Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Från celler till cellfri proteinsyntes inom 24 timmar med hjälp av cellfritt autoinduktionsarbetsflöde

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta arbete beskriver beredningen av cellextrakt från Escherichia coli (E. coli) följt av cellfria proteinsyntesreaktioner (CFPS) på under 24 timmar. Förklaring av det cellfria autoinduktionsprotokollet (CFAI) beskriver förbättringar som gjorts för att minska forskarnas tillsyn och öka mängden erhållet cellextrakt.

Abstract

Cellfri proteinsyntes (CFPS) har vuxit som en bioteknikplattform som fångar transkriptions- och översättningsmaskineri in vitro. Många utvecklingar har gjort CFPS-plattformen mer tillgänglig för nya användare och har utökat utbudet av applikationer. För lysatbaserade CFPS-system kan cellextrakt genereras från en mängd olika organismer, utnyttja värdens unika biokemi för att öka proteinsyntesen. Under de senaste 20 åren har Escherichia coli (E. coli) blivit en av de mest använda organismerna för att stödja CFPS på grund av dess överkomliga priser och mångsidighet. Trots många viktiga framsteg har arbetsflödet för beredning av E. coli-cellextrakt förblivit en viktig flaskhals för nya användare att implementera CFPS för sina applikationer. Arbetsflödet för extraktberedning är tidskrävande och kräver teknisk expertis för att uppnå reproducerbara resultat. För att övervinna dessa hinder rapporterade vi tidigare utvecklingen av ett 24-timmars cellfritt autoinduktionsarbetsflöde (CFAI) som minskar användarinmatning och teknisk expertis som krävs. CFAI-arbetsflödet minimerar det arbete och den tekniska skicklighet som krävs för att generera cellextrakt samtidigt som det ökar de totala mängderna cellextrakt som erhålls. Här beskriver vi det arbetsflödet på ett steg-för-steg-sätt för att förbättra tillgången och stödja det breda genomförandet av E. coli-baserade CFPS.

Introduction

Användningen av cellfri proteinsyntes (CFPS) för biotekniska tillämpningar har ökat avsevärt under de senaste åren 1,2,3. Denna utveckling kan delvis tillskrivas ökade ansträngningar för att förstå de processer som förekommer i CFPS och rollen för varje komponent 4,5. Dessutom har minskade kostnader som tillskrivs optimerade inställningar och alternativa energikällor gjort cellfri teknik enklare att implementera för nya användare 6,7,8,9. För att implementera de nödvändiga transkriptions- och translationsfaktorerna för proteinsyntes används cellextrakt ofta för att driva cellfria reaktioner10. Nyligen publicerade användarhandböcker har tillhandahållit enkla protokoll för att producera funktionellt extrakt, vilket gör det lättare att implementera för både nya och erfarna användare 1,11,12,13,14. Cellextrakt erhålls vanligtvis genom lys av en cellodling, som kan odlas med användning av olika organismer beroende på den specifika användningen som önskas 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) har snabbt blivit en av de vanligaste värdorganismerna för att producera funktionella extrakt17. STAMMEN BL21 Star (DE3) är att föredra eftersom den tar bort proteaserna från det yttre membranet (OmpT-proteas) och cytoplasman (Lon-proteas), vilket ger en optimal miljö för det rekombinanta proteinuttrycket. Dessutom innehåller DE3 λDE3 som bär genen för T7 RNA-polymeras (T7 RNAP) under kontroll av lacUV5-promotorn; stjärnkomponenten innehåller en muterad RNaseE-gen som förhindrar klyvning av mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotorn tillåter isopropyl-tiogolaktopyranosid (IPTG) induktion uttrycket av T7 RNAP20,21. Dessa stammar används för att odla och skörda celler, vilket ger råmaterial för extraktberedning. Celllys kan utföras med hjälp av en mängd olika metoder, inklusive pärlslagning, fransk press, homogenisering, ultraljudsbehandling och kvävekavitation 1,11,12,22.

Processen för bakteriekultur och skörd är konsekvent på de flesta plattformar vid användning av E. coli, men kräver flera dagar och intensiv forskarövervakning 1,11,13. Denna process börjar vanligtvis med en frökultur över natten i LB-buljong, som vid nattens tillväxt sedan inokuleras i en större kultur av 2xYTPG (jäst, trypton, fosfatbuffert, glukos) nästa dag. Tillväxten av denna större kultur övervakas tills den når den tidiga till mitten av logfasen, vid en optisk densitet (OD) på 2,514,20. Konstant mätning krävs eftersom komponenterna i transkription och översättning tidigare har visat sig vara mycket aktiva i den tidiga till mellersta logfas23,24. Även om denna process kan skapa reproducerbart extrakt, har vårt laboratorium nyligen utvecklat en ny metod med cellfri autoinduktion (CFAI) Media, vilket minskar forskarnas tillsyn, ökar det totala utbytet av extrakt för en viss liter cellodling och förbättrar tillgången till E. coli-baserad extraktberedning för både erfarna och nya användare (Figur 1 ). Här tillhandahåller vi steg-för-steg-guiden för att implementera CFAI-arbetsflödet, för att gå från en streckad cellplatta till en slutförd CFPS-reaktion inom 24 timmar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medietillväxt

  1. Förbered 960 ml CFAI-media enligt beskrivningen i tabell 1 och justera pH-värdet till 7,2 med KOH.
  2. Överför odlingsmedier till en 2,5 L förbryllad kolv och autoklav i 30 minuter vid 121 °C.
  3. Bered en 40 ml sockerlösning enligt beskrivningen i tabell 1. Filtersterilisera lösningen i en separat autoklaverad glasbehållare.
    OBS: Sockerlösningen kan förvaras i en 30 °C inkubator tills vidare användning.
  4. Låt mediet svalna helt till under 40 °C efter autoklavering.
  5. Innan CFAI-mediet vaccineras, tillsätt sockerlösningen direkt till CFAI-mediet.
  6. För att inokulera media, svep en slinga av kolonier från en tidigare strimmig E. coli BL21 Star (DE3) platta och sätt in direkt i media. Virvla slingan i mediet men undvik att röra vid behållarens sidor. Se till att strimplattan är färsk, med livskraftiga celler.
  7. Placera kolven med det inokulerade mediet i en 30 °C kuvös medan du skakar vid 200 rpm. Låt kulturen växa över natten. Om celler inokuleras på kvällen kommer kulturen att nå en ungefärlig optisk densitet, uppmätt vid 600 nm (OD600), av 10 följande morgon. Inokulerings- och skördetider kan justeras efter behov.

2. Cell skörd

  1. Förbered S30-bufferten i förväg och håll den kall. Förbered S30-bufferten enligt tabell 2 till ett slutligt pH-värde på 8,2.
    OBS: S30-bufferten kan beredas dagar före cellskörden. Om detta görs, bered utan ditiotreitol och förvara vid 4 °C. Tillsätt ditiotreitol strax före användning.
  2. Från och med nu, håll alla lösningar och material på is. Överför 1 liter media till en 1 L centrifugflaska och centrifugera vid 5 000 x g mellan 4–10 °C i 10 minuter. Dekantera och kassera supernatanten. Använd en steril spatel och överför pelleten till ett förkylt och tidigare vägt 50 ml koniskt rör.
  3. Tvätta en gång med 30-40 ml kall S30-buffert genom att återsusponera pelleten via virvel i 30 s skurar med viloperioder på is.
    OBS: På grund av en högre volym pellets kan det vara till hjälp för tvättsteget att dela cellpelleten i två 50 ml koniska rör. Lagring av celler i mindre alikvoter ger också flexibilitet för nedströms bearbetning.
  4. Centrifugera cellens resuspension vid 5000 x g mellan 4-10 °C i 10 min.
  5. Kassera supernatanten och torka av eventuellt överskott från insidan av 50 ml koniska röret med en ren vävnad, undvik att röra vid själva pelleten. Väg och blixtfrys pelleten i flytande kväve. Förvaras vid -80 °C tills vidare användning.
    OBS: Pellets kanske inte kräver blixtfrysning om användaren planerar att fortsätta med extraktberedningsprotokollet.

3. Extrahera beredning

  1. Kombinera den frysta pelleten med 1 ml S30-buffert för varje 1 g av cellpelleten och låt tina på is i cirka 30-60 minuter. Resuspend tinad pellet via virvel i skurar på 30 s med viloperioder på is. Virvel tills det inte finns några synliga klumpar av celler kvar.
    OBS: Mindre klumpar kan återsuspenderas genom blandning med en pipett.
  2. Överför alikvoter på 1,4 ml cellåtersuspension till 1,5 ml mikrofugerör för celllys. Ultraljudsera varje rör med en frekvens av 20 kHz och 50% amplitud för tre skurar på 45 s med 59 s vila per cykel omgiven av ett isbad. Invertera röret mellan cykler och omedelbart tillsätt 4.5 μL av 1 M ditiotreitol efter den sista ultraljudsbehandling cykeln.
    OBS: På grund av värmen som frigörs från ultraljudsbehandling är det oerhört viktigt att se till att alla alikvoter hålls på is när de inte är soniska. Isbadet bör ständigt fyllas på eller tillräckligt stort för att hålla sig svalt under hela ultraljudsbehandlingsprocessen.
  3. Centrifugera varje rör vid 18 000 x g och 4 °C i 10 min. Hämta supernatanten och alikvoten i 1,5 ml mikrofugerör i 600 μL alikvoter. Flash fryser alikvoter och förvaras vid -80 °C tills vidare användning. Försiktighet bör vidtas för att pipettera endast supernatanten.

4. Cellfri proteinsyntes

  1. Tina en alikvot extrakt från föregående steg för att utföra 15 μL cellfria proteinsyntesreaktioner i 1,5 ml mikrofugerör i fyrdubbla.
  2. Förbered varje reaktion genom att kombinera 240 ng DNA (16 μg/ml slutlig koncentration), 2,20 μl lösning A, 2,10 μl lösning B, 5,0 μl extrakt och en varierande volym molekylvatten för att fylla reaktionen till 15 μl. Denna reaktion kan skalas till högre volymer. Se tabell 3 för nyckeltal.
    1. Förbered lösning A och B enligt tabell 4. Varje lösning kan beredas i satser på 100 μl till 1 ml, alikvoteras och lagras vid -80 °C tills vidare användning.
      OBS: DNA-mängden kan variera beroende på proteinet av intresse. I detta fall har den använda plasmiden, pJL1-sfGFP, optimerats för att prestera vid 16 μg/ml, eller 597 μM.
  3. Låt reaktionerna pågå i minst 4 timmar vid 37 °C.

5. Kvantifiering av reporterprotein, supermapp grönt fluorescerande protein (sfGFP)

  1. Använd en halv 96-brunnars svart polystyrenplatta, kombinera 2 μL av varje cellfri proteinsyntesreaktionsprodukt med 48 μL 0,05 M HEPES-buffert vid pH 7,2. Tre till fyra replikat av varje reaktionsrör rekommenderas.
  2. Kvantifiera fluorescensintensiteten hos sfGFP med en excitationsvåglängd på 485 nm och en emissionsvåglängd på 528 nm.
  3. För omvandling av relativa fluorescensenheter till volymetriskt utbyte (μg / ml) av sfGFP, upprätta en standardkurva med renad pJL1-sfGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vid beredning av CFAI-media byttes glukos ut mot en ökning av laktos och glycerol som det huvudsakliga energisubstratet i media. Dessutom ökades buffertkapaciteten för CFAI-media också. Dessa specifika komponenter anges i tabell 1.

Cellerna odlades sedan till både en OD600 av 10 och standard 2.5 i CFAI-media för att visa konsistens med extraktkvalitet trots varierande extraktmängder. 2,5 OD600 CFAI-mediet odlades efter inokulering från en frökultur i LB-buljong vid 37 ° C, 200 rpm, medan OD600 10-kulturen inokulerades direkt från en platta. Varje sats CFAI-media övervakades sedan och skördades vid respektive OD600. Tillväxten till en OD600 av 10 ledde till en ökning av högre mängd cellpellets och totalt erhållet extrakt, eftersom det producerade 9,60 ml extrakt jämfört med 2,10 ml extrakt erhållet från tillväxten till 2,5 OD600 (figur 2). Ytterligare analys av den totala proteinkoncentrationen visade ingen signifikant skillnad i totalt protein i varje extrakt (tabell 5). Även om de odlades till olika nivåer av optisk densitet, visade båda satserna av extrakt liknande resultat i cellfria reaktioner med sfGFP (Figur 3). Detta tyder på att kombinationen av den ökade buffringskapaciteten, användningen av laktos och glycerol som den huvudsakliga kolkällan och implementering av laktos istället för IPTG för T7RNAP-induktion hjälper till att stabilisera extrakttillväxten till alla OD600 under 10.

Autoklaverade CFAI-media:
Komponenter Belopp
Koksalt 5,0 g
Tryptone 20,0 g
Jästextrakt 5,0 g
Kaliumfosfat, monobasisk 6,0 g
Kaliumfosfat, dibasiskt 14,0 g
NanopureTM Vatten Fyll till totalt 960 ml
Filtrera steriliserad sockerlösning:
Komponenter Belopp
D-glukos 0,50 g
D-laktos 4,0 g
80% v/v Glycerol 7,5 ml
NanopureTM Vatten 28,0 ml

Tabell 1: CFAI-komponenter. Komponenter för CFAI-media och sockerlösningar med sina respektive mängder. Mediet bör omröras under tillsatsen av varje komponent och sockerlösningsfiltret steriliseras. Varje lösning ska tillsättas till en separat steril behållare före inokulering.

S30 Buffert
Komponenter Koncentration
Trisacetat pH 8,2 vid rumstemperatur 10 mM
Magnesiumacetat 14 mM
Kaliumacetat 60 mM
Ditiotreitol 2 mM

Tabell 2: S30-buffertkomponenter: Komponenter för S30-buffert tillsattes med sina respektive mängder i ett sterilt 50 ml koniskt rör.

Komponent Belopp
Lösning A 2,20 μl
Lösning B 2,1 μl
Extrakt 5 μl
DNA-mall Volym för 16 μg/ml slutlig
Vatten Fyll till totalt 15 μl

Tabell 3: CFPS-reaktionsförhållanden: Relativa volymprocentsatser för lösning A, lösning B och extrakt. DNA-volymen kan variera beroende på den specifika plasmidens koncentration och kan behöva optimeras för användarens specifika plasmid som används.

Lösning A Lösning B
Komponenter Koncentration Komponenter Koncentration
ATP 1,2 mM Magnesiumglutamat 10 mM
Gtp 0,850 mM Ammoniumglutamat 10 mM
Utp 0,850 mM Kaliumglutamat 130 mM
CTP 0,850 mM Fosfoenolpyruvat (PEP) 30 mM
Folinsyra 31,50 μg/ml L-valin 2 mM
tRNA 170,60 μg/ml L-tryptofan 2 mM
Nikotinamid Adenindinukleotid (NAD) 0,40 mM L-isoleucin 2 mM
Koenzym A 0,27 mM L-leucin 2 mM
Oxalsyra 4,00 mM L-cystein 2 mM
Putrescine 1,00 mM L-metionin 2 mM
Spermidin 1,50 mM L-alanin 2 mM
HEPES Buffert pH 7,5 57,33 mM L-arginin 2 mM
L-Asparagin 2 mM
L-asparaginsyra 2 mM
L-glutaminsyra 2 mM
L-glycin 2 mM
L-glutamin 2 mM
L-histidin 2 mM
L-lysin 2 mM
L-Proline 2 mM
L-Serin 2 mM
L-treonin 2 mM
L-fenylalanin 2 mM
L-tyrosin 2 mM

Tabell 4: Lösning A- och B-komponenter. Stamkoncentrationer för komponenterna för lösning A och B tillsattes med sina respektive mängder, var och en i ett 1,5 ml mikrofugerör.

Extrakt Total proteinkoncentration (μg/ml) Standardavvikelse
2xYTPG 2,5 OD 30617 3745
CFAI 2,5 OD 30895 2254
CFAI 10,0 OD 27905 3582

Tabell 5: Totalt extraktproteinutbyte. Analys av det totala proteinet i olika cellextrakttillväxter. Den totala proteinkoncentrationen bestämdes med hjälp av en Bradford-analys. Varje koncentration bestämdes från tredubblingar med användning av en utspädning på 1:40.

Figure 1
Bild 1: Jämförelse av CFAI och typiskt arbetsflöde från celler till CFPS: Jämförelse av den övergripande tidslinjen från celler till CFPS med hjälp av (A) CFAI-arbetsflödet (vänster, rött) jämfört med (B) tidigare etablerad metod (grön, höger). Jämförelsen visar den minskade forskarövervakningen och tidslinjen när man utför CFPS med CFAI-arbetsflödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: CFAI-pelletsstorleksjämförelse. Jämförelse av CFAI-mediapellets efter cellskörd vid olika OD600. Mediet som odlades till en OD600 på 2,5 producerade en 2,23 g cellpellet (vänster) och mediet som odlades till en OD600 av 10 producerade en 9,49 g cellpellets (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Effekter av tillväxt på CFPS-reaktionsutbyten. Cellfria reaktioner utfördes i ett 1,5 ml mikrofugerör och kvantifierades efter 24 timmars inkubation vid 37 °C med hjälp av en standardkurva för att korrelera fluorescens till sfGFP-koncentration. Den "negativa" motsvarar uppsättningen negativa kontrollreaktioner där inget mall-DNA tillsattes. De traditionella 2xYTPG-medierna (den positiva kontrollen) och CFAI-extrakten är av liknande kvalitet som demonstreras genom deras höga CFPS-avkastning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskarövervakning behövs traditionellt för två nyckelåtgärder under celltillväxt: induktion av T7 RNAP och skörd av celler vid en specifik OD600. CFAI undanröjer båda dessa krav för att minska forskarens tid och tekniska utbildning som krävs för att förbereda högkvalitativa cellextrakt. Automatisk induktion av T7 RNAP uppnås genom att ersätta glukos med laktos som primärsocker i media, vilket undanröjer det tidigare behovet av att aktivt övervaka tillväxten och sedan inducera med IPTG vid en exakt punkt under celltillväxt. Behovet av att aktivt övervaka cellkulturer för att skörda vid en specifik OD600 undanröjs också, vilket frigör forskaren från cellkulturen. Detta bidrar till det senaste arbetet som också har visat produktion av kvalitetsextrakt skördade vid icke-traditionella tider 13,25,26. Den nya medieformuleringen förbättrar buffringskapaciteten och kolkällorna för att stödja aktiv energimetabolism även när cellodlingen närmar sig stationär fas. Kapaciteten att erhålla robusta cellextrakt från höga OD600-kulturer gör det möjligt för forskaren att skörda kulturerna när det passardem 27. Arbetsflödet vi föredrar och rekommenderar är att inokulera kulturen på kvällen och återvända för att skörda nästa morgon.

Att skörda celler vid en högre OD600 resulterar också i en betydligt större mängd celler som erhålls för extraktberedning. För erfarna forskare är det värt att notera att cellpelleten är mycket mörkare i färg jämfört med celler som odlas i 2xYTPG-media, även när de skördas vid en OD600 på 2,5. Det är också viktigt att notera att om hela cellpelleten bearbetas på en gång, kommer den stora mängden resuspension som erhålls per cellpellets när man utför lys via ultraljudsbehandling att ta lite tid. Därför är det viktigt att hålla alla alikvoter kalla under denna process 11,13,14. Ökningen av extraktvolymen per tillväxt minskar kostnaden proportionellt och stöder biotillverkningstillämpningar. Med de förbättringar som demonstrerats ger CFAI-arbetsflödet ett enklare protokoll för nya och erfarna användare av cellfri teknik att producera reproducerbart, funktionellt E. coli-extrakt.

Trots fördelarna med de tillhandahållna CFAI-medierna finns det begränsningar för denna metod. Den främsta utmaningen är arbetsflödets framväxande natur. Medan metabolomikanalys har belyst skillnaderna i CFAI OD600 10-extrakt samt reaktionsprodukter jämfört med 2xYTPG, förblir konsekvenserna av dessa skillnader på specifika applikationer okarakteriserade27. Dessutom har detta arbetsflöde utvecklats för BL21 E. coli-baserad lysat. Det är oklart om medieomformuleringen skulle stödja robust extraktberedning från andra E. coli-stammar, såsom de genomiskt omkodade stammarna av E. coli28,29. Det är möjligt att CFAI-metoden kan användas för att generera extrakt från andra bakterieorganismer, men det är osannolikt att stödja extraktberedning för eukaryota organismer såsom kinesisk hamsteräggstock eller kaninretikulocyt; dessa har dock sina egna etablerade metoder30,31. Vi förväntar oss att enkelheten i CFAI-arbetsflödet kommer att minska hindren och stimulera det cellfria samhället att karakterisera och utvärdera dess användbarhet för det breda utbudet av applikationer som CFPS stöder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressekonflikter.

Acknowledgments

Författare vill tacka Dr Jennifer VanderKelen och Andrea Laubscher för teknisk support. Författarna vill också tacka Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington och Jillian Kasman för hjälpsamma diskussioner. Författare erkänner också finansieringsstöd från Bill och Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly och National Science Foundation (NSF-1708919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Tags

Bioteknik utgåva 173

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Från celler till cellfri proteinsyntes inom 24 timmar med hjälp av cellfritt autoinduktionsarbetsflöde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, … More

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter