Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu çalışma, Escherichia coli'den (E. coli ) hücre ekstraktının hazırlanmasını ve ardından 24 saatten kısa sürede hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını açıklamaktadır. Hücresiz otoindüksiyon (CFAI) protokolünün açıklaması, araştırmacı gözetimini azaltmak ve elde edilen hücre ekstraktı miktarlarını artırmak için yapılan iyileştirmeleri detaylandırmaktadır.

Abstract

Hücresiz protein sentezi (CFPS), transkripsiyon ve çeviri makinelerini in vitro olarak yakalayan bir biyoteknoloji platformu olarak büyümüştür. Çok sayıda gelişme, CFPS platformunu yeni kullanıcılar için daha erişilebilir hale getirdi ve uygulama yelpazesini genişletti. Lisat bazlı CFPS sistemleri için, hücre ekstraktları çeşitli organizmalardan üretilebilir ve protein sentezini arttırmak için bu konağın benzersiz biyokimyasından yararlanılabilir. Son 20 yılda, Escherichia coli (E. coli), satın alınabilirliği ve çok yönlülüğü nedeniyle CFPS'yi desteklemek için en yaygın kullanılan organizmalardan biri haline gelmiştir. Çok sayıda önemli ilerlemeye rağmen, E. coli hücre ekstraktı hazırlama iş akışı, yeni kullanıcıların uygulamaları için CFPS'yi uygulamaları için uygulamaları için önemli bir darboğaz olmaya devam etmiştir. Ekstrakt hazırlama iş akışı zaman alıcıdır ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için teknik uzmanlık gerektirir. Bu engellerin üstesinden gelmek için, daha önce kullanıcı girdisini ve gerekli teknik uzmanlığı azaltan 24 saat hücresiz otomatik indüksiyon (CFAI) iş akışının geliştirildiğini bildirmiştik. CFAI iş akışı, hücre ekstraktları üretmek için gereken işçiliği ve teknik beceriyi en aza indirirken, elde edilen toplam hücre ekstresi miktarlarını da arttırır. Burada, erişimi iyileştirmek ve E. coli tabanlı CFPS'nin geniş kapsamlı uygulamasını desteklemek için bu iş akışını adım adım açıklıyoruz.

Introduction

Biyoteknoloji uygulamaları için hücresiz protein sentezinin (CFPS) kullanımı son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır 1,2,3. Bu gelişme kısmen, CFPS'de meydana gelen süreçleri ve her bir bileşenin rolünü anlamada artan çabalara bağlanabilir 4,5. Ek olarak, optimize edilmiş kurulumlara ve alternatif enerji kaynaklarına atfedilen azaltılmış maliyetler, hücresiz teknolojinin yeni kullanıcılar için uygulanmasını kolaylaştırmıştır 6,7,8,9. Protein sentezi için gerekli transkripsiyon ve translasyon faktörlerini uygulamak için, hücre ekstresi genellikle hücresiz reaksiyonları yönlendirmek için kullanılır10. Son zamanlarda yayınlanan kullanım kılavuzları, işlevsel özüt üretmek için basit protokoller sağlamış ve1,11,12,13,14 gibi yeni ve deneyimli kullanıcılar için uygulamayı kolaylaştırmıştır. Hücre ekstraktı genellikle, istenen spesifik kullanıma bağlı olarak farklı organizmalar kullanılarak yetiştirilebilen bir hücre kültürünün lizisi yoluyla elde edilir 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) hızla fonksiyonel ekstraktlar üretmek için en yaygın kullanılan konakçı organizmalardan biri haline gelmiştir17. BL21 Star (DE3) suşu tercih edilir, çünkü proteazları dış zardan (OmpT proteaz) ve sitoplazmadan (Lon proteaz) uzaklaştırır ve rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ortamı sağlar. Ek olarak, DE3, lacUV5 promotörünün kontrolü altında T7 RNA polimeraz (T7 RNAP) genini taşıyan λDE3'ü içerir; yıldız bileşeni, mRNA4,14,18,19'un bölünmesini önleyen mutasyona uğramış bir RNaseE geni içerir. LakUV5 promotörü altında, izopropil-tiyogalaktopiranosid (IPTG) indüksiyonu, T7 RNAP20,21'in ekspresyonuna izin verir. Bu suşlar, ekstrakt hazırlanması için hammadde veren hücrelerin büyümesi ve toplanması için kullanılır. Hücre lizisi, boncuk çırpma, Fransız presi, homojenizasyon, sonikasyon ve azot kavitasyonu1,11,12,22 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bakteri kültürü ve hasat süreci, E. coli kullanırken çoğu platformda tutarlıdır, ancak birkaç gün ve yoğun araştırmacı gözetimi gerektirir 1,11,13. Bu işlem genellikle LB suyunda bir gecede tohum kültürü ile başlar, bu da gece büyümesi üzerine ertesi gün daha büyük bir 2xYTPG kültürüne (maya, tripton, fosfat tamponu, glikoz) aşılanır. Bu daha büyük kültürün büyümesi, 2.5 14,20'lik bir optik yoğunlukta (OD) erken-orta log fazına ulaşana kadar izlenir. Transkripsiyon ve çeviri bileşenlerinin daha önce23,24 erken ve orta log fazında oldukça aktif olduğu gösterildiğinden sürekli ölçüm gereklidir. Bu işlem tekrarlanabilir ekstrakt oluşturabilse de, laboratuvarımız yakın zamanda araştırmacı gözetimini azaltan, belirli bir litre hücre kültürü için ekstraktın genel verimini artıran ve hem deneyimli hem de yeni kullanıcılar için E. coli bazlı ekstrakt preparatına erişimi artıran Hücresiz Otomatik İndüksiyon (CFAI) Ortamını kullanarak yeni bir yöntem geliştirmiştir (Şekil 1 ). Burada, CFAI iş akışını uygulamak için, çizgili bir hücre plakasından 24 saat içinde tamamlanmış bir CFPS reaksiyonuna geçmek için adım adım kılavuz sunuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medya büyümesi

  1. Tablo 1'de açıklandığı gibi 960 mL CFAI ortamı hazırlayın ve KOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
  2. Kültür ortamını 121 °C'de 30 dakika boyunca 2,5 L şaşkın şişeye ve otoklavlara aktarın.
  3. Tablo 1'de açıklandığı gibi 40 mL'lik bir şeker çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi ayrı bir otoklavlanmış cam kaba filtreleyerek sterilize edin.
    NOT: Şeker çözeltisi, daha fazla kullanıma kadar 30 °C'lik bir inkübatörde saklanabilir.
  4. Otoklavlamadan sonra ortamın 40 °C'nin altına tamamen soğumasını bekleyin.
  5. CFAI ortamının aşılanmasından önce, şeker çözeltisini doğrudan CFAI ortamına ekleyin.
  6. Medyayı aşılamak için, daha önce çizgilenmiş bir E. coli BL21 Star (DE3) plakasından bir döngü dolusu koloni kaydırın ve doğrudan ortama yerleştirin. Döngüyü ortama döndürün, ancak kabın kenarlarına dokunmaktan kaçının. Çizgi plakasının canlı hücrelerle taze olduğundan emin olun.
  7. Şişeyi aşılanmış ortamla birlikte 200 rpm'de sallarken 30 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kültürün bir gecede büyümesine izin verin. Hücreler akşamları aşılanırsa, kültür ertesi sabah 10'un 600 nm'sinde (OD600) ölçülen yaklaşık bir optik yoğunluğa ulaşacaktır. Aşılama ve hasat zamanları gerektiği gibi ayarlanabilir.

2. Hücre hasadı

  1. S30 arabelleğini önceden hazırlayın ve soğuk tutun. S30 tamponunu Tablo 2'ye göre son pH değeri 8,2'ye hazırlayın.
    NOT: S30 tamponu, hücre hasadından günler önce hazırlanabilir. Bu yapılırsa, ditiyotrreitol olmadan hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce dithiothreitol ekleyin.
  2. Bu noktadan itibaren, tüm çözeltileri ve malzemeleri buz üzerinde tutun. 1 L ortamın 1 L santrifüj şişesine aktarılması ve 10 dakika boyunca 4-10 °C arasında 5.000 x g'de santrifüj yapılması. Süpernatanın dekantını ve elden çıkarın. Steril bir spatula kullanarak, peleti önceden soğutulmuş ve daha önce tartılmış 50 mL konik bir tüpe aktarın.
  3. 30-40 mL soğuk S30 tamponu ile bir kez yıkayın, buz üzerinde dinlenme süreleri olan 30 saniyelik patlamalarda vorteks yoluyla peleti yeniden askıya alın.
    NOT: Daha yüksek bir pelet hacmi nedeniyle, hücre peletinin iki adet 50 mL konik tüpe bölünmesi, yıkama adımı için yararlı olabilir. Hücrelerin daha küçük alikotlarda depolanması, aşağı akış işleme için esneklik de sağlar.
  4. Hücre süspansiyonunu 5000 x g'da 4-10 °C arasında 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı atın ve temiz bir doku kullanarak 50 mL konik tüpün iç duvarlarındaki fazlalıkları silin, peletin kendisine dokunmaktan kaçının. Tartın ve peleti sıvı azot içinde dondurun. Daha fazla kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Kullanıcı ekstrakt hazırlama protokolüne devam etmeyi planlıyorsa, peletler flaş dondurma gerektirmeyebilir.

3. Ekstrakt hazırlama

  1. Dondurulmuş peleti, hücre peletinin her 1 g'ı için 1 mL S30 tamponu ile birleştirin ve yaklaşık 30-60 dakika boyunca buz üzerinde çözülmeye bırakın. Çözülmüş peleti vorteks yoluyla buz üzerinde dinlenme süreleri olan 30 saniyelik patlamalarda yeniden askıya alın. Görünür hücre kümeleri kalmayana kadar vorteks.
    NOT: Daha küçük kümeler, pipet kullanılarak karıştırılarak yeniden askıya alınabilir.
  2. 1.4 mL hücre resüspansiyonunun alikotlarını hücre lizisi için 1.5 mL mikrofüj tüplerine aktarın. Her tüpü 20 kHz frekansında ve% 50 genlikte, bir buz banyosu ile çevrili döngü başına 59 s dinlenme ile 45 s'lik üç patlama için sonikleştirin. Tüpü döngüler arasında ters çevirin ve son sonikasyon döngüsünden sonra hemen 4.5 μL 1 M ditiyotreitol ekleyin.
    NOT: Sonikasyondan salınan ısı nedeniyle, sonikasyon yapılmadığında tüm alikotların buz üzerinde tutulduğundan emin olmak son derece önemlidir. Buz banyosu sürekli olarak yenilenmeli veya tüm sonikasyon süreci boyunca serin kalacak kadar büyük olmalıdır.
  3. Her tüpü 10 dakika boyunca 18.000 x g ve 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatant ve alikotu 600 μL alikotta 1,5 mL mikrofüj tüplerine alın. Alikotları flaşla dondurun ve daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın. Pipete sadece süpernatant dikkat edilmelidir.

4. Hücresiz protein sentezi

  1. Quadruplicate'te 1.5 mL mikrofüj tüplerinde 15 μL hücresiz protein sentez reaksiyonları gerçekleştirmek için önceki adımdan bir aliquot ekstraktı çözün.
  2. Her reaksiyonu, 240 ng DNA (16 μg / mL nihai konsantrasyon), 2.20 μL Çözelti A, 2.10 μL Çözelti B, 5.0 μL ekstrakt ve 15 μL'ye reaksiyonu doldurmak için değişen hacimde moleküler dereceli suyu birleştirerek hazırlayın. Bu reaksiyon daha yüksek hacimlere ölçeklendirilebilir. Oranlar için Tablo 3'e bakınız.
    1. A ve B çözeltilerini Tablo 4'e göre hazırlayın. Her çözelti 100 μL ila 1 mL'lik partiler halinde hazırlanabilir, aliquoted edilebilir ve daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklanabilir.
      NOT: DNA miktarı, ilgilenilen proteine bağlı olarak değişebilir. Bu durumda, kullanılan plazmid, pJL1-sfGFP, 16 μg / mL veya 597 μM'de performans gösterecek şekilde optimize edilmiştir.
  3. Reaksiyonların 37 °C'de en az 4 saat çalışmasına izin verin.

5. Muhabir proteininin miktarı, süper klasör yeşil floresan proteini (sfGFP)

  1. Yarım alanlı 96 kuyucuklu siyah polistiren plaka kullanarak, her hücresiz protein sentezi reaksiyon ürününün 2 μL'sini, pH 7.2'de 48 μL 0.05 M HEPES tamponu ile birleştirin. Her reaksiyon tüpünün üç ila dört kopyası önerilir.
  2. SfGFP'nin floresan yoğunluğunu 485 nm uyarma dalga boyu ve 528 nm emisyon dalga boyu ile ölçün.
  3. Bağıl floresan birimlerinin sfGFP'nin hacimsel verimine (μg / mL) dönüştürülmesi için, saflaştırılmış pJL1-sfGFP kullanarak standart bir eğri oluşturun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CFAI ortamı hazırlanırken, glikoz, ortamdaki ana enerji substratı olarak laktoz ve gliseroldeki bir artış ile değiştirildi. Ek olarak, CFAI ortamının tamponlama kapasitesi de artırıldı. Bu özel bileşenler Tablo 1'de verilmiştir.

Hücreler daha sonra değişen ekstrakt miktarlarına rağmen ekstrakt kalitesiyle tutarlılık göstermek için hem OD600 / 10'a hem de CFAI ortamındaki standart 2.5'e büyütüldü. 2.5 OD600 CFAI ortamı, LB suyundaki bir tohum kültüründen 37 ° C, 200 rpm'de aşılandıktan sonra yetiştirilirken, OD600 10 kültürü doğrudan bir plakadan aşılandı. CFAI ortamının her partisi daha sonra kendi OD600'lerinde izlendi ve hasat edildi. 10'luk bir OD600'e büyüme, daha yüksek miktarda hücre peleti ve elde edilen genel ekstraktta bir artışa yol açtı, çünkü büyümeden elde edilen 2.10 mL ekstrakta karşı 2.5 OD 600'e kadar9.60 mL ekstrakt üretti (Şekil 2). Toplam protein konsantrasyonunun daha ileri analizi, her ekstrakttaki genel proteinde anlamlı bir fark göstermemiştir (Tablo 5). Farklı optik yoğunluk seviyelerine yetiştirilmiş olsalar da, her iki ekstrakt partisi de sfGFP kullanarak hücresiz reaksiyonlarda benzer sonuçlar göstermiştir (Şekil 3). Bu, artan tamponlama kapasitesinin, ana karbon kaynağı olarak laktoz ve gliserol kullanımının ve T7RNAP indüksiyonu için IPTG yerine laktoz uygulanmasının kombinasyonunun, ekstrakt büyümelerini 10'un altındaki herhangi bir OD600'e stabilize etmeye yardımcı olduğunu göstermektedir.

Otoklavlanmış CFAI Medya:
Bileşen Miktar
Sodyum Klorür 5.0 gr
Tripton 20.0 gr
Maya Ekstresi 5.0 gr
Potasyum Fosfat, monobazik 6.0 gr
Potasyum Fosfat, dibazik 14.0 gr
NanopureTM Su Toplam 960 mL'ye kadar doldurma
Filtre Sterilize Şeker Çözeltisi:
Bileşen Miktar
D-Glikoz 0.50 gr
D-Laktoz 4.0 gr
%80 v/v Gliserol 7,5 mL
NanopureTM Su 28,0 mL

Tablo 1: CFAI bileşenleri. CFAI ortam ve şeker çözeltileri için bileşenler ve ilgili miktarları. Ortam, her bir bileşenin eklenmesi boyunca karıştırılmalı ve şeker çözeltisi filtresi sterilize edilmelidir. Her çözelti, aşılamadan önce ayrı bir steril kaba eklenmelidir.

S30 Arabellek
Bileşen Konsantrasyon
Oda sıcaklığında Tris Asetat pH 8.2 10 mM
Magnezyum Asetat 14 mM
Potasyum Asetat 60 mM
Ditiothreitol 2 mM

Tablo 2: S30 tampon bileşenleri: S30 tampon bileşenleri, steril 50 mL konik bir tüpe ilgili miktarlarıyla birlikte eklendi.

Parça Miktar
Çözüm A 2,20 μL
Çözüm B 2,1 μL
Hulâsa 5 μL
DNA Şablonu 16 μg/mL son işlem için ses seviyesi
Su Toplam 15 μL'ye kadar doldurun

Tablo 3: CFPS reaksiyon oranları: Çözüm A, Çözüm B ve ekstrakt için göreceli hacim yüzdeleri. DNA hacmi, spesifik plazmidin konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir ve kullanıcının kullanılan spesifik plazmidi için optimize edilmesi gerekebilir.

Çözüm A Çözüm B
Bileşen Konsantrasyon Bileşen Konsantrasyon
Atp 1,2 mM Magnezyum Glutamat 10 mM
GTP (İngilizce) 0.850 mM Amonyum Glutamat 10 mM
Utp 0.850 mM Potasyum Glutamat 130 mM
cesaret 0.850 mM Fosfoenolpiruvat (PEP) 30 mM
Folinik Asit 31,50 μg/mL L-Valin 2 mM
tRNA 170,60 μg/mL L-Triptofan 2 mM
Nikotinamid Adenin Dinükleotid (NAD) 0,40 mM L-İzolösin 2 mM
Koenzim A 0,27 mM L-Lösin 2 mM
Oksalik Asit 4,00 mM L-Sistein 2 mM
Putrescine 1,00 mM L-Metiyonin 2 mM
Spermidin 1,50 mM L-Alanin 2 mM
HEPES Tampon pH 7.5 57,33 milyon M L-Arginin 2 mM
L-Asparajin 2 mM
L-Aspartik Asit 2 mM
L-Glutamik asit 2 mM
L-Glisin 2 mM
L-Glutamin 2 mM
L-Histidin 2 mM
L-Lizin 2 mM
L-Prolin 2 mM
L-Serin 2 mM
L-Treonin 2 mM
L-Fenilalanin 2 mM
L-Tirozin 2 mM

Tablo 4: Çözüm A ve B bileşenleri. Çözelti A ve B bileşenleri için stok konsantrasyonları, her biri 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde kendi miktarlarıyla birlikte eklenmiştir.

Hulâsa Toplam Protein Konsantrasyonu (μg/mL) Standart sapma
2xYTPG 2,5 OD 30617 3745
CFAI 2.5 OD 30895 2254
CFAI 10.0 OD 27905 3582

Tablo 5: Toplam ekstrakt protein verimi. Farklı hücre ekstresi büyümelerinin toplam proteininin analizi. Toplam protein konsantrasyonu Bradford Testi kullanılarak belirlendi. Her konsantrasyon, 1:40 seyreltme kullanılarak üçlü olarak belirlendi.

Figure 1
Şekil 1: CFAI'nin ve hücrelerden CFPS'ye tipik iş akışının karşılaştırılması: (A) CFAI iş akışı (sol, kırmızı) ile (B) önceden belirlenmiş yöntem (yeşil, sağ) kullanılarak hücrelerden CFPS'ye genel zaman çizelgesinin karşılaştırılması. Karşılaştırma, CFAI iş akışını kullanarak CFPS gerçekleştirirken azaltılmış araştırmacı gözetimini ve zaman çizelgesini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CFAI pelet boyutu karşılaştırması. Farklı OD600'de hücre hasadı sonrası CFAI ortam peletlerinin karşılaştırılması. 2.5'lik bir OD 600'e yetiştirilen medya, 2.23 g'lık bir hücre peleti (solda) üretti ve 10'un OD600'üne yetiştirilen medya, 9.49 g'lık bir hücre peleti (sağda) üretti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Büyümenin CFPS reaksiyon verimleri üzerindeki etkileri . (A) CFPS reaksiyon verimlerinin 2,5 OD600 ve 10 OD600 arasındaki büyümeler arasında karşılaştırılması, (B) her CFPS reaksiyonunun görüntüleri kendi verimlerinin üzerindedir. Hücresiz reaksiyonlar 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde gerçekleştirildi ve floresanı sfGFP konsantrasyonuyla ilişkilendirmek için standart bir eğri kullanılarak 37 ° C'de 24 saatlik inkübasyondan sonra ölçüldü. "Negatif", hiçbir şablon DNA'nın eklenmediği negatif kontrol reaksiyonları kümesine karşılık gelir. Geleneksel 2xYTPG ortamı (pozitif kontrol) ve CFAI ekstraktları, yüksek CFPS verimleriyle gösterildiği gibi benzer kalitededir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücre büyümesi sırasında iki temel eylem için geleneksel olarak araştırmacı gözetimine ihtiyaç vardır: T7 RNAP'nin indüksiyonu ve belirli bir OD600'de hücrelerin toplanması. CFAI, araştırmacının zamanını ve yüksek kaliteli hücre ekstraktları hazırlamak için gereken teknik eğitimi azaltmak için bu gereksinimlerin her ikisini de ortadan kaldırır. T7 RNAP'nin otomatik indüksiyonu, glikozun ortamdaki birincil şeker olarak laktoz ile değiştirilmesi, büyümenin aktif olarak izlenmesi ve daha sonra hücre büyümesi sırasında kesin bir noktada IPTG ile indüklenmesi için önceki ihtiyacın ortadan kaldırılmasıyla elde edilir. Belirli bir OD600'de hasat yapmak için hücre kültürlerini aktif olarak izleme ihtiyacı da ortadan kalkar ve araştırmacıyı hücre kültüründen ayırır. Bu, geleneksel olmayan zamanlarda hasat edilen kaliteli ekstraktların üretimini de gösteren son çalışmalara katkıda bulunur 13,25,26. Yeni medya formülasyonu, hücre kültürü durağan faza yaklaşırken bile aktif enerji metabolizmasını desteklemek için tamponlama kapasitesini ve karbon kaynaklarını geliştirir. Yüksek OD600 kültürlerinden sağlam hücre ekstraktları elde etme kapasitesi, araştırmacının kültürleri kolaylıkla hasat etmesini sağlar27. Tercih ettiğimiz ve önerdiğimiz iş akışı, akşamları kültürü aşılamak ve ertesi sabah hasada geri dönmektir.

Daha yüksek bir OD600'de hücrelerin toplanması, ekstrakt hazırlığı için elde edilen önemli miktarda hücreye de neden olur. Deneyimli araştırmacılar için, hücre peletinin, 2.5'lik bir OD600'de hasat edildiğinde bile, 2xYTPG ortamında yetiştirilen hücrelere kıyasla çok daha koyu renkli olduğunu belirtmek gerekir. Tüm hücre peleti bir kerede işleniyorsa, sonikasyon yoluyla lizis gerçekleştirirken hücre peleti başına elde edilen büyük miktarda resüspansiyonun biraz zaman alacağına dikkat etmek de önemlidir. Bu nedenle, bu işlem sırasında tüm alikotları soğuk tutmak önemlidir11,13,14. Büyüme başına ekstrakt hacmindeki artış, maliyeti orantılı olarak düşürür ve biyo-üretim uygulamalarını destekler. Gösterilen iyileştirmelerle, CFAI iş akışı, hücresiz teknolojinin yeni ve deneyimli kullanıcıları için tekrarlanabilir, işlevsel E. coli özü üretmek için daha kolay bir protokol sağlar.

Sağlanan CFAI ortamının avantajlarına rağmen, bu yöntemin sınırlamaları vardır. Birincil zorluk, iş akışının yeni ortaya çıkan doğasıdır. Metabolomik analiz, CFAI OD600 10 ekstraktlarının yanı sıra reaksiyon ürünlerindeki 2xYTPG'ye kıyasla farklılıklara ışık tutmuş olsa da, bu farklılıkların spesifik uygulamalar üzerindeki etkileri karakterize edilmemiştir27. Ek olarak, bu iş akışı BL21 E. coli bazlı lizat için geliştirilmiştir. Medya yeniden formülasyonunun, E. coli 28,29'un genomik olarak yeniden kodlanmış suşları gibi diğer E. coli suşlarından sağlam ekstrakt preparatını destekleyip desteklemeyeceği belirsizdir.  CFAI yaklaşımının diğer bakteriyel organizmalardan ekstraktlar üretmek için kullanılması mümkündür, ancak Çin Hamster Yumurtalık veya tavşan retikülosit gibi ökaryotik organizmalar için ekstrakt preparatını destekleme olasılığı düşüktür; ancak, bunların kendi yerleşik yöntemleri vardır30,31. CFAI iş akışının basitliğinin engelleri azaltacağını ve hücresiz topluluğu, CFPS'nin desteklediği geniş uygulama yelpazesi için faydasını karakterize etmeye ve değerlendirmeye teşvik edeceğini öngörüyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rakip finansal çıkar çatışmalarına sahip olmadıklarını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, teknik destek için Dr. Jennifer VanderKelen ve Andrea Laubscher'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yararlı tartışmalar için Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Voyvoda, Logan Burrington ve Jillian Kasman'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Bill ve Linda Frost Fonu, Biyoteknoloji Uygulamaları Merkezi'nin Chevron Biyoteknoloji Uygulamalı Araştırma Bağış Bursu, Cal Poly Research, Bilimsel ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF-1708919) finansman desteğini de kabul ediyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Tags

Biyomühendislik Sayı 173

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, … More

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter