Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Global identifiering av saminterventionella interaktionsnätverk genom selektiv ribosomprofilering

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Samöversättningsinteraktioner spelar en avgörande roll i begynnande kedjemodifieringar, inriktnings-, viknings- och monteringsvägar. Här beskriver vi Selektiv ribosomprofilering, en metod för in vivo, direkt analys av dessa interaktioner i modellen eukaryot Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Under de senaste åren har det blivit uppenbart att ribosomer inte bara avkodar vårt mRNA utan också styr framväxten av polypeptidkedjan i den trånga cellulära miljön. Ribosomer ger plattformen för rumsligt och kinetiskt kontrollerad bindning av membraninriktningsfaktorer, modifierande enzymer och vikbara chaperoner. Även sammansättningen i högordnade oligomera komplex, såväl som protein-proteinnätverksbildningssteg, upptäcktes nyligen samordnas med syntes.

Här beskriver vi Selective Ribosome Profiling, en metod utvecklad för att fånga sam-translationella interaktioner in vivo. Vi kommer att beskriva de olika affinitetsreningsstegen som krävs för att fånga ribosom-begynnande kedjekomplex tillsammans med sam-translationella interagerare, liksom mRNA-extraktion, storleksuteslutning, omvänd transkription, djupsekvensering och big-data-analyssteg, som krävs för att dechiffrera sam-translationella interaktioner i nära kodonupplösning.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) är den enda metoden hittills som fångar och karakteriserar sam-translationella interaktioner, in vivo, på ett direkt sätt 1,2,3,4,5,6. SeRP möjliggör global profilering av interaktioner mellan vilken faktor som helst med översättning av ribosomer i nära kodonupplösning 2,7.

Metoden bygger på blixtfrysning av växande celler och bevarande av aktiv översättning. Celllysater behandlas sedan med RNas I för att smälta allt mRNA i cellen utom ribosomskyddade mRNA-fragment som kallas "ribosomavtryck". Provet delas sedan upp i två delar; en del används direkt för isolering av alla cellulära ribosomala fotavtryck, vilket representerar all pågående översättning i cellen. Den andra delen används för affinitetsrening av den specifika delmängden ribosomer associerade med en faktor av intresse, till exempel: modifierande enzymer, translokationsfaktorer, vikbara chaperoner och komplexa monteringsinteraktioner. De affinitetsrenade ribosomala fotavtrycken kallas kollektivt interaktionomet. Därefter extraheras de ribosomskyddade mRNA och används för cDNA-biblioteksgenerering, följt av djup sekvensering.

Jämförande analys av de totala translatom- och interaktionsproverna möjliggör identifiering av alla orfs som associerar med intressefaktorn, samt karakterisering av varje orf-interaktionsprofil. Denna profil rapporterar de exakta engagemangsstart- och avslutningssekvenserna från vilka man kan härleda de avkodade kodonerna och respektive rester av den framväxande polypeptidkedjan, liksom på ribosomhastighetsvariationerna under interaktionen 7,8. Figur 1 visar protokollet som ett schema.

Figure 1
Bild 1: En översikt över SeRP-protokollet. Detta protokoll kan utföras i sin helhet inom 7-10 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generera stammar för selektiv ribosomprofilering

OBS: Selective Ribosome Profiling (SeRP) är en metod som bygger på affinitetsrening av faktorer av intresse för att bedöma deras interaktionssätt med ribosomer-begynnande kedjekomplex. Homolog rekombination9, liksom CRISPR/Cas910-baserade metoder används för att smälta samman olika faktorer av intresse med taggar för affinitetsrening. Sådana taggar är GFP, för GFP-trap affinitetsrening, TAP-tag för IgG-Sepharose pärlor rening samt AVI-Tag renad av avidin eller streptavidin, för att lista några framgångsrika exempel från de senaste åren.

  1. Utför tillväxt- eller funktionella analyser för att validera att märkning inte påverkade proteinfunktionen. N' kontra C' terminalmärkning bör utvärderas.
    OBS: Ribosomerna (rRNA), liksom många ribosombindande domäner i olika faktorer, är mycket laddade, vilket gör mycket laddade taggar (såsom polyhistidin) oförutsägbara att använda, eftersom det kan leda till falsk upptäckt eller ändrat bindningsläge.

2. Kulturens tillväxt

  1. Odla de konstruerade jästkulturerna (baserat på stammen BY4741), som innehåller de önskade taggade proteinerna, antingen flytande jäst-extrakt-pepton-dextros (YPD)-rikt medium, eller i syntetiskt dextros (SD) minimalt medium (1,7 g / L jästkvävebas med ammoniumsulfat eller 1,7 g / L jästkvävebas utan ammoniumsulfat med 1 g / L mononatriumglutaminsyra, 2% glukos och kompletterad med en fullständig eller lämplig blandning av aminosyror).
  2. Odla 250–500 ml cellodling till 0,5 OD600 (mitten av logen) vid 30 °C i ett lämpligt medium.

3. Cellsamling och lys

  1. Samla snabbt celler genom vakuumfiltrering på ett 0,45 μm nitrocellulosablottmembran med ett glasfiltreringssystem (glasfilterhållare med 1 L glastratt, vakuumbas och lock, rostfri skärm, packning och fjäderklämma, 90 mm; jordfogkolv 1 L).
  2. Flash fryser de uppsamlade cellerna genom att skrapa de pelleterade cellerna med en spatel och omedelbart nedsänka dem i ett flytande kvävefyllt 50 ml rör.
    STOPPPUNKT: Cellerna kan förvaras vid -80 °C i upp till 3-4 veckor.
  3. Utför celllys genom kryogen slipning i en mixerkvarn: två gånger i 2 minuter vid 30 Hz, med 1 ml av lysbufferten (se tabell 1). Kyl i flytande kväve mellan fräsningarna.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
10 mg/ml CHX (cykloheximid) 220 0,5 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0 88 20 mM
3M KCl 205.7 140 mM
1M MgCl2 26.4 6 mM
1M PMSF 4.4 1 mM
Np-40 4.4 0.10%
Proteashämmare 2 tabletter
DNase I 8.8 0,02 U/ml
Slutlig volym 4,400

Tabell 1: Recept för lysbuffertmästarmixen.

OBS: Lysbuffert kan ändras för att innehålla fler proteashämmare (såsom bestatin, leupeptin, aprotinin, etc.) om proteinet av intresse är mycket instabilt, men det är viktigt att undvika EDTA för att bibehålla ribosomens små och stora underenheter monterade under följande steg. Av liknande skäl, behåll alltid minst 6 mM MgCl2 i buffertlösningen.

VARNING: HCl är mycket frätande och PMSF är giftigt. Använd handskar och hantera försiktigt.

  1. Centrifugera i 2 min vid 30 000 x g, 4 °C för att rensa lysaten och samla supernatanten.

4. Rening av ribosom-begynnande-kedjekomplex för SeRP

  1. För varje experiment, dela supernatanten i två delar; var och en i ett annat mikrocentrifugrör: totalt RNA-prov (~ 200 μL) och immunopurifieringsprov (IP) (~ 700 μL) translatomprover.
  2. Bearbetning av det totala RNA-provet
    1. Smälta det totala RNA-provet med 10 U RNas I i 25 minuter vid 4 °C. rotera vid 30 rpm med ett roterande blandningsställ.
      OBS: Matsmältningsförhållandena kan kalibreras med polysomprofilering för att säkerställa att ingen över- eller undersmältning av monosomer toppar.
    2. Förbered sackaroskuddens huvudblandning enligt beskrivningen i tabell 2.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
50% Sackaros 200 25%
1M Tris-HCl pH 8,0 8 20 mM
3M KCl 18.7 140 mM
1M MgCl2 4 10 mM
100 mg/ml CHX 0.4 0,1 mg/ml
Proteashämmare 1 tablett
Slutlig volym 400

Tabell 2: Recept på sackaroskudde master mix.

  1. Fyll provet på 400 μl av sackaroskudden och centrifugera i en TLA120-rotor i 90 minuter vid 245 000 x g och vid 4 °C.
  2. Ta bort supernatanten snabbt med en vakuumpump och lägg över pellets med en 150 μl lysbuffert. Återsuspendera pelletsen genom att skaka i 1 timme vid 4 °C och vid 300 rpm.
  3. Resuspendera restpelleten genom pipettering och överför till ett nytt 1,5 ml rör.
    OBS: 100-200 μg totalt RNA är vanligtvis tillräckligt för ribosomprofilering av det totala translatomet. Man kan lägga till rRNA-utarmningssteg för att minska rRNA-kontaminering, vilket är den vanligaste föroreningen av ribosom-framväxande kedjor komplex affinitetsrening11 (se diskussion för mer information).
  1. Bearbetning av immunreningsprovet
    1. Tvätta 100-400 μL av affinitetsbindande matrisen (1:1 antikroppskonjugerade pärlor i 70% EtOH) per prov med 3 x 1 ml lysbuffert (utan DNasE I och proteashämmare); återsuspendera affinitetsmatrisen i lysbufferten och rotera sedan vid 30 rpm med ett roterande blandningsställ vid 4 °C i 5 min. Fäll ut genom centrifugering i 30 s vid 3 000 x g, 4 °C. Kassera den övre vätskan. Upprepa tre gånger.
    2. Smälta immunreproducerande prover med användning av 10 U per A260 nm-enhet RNasE I, tillsammans med affinitetsbindande matris (till exempel 100-400 μL GFP-TRAP per prov).
    3. Rotera i 25 minuter vid 30 rpm med ett roterande blandningsställ för att binda proteinet till affinitetsmatrisen vid 4 °C.
    4. Förbered tvättbuffertens huvudblandning enligt tabell 3.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
10 mg/ml CHX 50 0,1 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0 100 20 mM
3M KCl 233 140 mM
1M MgCl2 50 10 mM
1M PMSF 5 1 mM
Np-40 0.5 0.01%
Proteashämmare 2 tabletter
50% Glycerol 1,000 10%
Slutlig volym 5,000

Tabell 3: Recept för tvättbuffertmästarblandningen.

  1. Tvätta affinitetsbindande matris tre gånger med 1 ml tvättbuffert, varje gång i ~ 1 min, roterande i blandningsstället vid 30 rpm, vid 4 °C.
  2. Fäll ut genom centrifugering vid 3 000 x g i 30 s vid 4 °C. Kassera den övre vätskan.
  3. Tvätta två gånger till i 1 ml tvättbuffert, varje gång i 5 minuter, roterande i blandningsstället vid 30 rpm, vid 4 °C.
  4. Fäll ut genom centrifugering i 30 s vid 3 000 x g och 4 °C.
  5. Använd 50 μL pärlor för proteineluering med samma mängd 2x provbuffert. Använd resten av pärlorna för RNA-extraktion.
  6. Centrifugera i 30 s vid 3 000 x g, 4 °C för att pelletera pärlorna och kasta den övre vätskan.
  7. Frys in i flytande kväve och förvara vid -80 °C. Använd dessa prover för efterföljande RNA-extraktion.
    STOPPPUNKT: Proverna kan förvaras vid -80 °C över natten eller längre. Detta kan vara en stopppunkt.
  8. Bedöm framgången för affinitetsrening steg för western blot eller Coomassie färgning med alikvoter (~ 10 volymprocent, efter blandning) av varje steg. Använd alltid mock IP på en icke-taggad WT-stam som en kontroll för icke-specifik bindning till affinitetsmatrisen.
    OBS: Hög ospecifik bakgrund kan övervinnas genom ytterligare tvättsteg med ökande salt- / tvättmedelskoncentrationer. Övergående interaktion kan stabiliseras genom olika tvärbindningsmedel behandling, till exempel paraformaldehyd (PFA) behandling av levande celler - tillsats av 0,4% -1% PFA till tillväxtmediet i 2-5 min, följt av glycin (0,3 M) släckning i 3 min, rekommenderas starkt.
    VARNING: Paraformaldehyd är ett misstänkt cancerframkallande ämne. Eftersom paraformaldehyd avdunstar snabbt och är frätande, arbeta i en kemisk säkerhetshuv och använd två lager handskar.

5. cDNA-biblioteksförberedelse för djupsekvensering

  1. RNA-extraktion
    OBS: Arbeta med RNase-fria non-stick 1,5 ml rör för att förhindra eventuell RNA- eller DNA-utarmning.
    1. Tina proverna från steg 4.2.5 och 4.3.12 på is och återsuspendera proverna med 10 mM Tris-HCl pH 7,0 till en slutlig volym på 700 μL.
      VARNING: Syrafenol och kloroform är flyktiga och skadliga. Arbeta i en kemisk säkerhetshuva.
    2. Tillsätt 40 μL 20% SDS till 0,7 ml totala RNA- eller IP-elueringar. Stäng och invertera några gånger. Proteinutfällning bör göra proverna vita.
    3. Tillsätt 0,75 ml förvärmd syrafenol:kloroform till proverna. Täta rören ordentligt och skaka i en termisk mixer vid 1 400 rpm i 5 min och vid 65 °C. Kyl proverna på is i 5 min.
    4. Centrifugera röret från steg 5.1.3. vid 20 000 x g i 2 min. Överför det övre vattenhaltiga skiktet till ett nytt rör och tillsätt det 0,7 ml syrafenol:kloroform.
    5. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur, ibland virvlande. Centrifugera i 2 min vid 20 000 x g. Överför det övre vattenhaltiga skiktet till ett nytt rör och tillsätt 0,6 ml kloroform och virvel.
    6. Centrifugera i 1 min vid 20 000 x g. Överför det övre vattenhaltiga lagret till ett nytt rör.
    7. Fäll ut nukleinsyror genom tillsats av 78 μl 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL glykoblue och 0,75 ml isopropanol. Vortex noggrant i 5 min. Inkubera i minst 1 timme vid -80 °C eller 16 timmar vid -20 °C.
    8. Centrifugera i 30 min vid 20 000 x g och vid 4 °C och kassera supernatanten. Tvätta pelletsen med iskalla 0,75 ml 80% etanol. Vänd upp rören för en noggrann tvätt. Centrifugera vid 20 000 x g i 5 min vid 4 °C och kassera sedan supernatanten.
    9. Snurra ner vid 450 x g, 4 °C i 20 s och ta bort resterande etanol och kassera vätskorna. Torka pelleten med öppet lock i 5 min vid 65 °C. Resuspendera proverna enligt följande: för IP resuspendera provet i 10 μL 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. För total translatomanalys, resuspendera provet i 20 μL 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      STOPPPUNKT: RNA kan förvaras vid -80 °C i flera månader.
  2. Kvantifiera total RNA-koncentration med fluorometri
    OBS: Alla följande material och ytor ska vara RNase-fria när du förbereder cDNA-biblioteket för nästa generations sekvensering. Använd handskar när du hanterar RNA-prover.
    1. Späd 1 μL syrafenol-extraherat totalt RNA i 9 μL 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kvantifiera med hjälp av en fluorometer, enligt instruktionerna på tillverkarens webbplats.
    2. Späd proverna innehållande 50 μg RNA med 10 μL 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      OBSERVERA: Mät inte IP-prover, använd allt för nästa steg.
  3. Gelrenade ribosomskyddade fotavtrycksfragment
    1. Ställ in en 15% TBE-urea polyakrylamidgel och sänk ner i 1x TBE-löpbuffert. Kör i 30 minuter vid 200 V innan provbelastningen. Tillsätt 20 μl 2x TBE-ureaprovbuffert till varje prov.
      OBS: Förväntad bandstorlek är cirka 25-35 nt.
    2. Tina en 10 bp DNA-stege och denaturera prover (inte stege) vid 80 °C i 2 minuter och kyl sedan på is. Ladda varje prov på varannan fil. Kör gelén i 50-70 min vid 200 V.
    3. Späd 6 μL SYBR Gold (10 000 x koncentrat) i 60 ml 1x TBE-buffert och fläck medan du skakar i ljusskyddade lådor i 15-20 min. Medan du färgar gelén, förbered en steril skalpell och 0,5 ml gelbrytarrör i märkta 1,5 ml rör.
    4. Skär ut de önskade banden med en steril skalpell (använd en ny eller rengör väl mellan proverna) och placera varje gelbit i ett gelbrytarrör.
    5. Ta en bild av gelén för att se till att inga provrester finns kvar i gelén.
    6. Centrifugera rören som innehåller skurna skivor vid 20 000 x g i 5 minuter vid 4 °C och överför de återstående gelbitarna från gelbrytarröret till 1,5 ml-röret.
    7. Tillsätt 0,5 ml 10 mM Tris, pH 7,0. Skaka i en termisk mixer vid 1 400 rpm i 10 min vid 70 °C.
    8. Överför till en cellulosaacetatkolonn med en bred borrpipettspets och centrifugera vid 20 000 x g i 3 minuter vid 4 °C.
    9. Överför genomströmningen till ett nytt 1,5 ml rör och kyla på is.
    10. För att fälla ut nukleinsyrorna, tillsätt: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc och 2 μL glykoblå och virvel för att blanda noggrant. Placera proverna vid -80 °C i minst 1 timme.
    11. Centrifugera i minst 1 timme vid 20 000 x g och 4 °C och kassera supernatanten. Tvätta pelletsen med 0,75 ml iskall 80% etanol. Vänd upp rören för en noggrann tvätt tills pellets separeras från botten. Centrifugera igen vid 20 000 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
    12. Centrifugera vid 450 x g, 4 °C i 20 s och ta bort resterande etanol. Torka pelletsen med öppet lock i 5 min vid 65 °C.
    13. Tillsätt 15 μL 10 mM Tris, pH 7,0 och återsuspendera pelletsen noggrant. Snurra ner vid 450 x g, 4 °C i 20 s och överför provet till ett nytt 1,5 ml rör.
      STOPPPUNKT: Renat RNA kan förvaras vid -80 °C i några månader.
  4. Defosforylering
    1. Använd 3 μL av följande blandning för varje prov: Tillsätt 1 μl RNas-hämmare till 2 μl 10x T4 polynukleotidkinasreaktionsbuffert utan ATP. Tillsätt 2 μl T4-polynukleotidkinas till varje prov. Pipettera försiktigt för att blanda väl och inkubera vid 37 °C i 2 timmar, utan att skaka.
    2. För att inaktivera enzymet, inkubera provet vid 75 °C i 10 min och snurra ner vid 450 x g, 4 °C, i 20 s. Tillsätt 0,5 ml 10 mM Tris, pH 7,0.
    3. För att fälla ut nukleinsyra, tillsätt 2 μL glykoblue, 550 μl IPA och 55 μl 3 M NaOAc.
    4. Virvel att blanda noggrant och kyla proverna vid -80 °C i minst 1 timme.
      STOPPPUNKT: Proverna kan förvaras vid -80 °C över natten eller längre.
    5. Upprepa steg 5.3.11-5.3.13.
      STOPPPUNKT: Defosforylerat RNA kan förvaras vid -80 °C i flera månader.
  5. Kvantifiering med hjälp av en bioanalysator
    1. Gör en 1:4 utspädning av varje RNA-prov genom att blanda 1 μL prov och 4 μL DEPC-behandlat vatten.
      VARNING: DEPC är cancerframkallande. Använd handskar och arbeta försiktigt.
    2. Kör ett Bioanalyzer Small RNA Chip/TapeStation. Följ tillverkarens protokoll.
      OBS: Förväntad ribosomskyddad RNA-fragmentstorlek är cirka 28-30 nt.
  6. Ligate 3 'slut med Linker-1
    1. Späd 5 pmol små RNA-fragment till 10 μL med 10 mM Tris, pH 7,0. Denaturera prover vid 80 °C i 2 min och kyla på is.
    2. Bered huvudblandningen enligt tabell 4 och använd 29 μl per prov.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
50% sterilfiltrerad PEG 8000 16 20%
DMSO 4 10%
10× T4 RNA-ligas 2-buffert 4 1x
SUPERase-In RNas-hämmare 2 2 U
10 mM adenylerad länkare 3-L1 0.1 25 μM
DEPC-behandlat vatten 2.9
Slutlig volym 29

Tabell 4: Recept för 3'-slutligeringsmästarmix.

  1. Tillsätt 1 μl T4 RNA-ligas 2 och pipettera försiktigt för att blanda väl. Inkubera vid 23 °C i 2 timmar.
  2. För att fälla ut nukleinsyrorna, tillsätt: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL 3 M NaOAc och 2 μL glykoblue. Virvel blandas noggrant och placera proverna vid -80 °C i minst 1 timme.
    STOPPPUNKT: Förvara proverna vid -80 °C över natten eller längre.
  3. Upprepa steg 5.3.2–5.3.12.
  4. Resuspendera pelleten i 6 μL 10 mM Tris, pH 7,0. Snurra ner vid 450 x g, 4 °C i 20 s och överför provet till ett nytt 1,5 ml rör.
    STOPPPUNKT: Prover kan förvaras vid -80 °C i månader.
  1. Gelrening av 3' länkade fotavtryck
    1. Ställ in en 10% TBE-urea polyakrylamidgel och sänk ner i 1x TBE-löpbuffert. Kör i 30 minuter vid 200 V innan provbelastningen. Tillsätt 6 μl 2x TBE-ureaprovbuffert till varje prov.
      OBS: Förväntad bandstorlek är cirka 71-73 nt.
    2. Upprepa steg 5.3.2–5.3.13.
      STOPPPUNKT: Prover kan förvaras vid -80 °C i månader.
  2. Omvänd transkribering av 3ʹ länkade fotavtrycksfragment för att generera ssDNA
    1. Bered en huvudblandning enligt tabell 5 och använd 3 μl per prov.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
10 mM dNTP 1 0,5 mM
25 μM Länkare L(rt) 0.5 625 nM
DEPC-behandlat vatten 1.5
Slutlig volym 3

Tabell 5: Recept för den omvända transkriptionsbuffertmästarblandningen före nukleinsyrornas denaturering.

  1. Vortex och snurra ner provet.
  2. Inkubera prover vid 65 °C i 5 minuter.
  3. Kyl prover på is.
  4. Bered en huvudblandning enligt tabell 6 och använd 6 μl per prov. Vortex och snurra ner provet. Tillsätt 1 μl upphöjd III till varje prov och pipettera försiktigt för att blanda väl och inkubera i 30 minuter vid 50 °C.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
5× FS-buffert 4 1x
SUPERase-In RNas-hämmare 1 2 U
DTT 0,1 M 1 5 mM
Slutlig volym 6

Tabell 6: Recept för den omvända transkriptionsbuffertmästarblandningen efter nukleinsyrornas denaturering.

  1. Tillsätt 2,3 μl 1 N NaOH, som hydrolyserar RNA och släcker omvänd transkription.
    VARNING: NaOH är mycket frätande. Använd handskar och ögonskydd.
  2. Inkubera i 15 minuter vid 95 °C tills provet blir rosa.
  3. Ställ in en 10% TBE-urea polyakrylamidgel och sänk ner i 1x TBE-löpbuffert. Kör i 30 minuter vid 200 V innan provbelastningen. Tillsätt 23 μl 2x TBE-ureaprovbuffert till varje prov.
    OBS: Den förväntade DNA-bandstorleken är 115-117 nt.
  4. Upprepa steg 5.3.2–5.3.12.
  5. Resuspendera pelleten i 15 μL 10 mM Tris, pH 8,0. Snurra ner vid 450 x g, 4 °C i 20 s och överför provet till ett nytt 1,5 ml rör.
    STOPPPUNKT: Prover kan förvaras vid -80 °C i månader.
  1. ssDNA cirkularisering
    1. Bered följande huvudblandning och fyll på 4 μl per prov, enligt tabell 7.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
10× CircLigase II buffert 2 1x
5 M betain (tillval) 1 0,25 M
50 mM MnCl2 1 2,5 mM
Slutlig volym 4

Tabell 7: Recept för ssDNA cirkulär master mix.

  1. Tillsätt 1 μl CircLigase II ssDNA-ligas till varje prov och inkubera i 1 timme vid 60 °C.
    OBS: Effektiviteten i detta steg kan ökas genom att tillsätta 1 μL CircLigase II ssDNA-ligas till varje prov efter 1 h inkubation.
  2. Inaktivera enzymet genom att inkubera vid 80 °C i 10 minuter.
  3. Kyl på is och fortsätt till PCR-förstärkning eller förvara vid -80 °C.
    STOPPPUNKT: Prover kan förvaras vid -80 °C i flera år.
  1. PCR-förstärkning
    1. Förbered följande PCR-mastermix och ladda 82 μL per prov, enligt beskrivningen i tabell 8.
Reagens Mängd per prov (μl) Slutlig koncentration
DEPC-behandlat vatten 61.6
5× HF-reaktionsbuffert 17.6 1x
10 mM dNTP 1.8 200 μM
100 μM PCR framåt primer 0.2 225 nM
HF Phusion polymeras 0.8 1.6 U
Slutlig volym 82

Tabell 8: Recept för PCR-förstärkning master mix.

  1. Tillsätt 5 μl cirkulärt DNA till varje rör som innehåller huvudblandning.
    OBS: Förvara resten av de cirkulerade DNA-proverna vid -80 °C.
  2. Tillsätt en annan 1 μL 20 μM PCR omvänd streckkodsprimer till varje prov (se tabell 9) och virvel för att blanda noggrant.
  3. Alikvotera varje rör i fyra separata PCR-rör, var och en kommer att användas för ett annat antal PCR-cykler.
  4. Kör en PCR-reaktion enligt följande program, som beskrivs i tabell 10.
Cykel Denaturering (98 °C) Glödgning (60 °C) Förläng (72 °C)
1 30 s
2-16 10 s 10 s 5 s

Tabell 10: PCR-program för PCR-reaktion.

  1. Efter cyklerna 8, 9, 10 och 11 ta bort PCR-rör (för IP-prover, cykler sträcker sig från 9 till 15) som ett första försök. Efter varje cykel, pausa programmet, ta ut en alikvot och lägg den på is och återuppta sedan snabbt programmet.
    OBS: Antalet cykler bör justeras baserat på mängden cirkulärt DNA i varje reaktion. Se figur 4 för ett exempel och ytterligare förtydligande.
  2. Till varje 17 μL reaktion, tillsätt 3,5 μL 6x DNA-laddningsfärgämne.
  3. Tina en 10 bp DNA-stege.
  4. För storleksseparation genom gelelektrofores, sänk ner 8% TBE-polyakrylamid i 1x TBE-löpbuffert och ladda proverna från varje annat cykelnummer i intilliggande brunnar och kör gelén i 50 min vid 180 V.
  5. Späd 6 μL SYBR Gold (10 000 x koncentrat) i 60 ml 1x TBE-buffert och fläck medan du skakar i ljusskyddade lådor i 15-20 min.
  6. Medan du färgar gelén, förbered en steril skalpell och 0,5 ml gelbrytarrör i märkta 1,5 ml rör.
  7. Ta en bild av de färgade nukleinsyrorna.
  8. Skär önskat band med en förväntad bandstorlek på 174-176 bp med den sterila skalpellen och placera gelskivan i det beredda 0,5 ml gelbrytarröret (rengör noggrant mellan proverna och använd RNase-inaktiverande medel, eller byt till ett nytt blad).
  9. Centrifugera rören i 5 minuter vid 20 000 x g och 4 °C och överför sedan de återstående gelbitarna från 0,5 ml gelbrytarröret till 1,5 ml röret.
  10. Tillsätt 500 μL 10 mM Tris, pH 8,0 och skaka i en termisk mixer vid 1 400 rpm i 10 min och 70 °C.
  11. Överför den upplösta gelén till en cellulosaacetatkolonn med en bred borrpipettspets.
  12. Centrifugera kolonnen i 3 minuter vid 20 000 x g och 4 °C och överför genomströmningen till ett nytt 1,5 ml rör och kyla på is.
  13. För att fälla ut nukleinsyran, tillsätt: 550 μL IPA, 32 μL 5 M NaCl, 1 μL 0,5 M EDTA och 2 μL glykoblue och virvel för att blanda noggrant.
  14. Förvara proverna i minst 1 timme vid -80 °C eller -20 °C över natten.
    STOPPPUNKT: Proverna kan förvaras vid -80 °C över natten eller längre.
  15. Upprepa steg 5.3.11-5.3.12.
  16. Resuspend i 11 μL 10 mM Tris, pH 8,0. Snurra ner vid 450 x g, 4 °C i 20 s och överför provet till ett nytt 1,5 ml rör.
    STOPPPUNKT: Prover kan förvaras vid -80 °C i flera år.
  1. Kvantifiera storleksfördelning med Bioanalyzer
    1. Späd varje prov med 1:4 genom att blanda 1 μl prov med 4 μl DEPC-behandlat vatten.
    2. Kör Bioanalyzer Small RNA Chip. Följ tillverkarens protokoll.
      OBS: Den förväntade längden är 175 ± 5 bp.
  2. Kvantifiera DNA-koncentrationen med fluorometer
    1. Utför en dsDNA högkänslig koncentrationskontroll med en fluorometer enligt tillverkarens rekommendationer.
    2. Multiplex- och sekvensprover enligt Illuminas rekommendationer (Index Adapters Pooling Guide12).

6. Analys av data

  1. Utför analys enligt beskrivningen i tilläggsfilen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som illustreras i flödesschemat för detta protokoll (figur 1) odlades celler till loggfas och samlades sedan snabbt genom filtrering och lyserades genom kryogen slipning. Lysaten delades sedan upp i två: en för totala ribosomskyddade mRNA-fotavtryck och den andra för utvalda ribosomskyddade mRNA-fotavtryck, på vilken vi utförde affinitetsrening för att dra ner de taggade protein-ribosom-begynnande kedjorna. Vi säkerställde taggat proteinuttryck och framgången för pull-down genom western blot-analys, vilket kan ses i figur 2. Vi validerade isoleringen av ribosomskyddade fotavtryck, som vanligtvis är 20-45 nt långa genom liten RNA-elektrofores (2100 BioAnalyzer-system), vilket möjliggör 5-10 nt förskjutning i storleksdetektering, enligt systemhandboken (figur 3). Sedan genererade vi ett cDNA-bibliotek för djupsekvensering och big-data-analys. När du genererar cDNA-biblioteket bör du observera att undercykling kan leda till låg avkastning (vilket kan ses i körfält 2 i figur 3), men omförstärkning är möjlig för att återställa det genererade biblioteket. Övercykling kan uppstå när PCR-primers är uttömda men reaktionen fortsätter. När dNTP fortfarande är närvarande fortsätter reaktionen och genererar längre PCR-artefakter med chimära sekvenser på grund av att PCR-produkter grundar sig13 (vilket kan ses i körfält 3-4 i figur 3, indikerat av det synliga smetet). Om dNTP: s koncentration också blir begränsande kan produkter som indikerar närvaron av heteroduplexer som består av endast delvis homologa biblioteksfragment uppträda. Figur 4 fungerar som en referens, med körfält 2 som representerar optimal förstärkning och körfält 3 en acceptabel förstärkning. Prover från körfält 4 och 5 (cyklerna 10 och 11) bör inte användas på grund av möjligheten att införa PCR-dubbletter och artefakter. Det genererade biblioteket validerades ytterligare genom DNA-elektrofores med hög känslighet (samma BioAnalyzer-system användes) för exakt storleksfördelning och kvantifiering (figur 5). Efter 3 'slutlänkare ligering, omvänd transkription och PCR-förstärkning förväntas en cDNA-längdfördelning som sådan, med en skarp topp runt 175 nt.

Vi trimmade och tog bort adaptrar och streckkoder från det sekvenserade biblioteket, och endast avläsningarna mellan 20 och 45 nt valdes för vidare analys. Figur 6 visar den resulterande längdfördelningen. Läsningarna delades in i olika grupper av: kodningssekvenser, introner och intergeniska sekvenser (figur 7) och klassificerades vidare som visas i figur 8.

Slutlig analys för detektion och karakterisering av sam-translationella interaktioner utfördes baserat på anrikning av ribosomskyddade mRNA-fragment, vilket gav graferna i figur 9. Vi jämförde den normaliserade ribosombeläggningen (vid varje nukleotid längs varje orf) av det totala översättningsöverdraget med dess motsvarande valda translatom (nascent-interactome). Per nukleotidjämförelse eliminerar artefakter för översättningshastigheter. Reproducerbarheten mellan biologiska replikat utvärderades med Pearson-korrelation (tröskelvärde > 0,6). Vi presenterar selektiva ribosomprofiler och analyserar sam-translationella interaktioner av Vma2p med tre proteiner: ribosomassocierat chaperon Ssb1p, Pfk2p (fosfofrukttokinas) och Fas1p (fettsyrasyntas), med varje protein C 'terminalt märkt av GFP. Vi utförde protokollet i biologiska replikat. Figur 9 A, D och G visar det experimentella schemat för varje affinitetsrening. Vi visar sedan ribosombeläggningen av totala translatomer jämfört med Ssb1-interaktionomer längs Vma2p orf, kodning för en underenhet av den vakuolära H +-ATPase (Figur 9 B, E och H). Slutligen utförde vi kvotbaserad ribosomberikningsprofilering (IP/Total) vid varje ribosomposition i [kodon/aa] längs orf (figur 9 C, F och I). Att jämföra de sam-translationella interaktionerna mellan dessa tre proteiner med Vma2p, som syntetiseras av ribosomen, avslöjade att Ssb1 chaperon engagerar den framväxande Vma2p vid fyra olika regioner längs orf, eftersom vi identifierade fyra signifikanta anrikningstoppar av SeRP. Annorlunda visar Pfk2p endast en signifikant anrikningstopp, som identifierats av SeRP, i en annan position jämfört med den sam-translationella chaperonen Ssb1. Analys av Fas1-sam-translationella interaktioner med framväxande Vma2p detekterade ingen signifikant anrikning. Således visar jämförelsen av dessa förhållandebaserade anrikningsribosomprofiler detta protokolls kraft vid detektion och karakterisering av olika samtranslationella interaktioner i nära kodonupplösning.

Figure 2
Figur 2: Representativt resultat för western blot efter affinitetsrening av BY4741-stam med HA-märkt Naa10. Representativt western blot-resultat efter affinitetsrening av BY4741-stam med HA-märkt Naa10 som visar ett band runt 27,8 kDa, medan vildtypen, som en negativ kontroll, inte visar något band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativt bioanalysresultat efter fotavtrycksisolering och RNA-extraktion med syrafenol: kloroform och en genomsnittlig storlek på 25 nt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativ gelelektrofores av PCR-förstärkning. Representativ gelelektrofores av PCR-förstärkning med banor 2-5 laddade med PCR-produkter från cyklerna 8-11 och stegar på båda sidor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativt BioAnalyzer-resultat som erhållits efter skapandet av ett cDNA-bibliotek.

Figure 6
Figur 6: Förväntad längdfördelning av läsningar efter borttagning av adaptrarna med Cutadapt (borttagning av läsningar som är kortare än 20 eller längre än 45). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Förväntad justeringsframgångsprocent efter att ha tagit bort icke-kodande RNA-läsningar med Bowtie2 och använt TopHat för att justera de återstående läsningarna till olika organismer. Provet togs från S. cerevisiae (en muterad variant av BY4741). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: En graf genererad med RiboToolkit som representerar förväntat kodning kontra icke-kodande förhållande mellan justerade läsningar efter att ha använt Bowtie2 för att ta bort rRNA-element i läsningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Sam-translationella interaktioner mellan tre olika proteiner: Ssb1p, Pfk2p och Fas1p med Vma2p, som syntetiseras av ribosomen, analyserad av SeRP. Alla y-axlar visas i läsningar per miljon (RPM) läsningar. (A, D, G) Experimentellt schema för SeRP av Ssb1p, Pfk2p och Fas1p C 'terminalt taggade av GFP, respektive. (B, E, H) Ribosombeläggning längs orf för totala translatomer jämfört med Ssb1, Pfk2p respektive Fas1p-interaktionomer (i biologiska replikat). (C, F, I) Genomsnittlig anrikning av Ssb1p, Pfk2p och Fas1p (IP/Total-förhållande) vid varje ribosomposition i [kodon/aa] längs orf. Variationen mellan biologiska replikat indikeras av det skuggade området. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 9: 3' Linker- och primersekvenser. 3' Linker L1: Linker 3-L1 med 5ʹ adenylering och 3ʹ dideoxi-cytidin unika molekylära identifierare ("NN ...") (RNase-fri HPLC-rening; Omvänd transkriptionslänkare: omvänd transkription (L (rt)) med 5ʹ fosforylerade, unika molekylära identifierare (RNase-fri HPLC-rening); PCR framåt primer: PCRf; HPLC renas. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver protokollet den selektiva ribosomprofileringsmetoden för att fånga samöversättningsinteraktioner i nära kodonupplösning. När ribosomen stiger som ett nav för att samordna den framväxande kedjans uppkomst i den trånga cytoplasman, är detta en avgörande metod för att identifiera och karakterisera de olika sam-translationella interaktioner som krävs för att säkerställa ett funktionellt proteom, liksom för att studera olika sjukdomar. Hittills är SeRP den enda metoden som kan fånga och karakterisera dessa interaktioner, på ett direkt sätt, in vivo 14,15,16.

Det första och mest kritiska steget är cellinsamling och lys. Det är absolut nödvändigt att inom några sekunder fånga pågående översättning genom blixtfrysning följt av lys i fruset tillstånd. Cellinsamling måste ske med brådska för att undvika ribosomal avrinning samt inducera stress translationella svar, som kan uppstå snabbt. Det andra kritiska steget är affinitetsreningssteget. Det är absolut nödvändigt att minska bakgrundsbindningen genom strikt tvättning samtidigt som man ser till att samöversättningsinteraktionerna upprätthålls, vilket kan underlättas genom in vivo-tvärbindning. Eftersom detta protokoll är baserat på den mycket känsliga NGS (Next Generation Sequencing) kan hög bakgrund i de första stegen förstärkas i följande cDNA-biblioteksförberedelsesteg, vilket leder till låga signal-brusförhållanden.

Nukleasbehandling, för att smälta alla icke-skyddade mRNA bör utvärderas genom polysomprofilering17 tillsammans med noggrann utvärdering av den isolerade ribosomala fotavtryckens storleksfördelning (som beskrivs ovan) för att undvika över- eller under RNA-matsmältning. Kalibrering av nukleaskoncentration och matsmältningstider kan underlätta exakt återvinning av fotavtryck, eftersom översmältning kan leda till ribosomal rRNA-matsmältning, vilket leder till förlust av ribosomskyddade fotavtryck. Det är viktigt att notera att undersmältning också kan leda till lägre upptäcktshastigheter för ribosomskyddade fotavtryck, eftersom cDNA-bibliotekets förberedelsesteg, liksom dataanalyssteg som beskrivs här kasserar långa, okarakteristiska läsningar.

Även om rRNA-utarmning inte alltid utgör ett kritiskt steg och inte är obligatoriskt, har det vissa fördelar som renare prover och därför en högre hastighet av genommappade läsningar. Å andra sidan finns det möjlighet till förspänningar, eftersom många rRNA-utarmningsprotokoll också kan orsaka utarmning av de önskade ribosomskyddade fragmenten. Man bör också ta hänsyn till kostnaderna för rRNA-utarmningssatserna. rRNA-utarmning kan utföras efter isoleringssteget för ribosomfotavtryck eller efter cDNA-cirkulariseringssteget.

cDNA-biblioteksberedningssteg som beskrivs här har optimerats för låg mRNA-ingång, eftersom affinitets- och ribosomreningsstegen kraftigt minskar mRNA-ingångsmängden jämfört med RNA-seq-uttrycksstudier. Uppskalning av den initiala mängden cellkulturer kan i hög grad underlätta generering av cDNA-bibliotek. Alternativt kan valfritt cDNA-biblioteksprotokoll passa med stegen för affinitetsrening och fotavtrycksisolering som beskrivs här. Det är viktigt att notera att nukleasbehandlingen som genererar de ribosomala fotavtrycken kräver den resulterande mRNA-slutreparationen (cDNA-biblioteksberedning, defosforyleringssteg) för att möjliggöra följande länkligeringssteg i cDNA-protokollet som beskrivs här på i ditt valda protokoll.

Under sekvensering är det viktigt att skilja SeRP från RNA-Seq, eftersom de genererade bibliotekens heterogenitet varierar kraftigt beroende på affinitetsmärkta faktorer. Molekylära chaperoner och inriktningsfaktorer är ofta mer promiskuösa vid bindning, interagerar med hundratals eller tusentals substrat under översättning, vilket leder till mycket olika cDNA-bibliotek. Men mycket specifika interagerare, såsom samöversättningskomplexa sammansättningsinteraktioner, kan ofta leda till generering av mycket mindre olika cDNA-bibliotek. Att öka antalet olika och icke-olika bibliotek på samma körfält kan avsevärt förbättra sekvenseringen och följa dataanalysresultaten.

En annan unik egenskap hos SeRP är dess förmåga att fånga lokala variationer i ribosombeläggningar längs orf vilket möjliggör upptäckt av ribosomala förändringar i översättningshastighet associerad med varje uppsättning interaktioner. Det är därför absolut nödvändigt att jämföra ribosombeläggningar i varje kodon längs orf för att korrekt identifiera anrikning. Att använda orfs-medelvärden kan leda till förlust av övergående interaktioner eller falsk upptäckt.

Korrekt användning av SeRP-metoden öppnar många sam-translationella vägar för direkt analys, upptäcker nya mekanistiska egenskaper såväl som nya ribosomassocierade faktorer, vilket revolutionerar protein-biosyntesfältet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka alla labbmedlemmar för givande diskussioner och Muhammad Makhzumy för den kritiska läsningen av manuskriptet. Detta arbete finansierades av ISF (Israeli Science Foundation) bidrag 2106/20.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

Tags

Biologi utgåva 176
Global identifiering av saminterventionella interaktionsnätverk genom selektiv ribosomprofilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter