel das Pellet in ein vorgekühltes und zuvor gewogenes 50 ml konisches Rohr überführen.
- Einmal mit 30-40 ml kaltem S30-Puffer waschen, indem Sie das Pellet durch Vortexing in 30 s Ausbrüchen mit Ruhephasen auf Eis wieder suspendieren.
HINWEIS: Aufgrund eines höheren Pelletvolumens kann das Aufteilen des Zellpellets in zwei 50 ml konische Röhrchen für den Waschschritt hilfreich sein. Das Speichern von Zellen in kleineren Aliquots bietet auch Flexibilität für die nachgelagerte Verarbeitung. - Zentrifugieren Sie die Zellresuspension bei 5000 x g zwischen 4-10 °C für 10 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und wischen Sie den Überschuss von den Innenwänden des 50 ml konischen Rohrs mit einem Reingewebe ab, vermeiden Sie es, das Pellet selbst zu berühren. Wiegen und schockgefrieren Sie das Pellet in flüssigem Stickstoff. Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Pellets erfordern möglicherweise kein Schockgefrieren, wenn der Benutzer plant, mit dem Extraktvorbereitungsprotokoll fortzufahren.
3. Extraktvorbereitung
- Kombinieren Sie das gefrorene Pellet mit 1 ml S30-Puffer pro 1 g des Zellpellets und lassen Sie es ca. 30-60 min auf Eis auftauen. Resuspendiertes aufgetautes Pellet durch Vortexing in Schüben von 30 s mit Ruhephasen auf Eis. Wirbel, bis keine sichtbaren Zellklumpen mehr übrig sind.
HINWEIS: Kleinere Klumpen können durch Mischen mit einer Pipette resuspendiert werden. - Transfer von Aliquots von 1,4 ml Zellresuspension in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen für die Zelllyse. Beschallen Sie jede Röhre mit einer Frequenz von 20 kHz und 50% Amplitude für drei Ausbrüche von 45 s mit 59 s Ruhe pro Zyklus, umgeben von einem Eisbad. Kehren Sie das Rohr zwischen den Zyklen um und fügen Sie nach dem letzten Beschallungszyklus sofort 4,5 μL 1 M Dithiothreitol hinzu.
HINWEIS: Aufgrund der bei der Beschallung freigesetzten Wärme ist es äußerst wichtig, sicherzustellen, dass alle Aliquots auf Eis gehalten werden, wenn sie nicht beschallt werden. Das Eisbad sollte ständig aufgefüllt oder groß genug sein, um während des gesamten Beschallungsprozesses kühl zu bleiben. - Zentrieren Sie jedes Röhrchen bei 18.000 x g und 4 °C für 10 min. Holen Sie sich den Überstand und das Aliquot in 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen in 600-μL-Aliquoten. Aliquots einfrieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern. Es sollte darauf geachtet werden, nur den Überstand zu pipettieren.
4. Zellfreie Proteinsynthese
- Tauen Sie ein Aliquot Extrakt aus dem vorherigen Schritt auf, um 15 μL zellfreie Proteinsynthesereaktionen in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen in Quadruplicate durchzuführen.
- Bereiten Sie jede Reaktion vor, indem Sie 240 ng DNA (16 μg/ml Endkonzentration), 2,20 μL Lösung A, 2,10 μL Lösung B, 5,0 μL Extrakt und ein variierendes Volumen an molekularem Wasser kombinieren, um die Reaktion auf 15 μL zu füllen. Diese Reaktion kann auf höhere Volumina skaliert werden. Die Verhältnisse sind Tabelle 3 zu entnehmen.
- Bereiten Sie die Lösungen A und B gemäß Tabelle 4 vor. Jede Lösung kann in Chargen von 100 μL bis 1 ml hergestellt, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
HINWEIS: Die DNA-Menge kann je nach interessantem Protein variieren. In diesem Fall wurde das verwendete Plasmid pJL1-sfGFP für eine Leistung von 16 μg/ml oder 597 μM optimiert.
- Bereiten Sie die Lösungen A und B gemäß Tabelle 4 vor. Jede Lösung kann in Chargen von 100 μL bis 1 ml hergestellt, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
- Lassen Sie die Reaktionen mindestens 4 h bei 37 °C laufen.
5. Quantifizierung von Reporterprotein, Superfolder grün fluoreszierendes Protein (sfGFP)
- Kombinieren Sie 2 μL jedes zellfreien Proteinsynthesereaktionsprodukts mit 48 μL 0,05 M HEPES-Puffer bei pH 7,2 mit einer halbgroßen schwarzen Polystyrolplatte mit einer Fläche von 96 Wells. Drei bis vier Replikate jedes Reaktionsrohrs werden empfohlen.
- Quantifizierung der Fluoreszenzintensität des sfGFP mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 528 nm.
- Für die Umrechnung von relativen Fluoreszenzeinheiten in volumetrische Ausbeute (μg/ml) von sfGFP ist eine Standardkurve mit gereinigtem pJL1-sfGFP zu erstellen.
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Representative Results
Bei der Herstellung von CFAI-Medien wurde Glukose gegen eine Erhöhung von Laktose und Glycerin als Hauptenergiesubstrat in den Medien ausgetauscht. Zusätzlich wurde auch die Pufferkapazität der CFAI-Medien erhöht. Diese spezifischen Komponenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Zellen wurden dann sowohl zu einem OD600 von 10 als auch zum Standard 2,5 in CFAI-Medien gezüchtet, um trotz unterschiedlicher Extraktmengen Konsistenz mit der Extraktqualität zu zeigen. Das CFAI-Medium 2,5 OD 600 wurde nach der Impfung aus einer Samenkultur in LB-Brühe bei 37 °C, 200 U/min gezüchtet, während die OD600 10-Kultur direkt von einer Platte geimpft wurde. Jede Charge CFAI-Medien wurde dann überwacht und mit ihrem jeweiligen OD600 geerntet. Das Wachstum auf eine OD600 von 10 führte zu einer Zunahme der höheren Menge an Zellpellets und Gesamtextrakt, da es 9,60 ml Extrakt gegenüber den 2,10 ml Extrakt produzierte, die aus dem Wachstum auf 2,5 OD600 erhalten wurden (Abbildung 2). Eine weitere Analyse der Gesamtproteinkonzentration zeigte keinen signifikanten Unterschied im Gesamtprotein in jedem Extrakt (Tabelle 5). Obwohl sie auf unterschiedliche optische Dichtegrade gezüchtet wurden, zeigten beide Extraktchargen ähnliche Ergebnisse bei zellfreien Reaktionen mit sfGFP (Abbildung 3). Dies deutet darauf hin, dass die Kombination aus der erhöhten Pufferkapazität, der Verwendung von Laktose und Glycerin als Hauptkohlenstoffquelle und der Implementierung von Laktose anstelle von IPTG für die T7RNAP-Induktion dazu beiträgt, das Extraktwachstum auf OD600 unter 10 zu stabilisieren.
| Autoklavierte CFAI-Medien: | |
| Komponenten | Menge |
| Natriumchlorid | 5,0 g |
| Trypton | 20,0 g |
| Hefeextrakt | 5,0 g |
| Kaliumphosphat, einbasisch | 6,0 g |
| Kaliumphosphat, zweibasisch | 14,0 g |
| Nanoreines TM-Wasser | Füllung auf insgesamt 960 mL |
| Filtersterilisierte Zuckerlösung: | |
| Komponenten | Menge |
| D-Glukose | 0,50 g |
| D-Laktose | 4,0 g |
| 80% v/v Glycerin | 7,5 ml |
| Nanoreines TM-Wasser | 28,0 ml |
Tabelle 1: CFAI-Komponenten. Komponenten für CFAI-Medien und Zuckerlösungen mit ihren jeweiligen Mengen. Die Medien sollten während der Zugabe jeder Komponente gerührt und der Zuckerlösungsfilter sterilisiert werden. Jede Lösung sollte vor der Impfung in einen separaten sterilen Behälter gegeben werden.
| S30-Puffer | |
| Komponenten | Konzentration |
| Trisacetat pH 8,2 bei Raumtemperatur | 10 mM |
| Magnesiumacetat | 14 mM |
| Kaliumacetat | 60 mM |
| Dithiothreitol | 2 mM |
Tabelle 2: S30-Pufferkomponenten: Komponenten für S30-Puffer wurden mit ihren jeweiligen Mengen in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen gegeben.
| Bestandteil | Menge |
| Lösung A | 2,20 μL |
| Lösung B | 2,1 μL |
| Auszug | 5 μL |
| DNA-Schablone | Volumen für 16 μg/ml endgültig |
| Wasser | Füllung auf insgesamt 15 μL |
Tabelle 3: CFPS-Reaktionsverhältnisse: Relative Volumenprozentsätze für Lösung A, Lösung B und Extrakt. Das DNA-Volumen kann je nach Konzentration des spezifischen Plasmids variieren und muss möglicherweise für das spezifische verwendete Plasmid des Benutzers optimiert werden.
| Lösung A | Lösung B | ||
| Komponenten | Konzentration | Komponenten | Konzentration |
| Atp | 1,2 mM | Magnesiumglutamat | 10 mM |
| GTP | 0,850 mM | Ammoniumglutamat | 10 mM |
| Utp | 0,850 mM | Kaliumglutamat | 130 mM |
| CTP | 0,850 mM | Phosphoenolpyruvat (PEP) | 30 mM |
| Folinsäure | 31,50 μg/ml | L-Valin | 2 mM |
| trna | 170,60 μg/ml | L-Tryptophan | 2 mM |
| Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) | 0,40 mM | L-Isoleucin | 2 mM |
| Coenzym A | 0,27 mM | L-Leucin | 2 mM |
| Oxalsäure | 4,00 mM | L-Cystein | 2 mM |
| Putrescin | 1,00 mM | L-Methionin | 2 mM |
| Spermidin | 1,50 mM | L-Alanin | 2 mM |
| HEPES-Puffer pH 7,5 | 57,33 mM | L-Arginin | 2 mM |
| L-Asparagin | 2 mM | ||
| L-Asparaginsäure | 2 mM | ||
| L-Glutaminsäure | 2 mM | ||
| L-Glycin | 2 mM | ||
| L-Glutamin | 2 mM | ||
| L-Histidin | 2 mM | ||
| L-Lysin | 2 mM | ||
| L-Prolin | 2 mM | ||
| L-Serin | 2 mM | ||
| L-Threonin | 2 mM | ||
| L-Phenylalanin | 2 mM | ||
| L-Tyrosin | 2 mM | ||
Tabelle 4: Komponenten für Lösung A und B Die Stammkonzentrationen für die Komponenten für Lösung A und B wurden mit ihren jeweiligen Mengen jeweils in einem 1,5 ml Mikrofugenröhrchen zugegeben.
| Auszug | Gesamtproteinkonzentration (μg/ml) | Standardabweichung |
| 2xYTPG 2,5 OD | 30617 | 3745 |
| CFAI 2,5 OD | 30895 | 2254 |
| CFAI 10,0 OD | 27905 | 3582 |
Tabelle 5: Gesamterträge an Extraktproteinen. Analyse des Gesamtproteins verschiedener Zellextraktwüchse. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit einem Bradford-Assay bestimmt. Jede Konzentration wurde aus Verdreifachungen unter Verwendung einer 1:40-Verdünnung bestimmt.
Abbildung 1: Vergleich von CFAI und typischem Workflow von Zellen zu CFPS: Vergleich der Gesamtzeitachse von Zellen zu CFPS unter Verwendung des (A) CFAI-Workflows (links, rot) mit der (B) zuvor festgelegten Methode (grün, rechts). Der Vergleich zeigt die reduzierte Aufsicht und Zeitleiste der Forscher bei der Durchführung von CFPS mit dem CFAI-Workflow. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich der CFAI-Pelletsgröße. Vergleich von CFAI-Medienpellets nach Zellernte bei verschiedenen OD600. Das auf einen OD 600 von 2,5 gewachsene Medium produzierte ein 2,23 g Zellpellet (links) und das zu einem OD600 von10 gewachsene Medium produzierte ein 9,49 g Zellpellet (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Auswirkungen des Wachstums auf die CFPS-Reaktionserträge. (A) Vergleich der CFPS-Reaktionserträge zwischen den Zuwächsen auf 2,5 OD 600 und 10 OD600, wobei (B) Bilder jeder CFPS-Reaktion über ihrer jeweiligen Ausbeute liegen. Zellfreie Reaktionen wurden in einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen durchgeführt und nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C unter Verwendung einer Standardkurve quantifiziert, um die Fluoreszenz mit der sfGFP-Konzentration zu korrelieren. Das "Negative" entspricht der Menge der negativen Kontrollreaktionen, in denen keine Template-DNA hinzugefügt wurde. Die traditionellen 2xYTPG-Medien (die Positivkontrolle) und die CFAI-Extrakte sind von ähnlicher Qualität, wie ihre hohen CFPS-Erträge zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Aufsicht der Forscher wird traditionell für zwei Schlüsselaktionen während des Zellwachstums benötigt: die Induktion von T7-RNAP und die Gewinnung von Zellen bei einem spezifischen OD600. CFAI macht beide Anforderungen überflüssig, um die Zeit des Forschers und die technische Ausbildung zu verringern, die für die Herstellung hochwertiger Zellextrakte erforderlich sind. Die Autoinduktion von T7-RNAP wird erreicht, indem Glukose durch Laktose als primären Zucker in den Medien ersetzt wird, wodurch die vorherige Notwendigkeit, das Wachstum aktiv zu überwachen und dann mit IPTG zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Zellwachstums zu induzieren, entfällt. Die Notwendigkeit, Zellkulturen aktiv zu überwachen, um bei einem bestimmten OD600 zu ernten, entfällt ebenfalls, wodurch der Forscher von der Zellkultur befreit wird. Dies ergänzt die jüngsten Arbeiten, die auch die Produktion von Qualitätsextrakten nachgewiesen haben, die zu nicht-traditionellen Zeiten geerntet wurden 13,25,26. Die neue Medienformulierung verbessert die Pufferkapazität und die Kohlenstoffquellen, um den aktiven Energiestoffwechsel zu unterstützen, auch wenn sich die Zellkultur der stationären Phase nähert. Die Fähigkeit, robuste Zellextrakte aus Kulturen mit hohem OD600 zu erhalten, ermöglicht es dem Forscher, die Kulturen nach Belieben zu ernten27. Der Workflow, den wir bevorzugen und empfehlen, besteht darin, die Kultur am Abend zu impfen und am nächsten Morgen zur Ernte zurückzukehren.
Die Gewinnung von Zellen mit einem höheren OD600 führt auch zu einer signifikant größeren Menge an Zellen, die für die Extraktvorbereitung gewonnen werden. Für erfahrene Forscher ist es erwähnenswert, dass das Zellpellet im Vergleich zu Zellen, die in 2xYTPG-Medien gezüchtet werden, viel dunkler gefärbt ist, selbst wenn es bei einem OD600 von 2,5 geerntet wird. Es ist auch wichtig zu beachten, dass, wenn das gesamte Zellpellet auf einmal verarbeitet wird, die große Menge an Resuspension, die pro Zellpellet bei der Durchführung der Lyse durch Ultraschall erhalten wird, einige Zeit in Anspruch nehmen wird. Daher ist es wichtig, alle Aliquots während dieses Prozesses kalt zu halten11,13,14. Die Zunahme des Extraktvolumens pro Wachstum senkt die Kosten proportional und unterstützt Bioproduktionsanwendungen. Mit den demonstrierten Verbesserungen bietet der CFAI-Workflow ein einfacheres Protokoll für neue und erfahrene Benutzer der zellfreien Technologie, um reproduzierbaren, funktionellen E. coli-Extrakt herzustellen.
Trotz der Vorteile der bereitgestellten CFAI-Medien gibt es Einschränkungen für diese Methode. Die größte Herausforderung ist die Entstehungsnatur des Workflows. Während die Metabolomik-Analyse die Unterschiede zwischen CFAI OD600 10-Extrakten sowie Reaktionsprodukten im Vergleich zu 2xYTPG beleuchtet hat, bleiben die Auswirkungen dieser Unterschiede auf spezifische Anwendungen uncharakterisiert27. Zusätzlich wurde dieser Workflow für BL21 E. coli-basiertes Lysat entwickelt. Es ist unklar, ob die mediale Neuformulierung eine robuste Extraktaufbereitung aus anderen E. coli-Stämmen, wie den genomisch rekodierten Stämmen von E. coli28,29, unterstützen würde. Es ist möglich, dass der CFAI-Ansatz zur Erzeugung von Extrakten aus anderen bakteriellen Organismen verwendet werden könnte, aber es ist unwahrscheinlich, dass er die Extraktvorbereitung für eukaryotische Organismen wie den chinesischen Hamster-Eierstock oder den Kaninchen-Retikulozyten unterstützt; Diese haben jedoch ihre eigenen etablierten Methoden30,31. Wir gehen davon aus, dass die Einfachheit des CFAI-Workflows die Barrieren verringern und die zellfreie Community dazu anregen wird, ihren Nutzen für die breite Palette von Anwendungen, die CFPS unterstützt, zu charakterisieren und zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Jennifer VanderKelen und Andrea Laubscher für die technische Unterstützung. Die Autoren danken auch Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington und Jillian Kasman für hilfreiche Diskussionen. Die Autoren würdigen auch die finanzielle Unterstützung durch den Bill and Linda Frost Fund, den Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant des Center for Applications in Biotechnology, Cal Poly Research, Scholarly und die National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
References
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Bioengineering Ausgabe 173Erratum
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
