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Biology

चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग द्वारा सह-अनुवादक इंटरैक्शन नेटवर्क की वैश्विक पहचान

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

सह-अनुवादक इंटरैक्शन नवजात-श्रृंखला संशोधनों, लक्ष्यीकरण, तह और असेंबली मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां, हम चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग का वर्णन करते हैं, विवो में एक विधि, मॉडल यूकेरियोट सैकेरोमाइसेस सेरेविसिया में इन इंटरैक्शन का प्रत्यक्ष विश्लेषण।

Abstract

हाल के वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि राइबोसोम न केवल हमारे एमआरएनए को डिकोड करते हैं, बल्कि भीड़ वाले सेलुलर वातावरण में पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के उद्भव का मार्गदर्शन भी करते हैं। राइबोसोम झिल्ली-लक्ष्यीकरण कारकों के स्थानिक और किनेटिक रूप से नियंत्रित बंधन, एंजाइमों को संशोधित करने और चैपरोन को तह करने के लिए मंच प्रदान करते हैं। यहां तक कि उच्च-क्रम ओलिगोमेरिक परिसरों में असेंबली, साथ ही प्रोटीन-प्रोटीन नेटवर्क गठन चरणों को हाल ही में संश्लेषण के साथ समन्वित करने की खोज की गई थी।

यहां, हम चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग का वर्णन करते हैं, विवो में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को पकड़ने के लिए विकसित एक विधि। हम राइबोसोम-नवजात-श्रृंखला परिसरों को सह-अनुवादक इंटरैक्टर्स के साथ-साथ एमआरएनए निष्कर्षण, आकार बहिष्करण, रिवर्स प्रतिलेखन, गहरी अनुक्रमण और बड़े डेटा विश्लेषण चरणों के साथ कैप्चर करने के लिए आवश्यक विभिन्न आत्मीयता शुद्धिकरण चरणों का विस्तार करेंगे, जो निकट-कोडन रिज़ॉल्यूशन में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को समझने के लिए आवश्यक हैं।

Introduction

एसईलेक्टिव आरइबोसोम पीरोफिलिंग (एसईआरपी) आज तक का एकमात्र तरीका है, जो विवो में, सीधे तरीके से 1,2,3,4,5,6 में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को कैप्चर और चिह्नित करता है। एसईआरपी निकट कोडन रिज़ॉल्यूशन 2,7 में राइबोसोम का अनुवाद करने के साथ किसी भी कारक की बातचीत की वैश्विक रूपरेखा को सक्षम बनाता है।

विधि बढ़ती कोशिकाओं के फ्लैश फ्रीजिंग और सक्रिय अनुवाद को संरक्षित करने पर निर्भर करती है। राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों को छोड़कर सेल में सभी एमआरएनए को पचाने के लिए सेल लाइसेट्स को आरनेस आई के साथ इलाज किया जाता है जिसे "राइबोसोम पैरों के निशान" कहा जाता है। नमूना तब दो भागों में विभाजित किया जाता है; एक भाग का उपयोग सीधे सभी सेलुलर राइबोसोमल पैरों के निशान के अलगाव के लिए किया जाता है, जो सेल में सभी चल रहे अनुवाद का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरे भाग का उपयोग ब्याज के कारक से जुड़े राइबोसोम के विशिष्ट सबसेट की आत्मीयता-शुद्धि के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए: एंजाइमों को संशोधित करना, अनुवाद कारक, तह चैपरोन और जटिल-असेंबली इंटरैक्शन। आत्मीयता-शुद्ध राइबोसोमल पैरों के निशान को सामूहिक रूप से इंटरैक्टोम कहा जाता है। फिर, राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए निकाले जाते हैं और सीडीएनए लाइब्रेरी पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाते हैं, इसके बाद गहरी अनुक्रमण होता है।

कुल अनुवाद और इंटरैक्टोम नमूनों का तुलनात्मक विश्लेषण उन सभी ऑर्फ की पहचान करने की अनुमति देता है जो ब्याज के कारक के साथ-साथ प्रत्येक ओआरएफ इंटरैक्शन प्रोफाइल के लक्षण वर्णन के साथ जुड़ते हैं। यह प्रोफ़ाइल सटीक सगाई की शुरुआत और समाप्ति अनुक्रमों की रिपोर्ट करती है जिसमें से कोई डीकोडेड कोडन और उभरती पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के संबंधित अवशेषों के साथ-साथ बातचीत 7,8 के दौरान राइबोसोम गति भिन्नताओं का अनुमान लगा सकता है। चित्रा 1 एक योजनाबद्ध के रूप में प्रोटोकॉल को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एसईआरपी प्रोटोकॉल का अवलोकन। यह प्रोटोकॉल 7-10 दिनों के भीतर अपनी संपूर्णता में किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग के लिए उपभेदों का उत्पादन

नोट: सेलेक्टिव आरइबोसोम पीरोफिलिंग (एसईआरपी) एक ऐसी विधि है जो राइबोसोम-नवजात श्रृंखला परिसरों के साथ बातचीत के अपने तरीके का आकलन करने के लिए ब्याज के कारकों की आत्मीयता शुद्धि पर निर्भर करती है। सजातीय पुनर्संयोजन9, साथ ही सीआरआईएसपीआर / कैस 910 आधारित तरीकों का उपयोग आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए टैग के साथ ब्याज के विभिन्न कारकों को फ्यूज करने के लिए किया जाता है। इस तरह के टैग जीएफपी हैं, जीएफपी-ट्रैप आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए, आईजीजी-सेफरोज मोती शुद्धिकरण के लिए टीएपी-टैग के साथ-साथ एविडिन या स्ट्रेप्टाविडिन द्वारा शुद्ध एवीआई-टैग, हाल के वर्षों से कुछ सफल उदाहरणों को सूचीबद्ध करने के लिए।

  1. यह मान्य करने के लिए विकास या कार्यात्मक परख करें कि टैगिंग ने प्रोटीन फ़ंक्शन को प्रभावित नहीं किया। एन 'बनाम सी' टर्मिनल टैगिंग का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
    नोट: राइबोसोम (आरआरएनए), साथ ही विभिन्न कारकों में कई राइबोसोम-बाइंडिंग डोमेन, अत्यधिक चार्ज किए जाते हैं, जिससे अत्यधिक चार्ज किए गए टैग (जैसे पॉलीहिस्टिडाइन) का उपयोग करने के लिए अप्रत्याशित हो जाता है, क्योंकि इससे झूठी खोज या परिवर्तित बाध्यकारी मोड हो सकता है।

2. संस्कृति विकास

  1. निर्मित खमीर संस्कृतियों (तनाव बीवाई 4741 के आधार पर) की खेती करें, जिसमें वांछित टैग किए गए प्रोटीन होते हैं, या तो तरल खमीर-निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोज (वाईपीडी) समृद्ध माध्यम में, या सिंथेटिक डेक्सट्रोज (एसडी) न्यूनतम माध्यम (अमोनियम सल्फेट के साथ 1.7 ग्राम /
  2. एक उपयुक्त माध्यम में 30 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 आयुध डिपो600 (मध्य लॉग) के लिए सेल संस्कृति के 250-500 एमएल बढ़ो।

3. सेल संग्रह और लसीका

  1. ग्लास फ़िल्टरिंग सिस्टम (1 एल ग्लास फ़नल, वैक्यूम बेस और कैप, स्टेनलेस स्टील स्क्रीन, गैस्केट और स्प्रिंग क्लैंप, 90 मिमी; ग्राउंड जॉइंट फ्लास्क 1 एल के साथ ग्लास फिल्टर धारक) के साथ 0.45 μm नाइट्रोसेल्यूलोज सोख्ता झिल्ली पर वैक्यूम निस्पंदन द्वारा कोशिकाओं को तेजी से इकट्ठा करें।
  2. फ्लैश एकत्र कोशिकाओं को फ्रीज करें, एक स्पैटुला के साथ गोली वाली कोशिकाओं को स्क्रैप करके और तुरंत उन्हें तरल नाइट्रोजन से भरे 50 एमएल ट्यूब में डुबो दें।
    स्टॉपिंग पॉइंट: कोशिकाओं को 3-4 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. एक मिक्सर मिल में क्रायोजेनिक पीसने से सेल लिसिस करें: 30 हर्ट्ज पर 2 मिनट के लिए दो बार, लाइसिस बफर के 1 एमएल के साथ ( तालिका 1 देखें)। मिलिंग के बीच तरल नाइट्रोजन में ठंडा करें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
10 मिलीग्राम/एमएल सीएचएक्स (साइक्लोहेक्सिमाइड) 220 0.5 मिलीग्राम /
1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 88 20 एमएम
3 एम केसीएल 205.7 140 एमएम
1 एम एमजीसीएल2 26.4 6 एमएम
1 एम पीएमएसएफ 4.4 1 एमएम
एनपी -40 4.4 0.10%
प्रोटीज अवरोधक 2 गोलियां
मैं 8.8 0.02 यू /
अंतिम वॉल्यूम 4,400

तालिका 1: लाइसिस बफर मास्टर मिश्रण के लिए पकाने की विधि।

नोट: ब्याज का प्रोटीन बहुत अस्थिर होने की स्थिति में अधिक प्रोटीज अवरोधकों (जैसे कि बेस्टैटिन, ल्यूपेप्टिन, एप्रोटिनिन, आदि) को शामिल करने के लिए लाइसिस बफर को बदला जा सकता है, लेकिन निम्नलिखित चरणों के दौरान इकट्ठे राइबोसोम के छोटे और बड़े सबयूनिट्स को बनाए रखने के लिए ईडीटीए से बचना महत्वपूर्ण है। इसी तरह के कारणों से, हमेशा बफर समाधान में कम से कम 6 एमएम एमजीसीएल2 बनाए रखें।

सावधानी: एचसीएल अत्यधिक संक्षारक है और पीएमएसएफ विषाक्त है। दस्ताने पहनें और देखभाल के साथ संभालें।

  1. लाइसेट को साफ करने और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए 30,000 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।

4. एसईआरपी के लिए राइबोसोम-नवजात-श्रृंखला परिसरों का शुद्धिकरण

  1. प्रत्येक प्रयोग के लिए, सतह पर तैरनेवाला को दो भागों में विभाजित करें; एक अलग माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक: कुल आरएनए नमूना (~ 200 μL) और इम्यूनोप्यूरिफिकेशन (आईपी) नमूना (~ 700 μL) अनुवाद नमूने।
  2. कुल आरएनए नमूने को संसाधित करना
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए आरनेस आई के 10 यू का उपयोग करके कुल आरएनए नमूना डाइजेस्ट करें; एक घूर्णन मिश्रण रैक के साथ 30 आरपीएम पर बारी बारी से।
      नोट: पाचन की स्थिति को पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मोनोसोम चोटी का कोई अधिक या अंडर-पाचन न हो।
    2. सुक्रोज कुशन मास्टर मिश्रण तैयार करें जैसा कि तालिका 2 में वर्णित है।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
50% सुक्रोज 200 25%
1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 8 20 एमएम
3 एम केसीएल 18.7 140 एमएम
1 एम एमजीसीएल2 4 10 एमएम
100 मिलीग्राम/एमएल सीएचएक्स 0.4 0.1 मिलीग्राम /
प्रोटीज अवरोधक 1 गोली
अंतिम वॉल्यूम 400

तालिका 2: सुक्रोज कुशन मास्टर मिश्रण के लिए पकाने की विधि।

  1. 245,000 एक्स जी पर 90 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टीएलए 120-रोटर में सुक्रोज कुशन और अपकेंद्रित्र के 400 μL पर नमूना लोड करें।
  2. एक वैक्यूम पंप के साथ सतह पर तैरनेवाला जल्दी से निकालें और एक 150 μL लाइसिस बफर के साथ उपरिशायी छर्रों। 4 डिग्री सेल्सियस और 300 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए मिलाते हुए छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  3. पाइपिंग द्वारा अवशिष्ट गोली को फिर से निलंबित करें और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: कुल आरएनए का 100-200 μg आमतौर पर कुल अनुवाद के राइबोसोम प्रोफाइलिंग के लिए पर्याप्त है। आरआरएनए संदूषण को कम करने के लिए कोई आरआरएनए कमी कदम जोड़ सकता है, जो राइबोसोम-नवजात श्रृंखला परिसरों आत्मीयता शुद्धिकरण11 का सबसे प्रचलित संदूषक है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)।
  1. इम्यूनोप्यूरिफिकेशन नमूने को संसाधित करना
    1. 3 एक्स 1 एमएल लाइसिस बफर (डीएनएएसई आई और प्रोटीज अवरोधकों के बिना) के साथ प्रति नमूना आत्मीयता-बाध्यकारी मैट्रिक्स (70% ईटीओएच में 1: 1 एंटीबॉडी-संयुग्मित मोती) के 100-400 μL धो लें; लाइसिस बफर में आत्मीयता मैट्रिक्स को फिर से निलंबित करें, और फिर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन मिश्रण रैक के साथ 30 आरपीएम पर घुमाएं। 3,000 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अवक्षेपित करें। ऊपरी तरल को त्यागें। इसे तीन बार दोहराएं।
    2. आरनेस आई की ए 260 एनएम इकाई के प्रति 10 यू का उपयोग करके डाइजेस्ट इम्यूनोप्यूरिफिकेशन नमूने, आत्मीयता-बाध्यकारी मैट्रिक्स (उदाहरण के लिए, प्रति नमूना जीएफपी-ट्रैप के 100-400 μL) के साथ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर आत्मीयता मैट्रिक्स के लिए प्रोटीन को बांधने के लिए एक घूर्णन मिश्रण रैक के साथ 30 आरपीएम पर 25 मिनट के लिए घुमाएँ।
    4. तालिका 3 में विस्तृत के रूप में धोने बफर मास्टर मिश्रण तैयार करें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
10 मिलीग्राम/एमएल सीएचएक्स 50 0.1 मिलीग्राम /
1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 100 20 एमएम
3 एम केसीएल 233 140 एमएम
1 एम एमजीसीएल2 50 10 एमएम
1 एम पीएमएसएफ 5 1 एमएम
एनपी -40 0.5 0.01%
प्रोटीज अवरोधक 2 गोलियां
50% ग्लिसरॉल 1,000 10%
अंतिम वॉल्यूम 5,000

तालिका 3: धोने बफर मास्टर मिश्रण के लिए पकाने की विधि।

  1. 1 मिलीलीटर धोने बफर के साथ आत्मीयता-बाध्यकारी मैट्रिक्स को तीन बार धोएं, हर बार ~ 1 मिनट के लिए, 30 आरपीएम पर मिश्रण रैक में घूर्णन, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 3,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अवक्षेपित करें। ऊपरी तरल को त्यागें।
  3. 1 एमएल धोने बफर में दो बार और धोलें, हर बार 5 मिनट के लिए, 30 आरपीएम पर मिश्रण रैक में घूर्णन, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. 3,000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अवक्षेपित करें।
  5. 2x नमूना बफर की एक ही राशि के साथ प्रोटीन क्षालन के लिए मोती के 50 μL का प्रयोग करें। आरएनए निष्कर्षण के लिए बाकी मोतियों का उपयोग करें।
  6. मोतियों गोली और ऊपरी तरल त्यागने के लिए 3,000 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र।
  7. तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बाद के आरएनए निष्कर्षण के लिए इन नमूनों का उपयोग करें।
    स्टॉपिंग प्वाइंट: नमूने रात भर या उससे अधिक समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। यह एक स्टॉपिंग पॉइंट हो सकता है।
  8. प्रत्येक चरण के विभाज्य (मात्रा द्वारा ~ 10%, मिश्रण के बाद) के साथ पश्चिमी धब्बा या कूमासी धुंधला द्वारा आत्मीयता शुद्धि कदम की सफलता का आकलन करें। आत्मीयता मैट्रिक्स के लिए गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए नियंत्रण के रूप में हमेशा एक गैर-टैग किए गए डब्ल्यूटी तनाव पर नकली आईपी का उपयोग करें।
    नोट: उच्च गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि को नमक /डिटर्जेंट सांद्रता बढ़ाने के साथ अतिरिक्त धोने के चरणों से दूर किया जा सकता है। क्षणिक बातचीत को विभिन्न क्रॉस-लिंकिंग एजेंटों के उपचार द्वारा स्थिर किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जीवित कोशिकाओं के पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) उपचार - 2-5 मिनट के लिए विकास मीडिया में 0.4% -1% पीएफए जोड़ना, इसके बाद 3 मिनट के लिए ग्लाइसिन (0.3 एम) शमन, अत्यधिक अनुशंसित है।
    चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड एक संदिग्ध कार्सिनोजेन है। चूंकि पैराफॉर्मलडिहाइड जल्दी से वाष्पित हो जाता है और संक्षारक होता है, इसलिए रासायनिक सुरक्षा हुड में काम करें और दस्ताने की दो परतें पहनें।

5. गहरी अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी

  1. आरएनए निष्कर्षण
    नोट: संभावित आरएनए या डीएनए की कमी को रोकने के लिए आरएनए-मुक्त नॉन-स्टिक 1.5 एमएल ट्यूबों के साथ काम करें।
    1. बर्फ पर चरण 4.2.5 और 4.3.12 से नमूनों को पिघलाएं और 700 μL की अंतिम मात्रा में 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.0 के साथ नमूनों को फिर से निलंबित करें।
      सावधानी: एसिड-फिनोल और क्लोरोफॉर्म वाष्पशील और हानिकारक हैं। एक रासायनिक सुरक्षा हुड में काम करते हैं।
    2. 0.7 एमएल कुल आरएनए या आईपी क्षालन के लिए 20% एसडीएस के 40 μL जोड़ें। कुछ बार बंद करें और पलटें। प्रोटीन वर्षा नमूनों को सफेद करना चाहिए।
    3. नमूनों में पूर्व-गर्म एसिड-फिनोल: क्लोरोफॉर्म के 0.75 मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूबों को कसकर सील करें और 5 मिनट के लिए 1,400 आरपीएम पर और 65 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल मिक्सर में हिलाएं। 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडे नमूने।
    4. कदम 5.1.3 से ट्यूब अपकेंद्रित्र। 2 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर। शीर्ष जलीय परत को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसमें एसिड-फिनोल: क्लोरोफॉर्म के 0.7 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं, कभी-कभी भंवर। 20,000 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। शीर्ष जलीय परत को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसमें 0.6 एमएल क्लोरोफॉर्म और भंवर जोड़ें।
    6. 20,000 एक्स जी पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। एक ताजा ट्यूब के लिए शीर्ष जलीय परत स्थानांतरण।
    7. 3 एम एनएओएसी के 78 μL, पीएच 5.5, ग्लाइकोब्लू के 2 μL और आइसोप्रोपेनॉल के 0.75 एमएल जोड़कर न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करें। 5 मिनट के लिए अच्छी तरह से भंवर। -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे या -20 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए सेते हैं।
    8. 20,000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 80% इथेनॉल के बर्फ-ठंडे 0.75 एमएल के साथ छर्रों को धो लें। पूरी तरह से धोने के लिए ट्यूबों को पलटें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, और फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. 450 एक्स जी, 20 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन और शेष इथेनॉल को हटाने और तरल पदार्थ त्यागें। 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक खुले ढक्कन के साथ गोली सूखी। नमूनों को निम्नानुसार पुन: निलंबित करें: आईपी के लिए 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.0 के 10 μL में नमूना को फिर से निलंबित करें। कुल अनुवाद विश्लेषण के लिए, 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.0 के 20 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें।
      स्टॉपिंग पॉइंट: आरएनए को महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. फ्लोरोमेट्री द्वारा कुल आरएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें
    नोट: अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए सीडीएनए लाइब्रेरी तैयार करते समय निम्नलिखित सभी सामग्रियों और सतहों को आरनेस-मुक्त होना चाहिए। आरएनए नमूनों को संभालते समय, दस्ताने पहनें।
    1. 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.0 के 9 μL में एसिड फिनोल-निकाले गए कुल आरएनए के 1 μL को पतला करें। निर्माता की वेबसाइट पर दिए गए निर्देशों के अनुसार, फ्लोरोमीटर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें।
    2. 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.0 के 10 μL के साथ आरएनए के 50 μg युक्त नमूनों को पतला करें।
      नोट: आईपी नमूने को मापने के लिए, अगले चरण के लिए सब कुछ का उपयोग करें।
  3. जेल-शुद्ध राइबोसोम संरक्षित पदचिह्न टुकड़े
    1. एक 15% टीबीई-यूरिया पॉलीक्रिलामाइड जेल सेट करें और 1एक्स टीबीई रनिंग बफर में डूब जाएं। नमूना लोड हो रहा है से पहले 200 वी पर 30 मिनट के लिए चलाएँ। प्रत्येक नमूने के लिए, 2x टीबीई-यूरिया नमूना बफर के 20 μL जोड़ें।
      नोट: अपेक्षित बैंड आकार लगभग 25-35 एनटी है।
    2. 2 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 10 बीपी डीएनए सीढ़ी और विकृत नमूने (सीढ़ी नहीं) पिघलना, और फिर बर्फ पर ठंडा करें। प्रत्येक नमूने को हर दूसरे लेन पर लोड करें। 200 वी पर 50-70 मिनट के लिए जेल चलाएं।
    3. 1x टीबीई बफर के 60 एमएल में एसवाईबीआर गोल्ड (10,000 एक्स ध्यान केंद्रित) के 6 μL पतला और दाग जबकि 15-20 मिनट के लिए प्रकाश-संरक्षित बक्से में मिलाते हुए। जेल को धुंधला करते समय, लेबल 1.5 एमएल ट्यूबों में एक बाँझ स्केलपेल और 0.5 एमएल जेल-ब्रेकर ट्यूब तैयार करें।
    4. एक बाँझ स्केलपेल के साथ वांछित बैंड का उत्पादन करें (एक ताजा एक का उपयोग करें या नमूनों के बीच अच्छी तरह से साफ करें) और प्रत्येक जेल टुकड़े को जेल-ब्रेकर ट्यूब में रखें।
    5. यह सुनिश्चित करने के लिए जेल की एक छवि लें कि जेल में कोई नमूना अवशेष नहीं बचा है।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर कट स्लाइस युक्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र और जेल ब्रेकर ट्यूब से 1.5 एमएल ट्यूब के लिए शेष जेल टुकड़े हस्तांतरण।
    7. 10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.0 के 0.5 एमएल जोड़ें। 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,400 आरपीएम पर एक थर्मल मिक्सर में हिलाएं।
    8. एक विस्तृत बोर पिपेट टिप के साथ एक सेल्यूलोज एसीटेट स्तंभ में स्थानांतरण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    9. एक नई 1.5 एमएल ट्यूब के माध्यम से प्रवाह-स्थानांतरण और बर्फ पर ठंडा करें।
    10. न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करने के लिए, जोड़ें: आईपीए के 550 μL, 3 एम एनएओएसी के 55 μL, और ग्लाइकोब्लू और भंवर के 2 μL अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए। कम से कम 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें।
    11. 20,000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। छर्रों को बर्फ-ठंडा 80% इथेनॉल के 0.75 मिलीलीटर के साथ धो लें। छर्रों के नीचे से अलग होने तक पूरी तरह से धोने के लिए ट्यूबों को पलटें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर फिर से अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    12. 450 एक्स जी, 20 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन और शेष इथेनॉल को हटा दें। 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक खुले ढक्कन के साथ छर्रों सूखी।
    13. 10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.0 के 15 μL जोड़ें और छर्रों को अच्छी तरह से फिर से निलंबित करें। 450 एक्स जी, 20 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन और एक नए 1.5 एमएल ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण।
      स्टॉपिंग पॉइंट: शुद्ध आरएनए को कुछ महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. डिफॉस्फोराइलेशन
    1. प्रत्येक नमूने के लिए निम्नलिखित मिश्रण के 3 μL का उपयोग करें: एटीपी के बिना 10x T4 पॉली न्यूक्लियोटाइड किनेज प्रतिक्रिया बफर के 2 μL में आरएनएएसई अवरोधक के 1 μL जोड़ें। प्रत्येक नमूने में टी 4 पॉली न्यूक्लियोटाइड किनेज के 2 μL जोड़ें। पिपेट धीरे अच्छी तरह से मिश्रण और मिलाते हुए बिना, 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं करने के लिए।
    2. एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए, 10 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं और 20 एस के लिए 450 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन करें।
    3. न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करने के लिए, ग्लाइकोब्लू के 2 μL, आईपीए के 550 μL और 3 M NaOAC के 55 μL जोड़ें।
    4. भंवर अच्छी तरह से मिश्रण और कम से कम 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने ठंडा करने के लिए।
      स्टॉपिंग प्वाइंट: नमूने रात भर या उससे अधिक समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    5. चरण 5.3.11-5.3.13 दोहराएँ।
      स्टॉपिंग पॉइंट: डिफॉस्फोराइलेटेड आरएनए को महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. बायोएनालाइज़र का उपयोग करके मात्रा का ठहराव
    1. नमूने के 1 μL और डीईपीसी-उपचारित पानी के 4 μL मिश्रण द्वारा प्रत्येक आरएनए नमूने का 1: 4 कमजोर पड़ना बनाओ।
      सावधानी: डीईपीसी एक कार्सिनोजेन है। दस्ताने पहनें और सावधानी से काम करें।
    2. एक बायोएनालाइज़र छोटे आरएनए चिप / निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
      नोट: अपेक्षित राइबोसोम-संरक्षित आरएनए टुकड़ा आकार लगभग 28-30 एनटी है।
  6. लिंकर -1 के साथ लिगेट 3 'अंत
    1. 10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.0 के साथ 10 μL करने के लिए छोटे आरएनए टुकड़े के 5 पीएमओएल पतला। 2 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण नमूने और बर्फ पर ठंडा।
    2. तालिका 4 में विस्तृत के रूप में मास्टर मिश्रण तैयार करें और नमूना प्रति 29 μL का उपयोग करें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
50% बाँझ-फ़िल्टर खूंटी 8000 16 20%
डीएमएसओ 4 10%
10× टी 4 आरएनए लिगेज 2 बफर 4 1x
एसयूपी-इन आरएनएएसई अवरोधक 2 2 यू
10 एमएम एडेनिलेटेड लिंकर 3-एल 1 0.1 25 μM
डीईपीसी-उपचारित पानी 2.9
अंतिम वॉल्यूम 29

तालिका 4: 3 'अंत बंधाव मास्टर मिश्रण के लिए पकाने की विधि।

  1. टी 4 आरएनए लिगेज 2 के 1 μL जोड़ें और धीरे-धीरे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए पिपेट। 2 घंटे के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करने के लिए, जोड़ें: आईपीए के 550 μL, 10 एमएम ट्रिस के 500 μL, पीएच 7.0, 3 एम एनएओएसी के 55 μL, और ग्लाइकोब्लू के 2 μL। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए, और कम से कम 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने जगह।
    स्टॉपिंग पॉइंट: रात भर या उससे अधिक समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।
  3. चरण 5.3.2-5.3.12 दोहराएँ।
  4. 10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.0 के 6 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। 450 एक्स जी, 20 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन, और एक नए 1.5 एमएल ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण।
    स्टॉपिंग प्वाइंट: नमूने महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  1. 3 'लिंक किए गए पैरों के निशान की जेल शुद्धि
    1. एक 10% टीबीई-यूरिया पॉलीक्रिलामाइड जेल सेट करें और 1एक्स टीबीई रनिंग बफर में डूब जाएं। नमूना लोड हो रहा है से पहले 200 वी पर 30 मिनट के लिए चलाएँ। प्रत्येक नमूने के लिए, 2x टीबीई-यूरिया नमूना बफर के 6 μL जोड़ें।
      नोट: अपेक्षित बैंड आकार लगभग 71-73 एनटी है।
    2. चरण 5.3.2-5.3.13 दोहराएँ।
      स्टॉपिंग प्वाइंट: नमूने महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एसएसडीएनए उत्पन्न करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्राइब 3 लिंक्ड पदचिह्न टुकड़े
    1. तालिका 5 में विस्तृत के रूप में एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और नमूना प्रति 3 μL का उपयोग करें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
10 एमएम डीएनटीपी 1 0.5 एमएम
25 μM लिंकर एल (आरटी) 0.5 625 एनएम
डीईपीसी-उपचारित पानी 1.5
अंतिम वॉल्यूम 3

तालिका 5: न्यूक्लिक एसिड के विकृतीकरण से पहले रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बफर मास्टर मिश्रण के लिए पकाने की विधि।

  1. भंवर और नमूना नीचे स्पिन।
  2. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  3. बर्फ पर ठंडे नमूने।
  4. तालिका 6 में विस्तृत के रूप में एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और नमूना प्रति 6 μL का उपयोग करें। भंवर और नमूना नीचे स्पिन। प्रत्येक नमूना और विंदुक धीरे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते करने के लिए सुपरस्क्रिप्ट तृतीय के 1 μL जोड़ें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
5× एफएस बफर 4 1x
एसयूपी-इन आरएनएएसई अवरोधक 1 2 यू
डीटीटी 0.1 एम 1 5 एमएम
अंतिम वॉल्यूम 6

तालिका 6: न्यूक्लिक एसिड के विकृतीकरण के बाद रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बफर मास्टर मिश्रण के लिए पकाने की विधि।

  1. 1 एन एनएओएच के 2.3 μL जोड़ें, जो आरएनए को हाइड्रोलाइज करता है और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को बुझाता है।
    सावधानी: एनएओएच अत्यधिक संक्षारक है। दस्ताने और आंखों की सुरक्षा पहनें।
  2. नमूना गुलाबी हो जाता है जब तक, 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. एक 10% टीबीई-यूरिया पॉलीक्रिलामाइड जेल सेट करें और 1एक्स टीबीई रनिंग बफर में डूब जाएं। नमूना लोड हो रहा है से पहले 200 वी पर 30 मिनट के लिए चलाएँ। प्रत्येक नमूने के लिए, 2x टीबीई-यूरिया नमूना बफर के 23 μL जोड़ें।
    नोट: अपेक्षित डीएनए बैंड का आकार 115-117 एनटी है।
  4. चरण 5.3.2-5.3.12 दोहराएँ।
  5. 10 एमएम ट्रिस, पीएच 8.0 के 15 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। 450 एक्स जी, 20 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन और एक नए 1.5 एमएल ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण।
    स्टॉपिंग प्वाइंट: नमूने महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  1. एसएसडीएनए परिपत्रीकरण
    1. निम्नलिखित मास्टर मिश्रण तैयार करें और नमूना प्रति 4 μL लोड करें, जैसा कि तालिका 7 में विस्तृत है।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
10× सर्कलिगेज द्वितीय बफर 2 1x
5 एम बीटाइन (वैकल्पिक) 1 0.25 एम
50 एमएम एमएनसीएल2 1 2.5 एमएम
अंतिम वॉल्यूम 4

तालिका 7: एसएसडीएनए परिपत्रीकरण मास्टर मिश्रण के लिए पकाने की विधि।

  1. प्रत्येक नमूने के लिए सर्कलिगेज द्वितीय एसएसडीएनए लिगेज के 1 μL जोड़ें और 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: इस कदम की दक्षता 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद प्रत्येक नमूने के लिए सर्कलिगेज द्वितीय एसएसडीएनए लिगेज के 1 μL जोड़कर बढ़ाया जा सकता है।
  2. 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके एंजाइम निष्क्रिय करें।
  3. बर्फ पर ठंडा करें और पीसीआर प्रवर्धन या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना जारी रखें।
    स्टॉपिंग पॉइंट: नमूने वर्षों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  1. पीसीआर प्रवर्धन
    1. निम्नलिखित पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें और नमूना प्रति 82 μL लोड करें, जैसा कि तालिका 8 में विस्तृत है।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) नमूना प्रति राशि (μL) अंतिम एकाग्रता
डीईपीसी-उपचारित पानी 61.6
5× फुशन एचएफ प्रतिक्रिया बफर 17.6 1x
10 एमएम डीएनटीपी 1.8 200 μM
100 μM पीसीआर फॉरवर्ड प्राइमर 0.2 225 एनएम
एचएफ फ्यूजन पोलीमरेज़ 0.8 1.6 यू
अंतिम वॉल्यूम 82

तालिका 8: पीसीआर प्रवर्धन मास्टर मिश्रण के लिए नुस्खा।

  1. मास्टर मिश्रण युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए, परिपत्र डीएनए के 5 μL जोड़ें।
    नोट: -80 डिग्री सेल्सियस पर परिपत्र डीएनए नमूनों के बाकी स्टोर।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए 20 μM पीसीआर रिवर्स बारकोड प्राइमर का एक अलग 1 μL जोड़ें ( तालिका 9 देखें) और भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
  3. प्रत्येक ट्यूब को चार अलग-अलग पीसीआर ट्यूबों में विभाज्य करें, प्रत्येक का उपयोग पीसीआर चक्रों की एक अलग संख्या के लिए किया जाएगा।
  4. तालिका 10 में विस्तृत के रूप में निम्नलिखित कार्यक्रम के अनुसार एक पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं।
चक्र विकृतीकरण (98 डिग्री सेल्सियस) एनील (60 डिग्री सेल्सियस) विस्तार (72 डिग्री सेल्सियस)
1 30 सेकंड
2-16 10 सेकंड 10 सेकंड 5 सेकंड

तालिका 10: पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए पीसीआर कार्यक्रम।

  1. चक्र 8, 9, 10 और 11 के बाद पीसीआर ट्यूबों को हटा दें (आईपी नमूनों के लिए, चक्र 9 से 15 तक होते हैं) पहले प्रयास के रूप में। प्रत्येक चक्र के बाद, कार्यक्रम को रोकें, एक विभाज्य निकालें और इसे बर्फ पर रखें, और फिर तेजी से कार्यक्रम को फिर से शुरू करें।
    नोट: चक्रों की संख्या प्रत्येक प्रतिक्रिया में परिपत्रित डीएनए की मात्रा के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए। एक उदाहरण और आगे स्पष्टीकरण के लिए चित्रा 4 देखें।
  2. प्रत्येक 17 μL प्रतिक्रिया करने के लिए, 6x डीएनए लोडिंग डाई के 3.5 μL जोड़ें।
  3. एक 10 बीपी डीएनए सीढ़ी पिघलना।
  4. जेल-वैद्युतकणसंचलन द्वारा आकार पृथक्करण के लिए, 1x टीबीई चल रहे बफर में 8% टीबीई पॉलीक्रिलामाइड को डुबोएं और प्रत्येक अलग-अलग चक्र संख्या के नमूनों को आसन्न कुओं में लोड करें और 180 वी पर 50 मिनट के लिए जेल चलाएं।
  5. 1x टीबीई बफर के 60 एमएल में एसवाईबीआर गोल्ड (10,000 एक्स ध्यान केंद्रित) के 6 μL पतला और दाग जबकि 15-20 मिनट के लिए प्रकाश-संरक्षित बक्से में मिलाते हुए।
  6. जेल को धुंधला करते समय, लेबल 1.5 एमएल ट्यूबों में एक बाँझ स्केलपेल और 0.5 एमएल जेल-ब्रेकर ट्यूब तैयार करें।
  7. दाग न्यूक्लिक एसिड की एक छवि लें।
  8. बाँझ स्केलपेल के साथ 174-176 बीपी के अपेक्षित बैंड आकार के साथ वांछित बैंड को काटें और तैयार 0.5 एमएल जेल-ब्रेकर ट्यूब में जेल स्लाइस रखें (नमूनों के बीच अच्छी तरह से साफ करें और आरएनएएसई निष्क्रिय एजेंट का उपयोग करें, या एक नए ब्लेड पर स्विच करें)।
  9. 20,000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र, और फिर 0.5 एमएल जेल ब्रेकर ट्यूब से 1.5 एमएल ट्यूब के लिए शेष जेल टुकड़े हस्तांतरण।
  10. 10 एमएम ट्रिस, पीएच 8.0 के 500 μL जोड़ें और 10 मिनट और 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 1,400 आरपीएम पर एक थर्मल मिक्सर में हिलाएं।
  11. एक विस्तृत बोर विंदुक टिप के साथ एक सेल्यूलोज एसीटेट स्तंभ के लिए भंग जेल स्थानांतरण।
  12. 20,000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र और एक नए 1.5 एमएल ट्यूब के माध्यम से प्रवाह के माध्यम से स्थानांतरित और बर्फ पर ठंडा।
  13. न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करने के लिए, जोड़ें: आईपीए के 550 μL, 5 एम एनएसीएल के 32 μL, 0.5 M ईडीटीए के 1 μL, और ग्लाइकोब्लू और भंवर के 2 μL अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
  14. -80 डिग्री सेल्सियस, या -20 डिग्री सेल्सियस रात भर में कम से कम 1 घंटे के लिए नमूने रखें।
    स्टॉपिंग प्वाइंट: नमूने रात भर या उससे अधिक समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  15. चरण 5.3.11-5.3.12 दोहराएँ।
  16. 10 एमएम ट्रिस, पीएच 8.0 के 11 μL में पुन: निलंबित। 450 एक्स जी, 20 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन और एक नए 1.5 एमएल ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण।
    स्टॉपिंग पॉइंट: नमूने वर्षों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  1. बायोएनालाइज़र द्वारा आकार वितरण की मात्रा निर्धारित करें
    1. डीईपीसी-उपचारित पानी के 4 μL के साथ नमूने के 1 μL मिश्रण द्वारा प्रत्येक नमूने का 1: 4 कमजोर पड़ना बनाओ।
    2. बायोएनालाइज़र स्मॉल आरएनए चिप चलाएं। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
      नोट: अपेक्षित लंबाई 175 ± 5 बीपी है।
  2. फ्लोरोमीटर द्वारा डीएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें
    1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार फ्लोरोमीटर के साथ डीएसडीएनए उच्च संवेदनशीलता एकाग्रता जांच करें।
    2. इलुमिना सिफारिशों (इंडेक्स एडेप्टर पूलिंग गाइड12) के अनुसार मल्टीप्लेक्स और अनुक्रम नमूने।

6. डेटा विश्लेषण

  1. अनुपूरक फ़ाइल में विस्तृत के रूप में विश्लेषण करें।

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Representative Results

जैसा कि इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के प्रवाह चार्ट में सचित्र है, कोशिकाओं को चरण लॉग करने के लिए उगाया गया था, और फिर निस्पंदन द्वारा तेजी से एकत्र किया गया था और क्रायोजेनिक पीसने से लाइज़ किया गया था। लाइसेट को तब दो में विभाजित किया गया था: एक कुल राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए पैरों के निशान के लिए और दूसरा चयनित राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए पैरों के निशान के लिए, जिस पर हमने टैग किए गए प्रोटीन-राइबोसोम-नवजात श्रृंखला परिसरों को खींचने के लिए आत्मीयता शुद्धिकरण किया। हमने टैग किए गए प्रोटीन अभिव्यक्ति और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा पुल-डाउन की सफलता सुनिश्चित की, जैसा कि चित्रा 2 में देखा जा सकता है। हमने राइबोसोम-संरक्षित पैरों के निशान के अलगाव को मान्य किया, जो आमतौर पर छोटे आरएनए वैद्युतकणसंचलन (2100 बायोएनालाइज़र सिस्टम) द्वारा 20-45 एनटी लंबे होते हैं, सिस्टम मैनुअल (चित्रा 3) के अनुसार आकार का पता लगाने में 5-10 एनटी शिफ्ट की अनुमति देते हैं। फिर, हमने गहरी अनुक्रमण और बड़े डेटा विश्लेषण के लिए एक सीडीएनए लाइब्रेरी उत्पन्न की। सीडीएनए लाइब्रेरी उत्पन्न करते समय, ध्यान दें कि अंडर-साइकलिंग से कम उपज हो सकती है (जैसा कि चित्रा 3 में लेन 2 में देखा जा सकता है), लेकिन उत्पन्न लाइब्रेरी को पुनर्प्राप्त करने के लिए फिर से प्रवर्धन संभव है। ओवर-साइकिलिंग तब हो सकती है जब पीसीआर प्राइमर समाप्त हो जाते हैं लेकिन प्रतिक्रिया जारी रहती है। जब डीएनटीपी अभी भी मौजूद हैं, तो प्रतिक्रिया आगे बढ़ती है, पीसीआर उत्पादों के कारण चिमेरिक अनुक्रमों के साथ लंबे समय तक पीसीआर कलाकृतियों को उत्पन्न करती है जो खुद को13 (जैसा कि चित्रा 3 में लेन 3-4 में देखा जा सकता है, दृश्यमान धब्बा द्वारा इंगित किया गया है)। यदि डीएनटीपी की एकाग्रता भी सीमित हो जाती है, तो केवल आंशिक रूप से समरूप पुस्तकालय के टुकड़ों से बने हेटरोडुप्लेक्स की उपस्थिति का संकेत देने वाले उत्पाद दिखाई दे सकते हैं। चित्रा 4 एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है, लेन 2 इष्टतम प्रवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है, और लेन 3 एक स्वीकार्य प्रवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है। पीसीआर डुप्लिकेट और कलाकृतियों को पेश करने की संभावना के कारण लेन 4 और 5 (चक्र 10 और 11) के नमूनों का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। उत्पन्न पुस्तकालय को सटीक आकार वितरण और मात्रा का ठहराव (चित्रा 5) के लिए उच्च संवेदनशीलता डीएनए वैद्युतकणसंचलन (एक ही बायोएनालाइज़र प्रणाली का उपयोग किया गया था) द्वारा मान्य किया गया था। 3 'अंत लिंकर बंधाव, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन के बाद, एक सीडीएनए लंबाई वितरण की उम्मीद है, जिसमें 175 एनटी के आसपास एक तेज चोटी है।

हमने अनुक्रमित पुस्तकालय से एडेप्टर और बारकोड को छंटनी और हटा दिया, और केवल 20 और 45 एनटी के बीच के रीड्स को आगे के विश्लेषण के लिए चुना गया। चित्रा 6 परिणामी लंबाई वितरण से पता चलता है। पढ़ता है के विभिन्न समूहों में विभाजित थे: कोडिंग अनुक्रम, इंट्रॉन, और इंटरजेनिक अनुक्रम (चित्रा 7), और आगे चित्रा 8 में दिखाया गया के रूप में वर्गीकृत.

सह-अनुवादक इंटरैक्शन का पता लगाने और लक्षण वर्णन के लिए अंतिम विश्लेषण राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों के संवर्धन के आधार पर किया गया था, जो चित्रा 9 में रेखांकन का उत्पादन करता है। हमने कुल अनुवाद के सामान्यीकृत राइबोसोम अधिभोग (प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड पर प्रत्येक ओआरएफ के साथ) की तुलना इसके संबंधित चयनित अनुवाद (नवजात-इंटरैक्टोम) से की। प्रति न्यूक्लियोटाइड तुलना अनुवाद दर कलाकृतियों को समाप्त करती है। जैविक प्रतिकृतियों के बीच प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन पियर्सन सहसंबंध (थ्रेसहोल्ड > 0.6) द्वारा किया गया था। हम चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइल प्रस्तुत करते हैं, तीन प्रोटीनों के साथ वीएमए 2 पी के सह-अनुवादक इंटरैक्शन का विश्लेषण करते हैं: राइबोसोम से जुड़े चैपरोन एसएसबी 1 पी, पीएफके 2 पी (फॉस्फोफ्रुक्टोकिनेज) और फास 1 पी (फैटी एसिड सिंथेज़), प्रत्येक प्रोटीन सी के साथ जीएफपी द्वारा टैग किया गया है। हमने जैविक प्रतिकृतियों में प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। चित्र 9 ए, डी और जी प्रत्येक आत्मीयता शुद्धिकरण की प्रयोगात्मक योजना को दर्शाता है। इसके बाद हम वीएमए 2 पी ओआरएफ के साथ एसएसबी 1 इंटरैक्टोम की तुलना में कुल अनुवादों के राइबोसोम अधिभोग को दिखाते हैं, जो रिक्तिका एच +-एटीपीस (चित्रा 9 बी, ई और एच) के सबयूनिट के लिए एन्कोडिंग करते हैं। अंत में, हमने ओआरएफ (चित्रा 9 सी, एफ और आई) के साथ [कोडन / एए] में प्रत्येक राइबोसोम स्थिति में अनुपात-आधारित राइबोसोम-संवर्धन प्रोफाइलिंग (आईपी / वीएमए 2 पी के साथ इन तीन प्रोटीनों के सह-अनुवादक इंटरैक्शन की तुलना करते हुए, जिसे राइबोसोम द्वारा संश्लेषित किया जा रहा है, से पता चला है कि एसएसबी 1 चैपरोन ओआरएफ के साथ चार अलग-अलग क्षेत्रों में नवजात वीएमए 2 पी को संलग्न करता है, क्योंकि हमने एसईआरपी द्वारा चार महत्वपूर्ण संवर्धन चोटियों की पहचान की है। अलग-अलग, पीएफके 2 पी केवल एक महत्वपूर्ण संवर्धन शिखर दिखाता है, जैसा कि एसईआरपी द्वारा पहचाना गया है, सह-अनुवादक चैपरोन एसएसबी 1 की तुलना में एक अलग स्थिति में नवजात वीएमए 2 पी के साथ एफएएस 1 सह-अनुवादक बातचीत का विश्लेषण किसी भी महत्वपूर्ण संवर्धन का पता नहीं लगाता है। इस प्रकार, इन अनुपात-आधारित संवर्धन राइबोसोम प्रोफाइल की तुलना निकट कोडन-रिज़ॉल्यूशन में विभिन्न सह-अनुवादक इंटरैक्शन का पता लगाने और लक्षण वर्णन में इस प्रोटोकॉल की शक्ति को दर्शाती है।

Figure 2
चित्रा 2: एचए-टैग किए गए एनएए 10 के साथ बीवाई 4741 तनाव की आत्मीयता शुद्धि के बाद प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा परिणाम। एचए-टैग किए गए एनएए 10 के साथ बीवाई 4741 तनाव की आत्मीयता शुद्धि के बाद प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा परिणाम 27.8 केडीए के आसपास एक बैंड दिखा रहा है, जबकि जंगली प्रकार, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, कोई बैंड नहीं दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एसिड-फिनोल: क्लोरोफॉर्म के साथ पदचिह्न अलगाव और आरएनए निष्कर्षण के बाद प्रतिनिधि बायोएनालाइज़र परिणाम, और 25 एनटी का औसत आकार कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पीसीआर प्रवर्धन के प्रतिनिधि जेल-वैद्युतकणसंचलन। चक्र 8-11 से पीसीआर उत्पादों के साथ भरी हुई गलियों 2-5 के साथ पीसीआर प्रवर्धन के प्रतिनिधि जेल-वैद्युतकणसंचलन, और दोनों तरफ सीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: एक सीडीएनए लाइब्रेरी के निर्माण के बाद प्राप्त प्रतिनिधि बायोएनालाइज़र परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: कटएडैप्ट के साथ एडेप्टर को हटाने के बाद रीड्स का अपेक्षित लंबाई वितरण (हटाने से 20 से कम या 45 से अधिक पढ़ता है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: गैर-कोडिंग आरएनए को हटाने के बाद अपेक्षित संरेखण सफलता प्रतिशत बोटी 2 के साथ पढ़ता है और शेष पढ़ता है को विभिन्न जीवों को संरेखित करने के लिए टॉपहैट का उपयोग करता है। सेरेविसिया (बीवाई 4741 का एक उत्परिवर्तित संस्करण) से नमूना लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: रीड्स में आरआरएनए तत्वों को हटाने के लिए बोटी 2 का उपयोग करने के बाद अपेक्षित कोडिंग बनाम गठबंधन पढ़ने के गैर-कोडिंग अनुपात का प्रतिनिधित्व करने वाले राइबोटूलकिट के साथ उत्पन्न एक ग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: तीन अलग-अलग प्रोटीनों के सह-अनुवादक इंटरैक्शन: एसएसबी 1 पी, पीएफके 2 पी, और वीएमए 2 पी के साथ एफएएस 1 पी, जिसे राइबोसोम द्वारा संश्लेषित किया जा रहा है, एसईआरपी द्वारा विश्लेषण किया गया है। सभी वाई अक्षों को रीड्स पर मिलियन (आरपीएम) रीड्स में दिखाया गया है। (ए, डी, जी) एसएसबी 1 पी, पीएफके 2 पी, और एफएएस 1 पी सी के एसईआरपी की प्रायोगिक योजना क्रमशः जीएफपी द्वारा टैग की गई है। (बी, ई, एच) क्रमशः एसएसबी 1, पीएफके 2 पी और फास 1 पी इंटरैक्टोम्स की तुलना में कुल अनुवादों के ओआरएफ के साथ राइबोसोम अधिभोग (जैविक प्रतिकृतियों में)। (सी, एफ, आई) क्रमशः ओआरएफ के साथ [कोडन / एए] में प्रत्येक राइबोसोम स्थिति में एसएसबी 1 पी, पीएफके 2 पी और फास 1 पी (आईपी / कुल अनुपात) का औसत संवर्धन। जैविक प्रतिकृतियों के बीच भिन्नता छायांकित क्षेत्र द्वारा इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 9: 3 'लिंकर और प्राइमर अनुक्रम। 3'लिंकर एल1: लिंकर 3-एल1 5 एडेनिलेशन और 3 डाइडियोक्सी-साइटिडाइन अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता ('एनएन...') (आरएनएएसई मुक्त एचपीएलसी शुद्धि; रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लिंकर: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (एल (आरटी)) 5 फॉस्फोराइलेटेड, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं (आरएनएएसई मुक्त एचपीएलसी शुद्धि) के साथ; पीसीआर फॉरवर्ड प्राइमर: पीसीआर; एचपीएलसी शुद्ध हो गया। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, प्रोटोकॉल निकट कोडन रिज़ॉल्यूशन में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को कैप्चर करने के लिए चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण का विवरण देता है। चूंकि राइबोसोम भीड़ वाले साइटोप्लाज्म में नवजात-श्रृंखला उद्भव के समन्वय के लिए एक केंद्र के रूप में उगता है, यह एक कार्यात्मक प्रोटिओम सुनिश्चित करने के साथ-साथ विभिन्न बीमारियों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक विभिन्न सह-अनुवादक इंटरैक्शन की पहचान और विशेषता के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। आज तक, एसईआरपी एकमात्र तरीका है जो विवो14,15,16 में प्रत्यक्ष तरीके से इन इंटरैक्शन को कैप्चर और चिह्नित कर सकता है।

पहला और सबसे महत्वपूर्ण कदम सेल संग्रह और लिसिस है। एक जमे हुए अवस्था में लाइसिस के बाद फ्लैश-फ्रीजिंग द्वारा, सेकंड के भीतर, चल रहे अनुवाद को पकड़ना अनिवार्य है। राइबोसोमल अपवाह से बचने के साथ-साथ तनाव ट्रांसलेशनल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं का संग्रह जल्दबाजी में किया जाना चाहिए, जो तेजी से हो सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम आत्मीयता शुद्धिकरण कदम है। यह सुनिश्चित करते हुए कड़े धोने द्वारा पृष्ठभूमि बाध्यकारी को कम करना आवश्यक है कि सह-अनुवादक बातचीत को बनाए रखा जाए, जिसे विवो क्रॉस-लिंकिंग में सुविधाजनक बनाया जा सकता है। चूंकि यह प्रोटोकॉल अत्यधिक संवेदनशील एनजीएस (अगली पीढ़ी अनुक्रमण) पर आधारित है, इसलिए पहले चरणों में उच्च पृष्ठभूमि को निम्नलिखित सीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी चरणों में प्रवर्धित किया जा सकता है, जिससे कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात हो सकता है।

न्यूक्लियस उपचार, सभी गैर-संरक्षित एमआरएनए को पचाने के लिए आरएनए पाचन से बचने के लिए पृथक राइबोसोमल पैरों के निशान आकार वितरण (जैसा कि ऊपर विस्तृत है) के सावधानीपूर्वक मूल्यांकन के साथ पॉलीसोम प्रोफाइलिंग17 द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए। न्यूक्लियस एकाग्रता और पाचन समय का अंशांकन सटीक पदचिह्न वसूली की सुविधा प्रदान कर सकता है, क्योंकि अधिक पाचन राइबोसोमल आरआरएनए पाचन का कारण बन सकता है, जिससे राइबोसोम-संरक्षित पैरों के निशान का नुकसान हो सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अंडर-पाचन राइबोसोम-संरक्षित पैरों के निशान की कम खोज दर ों को भी जन्म दे सकता है, क्योंकि सीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी चरण, साथ ही यहां वर्णित डेटा विश्लेषण चरण लंबे, अस्वाभाविक रीड्स को त्याग देते हैं।

जबकि आरआरएनए की कमी हमेशा एक महत्वपूर्ण कदम का गठन नहीं करती है और अनिवार्य नहीं है, इसके कुछ फायदे हैं जैसे कि क्लीनर नमूने और इसलिए, जीनोम-मैप किए गए पढ़ने की उच्च दर। दूसरी ओर, पूर्वाग्रहों की संभावना है, क्योंकि कई आरआरएनए कमी प्रोटोकॉल भी वांछित राइबोसोम-संरक्षित टुकड़ों की कमी का कारण बन सकते हैं। किसी को आरआरएनए कमी किट की लागत को भी ध्यान में रखना चाहिए। आरआरएनए की कमी राइबोसोम-फुट प्रिंट अलगाव चरण के बाद या सीडीएनए परिपत्रीकरण चरण के बाद की जा सकती है।

यहां वर्णित सीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी चरणों को कम एमआरएनए इनपुट के लिए अनुकूलित किया गया है, क्योंकि आत्मीयता और राइबोसोम शुद्धिकरण कदम आरएनए-सीक्यू अभिव्यक्ति अध्ययनों की तुलना में एमआरएनए इनपुट राशि को अत्यधिक कम करते हैं। सेल संस्कृतियों की प्रारंभिक मात्रा को बढ़ाना सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी को बहुत सुविधाजनक बना सकता है। वैकल्पिक रूप से, पसंद का कोई भी सीडीएनए लाइब्रेरी प्रोटोकॉल यहां वर्णित आत्मीयता शुद्धि और पदचिह्न अलगाव चरणों के साथ फिट हो सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि राइबोसोमल पैरों के निशान पैदा करने वाले न्यूक्लियस उपचार को परिणामी एमआरएनए सिरों की मरम्मत (सीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी, डिफॉस्फोराइलेशन चरण) की आवश्यकता होती है ताकि आपकी पसंद के प्रोटोकॉल में यहां वर्णित सीडीएनए प्रोटोकॉल में निम्नलिखित लिंकर बंधाव चरणों की अनुमति मिल सके।

अनुक्रमण के दौरान, आरएनए-सेक से एसईआरपी को अलग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि उत्पन्न पुस्तकालयों की विषमता आत्मीयता टैग किए गए कारकों के आधार पर बहुत भिन्न होती है। आणविक चैपरोन और लक्ष्यीकरण कारक अक्सर बाध्यकारी में अधिक प्रचलित होते हैं, अनुवाद के दौरान सैकड़ों या हजारों सब्सट्रेट के साथ बातचीत करते हैं, जिससे अत्यधिक विविध सीडीएनए पुस्तकालय होते हैं। हालांकि, अत्यधिक विशिष्ट इंटरैक्टर्स, जैसे कि सह-अनुवादक जटिल असेंबली इंटरैक्टर्स अक्सर बहुत कम विविध सीडीएनए पुस्तकालयों की पीढ़ी का कारण बन सकते हैं। एक ही लेन पर विविध और गैर-विविध पुस्तकालयों में स्पाइक अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण परिणामों के बाद बहुत सुधार कर सकता है।

एसईआरपी की एक और अनूठी विशेषता ओआरएफ के साथ राइबोसोम अधिभोग में स्थानीय विविधताओं को पकड़ने की क्षमता है जो इंटरैक्शन के प्रत्येक सेट से जुड़े अनुवाद दर में राइबोसोमल बदलावों की खोज की अनुमति देती है। इसलिए संवर्धन को सही ढंग से पहचानने के लिए ओआरएफ के साथ प्रत्येक कोडन में राइबोसोम अधिभोग की तुलना करना अनिवार्य है। ओआरएफ औसत का उपयोग करने से क्षणिक इंटरैक्शन या झूठी खोज का नुकसान हो सकता है।

एसईआरपी विधि का सही उपयोग प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए कई सह-अनुवादक मार्ग खोलता है, उपन्यास यांत्रिक विशेषताओं के साथ-साथ उपन्यास राइबोसोम से जुड़े कारकों की खोज करता है, प्रोटीन-जैवसंश्लेषण क्षेत्र में क्रांतिकारी बदलाव करता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उपयोगी चर्चा के लिए और मुहम्मद मखज़ुमी को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम आईएसएफ (इजरायल साइंस फाउंडेशन) अनुदान 2106/20 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

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References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

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जीव विज्ञान अंक 176
चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग द्वारा सह-अनुवादक इंटरैक्शन नेटवर्क की वैश्विक पहचान
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Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

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