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Biology

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

Abstract

최근 몇 년 동안, 리보솜은 우리의 mRNA를 해독 할뿐만 아니라 혼잡 한 세포 환경으로 폴리펩티드 사슬의 출현을 안내한다는 것이 분명 해졌다. 리보솜은 막 표적화 인자의 공간적 및 동역학적으로 조절된 결합, 효소 변형 및 접이식 샤페론을 위한 플랫폼을 제공한다. 심지어 고차 올리고머 복합체로의 조립뿐만 아니라 단백질-단백질 네트워크 형성 단계도 합성과 배위되는 것으로 최근에 발견되었다.

여기에서는 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하기 위해 개발 된 방법 인 선택적 리보솜 프로파일 링 에 대해 설명합니다. 우리는 공동 번역 상호 작용기와 함께 리보솜 - 초기 사슬 복합체를 캡처하는 데 필요한 다양한 친화성 정제 단계뿐만 아니라 mRNA 추출, 크기 배제, 역전사, 딥 시퀀싱 및 빅 데이터 분석 단계를 자세히 설명합니다 거의 코돈 분해능에서 공동 번역 상호 작용을 해독하는 데 필요합니다.

Introduction

Se lective Ribosome Profiling (SeRP)은 현재까지 1,2,3,4,5,6 직접적인 방식으로 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하고 특성화하는 유일한 방법입니다. SeRP는 코돈 분해능 2,7에 가까운 리보솜을 번역하는 모든 인자의 상호작용에 대한 글로벌 프로파일링을 가능하게 한다.

이 방법은 성장하는 세포의 플래시 동결과 활성 번역 보존에 의존합니다. 이어서, 세포 용해물은 RNase I로 처리되어 "리보솜 발자국"으로 불리는 리보솜-보호된 mRNA 단편을 제외한 세포 내의 모든 mRNA를 소화시킨다. 그런 다음 샘플을 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 모든 세포 리보솜 발자국의 분리에 직접 사용되며, 이는 세포에서 진행중인 모든 번역을 나타냅니다. 두 번째 부분은 관심 인자와 관련된 리보솜의 특정 서브세트의 친화도-정제를 위해 사용된다: 예를 들어: 변형 효소, 전좌 인자, 폴딩 샤페론, 및 복합체-어셈블리 상호작용. 친화도 정제된 리보솜 발자국은 집합적으로 인터랙텀(interactome)이라고 불린다. 이어서, 리보솜-보호된 mRNA를 추출하고 cDNA 라이브러리 생성에 사용하고, 이어서 딥 시퀀싱을 수행한다.

전체 트랜스라톰 및 인터랙토메 샘플의 비교 분석은 관심 인자와 관련된 모든 orfs의 동정뿐만 아니라 각 orf 상호작용 프로파일의 특성화를 허용한다. 이 프로파일은 정확한 결합 개시 및 종결 서열을 보고하며, 이로부터 해독된 코돈 및 신흥 폴리펩티드 쇄의 각각의 잔기를 추론할 수 있을 뿐만 아니라, 상호작용 동안 리보솜 속도 변이(7,8)에 대해서도 보고한다. 그림 1은 프로토콜을 회로도로 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: SeRP 프로토콜의 개요 이 프로토콜은 7-10 일 이내에 전체적으로 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Protocol

1. 선택적 리보솜 프로파일링을 위한 균주 생성

참고: Selective Ribosome Profiling (SeRP)은 리보솜-초기 사슬 복합체와의 상호작용 모드를 평가하기 위해 관심 인자의 친화성 정제에 의존하는 방법이다. 상동성 재조합(9) 및 CRISPR/Cas910 기반 방법은 친화성 정제를 위해 다양한 관심 인자를 태그와 융합시키기 위해 이용된다. 이러한 태그는 GFP, GFP-트랩 친화성 정제를 위해, IgG-세파로스 비드 정제를 위한 TAP-태그 뿐만 아니라 아비딘 또는 스트렙타비딘에 의해 정제된 AVI-태그이며, 최근 몇 년 동안의 몇 가지 성공적인 예를 열거한다.

  1. 성장 또는 기능적 분석을 수행하여 태깅이 단백질 기능에 영향을 미치지 않았 음을 검증하십시오. N' 대 C' 터미널 태깅을 평가해야 합니다.
    참고: 리보솜(rRNA)과 다양한 인자의 많은 리보솜 결합 도메인은 고도로 충전되어 있어 고도로 대전된 태그(예: 폴리히스티딘)를 사용하는 것이 바람직하지 않습니다.

2. 문화 성장

  1. 원하는 태그가 붙은 단백질을 함유한 구성된 효모 배양물(균주 BY4741 기준)을 액체 효모-추출물-펩톤-덱스트로스(YPD)가 풍부한 배지 또는 합성 덱스트로스(SD) 최소 배지(황산암모늄이 포함된 1.7g/L 효모 질소 염기 또는 황산암모늄이 없는 1.7g/L 효모 질소 염기 1g/L 모노소듐 글루탐산, 2% 글루코스 및 아미노산의 완전하거나 적절한 혼합물로 보충)에서 배양하십시오.
  2. 세포 배양액 250-500 mL를 0.5OD600 (미드-로그)로 성장시키고, 30°C에서, 적절한 배지에서 성장시킨다.

3. 세포 수집 및 용해

  1. 유리 여과 시스템 (1 L 유리 깔때기, 진공 베이스 및 캡, 스테인레스 스틸 스크린, 개스킷 및 스프링 클램프, 90 mm; 접지 조인트 플라스크 1 L)이있는 0.45 μm 니트로 셀룰로오스 블롯팅 멤브레인 상에서 진공 여과하여 세포를 신속하게 수집합니다.
  2. 플래쉬 동결된 세포를 동결시키고, 펠릿화된 세포를 주걱으로 긁어내고, 즉시 이들을 액체 질소가 채워진 50 mL 튜브에 침지시킨다.
    정지 지점: 세포는 최대 3-4주 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
  3. 믹서 밀에서 극저온 분쇄에 의한 세포 용해를 수행한다: 30 Hz에서 2분 동안 2회, 용해 완충액 1 mL를 사용한다( 표 1 참조). 밀링 사이의 액체 질소에서 차가워집니다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
10 mg/mL CHX (사이클로헥시미드) 220 0.5 밀리그램/mL
1M 트리스-HCl pH 8.0 88 20 밀리지미터
3엠 KCl 205.7 140 밀리지미터
1MMgCl2 26.4 6 밀리지미터
1M PMSF 4.4 1 밀리지미터
NP-40 4.4 0.10%
프로테아제 억제제 2 정
DNase I 8.8 0.02 U/mL
최종 볼륨 4,400

표 1: 용해 완충액 마스터 믹스에 대한 레시피.

참고: 용해 완충액은 관심있는 단백질이 매우 불안정한 경우 더 많은 프로테아제 억제제 (예 : 베스타틴, 루펩틴, 아프로티닌 등)를 포함하도록 변경 될 수 있지만 다음 단계에서 조립 된 리보솜의 크고 작은 서브 유닛을 유지하기 위해 EDTA를 피하는 것이 중요합니다. 유사한 이유로, 항상 완충 용액 내에 적어도 6 mMMgCl2 를 유지한다.

주의: HCl은 부식성이 강하고 PMSF는 독성이 있습니다. 장갑을 끼고 조심스럽게 다루십시오.

  1. 30,000 x g, 4°C에서 2분 동안 원심분리하여 용해물을 맑게 하고 상층액을 수집한다.

4. SeRP를 위한 리보솜-초기 사슬 복합체의 정제

  1. 각 실험에 대해 상청액을 두 부분으로 나눕니다. 각각 다른 마이크로 원심분리 튜브에 있습니다 : 총 RNA 샘플 (∼200 μL) 및 면역 정제 (IP) 샘플 (∼700 μL) 트랜스라톰 샘플.
  2. 전체 RNA 샘플 처리
    1. 4°C에서 25분 동안 10 U의 RNase I을 사용하여 총 RNA 샘플을 소화하고; 회전 믹스 랙으로 30RPM으로 회전합니다.
      참고: 폴리솜 프로파일링을 사용하여 소화 상태를 보정하여 모노솜 피크의 과소화 또는 과소 소화를 보장할 수 있습니다.
    2. 표 2에 기재된 바와 같이 수크로오스 쿠션 마스터 믹스를 제조한다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
자당 50% 200 25%
1M 트리스-HCl pH 8.0 8 20 밀리지미터
3엠 KCl 18.7 140 밀리지미터
1MMgCl2 4 10 밀리지미터
100 밀리그램/mL CHX 0.4 0.1 밀리그램/mL
프로테아제 억제제 태블릿 1개
최종 볼륨 400

표 2: 자당 쿠션 마스터 믹스의 레시피.

  1. 샘플을 400 μL의 수크로오스 쿠션 상에 로딩하고, 245,000 x g 및 4°C에서 90분 동안 TLA120-로터에서 원심분리한다.
  2. 진공 펌프로 상층액을 신속하게 제거하고 펠렛을 150 μL 용해 완충액으로 오버레이하십시오. 펠렛을 4°C 및 300 RPM에서 1시간 동안 진탕하여 재현탁시킨다.
  3. 피펫팅에 의해 잔류 펠렛을 재현탁시키고 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
    참고: 총 RNA의 100-200 μg은 일반적으로 전체 트랜스라톰의 리보솜 프로파일링에 충분합니다. 리보솜-초기 사슬 복합체 친화성 정제(11 )의 가장 널리 퍼진 오염물질인 rRNA 오염을 감소시키기 위해 rRNA 고갈 단계를 추가할 수 있다(자세한 내용은 논의 참조).
  1. 면역정제 시료 처리
    1. 샘플 당 100-400 μL의 친화도-결합 매트릭스 (70% EtOH 중의 1:1 항체-컨쥬게이션된 비드)를 3 x 1 mL 용해 완충액 (DNase I 및 프로테아제 억제제 없이)으로 세척하고; 친화성 매트릭스를 용해 완충액에 재현탁시킨 다음, 5분 동안 4°C에서 회전 믹스 랙으로 30 RPM에서 회전시킨다. 3,000 x g, 4°C에서 30초 동안 원심분리하여 침전시켰다. 상부 액체를 버리십시오. 세 번 반복하십시오.
    2. 친화도 결합 매트릭스와 함께 RNase I의 A260 nm 단위 당 10 U를 사용하여 면역정제 샘플을 소화한다 (예를 들어, 샘플 당 100-400 μL의 GFP-TRAP).
    3. 단백질을 친화성 매트릭스에 결합시키기 위해, 4°C에서 회전 믹스 랙과 함께 30 RPM에서 25분 동안 회전시킨다.
    4. 표 3에 상술된 바와 같이 세척 완충액 마스터 믹스를 준비한다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
10 밀리그램/mL CHX 50 0.1 밀리그램/mL
1M 트리스-HCl pH 8.0 100 20 밀리지미터
3엠 KCl 233 140 밀리지미터
1MMgCl2 50 10 밀리지미터
1M PMSF 5 1 밀리지미터
NP-40 0.5 0.01%
프로테아제 억제제 2 정
50% 글리세롤 1,000 10%
최종 볼륨 5,000

표 3: 세척 완충액 마스터 믹스에 대한 레시피.

  1. 친화도 결합 매트릭스를 1 mL의 세척 완충액으로 3회 세척하고, 매번 ~1분 동안 혼합하고, 믹스 랙에서 30 RPM에서, 4°C에서 회전시킨다.
  2. 4°C에서 30초 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 침전물을 침전시켰다. 상부 액체를 버리십시오.
  3. 1 mL 세척 완충액에서 두 번 더 세척하고, 매번 5분 동안 혼합팩에서 회전시키고, 4°C에서 30 RPM으로 회전시킨다.
  4. 3,000 x g 및 4°C에서 30 s 동안 원심분리하여 침전시켰다.
  5. 동일한 양의 2x 샘플 버퍼로 단백질 용출을 위해 50μL의 비드를 사용하십시오. RNA 추출을 위해 나머지 비드를 사용하십시오.
  6. 3,000 x g, 4°C에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하고 상부 액체를 버린다.
  7. 액체 질소에서 동결시키고 -80°C에서 저장한다. 후속 RNA 추출을 위해 이러한 샘플을 사용하십시오.
    정지 지점: 샘플은 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관할 수 있습니다. 이는 중지 지점이 될 수 있습니다.
  8. 각 단계의 분취량(∼10 부피%, 혼합 후)으로 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 염색에 의한 친화성 정제 단계의 성공을 평가한다. 항상 친화성 매트릭스에 대한 비특이적 결합에 대한 대조군으로서 태그가 지정되지 않은 WT 균주에 대한 모의 IP를 사용하십시오.
    참고 : 높은 비특이적 배경은 소금 / 세제 농도가 증가하는 추가 세척 단계를 통해 극복 할 수 있습니다. 일시적 상호작용은 다양한 가교제 처리에 의해 안정화될 수 있으며, 예를 들어, 살아있는 세포의 파라포름알데히드 (PFA) 처리-성장 배지에 0.4%-1% PFA를 2-5분 동안 첨가하고, 이어서 글리신 (0.3 M) 담금질에 의해 3분 동안 켄칭하는 것이 매우 권장된다.
    주의: 파라포름알데히드는 발암물질로 의심됩니다. 파라포름 알데히드는 빠르게 증발하고 부식성이 있기 때문에 화학 안전 후드에서 작업하고 두 겹의 장갑을 착용하십시오.

5. 깊은 시퀀싱을위한 cDNA 라이브러리 준비

  1. RNA 추출
    참고: RNase가 없는 붙지 않는 1.5mL 튜브를 사용하여 RNA 또는 DNA 고갈을 방지하십시오.
    1. 단계 4.2.5 및 4.3.12로부터의 샘플을 얼음 상에서 해동시키고, 샘플을 10 mM Tris-HCl pH 7.0으로 재현탁시켜 700 μL의 최종 부피로 재현탁시킨다.
      주의: 산-페놀과 클로로포름은 휘발성이며 해롭다. 화학 안전 후드에서 작업하십시오.
    2. 40 μL의 20% SDS를 0.7 mL 총 RNA 또는 IP 용출액에 첨가한다. 몇 번 닫고 반전하십시오. 단백질 침전은 샘플을 흰색으로 바꿔야합니다.
    3. 0.75 mL의 미리 가온된 산-페놀:클로로포름을 샘플에 첨가하십시오. 튜브를 단단히 밀봉하고 열 혼합기에서 1,400RPM에서 5분 동안 그리고 65°C에서 흔들어 주십시오. 얼음 위에서 샘플을 5 분 동안 식히십시오.
    4. 튜브를 단계 5.1.3에서 원심분리한다. 2 분 동안 20,000 x g 에서. 상단 수층을 신선한 튜브로 옮기고 0.7 mL의 산 페놀 : 클로로포름을 첨가하십시오.
    5. 실온에서 5 분 동안 배양하고 때로는 볼텍싱합니다. 20,000 x g에서 2분 동안 원심분리한다. 상부 수성층을 신선한 튜브로 옮기고 0.6 mL 클로로포름 및 와류를 첨가한다.
    6. 20,000 x g에서 1분 동안 원심분리한다. 상단 수성 층을 신선한 튜브로 옮깁니다.
    7. 78 μL의 3 M NaOAc, pH 5.5, 2 μL의 글리코블루, 및 0.75 mL의 이소프로판올을 첨가하여 핵산을 침전시킨다. 5 분 동안 철저히 소용돌이. -80°C에서 적어도 1시간 또는 -20°C에서 16시간 동안 인큐베이션한다.
    8. 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하고 4°C에서 상층액을 버린다. 펠렛을 빙냉 0.75 mL의 80% 에탄올로 세척한다. 철저한 세척을 위해 튜브를 뒤집습니다. 4°C에서 5분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 버린다.
    9. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 스핀다운하고 남은 에탄올을 제거하고 액체를 버린다. 펠렛을 열린 뚜껑으로 65°C에서 5분 동안 건조시켰다. 샘플을 다음과 같이 재현탁시킨다: IP에 대해 샘플을 10 mM Tris-HCl, pH 7.0의 10 μL에 재현탁시킨다. 총 트랜스라톰 분석을 위해, 샘플을 20 μL의 10 mM Tris-HCl, pH 7.0에 재현탁시킨다.
      정지점: RNA는 수개월 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
  2. 형광측정법에 의한 총 RNA 농도 정량화
    참고: 다음 모든 물질과 표면은 차세대 시퀀싱을 위해 cDNA 라이브러리를 준비하는 동안 RNase가 없어야 합니다. RNA 샘플을 취급하는 동안 장갑을 착용하십시오.
    1. 1 μL의 산 페놀-추출된 총 RNA를 9 μL의 10 mM Tris-HCl, pH 7.0에 희석하였다. 제조업체의 웹 사이트에서 지시 한대로 형광계를 사용하여 정량화하십시오.
    2. 50 μg의 RNA를 함유하는 샘플을 10 μL의 10 mM Tris-HCl, pH 7.0으로 희석한다.
      참고: IP 샘플을 측정하지 말고 다음 단계를 위해 모든 것을 사용하십시오.
  3. 젤 정화 리보솜 보호 발자국 조각
    1. 15% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔을 설정하고 1x TBE 실행 완충액에 침수시킨다. 샘플 로딩 전에 200V에서 30분 동안 실행합니다. 각 샘플에 2x TBE-urea 샘플 버퍼 20μL를 첨가한다.
      참고: 예상 밴드 크기는 약 25-35nt입니다.
    2. 10 bp DNA 사다리를 해동시키고 변성 샘플(사다리 아님)을 80°C에서 2분 동안 해동시킨 다음, 얼음 상에서 냉각시킨다. 각 샘플을 다른 모든 차선에 로드합니다. 젤을 200V에서 50-70 분 동안 실행하십시오.
    3. 6 μL의 SYBR Gold (10,000 x 농축액)를 60 mL의 1x TBE 버퍼에 희석하고 15-20 분 동안 광 보호 상자에서 흔들면서 얼룩을냅니다. 겔을 염색하면서, 멸균 메스 및 0.5 mL 겔-브레이커 튜브를 표지된 1.5 mL 튜브에서 제조하였다.
    4. 멸균 메스로 원하는 밴드를 소비하고 (신선한 것을 사용하거나 샘플 사이에 잘 청소하십시오) 각 젤 조각을 젤 브레이커 튜브에 넣으십시오.
    5. 젤의 이미지를 촬영하여 젤에 샘플 잔류 물이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
    6. 절단된 슬라이스를 함유하는 튜브를 4°C에서 5분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하고, 나머지 겔 조각을 겔 차단기 튜브로부터 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
    7. 0.5 mL의 10 mM 트리스, pH 7.0을 첨가한다. 열 혼합기에서 1,400 RPM에서 70°C에서 10분 동안 흔들어준다.
    8. 넓은 보어 피펫 팁으로 셀룰로스 아세테이트 컬럼을 옮기고, 4°C에서 3분 동안 20,000 x g 에서 원심분리한다.
    9. 플로우스루를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 얼음 위에서 식히십시오.
    10. 핵산을 침전시키기 위해, 추가로 550 μL의 IPA, 55 μL의 3 M NaOAc, 및 2 μL의 글리코블루와 와류를 완전히 혼합한다. 샘플을 적어도 1시간 동안 -80°C에 둔다.
    11. 20,000 x g 및 4°C에서 적어도 1시간 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 펠렛을 빙냉 80% 에탄올 0.75 mL로 세척한다. 펠릿이 바닥에서 분리 될 때까지 철저히 세척하기 위해 튜브를 뒤집습니다. 다시 20,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다.
    12. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 스핀다운하고 남은 에탄올을 제거하였다. 펠렛을 열린 뚜껑으로 65°C에서 5분 동안 건조시킨다.
    13. 15 μL의 10 mM 트리스, pH 7.0을 첨가하고, 펠렛을 완전히 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
      정지점: 정제된 RNA는 -80°C에서 몇 달 동안 저장될 수 있다.
  4. 탈인산화
    1. 각 샘플에 대해 3 μL의 다음 믹스를 사용하십시오: ATP가 없는 10x T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충액 2μL에 RNase 억제제 1μL를 첨가하십시오. 2 μL의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 각 샘플에 첨가한다. 피펫을 부드럽게 잘 섞고, 진탕 없이 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
    2. 효소를 불활성화시키기 위해, 샘플을 75°C에서 10분 동안 인큐베이션하고, 450 x g, 4°C에서 20초 동안 스핀다운시킨다.
    3. 핵산을 침전시키려면, 2 μL의 글리코블루, 550 μL의 IPA 및 55 μL의 3 M NaOAc를 첨가하였다.
    4. 소용돌이를 완전히 혼합하고 샘플을 -80°C에서 적어도 1시간 동안 냉각시킨다.
      정지 지점: 샘플은 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관할 수 있습니다.
    5. 5.3.11-5.3.13단계를 반복합니다.
      정지점: 탈인산화된 RNA는 수개월 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
  5. 바이오분석기를 이용한 정량화
    1. 1 μL의 샘플과 4 μL의 DEPC 처리수를 혼합하여 각 RNA 샘플을 1:4 희석액으로 만든다.
      주의: DEPC는 발암 물질입니다. 장갑을 끼고 조심스럽게 작업하십시오.
    2. 바이오 분석기 소형 RNA 칩 / 테이프 스테이션을 실행하십시오. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
      참고: 예상 리보솜 보호 RNA 단편 크기는 약 28-30 nt입니다.
  6. Ligate 3' 끝과 링커-1
    1. 작은 RNA 단편 5 pmol을 10 μL로 희석하여 10 mM 트리스, pH 7.0으로 한다. 샘플을 80°C에서 2분 동안 변성시키고 얼음 위에서 차가워진다.
    2. 표 4에 상술된 바와 같이 마스터 믹스를 제조하고 샘플 당 29 μL를 사용한다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
50% 멸균 여과된 PEG 8000 16 20%
증권 시세 표시기 4 10%
10× T4 RNA 리가아제 2 완충액 4 1배
수퍼라아제-RNase 억제제에서 2 2 U
10 mM 아데닐화 링커 3-L1 0.1 25 μM
DEPC 처리 된 물 2.9
최종 볼륨 29

표 4: 3' 말단 결찰 마스터 믹스에 대한 레시피.

  1. 1 μL의 T4 RNA 리가아제 2와 피펫을 부드럽게 첨가하여 잘 혼합한다. 23°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
  2. 핵산을 침전시키기 위해, 추가로 550 μL의 IPA, 500 μL의 10 mM 트리스, pH 7.0, 55 μL의 3 M NaOAc, 및 2 μL의 글리코블루. 볼텍스를 완전히 혼합하고, 샘플을 적어도 1 h 동안 -80°C에 놓는다.
    정지점: 샘플을 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관한다.
  3. 5.3.2-5.3.12단계를 반복합니다.
  4. 펠렛을 6 μL의 10 mM 트리스, pH 7.0에 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고, 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
    정지 지점: 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  1. 3' 연결된 발자국의 겔 정제
    1. 10% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔을 설정하고 1x TBE 실행 완충액에 침수시킨다. 샘플 로딩 전에 200V에서 30분 동안 실행합니다. 각 샘플에 6 μL의 2x TBE-urea 샘플 버퍼를 첨가한다.
      참고: 예상 밴드 크기는 약 71-73nt입니다.
    2. 5.3.2-5.3.13단계를 반복합니다.
      정지 지점: 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. ssDNA를 생성하기 위해 3ʹ 연결된 발자국 조각을 역전사
    1. 표 5에 상술된 바와 같이 마스터 믹스를 제조하고 샘플 당 3 μL를 사용한다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
10 mM dNTPs 1 0.5 밀리지미터
25 μM 링커 L (rt) 0.5 625 nM
DEPC 처리 된 물 1.5
최종 볼륨 3

표 5: 핵산이 변성되기 전의 역전사 버퍼 마스터 믹스에 대한 레시피.

  1. 소용돌이 치며 샘플을 회전시킵니다.
  2. 샘플을 65°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  3. 얼음 위에서 샘플을 식히십시오.
  4. 표 6에 상술된 바와 같이 마스터 믹스를 제조하고 샘플 당 6 μL를 사용한다. 소용돌이 치며 샘플을 회전시킵니다. 1 μL의 Superscript III를 각 샘플 및 피펫에 첨가하고 부드럽게 혼합하여 잘 혼합하고 50°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
5× FS 버퍼 4 1배
수퍼라아제-RNase 억제제에서 1 2 U
DTT 0.1 엠 1 5 밀리지미터
최종 볼륨 6

표 6: 핵산 변성 후의 역전사 버퍼 마스터 믹스에 대한 레시피.

  1. 2.3 μL의 1 N NaOH를 첨가하고, 이는 RNA를 가수분해하고 역전사를 켄칭한다.
    주의: NaOH는 부식성이 매우 높습니다. 장갑과 눈 보호 장치를 착용하십시오.
  2. 샘플이 분홍색으로 변할 때까지 95°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
  3. 10% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔을 설정하고 1x TBE 실행 완충액에 침수시킨다. 샘플 로딩 전에 200V에서 30분 동안 실행합니다. 각 샘플에 23μL의 2x TBE-urea 샘플 버퍼를 첨가한다.
    참고: 예상 DNA 밴드 크기는 115-117 nt입니다.
  4. 5.3.2-5.3.12단계를 반복합니다.
  5. 펠렛을 10 mM 트리스, pH 8.0의 15 μL에 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
    정지 지점: 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  1. ssDNA 원형화
    1. 다음의 마스터 믹스를 준비하고, 표 7에 상술된 바와 같이 샘플당 4 μL를 로딩한다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
10× CircLigase II 버퍼 2 1배
5 M 베타인 (옵션) 1 0.25 엠
50 mMMnCl2 1 2.5 밀리지미터
최종 볼륨 4

표 7: ssDNA 원형화 마스터 믹스에 대한 레시피.

  1. 1 μL의 CircLigase II ssDNA 리가아제를 각 샘플에 첨가하고, 60°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
    참고: 이 단계의 효율은 1시간 배양 후 각 샘플에 1μL의 CircLigase II ssDNA 리가아제를 첨가함으로써 증가될 수 있다.
  2. 효소를 불활성화시키고 80°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
  3. 얼음 위에서 식히고 PCR 증폭을 계속하거나 -80°C에서 보관한다.
    정지 지점: 샘플은 -80°C에서 수년 동안 보관할 수 있습니다.
  1. PCR 증폭
    1. 다음의 PCR 마스터 믹스를 준비하고, 표 8에 상술된 바와 같이 샘플당 82 μL를 로딩한다.
시약 시료당 양(μL) 최종 농도
DEPC 처리 된 물 61.6
5× 퓨션 HF 반응 완충액 17.6 1배
10 mM dNTPs 1.8 200 μM
100 μM PCR 정방향 프라이머 0.2 225 nM
HF Phusion 중합효소 0.8 1.6 U
최종 볼륨 82

표 8: PCR 증폭 마스터 믹스를 위한 레시피.

  1. 마스터 믹스가 들어있는 각 튜브에 5μL의 원형 DNA를 첨가한다.
    참고: 나머지 원형 DNA 샘플을 -80°C에 보관하십시오.
  2. 20 μM PCR 역방향 바코드 프라이머의 상이한 1 μL를 각 샘플에 첨가하고( 표 9 참조) 와류하여 완전히 혼합한다.
  3. 각 튜브를 네 개의 개별 PCR 튜브로 분취하고, 각각은 상이한 수의 PCR 사이클을 위해 사용될 것이다.
  4. 표 10에 상술된 바와 같이 하기 프로그램에 따라 PCR 반응을 실행한다.
주기 변성 (98 °C) 어닐 (60 °C) 확장 (72 °C)
1 30초
2-16 10초 10초 5초

표 10: PCR 반응을 위한 PCR 프로그램.

  1. 사이클 8, 9, 10, 및 11 후에 첫 번째 시도로서 PCR 튜브(IP 샘플의 경우, 사이클 범위는 9 내지 15)를 제거하였다. 매 사이클이 끝나면 프로그램을 일시 중지하고 하나의 분취량을 꺼내 얼음 위에 놓은 다음 신속하게 프로그램을 다시 시작하십시오.
    참고 : 사이클 수는 각 반응에서 순환 된 DNA의 양에 따라 조정되어야합니다. 예를 들어 그림 4를 참조하고 더 자세히 설명합니다.
  2. 각 17 μL 반응에, 3.5 μL의 6x DNA 로딩 염료를 첨가한다.
  3. 10 bp DNA 사다리를 해동시킨다.
  4. 겔 전기영동에 의한 크기 분리를 위해, 8% TBE 폴리아크릴아미드를 1x TBE 실행 완충액에 침수시키고 각각의 상이한 사이클 수의 샘플을 인접한 웰에 로딩하고 180 V에서 50분 동안 겔을 실행한다.
  5. 6 μL의 SYBR Gold (10,000 x 농축액)를 60 mL의 1x TBE 버퍼에 희석하고 15-20 분 동안 광 보호 상자에서 흔들면서 얼룩을냅니다.
  6. 겔을 염색하면서, 멸균 메스 및 0.5 mL 겔-브레이커 튜브를 표지된 1.5 mL 튜브에서 제조하였다.
  7. 염색된 핵산의 이미지를 촬영한다.
  8. 멸균 메스로 174-176 bp의 예상 밴드 크기로 원하는 밴드를 절단하고 겔 슬라이스를 준비된 0.5 mL 겔 차단기 튜브에 넣습니다 (샘플 사이를 철저히 청소하고 RNase 불활성화제를 사용하거나 새로운 블레이드로 전환).
  9. 튜브를 20,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 이어서 나머지 겔 조각을 0.5 mL 겔 차단기 튜브로부터 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
  10. 500 μL의 10 mM 트리스, pH 8.0을 첨가하고, 10분 및 70°C에서 1,400 RPM의 열 혼합기에서 진탕한다.
  11. 용해된 겔을 넓은 보어 피펫 팁이 있는 셀룰로스 아세테이트 컬럼으로 옮긴다.
  12. 컬럼을 20,000 x g 및 4°C에서 3분 동안 원심분리하고, 유동-관통을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 얼음 상에서 냉각시킨다.
  13. 핵산을 침전시키기 위해, 추가로 550 μL의 IPA, 32 μL의 5 M NaCl, 1 μL의 0.5 M EDTA, 및 2 μL의 글리코블루와 와류를 완전히 혼합한다.
  14. 샘플을 -80°C 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 적어도 1시간 동안 보관한다.
    정지 지점: 샘플은 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관할 수 있습니다.
  15. 5.3.11-5.3.12단계를 반복합니다.
  16. 11 μL의 10 mM 트리스, pH 8.0에 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
    정지 지점: 샘플은 -80°C에서 수년 동안 보관할 수 있습니다.
  1. 바이오 분석기에 의한 크기 분포 정량화
    1. 1 μL의 시료를 4 μL의 DEPC 처리수와 혼합하여 각 시료를 1:4로 희석한다.
    2. 바이오 분석기 소형 RNA 칩을 실행합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
      참고: 예상 길이는 175 ± 5bp입니다.
  2. 형광계로 DNA 농도 정량화
    1. 제조업체의 권장 사항에 따라 형광계로 dsDNA 고감도 농도 검사를 수행하십시오.
    2. Illumina 권장 사항에 따라 멀티플렉스 및 시퀀스 샘플(인덱스 어댑터 풀링 가이드12).

6. 데이터 분석

  1. 보충 파일에 자세히 설명된 대로 분석을 수행합니다.

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Representative Results

이 프로토콜의 흐름도(도 1)에 예시된 바와 같이, 세포를 로그 페이즈로 성장시킨 다음, 여과에 의해 신속하게 수집하고, 극저온 분쇄에 의해 용해시켰다. 그런 다음 용해물을 두 개로 나눴습니다: 하나는 총 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고 다른 하나는 선택된 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고, 우리는 태그된 단백질-리보솜-초기 사슬 복합체를 풀다운하기 위해 친화성 정제를 수행했다. 우리는 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 태그된 단백질 발현 및 풀다운의 성공을 웨스턴 블롯 분석에 의해 보장하였다. 우리는 작은 RNA 전기영동(2100 BioAnalyzer 시스템)에 의해 일반적으로 20-45nt 길이인 리보솜 보호 풋프린트의 분리를 검증하여 시스템 매뉴얼에 따라 5-10nt 크기 시프트 검출을 가능하게 했습니다(그림 3). 그런 다음 심층 시퀀싱 및 빅 데이터 분석을위한 cDNA 라이브러리를 생성했습니다. cDNA 라이브러리를 생성하는 동안, 언더사이클링은 낮은 수율로 이어질 수 있지만( 도 3의 레인 2에서 볼 수 있듯이), 생성된 라이브러리를 복구하기 위해 재증폭이 가능하다는 점에 유의한다. PCR 프라이머가 고갈되었지만 반응이 계속될 때 오버사이클링이 발생할 수 있습니다. dNTPs가 여전히 존재할 때, 반응이 진행되어,13 개의 프라이밍된 PCR 산물로 인해 키메라 서열로 더 긴 PCR 아티팩트가 생성된다( 도 3의 레인 3-4에서 볼 수 있듯이, 가시적인 번짐으로 나타냄). dNTPs의 농도 또한 제한이되면, 부분적으로만 상동성인 라이브러리 단편으로 구성된 헤테로듀플렉스의 존재를 나타내는 생성물이 나타날 수 있다. 도 4는 기준으로서 작용하며, 레인 2는 최적 증폭을 나타내고, 레인 3은 허용 가능한 증폭을 나타낸다. 레인 4 및 5(사이클 10 및 11)로부터의 샘플은 PCR 중복 및 아티팩트를 도입할 가능성 때문에 사용해서는 안 된다. 생성된 라이브러리는 정확한 크기 분포 및 정량화를 위해 고감도 DNA 전기영동(동일한 BioAnalyzer 시스템이 사용됨)에 의해 추가로 검증되었다(도 5). 3' 말단 링커 라이게이션, 역전사 및 PCR 증폭 후, cDNA 길이 분포 등이 예상되며, 약 175 nt의 날카로운 피크가 있다.

시퀀스된 라이브러리에서 어댑터와 바코드를 트리밍하고 제거했으며, 추가 분석을 위해 20~45nt 사이의 판독값만 선택했습니다. 도 6은 결과 길이 분포를 나타낸다. 판독들은 다음의 상이한 그룹들로 나뉘어졌다: 코딩 서열, 인트론, 및 인터제닉 서열(도 7), 및 도 8에 도시된 바와 같이 추가로 분류되었다.

공동번역 상호작용의 검출 및 특성화를 위한 최종 분석은 리보솜-보호된 mRNA 단편의 농축에 기초하여 수행되었고, 도 9의 그래프를 생성하였다. 우리는 전체 트랜스라톰의 정규화된 리보솜 점유(각 orf를 따라 각각의 뉴클레오티드에서)를 상응하는 선택된 트랜스라톰(nascent-interactome)과 비교하였다. 뉴클레오티드 당 비교는 아티팩트의 번역률을 제거한다. 생물학적 반복실험 사이의 재현성은 피어슨 상관관계에 의해 평가되었다(역치 > 0.6). 우리는 리보솜 관련 샤페론 Ssb1p, Pfk2p (포스포프럭토키나제) 및 Fas1p (지방산 합성 효소)의 세 가지 단백질과 Vma2p의 공동 번역 상호 작용을 분석하는 선택적 리보솜 프로파일을 제시하며, 각 단백질 C'는 GFP에 의해 말단으로 태그됩니다. 우리는 생물학적 반복실험에서 프로토콜을 수행했습니다. 그림 9 A, D 및 G는 각각 친화성 정제의 실험 계획을 나타낸다. 다음으로 우리는 Vma2p orf를 따라 Ssb1 상호작용과 비교하여 진공 H+-ATPase의 서브유닛을 인코딩하는 총 경쇄 원자의 리보솜 점유를 보여준다(도 9 B, E 및 H). 마지막으로, orf 를 따라 [코돈/aa]의 각 리보솜 위치에서 비율 기반 리보솜 농축 프로파일링(IP/Total)을 수행했습니다(그림 9 C, F 및 I). 리보솜에 의해 합성되고 있는 Vma2p와 이 세 단백질의 공동 번역 상호작용을 비교한 결과, Ssb1 샤페론은 SeRP에 의해 네 개의 중요한 농축 피크를 확인하였기 때문에 , orf 를 따라 네 개의 상이한 영역에서 초기 Vma2p를 결합시킨다는 것이 밝혀졌다. 상이하게, Pfk2p는 SeRP에 의해 확인된 바와 같이, 공동-번역 샤페론 Ssb1과 비교하여 상이한 위치에서 단지 하나의 유의한 농축 피크만을 보여준다. 초기 Vma2p와의 Fas1 공동-번역 상호작용의 분석은 어떠한 유의한 농축도 검출하지 않았다. 따라서, 이러한 비율-기반 농축 리보솜 프로파일의 비교는 거의 코돈-분해능에서 다양한 공동-번역 상호작용의 검출 및 특성화에서 이 프로토콜의 힘을 입증한다.

Figure 2
도 2: HA 태깅된 Naa10을 사용한 BY4741 균주의 친화성 정제 후의 대표적인 웨스턴 블롯 결과. BY4741 균주와 HA 태깅된 Naa10의 친화성 정제 후 대표적인 웨스턴 블롯 결과는 약 27.8 kDa 밴드를 나타낸 반면, 음성대조군으로서 야생형은 밴드를 나타내지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 산-페놀:클로로포름을 사용한 발자국 분리 및 RNA 추출 후 나타나는 대표적인 BioAnalyzer 결과, 평균 크기는 25nt입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 대표적인 겔-PCR 증폭의 전기영동. 대표적인 겔-사이클 8-11로부터의 PCR 산물로 로딩된 레인 2-5를 사용한 PCR 증폭의 전기영동, 및 양쪽에 사다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: cDNA 라이브러리를 만든 후 얻은 대표적인 BioAnalyzer 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: Cutadapt를 사용하여 어댑터를 제거한 후 읽기의 예상 길이 분포(제거 읽기가 20보다 짧거나 45보다 길음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: Bowtie2로 비코딩 RNA 판독을 제거하고 TopHat을 사용하여 나머지 판독값을 다른 유기체에 정렬한 후 예상되는 정렬 성공률. 샘플을 S. cerevisiae (BY4741의 돌연변이된 변이체)로부터 취하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: RiboToolkit로 생성된 그래프로, Bowtie2를 사용하여 읽기에서 rRNA 요소를 제거한 후 정렬된 읽기의 예상 코딩 대 비코딩 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: Ssb1p, Pfk2p 및 Fas1p와 리보솜에 의해 합성되고 있는 Vma2p의 세 가지 단백질의 공동 번역 상호작용은 SeRP에 의해 분석됨. 모든 y 축은 백만 개당 판독값(RPM) 판독값으로 표시됩니다. (A, D, G) Ssb1p, Pfk2p 및 Fas1p C'의 SeRP의 실험 계획은 각각 GFP에 의해 말단 태그된다. (B, E, H) 리보솜은 Ssb1, Pfk2p 및 Fas1p 상호 작용체와 비교하여 총 경쇄 원자의 orf 를 따라 점유합니다 (생물학적 반복실험에서). (C, F, I) 각각 orf를 따라 [코돈/aa]의 각 리보솜 위치에서 Ssb1p, Pfk2p 및 Fas1p(IP/Total ratio)의 평균 농축. 생물학적 반복실험 사이의 변이는 음영 영역으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 9: 3' 링커 및 프라이머 서열. 3' 링커 L1: 링커 3-L1, 5ʹ 아데닐화 및 3ʹ 디데옥시시티딘 고유 분자 식별자('NN...') (RNase-free HPLC 정제; 역전사 링커: 5ʹ 인산화된, 고유한 분자 식별자를 갖는 역전사 (L(rt)) (RNase-free HPLC 정제); PCR 정방향 프라이머: PCRf; HPLC 정제. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기서, 프로토콜은 코돈 분해능에 가까운 공동-번역 상호작용을 캡처하기 위한 선택적 리보솜 프로파일링 접근법을 상세히 설명한다. 리보솜이 붐비는 세포질로 출현하는 초기 사슬을 조정하기위한 허브로 상승함에 따라, 이것은 기능적 프로테옴을 보장하고 다양한 질병을 연구하는 데 필요한 다양한 공동 번역 상호 작용을 확인하고 특성화하는 중요한 방법입니다. 현재까지, SeRP는 생체내14,15,16에서 직접적인 방식으로 이러한 상호작용을 포착하고 특성화할 수 있는 유일한 방법이다.

첫 번째이자 가장 중요한 단계는 세포 수집과 용해입니다. 몇 초 안에 진행중인 번역을 플래시 동결 후 동결 상태에서 용해하여 캡처하는 것이 필수적입니다. 세포 수집은 리보솜 유출을 피하고 빠르게 발생할 수있는 스트레스 번역 반응을 유도하기 위해 서둘러 수행되어야합니다. 두 번째 중요한 단계는 친화성 정제 단계이다. 엄격한 세척에 의한 배경 결합을 감소시키는 것이 필수적이며, 이는 생체내 가교결합에 의해 촉진될 수 있는 공동-번역 상호작용이 유지되도록 하는 것이다. 이 프로토콜은 첫 번째 단계에서 매우 민감한 NGS(Next Generation Sequencing)에 기초한 높은 배경에 기초하기 때문에 다음의 cDNA 라이브러리 준비 단계에서 증폭될 수 있고, 낮은 신호 대 잡음비로 이어질 수 있다.

뉴클레아제 처리는, 모든 비-보호된 mRNAs를 소화시키기 위해 폴리솜 프로파일링(17 )에 의해 평가되어야 하며, 단리된 리보솜 발자국 크기 분포(위에서 상술된 바와 같이)의 신중한 평가와 함께 RNA 소화 이상 또는 하하를 피해야 한다. 뉴클레아제 농도와 소화 시간의 교정은 과도한 소화가 리보솜 rRNA 소화로 이어질 수 있기 때문에 정확한 발자국 회복을 촉진하여 리보솜으로 보호 된 발자국의 손실을 초래할 수 있습니다. 소화 부족은 또한 cDNA 라이브러리 준비 단계뿐만 아니라 여기에 설명 된 데이터 분석 단계가 길고 특징적이지 않은 판독을 버리기 때문에 리보솜 보호 발자국의 발견 속도를 낮출 수 있다는 점에 유의해야합니다.

rRNA 고갈이 항상 중요한 단계를 구성하고 의무적이지는 않지만, 더 깨끗한 샘플과 같은 몇 가지 장점이 있으며, 따라서 게놈 매핑 판독의 더 높은 속도를 갖는다. 한편, 많은 rRNA 고갈 프로토콜이 또한 원하는 리보솜 보호 단편의 고갈을 야기할 수 있기 때문에 편향의 가능성이 있다. 하나는 또한 rRNA 고갈 키트의 비용을 고려해야한다. rRNA 고갈은 리보솜-풋프린트 단리 단계 후 또는 cDNA 순환화 단계 후에 수행될 수 있다.

본원에 기재된 cDNA 라이브러리 준비 단계는, RNA-seq 발현 연구와 비교하여 친화도 및 리보솜 정제 단계가 mRNA 투입량을 고도로 감소시키므로 낮은 mRNA 입력에 최적화되어 있다. 세포 배양의 초기 양을 업스케일링하면 cDNA 라이브러리 생성을 크게 촉진할 수 있다. 대안적으로, 선택의 임의의 cDNA 라이브러리 프로토콜은 여기에 설명된 친화성 정제 및 풋프린트 분리 단계에 적합할 수 있다. 리보솜 발자국을 생성하는 뉴클레아제 처리는 선택한 프로토콜에서 본원에 기술된 cDNA 프로토콜에서 다음의 링커 라이게이션 단계를 허용하기 위해 생성된 mRNA 말단 수복(cDNA 라이브러리 준비, 탈인산화 단계)을 필요로 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다.

시퀀싱 동안, 생성된 라이브러리의 이질성이 친화도 태깅 인자에 따라 크게 변하기 때문에 SeRP와 RNA-Seq를 구별하는 것이 중요하다. 분자 샤페론과 표적화 인자는 종종 결합에서 난잡하며, 번역 중에 수백 또는 수천 개의 기질과 상호 작용하여 매우 다양한 cDNA 라이브러리로 이어집니다. 그러나, 공동-번역 복합 조립 인터랙터와 같은 고도로 특이적인 상호작용기는 종종 훨씬 덜 다양한 cDNA 라이브러리의 생성을 유도할 수 있다. 동일한 차선에서 다양하고 다양하지 않은 라이브러리가 급증하면 시퀀싱 및 데이터 분석 결과를 크게 향상시킬 수 있습니다.

SeRP의 또 다른 독특한 특징은 orf 를 따라 리보솜 점유의 국부적 변화를 포착하여 각 상호 작용 세트와 관련된 번역 속도의 리보솜 변화를 발견 할 수 있다는 것입니다. 따라서 농축을 정확하게 식별하기 위해 orf 를 따라 각 코돈의 리보솜 점유를 비교하는 것이 필수적입니다. orfs 평균을 활용하면 일시적인 상호 작용이 손실되거나 잘못된 발견이 발생할 수 있습니다.

SeRP 방법을 올바르게 사용하면 분석을 지시하는 많은 공동 번역 경로가 열리고 새로운 기계론적 특징과 새로운 리보솜 관련 요인을 발견하여 단백질 생합성 분야에 혁명을 일으 킵니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 유익한 토론을 해준 모든 실험실 구성원들과 원고의 비판적 독서에 대한 무하마드 Makhzumy에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 ISF (이스라엘 과학 재단) 보조금 2106/20에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

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References

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생물학 문제 176
선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별
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Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

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