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Bioengineering

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.

Abstract

무세포 단백질 합성(CFPS)은 시험관 내에서 전사 및 번역 기계를 포획하는 생명공학 플랫폼으로 성장했습니다. 수많은 개발로 인해 CFPS 플랫폼은 새로운 사용자가 더 쉽게 액세스 할 수있게되었으며 응용 프로그램의 범위를 확장했습니다. 용해물 기반 CFPS 시스템의 경우, 세포 추출물은 다양한 유기체로부터 생성될 수 있으며, 단백질 합성을 증강시키기 위해 숙주의 독특한 생화학을 이용한다. 지난 20 년 동안 대장균 (E. coli) 은 경제성과 다양성으로 인해 CFPS를 지원하는 데 가장 널리 사용되는 유기체 중 하나가되었습니다. 수많은 주요 발전에도 불구하고, 대장균 세포 추출물 제조를 위한 워크플로우는 신규 사용자가 자신의 애플리케이션에 CFPS를 구현하는 데 있어 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 추출물 준비 작업 과정은 시간이 많이 걸리며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 기술적 전문 지식이 필요합니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 이전에 사용자 입력 및 필요한 기술 전문 지식을 줄이는 24 시간 무세포 자동 유도 (CFAI) 워크 플로의 개발을보고했습니다. CFAI 워크플로우는 세포 추출물을 생성하는 데 필요한 노동력과 기술 기술을 최소화하는 동시에 획득한 세포 추출물의 총 양을 증가시킵니다. 여기에서는 접근성을 향상시키고 대장균 기반 CFPS의 광범위한 구현을 지원하기 위해 단계별로 워크 플로우를 설명합니다.

Introduction

생명 공학 응용 분야를위한 무세포 단백질 합성 (CFPS)의 사용은 지난 몇 년 동안 1,2,3 년 동안 크게 증가했습니다. 이러한 개발은 부분적으로 CFPS에서 발생하는 프로세스와 각 구성 요소 4,5의 역할을 이해하려는 노력이 증가했기 때문일 수 있습니다. 또한 최적화 된 설정 및 대체 에너지 원으로 인한 비용 절감으로 인해 새로운 사용자 6,7,8,9를 위해 무세포 기술을 쉽게 구현할 수있었습니다. 단백질 합성에 필요한 전사 및 번역 인자를 구현하기 위해, 세포 추출물은 종종 무세포 반응(10)을 구동하는데 사용된다. 최근 출판 된 사용자 가이드는 기능 추출을 생성하기위한 간단한 프로토콜을 제공하여 신규 및 숙련 된 사용자 모두에게 구현하기가 더 쉬워졌습니다1,11,12,13,14. 세포 추출물은 일반적으로 세포 배양물의 용해를 통해 얻어지며, 이는 원하는 특정 용도1,15,16에 따라 다른 유기체를 사용하여 성장할 수 있다.

대장균(E. coli)은 기능성 추출물(17)을 생산하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 숙주 유기체 중 하나가 되었다. 상기 BL21 스타(DE3) 균주는 외막으로부터 프로테아제(OmpT 프로테아제) 및 세포질(Lon protease)을 제거하여, 재조합 단백질 발현을 위한 최적의 환경을 제공하기 때문에 바람직하다. 추가적으로, DE3은 lacUV5 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 폴리머라제 (T7 RNAP)에 대한 유전자를 운반하는 λDE3을 함유하고; 스타 성분은 mRNA4,14,18,19의 절단을 방지하는 돌연변이된 RNaseE 유전자를 함유한다. lacUV5 프로모터 하에서, 이소프로필티오갈락토피라노시드 (IPTG) 유도는 T7 RNAP20,21의 발현을 허용한다. 이 균주는 세포를 재배하고 수확하는 데 사용되며, 이는 추출물 준비를위한 원료를 제공합니다. 세포 용해는 비드 박동, 프렌치 프레스, 균질화, 초음파 처리 및 질소 캐비테이션1,11,12,22를 포함한 다양한 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다.

박테리아 배양 및 수확 과정은 대장균을 사용할 때 대부분의 플랫폼에서 일관되지만 며칠이 걸리고 강렬한 연구자 감독1,11,13이 필요합니다. 이 과정은 일반적으로 LB 국물에서 하룻밤 종자 배양으로 시작되며, 이는 밤새 성장시 다음날 2xYTPG (효모, 트립톤, 인산염 완충액, 포도당)의 더 큰 배양물에 접종된다. 이러한 더 큰 배양물의 성장은 2.514,20의 광학 밀도 (OD)에서 초기 내지 중간 로그 단계에 도달할 때까지 모니터링된다. 전사 및 번역의 구성 요소가 이전에 초기 내지 중간 로그 단계23,24에서 고도로 활성인 것으로 입증되었기 때문에 지속적인 측정이 요구된다. 이 과정이 재현 가능한 추출물을 만들 수 있지만, 우리 연구실은 최근 연구원의 감독을 줄이고 주어진 1 리터의 세포 배양에 대한 추출물의 전반적인 수율을 높이며 숙련 된 사용자와 신규 사용자 모두를위한 대장균 기반 추출물 제제에 대한 액세스를 향상시키는 무세포 자동 유도 (CFAI) Media를 사용하는 새로운 방법을 개발했습니다 (그림 1 ). 여기서 우리는 CFAI 워크플로우를 구현하기 위한 단계별 가이드를 제공하며, 줄무늬가 있는 세포 플레이트에서 24시간 이내에 완료된 CFPS 반응으로 이동합니다.

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Protocol

1. 미디어 성장

  1. 표 1에 기재된 바와 같이 CFAI 배지 960 mL를 제조하고 KOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정하였다.
  2. 배양 배지를 2.5 L 배플 플라스크에 옮기고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브한다.
  3. 표 1에 기재된 바와 같이 당 용액 40 mL를 제조하였다. 용액을 별도의 오토클레이브 유리 용기에 여과 멸균하십시오.
    참고: 설탕 용액은 추가 사용 시까지 30°C 인큐베이터에 보관할 수 있습니다.
  4. 오토클레이빙 후 매체를 40°C 이하로 완전히 냉각시키십시오.
  5. CFAI 배지를 접종하기 전에 설탕 용액을 CFAI 배지에 직접 첨가하십시오.
  6. 배지를 접종하기 위해, 이전에 줄무늬가 있는 대장균 BL21 스타(DE3) 플레이트로부터 루프풀한 콜로니를 스와이프하고 배지에 직접 삽입한다. 루프를 미디어에 소용돌이 치지 만 컨테이너의 측면을 만지지 마십시오. 줄무늬 플레이트가 생존 가능한 세포와 함께 신선한지 확인하십시오.
  7. 접종된 배지가 있는 플라스크를 30°C 인큐베이터에 놓고 200 rpm으로 진탕시킨다. 문화가 하룻밤 사이에 자라도록 허용하십시오. 세포가 저녁에 접종되는 경우, 배양물은 다음 날 아침 10의 600 nm (OD600)에서 측정된 대략적인 광학 밀도에 도달할 것이다. 접종 및 수확 시간은 필요에 따라 조정할 수 있습니다.

2. 세포 수확

  1. S30 버퍼를 미리 준비하고 차갑게 유지하십시오. 표 2에 따라 S30 버퍼를 준비하고, 최종 pH를 8.2로 하였다.
    참고: S30 버퍼는 셀 수확 며칠 전에 준비할 수 있습니다. 이것이 완료되면, 디티오트레이톨 없이 준비하고 4°C에서 보관한다. 사용 직전에 디티오트레이톨을 첨가하십시오.
  2. 이 시점부터 모든 솔루션과 재료를 얼음 위에 보관하십시오. 1 L의 배지를 1 L 원심분리 병에 옮기고 4-10°C 사이에서 5,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 데칸트하고 폐기하십시오. 멸균 주걱을 사용하여, 펠릿을 미리 냉각되고 이전에 칭량된 50 mL 코니컬 튜브로 옮긴다.
  3. 차가운 S30 버퍼 30-40 mL로 한 번 세척하여 얼음 위에서 휴식 기간과 함께 30 초 파열로 볼텍싱을 통해 펠렛을 재현탁하십시오.
    참고: 펠릿의 부피가 많기 때문에 세포 펠릿을 두 개의 50mL 원뿔형 튜브로 분할하면 세척 단계에 도움이 될 수 있습니다. 더 작은 분취량에 세포를 저장하는 것은 또한 다운스트림 처리를 위한 유연성을 제공한다.
  4. 세포를 5000 x g 에서 4-10°C 사이에서 10분 동안 재현탁시키는 원심분리기.
  5. 상청액을 폐기하고 깨끗한 조직을 사용하여 50 mL 원뿔형 튜브의 내벽에서 과량의 물을 닦아내고 펠릿 자체를 만지지 않도록하십시오. 무게를 재고 플래쉬하면 펠렛을 액체 질소에서 동결시킵니다. 추가 사용 시까지 -80°C에서 보관하십시오.
    참고: 사용자가 추출 준비 프로토콜을 계속할 계획인 경우 펠렛은 플래시 동결이 필요하지 않을 수 있습니다.

3. 추출물 제조

  1. 동결된 펠렛을 세포 펠릿 1g당 1mL의 S30 버퍼와 결합하고 약 30-60분 동안 얼음 위에서 해동되도록 한다. 볼텍싱을 통해 해동된 펠릿을 얼음 위에서 휴식 기간과 함께 30초의 버스트로 재현탁하십시오. 눈에 보이는 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 소용돌이.
    참고: 더 작은 덩어리는 피펫을 사용하여 혼합하여 재현탁할 수 있습니다.
  2. 세포 용해를 위해 1.4 mL의 세포 재현탁물의 분취량을 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 내로 옮긴다. 20kHz의 주파수와 50% 진폭의 각 튜브를 초음파 처리하여 45초의 세 번의 버스트를 처리하고 사이클당 59초의 휴식 시간을 얼음 욕조로 둘러싸고 있습니다. 사이클 사이에 튜브를 반전시키고 마지막 초음파 처리 사이클 후에 즉시 4.5 μL의 1 M 디티오트레이톨을 첨가하십시오.
    참고 : 초음파 처리에서 방출되는 열로 인해 초음파 처리되지 않을 때 모든 분취량을 얼음 위에 보관하는 것이 매우 중요합니다. 얼음 욕조는 지속적으로 보충되거나 전체 초음파 처리 과정에서 시원하게 유지되기에 충분히 커야합니다.
  3. 각 튜브를 18,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액 및 분취량을 600 μL 분취량의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 내로 회수한다. 플래시 동결 분취량을 추가 사용 때까지 -80°C에서 보관한다. 상층액 만 피펫에주의해야합니다.

4. 무세포 단백질 합성

  1. 이전 단계로부터의 추출물의 1분취량을 해동하여 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 무세포 단백질 합성 반응의 15 μL를 사분면으로 수행한다.
  2. 240 ng의 DNA (16 μg/mL 최종 농도), 2.20 μL의 용액 A, 2.10 μL의 용액 B, 5.0 μL의 추출물 및 다양한 부피의 분자 등급 물을 결합하여 각 반응을 준비하여 15 μL로 반응물을 채운다. 이 반응은 더 높은 부피로 스케일링될 수 있다. 비율에 대해서는 표 3 을 참조한다.
    1. 표 4에 따라 용액 A 및 B를 준비한다. 각 용액은 100 μL 내지 1 mL의 배치로 제조되고, 분취될 수 있고, 추가 사용 시까지 -80°C에서 저장될 수 있다.
      참고: DNA 양은 관심있는 단백질에 따라 달라질 수 있습니다. 이 경우, 사용된 플라스미드인 pJL1-sfGFP는 16μg/mL 또는 597μM에서 수행하도록 최적화되었습니다.
  3. 반응을 37°C에서 적어도 4시간 동안 실행시킨다.

5. 리포터 단백질, 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)의 정량

  1. 절반 면적 96-웰 검정 폴리스티렌 플레이트를 사용하여, 2 μL의 각 무세포 단백질 합성 반응 생성물을 pH 7.2에서 0.05 M HEPES 완충액 48 μL와 결합한다. 각 반응 튜브의 서너 번의 반복실험이 권장됩니다.
  2. 485nm의 여기 파장과 528nm의 방출 파장으로 sfGFP의 형광 강도를 정량화합니다.
  3. 상대 형광 단위를 sfGFP의 부피 수율(μg/mL)로 전환하려면 정제된 pJL1-sfGFP를 사용하여 표준 곡선을 수립하십시오.

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Representative Results

CFAI 배지를 제조할 때, 글루코스는 배지 내의 주요 에너지 기질로서 락토오스 및 글리세롤의 증가를 위해 교환되었다. 또한 CFAI 매체의 버퍼링 용량도 증가했습니다. 이들 특정 성분은 표 1에 제시되어 있다.

이어서, 세포를 CFAI 배지에서OD600 10 및 표준 2.5 둘 다로 성장시켜 다양한 추출물 양에도 불구하고 추출물 품질과의 일관성을 보여주었다. 상기 2.5 OD600 CFAI 배지를 LB 배양액에 접종한 후 37°C, 200 rpm으로 증식시킨 후,OD600 10 배양물을 플레이트로부터 직접 접종하였다. 이어서, CFAI 배지의 각 배치를 모니터링하고, 각각의OD600에서 수확하였다. 10의 OD600으로의 성장은 2.5OD600으로 성장함으로부터 수득된 추출물 2.10 mL에 비해 9.60 mL의 추출물을 생산함에 따라 수득된 더 많은 양의 세포 펠릿 및 전체 추출물의 증가를 가져왔다 (도 2). 총 단백질 농도의 추가 분석은 각 추출물에서 전체 단백질에서 유의한 차이가 없음을 입증하였다 (표 5). 서로 다른 수준의 광학 밀도로 성장했음에도 불구하고 두 추출물 배치 모두 sfGFP를 사용한 무세포 반응에서 유사한 결과를 보여주었습니다 (그림 3). 이는 증가된 완충 능력의 조합이, 주요 탄소원으로서 락토스 및 글리세롤의 사용 및 T7RNAP 유도를 위한 IPTG 대신에 락토스를 구현하는 것이 10 미만의 임의의OD600으로의 추출물 성장을 안정화시키는 데 도움이 된다는 것을 시사한다.

오토클레이브 CFAI 미디어:
구성 요소 분량
소금 5.0 지
트립톤 20.0 지
효모 추출물 5.0 지
인산칼륨, 일염기성 6.0 지
인산칼륨, 이염기성 14.0 지
나노 퓨어TM 워터 총 960mL까지 채우기
필터 살균 설탕 솔루션 :
구성 요소 분량
D- 포도당 0.50 지
D-락토오스 4.0 지
80% v/v 글리세롤 7.5 mL
나노 퓨어TM 워터 28.0 mL

표 1: CFAI 성분. CFAI 배지 및 설탕 솔루션의 구성 요소와 각각의 양. 배지는 멸균된 각 성분과 당 용액 필터의 첨가 전반에 걸쳐 교반되어야 한다. 각 용액은 접종 전에 별도의 멸균 용기에 첨가해야합니다.

S30 버퍼
구성 요소 농도
실온에서 트리스 아세테이트 pH 8.2 10 밀리지미터
마그네슘 아세테이트 14 밀리지미터
아세트산 칼륨 60 밀리지미터
디티오트레이톨 2 밀리지미터

표 2: S30 버퍼 구성 요소: S30 버퍼용 성분들을 멸균된 50 mL 원뿔형 튜브에 각각의 양과 함께 첨가하였다.

구성 요소 분량
해결책 A 2.20 μL
솔루션 B 2.1 μL
추출물 5 μL
DNA 주형 16 μg/mL 결승전을 위한 부피
물 총 15 μL로 채우기

표 3: CFPS 반응 비율: 용액 A, 용액 B 및 추출물에 대한 상대적 부피 백분율. DNA 부피는 특정 플라스미드의 농도에 따라 달라질 수 있으며, 사용되는 사용자의 특정 플라스미드에 대해 최적화될 필요가 있을 수 있다.

해결책 A 솔루션 B
구성 요소 농도 구성 요소 농도
증권 시세 표시기 1.2 밀리지미터 글루타메이트 마그네슘 10 밀리지미터
증권 시세 표시기 0.850 밀리지미터 글루타메이트 암모늄 10 밀리지미터
증권 시세 표시기 0.850 밀리지미터 글루타메이트 칼륨 130 밀리가바이트
증권 시세 표시기 0.850 밀리지미터 포스포에놀피루베이트 (PEP) 30 밀리지미터
엽산 31.50 μg/mL L-발린 2 밀리지미터
tRNA 170.60 μg/mL L- 트립토판 2 밀리지미터
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NAD) 0.40 밀리지미터 L-이소류신 2 밀리지미터
코엔자임 A 0.27 밀리지미터 L-류신 2 밀리지미터
옥살산 4.00 밀리지미터 L-시스테인 2 밀리지미터
푸트레신 1.00 밀리지미터 L-메티오닌 2 밀리지미터
스페르미딘 1.50 밀리지미터 L-알라닌 2 밀리지미터
헤페스 버퍼 pH 7.5 57.33 밀리지미터 L- 아르기닌 2 밀리지미터
L-아스파라긴 2 밀리지미터
L- 아스파르트산 2 밀리지미터
L- 글루탐산 2 밀리지미터
L- 글리신 2 밀리지미터
L- 글루타민 2 밀리지미터
L-히스티딘 2 밀리지미터
L- 라이신 2 밀리지미터
L-프롤린 2 밀리지미터
L-세린 2 밀리지미터
L-트레오닌 2 밀리지미터
L- 페닐알라닌 2 밀리지미터
L-티로신 2 밀리지미터

표 4: 용액 A 및 B 성분. 용액 A 및 B에 대한 성분에 대한 스톡 농도를 각각 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에 각각의 양과 함께 첨가하였다.

추출물 총 단백질 농도 (μg / mL) 표준 편차
2xYTPG 2.5 OD 30617 3745
CFAI 2.5 OD 30895 2254
CFAI 10.0 OD 27905 3582

표 5: 총 추출물 단백질 수율. 상이한 세포 추출물 성장의 총 단백질의 분석. 총 단백질 농도는 브래드포드 어세이를 사용하여 결정하였다. 각 농도는 1:40 희석을 사용하여 삼중항으로부터 결정하였다.

Figure 1
그림 1: CFAI 및 셀에서 CFPS로의 일반적인 워크플로우 비교: (A) CFAI 워크플로우(왼쪽, 빨간색)와 (B) 이전에 설정된 방법(녹색, 오른쪽)을 사용하여 셀에서 CFPS로 전체 타임라인을 비교합니다. 이 비교는 CFAI 워크플로를 사용하여 CFPS를 수행할 때 연구원의 감독 및 타임라인이 줄어든 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: CFAI 펠릿 크기 비교. 상이한OD600에서 세포 수확 후 CFAI 배지 펠릿의 비교. 2.5의 OD600으로 성장한 배지는 2.23 g 세포 펠릿 (왼쪽)을 생성하고, 배지를 10의OD600으로 성장시켜 9.49 g 세포 펠릿 (오른쪽)을 생성하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: CFPS 반응 수율에 대한 성장의 영향. (A) 2.5 OD600 및10 OD600으로의 성장 사이의 CFPS 반응 수율 비교, 각각의 수율 위의 각 CFPS 반응의 (B) 이미지. 무세포 반응을 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 수행하고, 형광을 sfGFP 농도와 상관시키기 위해 표준 곡선을 사용하여 37°C에서 24시간 인큐베이션 후 정량하였다. "음성"은 주형 DNA가 추가되지 않은 음성 대조군 반응 세트에 해당합니다. 전통적인 2xYTPG 배지 (양성 대조군)와 CFAI 추출물은 높은 CFPS 수율을 통해 입증 된 것과 비슷한 품질입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

연구원의 감독은 전통적으로 세포 성장 동안 두 가지 주요 작용, 즉 T7 RNAP의 유도와 특정OD600에서 세포를 수확하는 데 필요합니다. CFAI는 고품질의 세포 추출물을 제조하기 위해 필요한 연구자의 시간과 기술 교육을 줄이기 위해 이러한 요구 사항을 모두 제거합니다. T7 RNAP의 자동 유도는 배지 내의 일차 당으로서 글루코스를 락토오스로 대체함으로써, 세포 성장 동안 정확한 지점에서 IPTG로 유도한 후 성장을 능동적으로 모니터링해야 하는 이전의 필요성을 없애고 달성된다. 특정OD600에서 수확하기 위해 세포 배양물을 적극적으로 모니터링해야 할 필요성 또한 사라지고, 연구자를 세포 배양물로부터 떼어낸다. 이것은 또한 비 전통적 시간13,25,26에서 수확 된 양질의 추출물의 생산을 입증 한 최근의 연구에 추가됩니다. 새로운 배지 제형은 완충 능력과 탄소 공급원을 향상시켜 세포 배양이 정지 단계에 도달하더라도 활성 에너지 대사를 지원합니다. 높은OD600 배양물로부터 강력한 세포 추출물을 얻을 수 있는 능력은 연구원이 그들의 편의(27)에서 배양물을 수확할 수 있게 한다. 우리가 선호하고 권장하는 워크 플로우는 저녁에 문화를 접종하고 다음날 아침 수확으로 돌아 오는 것입니다.

더 높은OD600에서 세포를 수확하는 것은 또한 추출물 제조를 위해 수득된 세포의 상당히 많은 양을 초래한다. 숙련 된 연구자의 경우, 세포 펠릿이 2.5의OD600에서 수확 된 경우에도 2xYTPG 배지에서 자란 세포에 비해 훨씬 어두운 색이라는 점은 주목할 가치가 있습니다. 또한 전체 세포 펠릿이 한 번에 처리되는 경우, 초음파 처리를 통해 용해를 수행 할 때 세포 펠릿 당 얻어지는 다량의 재현탁에는 약간의 시간이 걸릴 것이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서이 과정에서 모든 분취량을 차갑게 유지하는 것이 중요합니다11,13,14. 성장 당 추출물 부피의 증가는 비용을 비례적으로 감소시키고 바이오 제조 응용 분야를 지원합니다. 입증 된 개선 사항을 통해 CFAI 워크 플로는 무세포 기술의 신규 및 숙련 된 사용자가 재현 가능하고 기능적인 대장균 추출물을 생산할 수있는 더 쉬운 프로토콜을 제공합니다.

제공된 CFAI 미디어의 장점에도 불구하고, 이 방법에는 한계가 있다. 주요 과제는 워크플로의 초기 특성입니다. 대사체학 분석은 CFAI OD600 10 추출물과 2xYTPG와 비교하여 반응 생성물의 차이에 대해 밝혀 주었지만, 특정 용도에 대한 이러한 차이의 함의는 특징이 없습니다27. 또한, 이 워크플로우는 BL21 E. 대장균 기반 용해물을 위해 개발되었다. 배지 재구성이 E. coli 28,29의 게놈적으로 재코딩된 균주와 같은 다른 대장균 균주로부터의 강력한 추출물 제제를 지지하는지 여부는 불분명하다. CFAI 접근법이 다른 박테리아 유기체로부터 추출물을 생성하는 데 활용 될 수 있지만, 중국 햄스터 난소 또는 토끼 망상 세포와 같은 진핵 생물에 대한 추출물 준비를 지원할 가능성은 거의 없습니다. 그러나, 이들은 그들 자신의 확립 된 방법30,31을 가지고있다. 우리는 CFAI 워크플로우의 단순성으로 인해 장벽이 줄어들고 셀프리 커뮤니티가 CFPS가 지원하는 광범위한 애플리케이션에 대한 유용성을 특성화하고 평가할 수 있도록 장려할 것으로 기대합니다.

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Disclosures

저자들은 경쟁적인 재정적 이해 상충이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 Jennifer VanderKelen 박사와 Andrea Laubscher가 기술 지원을 받고 있음을 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 니콜 그레고리오, 맥스 레빈, 알리사 멀린, 병철 소, 어거스트 브룩웰, 엘리자베스 (리지) 보이보다, 로건 버링턴, 질리언 카스만에게 도움이 된 토론에 감사드립니다. 저자는 또한 빌 앤 린다 프로스트 펀드, 생명 공학의 셰브론 생명 공학 응용 연구 기부 보조금 센터, 칼 폴리 연구, 학술 및 국립 과학 재단 (NSF-1708919)의 자금 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

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References

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생명공학 문제 173

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지
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Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

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