Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Global identifikation af co-translationelle interaktionsnetværk ved selektiv ribosomprofilering

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62878
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Co-translationelle interaktioner spiller en afgørende rolle i spirende kædemodifikationer, målretning, foldning og samlingsveje. Her beskriver vi selektiv ribosomprofilering, en metode til in vivo, direkte analyse af disse interaktioner i modellen eukaryot Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

I de senere år er det blevet tydeligt, at ribosomer ikke kun afkoder vores mRNA, men også styrer fremkomsten af polypeptidkæden ind i det overfyldte cellulære miljø. Ribosomer giver platformen for rumligt og kinetisk kontrolleret binding af membranmålretningsfaktorer, modificerende enzymer og foldning af chaperoner. Selv samlingen i højordens oligomere komplekser samt protein-protein netværksdannelsestrin blev for nylig opdaget at være koordineret med syntese.

Her beskriver vi Selektiv Ribosome Profilering, en metode udviklet til at fange co-translationelle interaktioner in vivo. Vi vil detaljere de forskellige affinitetsrensningstrin, der kræves til indfangning af ribosom-spirende kædekomplekser sammen med co-translationelle interaktionorer, samt mRNA-ekstraktion, størrelsesudelukkelse, omvendt transkription, dyb sekventering og big-data-analysetrin, der kræves for at dechiffrere co-translationelle interaktioner i næsten-codonopløsning.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) er den eneste metode til dato, der fanger og karakteriserer co-translationelle interaktioner, in vivo, på en direkte måde 1,2,3,4,5,6. SeRP muliggør global profilering af interaktioner af enhver faktor med oversættelse af ribosomer i nærkodonopløsning 2,7.

Metoden er afhængig af flashfrysning af voksende celler og bevarelse af aktiv translation. Cellelysater behandles derefter med RNase I for at fordøje alt mRNA i cellen undtagen ribosombeskyttede mRNA-fragmenter kaldet "ribosomfodspor". Prøven opdeles derefter i to dele; en del bruges direkte til isolering af alle de cellulære ribosomale fodspor, der repræsenterer al løbende translation i cellen. Den anden del anvendes til affinitetsrensning af den specifikke delmængde af ribosomer forbundet med en faktor af interesse, for eksempel: modificerende enzymer, translokationsfaktorer, foldning af chaperoner og komplekse samlingsinteraktioner. De affinitetsrensede ribosomale fodspor kaldes samlet interactomet. Derefter ekstraheres de ribosombeskyttede mRNA'er og bruges til cDNA-biblioteksgenerering efterfulgt af dyb sekventering.

Sammenlignende analyse af de samlede translatom- og interactomprøver muliggør identifikation af alle orfs, der er forbundet med interessefaktoren, samt karakterisering af hver orf-interaktionsprofil. Denne profil rapporterer de præcise engagementsstart- og afslutningssekvenser, hvorfra man kan udlede de afkodede kodoner og de respektive rester af den nye polypeptidkæde samt på ribosomhastighedsvariationerne under interaktionen 7,8. Figur 1 viser protokollen som en skematisk.

Figure 1
Figur 1: En oversigt over SeRP-protokollen. Denne protokol kan udføres i sin helhed inden for 7-10 dage. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering af stammer til selektiv ribosomprofilering

BEMÆRK: Selectiv Ribosom Profiling (SeRP) er en metode, der er afhængig af affinitetsrensning af faktorer af interesse for at vurdere deres interaktionsmåde med ribosomer-spirende kædekomplekser. Homolog rekombination9 samt CRISPR/Cas910-baserede metoder anvendes til at sammensmelte forskellige faktorer af interesse med tags til affinitetsrensninger. Sådanne tags er GFP, for GFP-trap affinitetsrensninger, TAP-tag for IgG-Sepharose perlerensninger samt AVI-Tag renset af avidin eller streptavidin, for at nævne et par vellykkede eksempler fra de seneste år.

  1. Udfør vækst- eller funktionelle assays for at validere, at mærkning ikke påvirkede proteinfunktionen. N' versus C' terminalmærkning bør evalueres.
    BEMÆRK: Ribosomerne (rRNA) samt mange ribosombindende domæner i forskellige faktorer er stærkt ladede, hvilket gør stærkt ladede tags (såsom polyhistidin) uforudsigelige at bruge, da det kan føre til falsk opdagelse eller ændret bindingstilstand.

2. Kulturvækst

  1. De konstruerede gærkulturer (baseret på stammen BY4741), der indeholder de ønskede mærkede proteiner, dyrkes i enten flydende gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD)-rige medium eller i syntetisk dextrose (SD) minimalt medium (1,7 g / L gærkvælstofbase med ammoniumsulfat eller 1,7 g / L gærkvælstofbase uden ammoniumsulfat med 1 g / l mononatriumglutaminsyre, 2% glucose og suppleret med en komplet eller passende blanding af aminosyrer).
  2. 250-500 ml cellekultur vokser til en 0,5 OD600 (midterbjælke) ved 30 °C i et passende medium.

3. Celleindsamling og lysis

  1. Saml hurtigt celler ved vakuumfiltrering på en 0,45 μm nitrocellulose blottingmembran med et glasfiltreringssystem (glasfilterholder med 1 L glastragt, vakuumbase og hætte, skærm i rustfrit stål, pakning og fjederklemme, 90 mm; formalet ledkolbe 1 L).
  2. Flash fryser de opsamlede celler ved at skrabe de pelleterede celler med en spatel og straks nedsænke dem i et flydende nitrogenfyldt 50 ml rør.
    STOPPESTED: Cellerne kan opbevares ved -80 °C i op til 3-4 uger.
  3. Udfør cellelysis ved kryogen slibning i en mixermølle: to gange i 2 minutter ved 30 Hz, med 1 ml lysisbuffer (se tabel 1). Afkøl i flydende nitrogen mellem fræsninger.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
10 mg/ml CHX (cycloheximid) 220 0,5 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0 88 20 mM
3 mio. KCl 205.7 140 mM
1M MgCl2 26.4 6 mM
1M PMSF 4.4 1 mM
Np-40 4.4 0.10%
Proteasehæmmer 2 tabletter
DNase I 8.8 0,02 U/ml
Sidste bind 4,400

Tabel 1: Opskrift på lysis buffer master mix.

BEMÆRK: Lysisbuffer kan ændres til at indeholde flere proteasehæmmere (såsom bestatin, leupeptin, aprotinin osv.), Hvis proteinet af interesse er meget ustabilt, men det er vigtigt at undgå EDTA for at opretholde ribosomets små og store underenheder samlet under de følgende trin. Af lignende grunde skal der altid opretholdes mindst 6 mM MgCl2 i bufferopløsningen.

FORSIGTIG: HCI er stærkt ætsende, og PMSF er giftig. Brug handsker og håndter med omhu.

  1. Centrifuger i 2 minutter ved 30.000 x g, 4 °C for at rense lysatet og opsamle supernatanten.

4. Rensning af ribosom-spirende kæder komplekser til SeRP

  1. For hvert eksperiment opdeles supernatanten i to dele; hver i et andet mikrocentrifugerør: total RNA-prøve (~ 200 μL) og immunopurification (IP) prøve (~ 700 μL) translatomprøver.
  2. Behandling af den samlede RNA-prøve
    1. Fordøje total RNA-prøve ved hjælp af 10 U RNase I i 25 minutter ved 4 °C; drej ved 30 o / min med et roterende blandingsstativ.
      BEMÆRK: Fordøjelsesbetingelserne kan kalibreres ved hjælp af polysomprofilering for at sikre, at monosomerne ikke over- eller underfordøjes.
    2. Saccharosepudemasterblandingen fremstilles som beskrevet i tabel 2.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
50% saccharose 200 25%
1M Tris-HCl pH 8,0 8 20 mM
3 mio. KCl 18.7 140 mM
1M MgCl2 4 10 mM
100 mg/ml CHX 0.4 0,1 mg/ml
Proteasehæmmer 1 tablet
Sidste bind 400

Tabel 2: Opskrift på saccharosepude master mix.

  1. Prøven hældes på 400 μL saccharosepude og centrifugeres i en TLA120-rotor i 90 minutter ved 245 000 x g og ved 4 °C.
  2. Fjern supernatanten hurtigt med en vakuumpumpe, og overlejr pellets med en 150 μL lysisbuffer. Træpillerne skal genaktiveres ved at ryste i 1 time ved 4 °C og ved 300 o/min.
  3. Resuspender restpellet ved pipettering og overfør til et nyt 1,5 ml rør.
    BEMÆRK: 100-200 μg total RNA er normalt tilstrækkeligt til ribosomprofilering af det samlede translationom. Man kan tilføje rRNA-udtømningstrin for at reducere rRNA-forurening, som er den mest udbredte forurening af ribosom-spirende kæder komplekser affinitetsrensninger11 (se diskussion for yderligere detaljer).
  1. Behandling af immunrensningsprøven
    1. 100-400 μL af den affinitetsbindende matrix (1:1 antistofkonjugerede perler i 70 % EtOH) vaskes pr. prøve med 3 x 1 ml lysisbuffer (uden DNase I og proteasehæmmere). resuspend affinitetsmatrixen i lysisbufferen, og drej derefter ved 30 o / min med et roterende blandingsstativ ved 4 ° C i 5 minutter. Udfældes ved centrifugering i 30 s ved 3.000 x g, 4 °C. Kassér den øvre væske. Gentag tre gange.
    2. Fordøje immunopurificationprøver ved hjælp af 10 U pr. A260 nm enhed af RNase I sammen med affinitetsbindende matrix (for eksempel 100-400 μL GFP-TRAP pr. Prøve).
    3. Drej i 25 minutter ved 30 o / min med et roterende blandingsstativ for at binde proteinet til affinitetsmatrixen ved 4 ° C.
    4. Forbered masterblandingen af vaskebufferen som beskrevet i tabel 3.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
10 mg/ml CHX 50 0,1 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0 100 20 mM
3 mio. KCl 233 140 mM
1M MgCl2 50 10 mM
1M PMSF 5 1 mM
Np-40 0.5 0.01%
Proteasehæmmer 2 tabletter
50% glycerol 1,000 10%
Sidste bind 5,000

Tabel 3: Opskrift på vaskebuffermasterblandingen.

  1. Den affinitetsbindende matrix vaskes tre gange med 1 ml vaskebuffer, hver gang i ~1 min,roterende i blandingsristen ved 30 o/min. ved 4 °C.
  2. Udfældes ved centrifugering ved 3.000 x g i 30 s ved 4 °C. Kassér den øvre væske.
  3. Vask to gange mere i 1 ml vaskebuffer, hver gang i 5 minutter, og drej i blandestativet ved 30 o / min ved 4 ° C.
  4. Udfældes ved centrifugering i 30 s ved 3.000 x g og 4 °C.
  5. Brug 50 μL perler til proteineluering med samme mængde 2x prøvebuffer. Brug resten af perlerne til RNA-ekstraktion.
  6. Centrifuger i 30 s ved 3.000 x g, 4 °C for at pelletere perlerne og kassere den øvre væske.
  7. Fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. Brug disse prøver til efterfølgende RNA-ekstraktion.
    STOPPESTED: Prøverne kan opbevares ved -80 °C natten over eller længere. Dette kan være et stoppested.
  8. Vurder succesen med affinitetsrensningen trin for western blot eller Coomassie farvning med aliquoter (~ 10 volumenprocent efter blanding) af hvert trin. Brug altid mock IP på en ikke-mærket WT-stamme som en kontrol for ikke-specifik binding til affinitetsmatrixen.
    BEMÆRK: Høj uspecifik baggrund kan overvindes ved yderligere vasketrin med stigende salt/ vaskemiddelkoncentrationer. Forbigående interaktion kan stabiliseres ved forskellige tværbindende midler behandling, for eksempel paraformaldehyd (PFA) behandling af levende celler - tilsætning af 0,4% -1% PFA til vækstmediet i 2-5 min, efterfulgt af glycin (0,3 M) slukning i 3 minutter, anbefales stærkt.
    FORSIGTIG: Paraformaldehyd er et mistænkt kræftfremkaldende stof. Da paraformaldehyd fordamper hurtigt og er ætsende, skal du arbejde i en kemisk sikkerhedshætte og bære to lag handsker.

5. cDNA bibliotek forberedelse til dyb sekventering

  1. RNA-ekstraktion
    BEMÆRK: Arbejd med RNase-fri non-stick 1,5 ml rør for at forhindre mulig RNA- eller DNA-udtømning.
    1. Optø prøverne fra trin 4.2.5 og 4.3.12 på is, og resuspend prøverne med 10 mM Tris-HCl pH 7,0 til et slutvolumen på 700 μL.
      FORSIGTIG: Syre-phenol og chloroform er flygtige og skadelige. Arbejd i en kemisk sikkerhedshætte.
    2. Tilsæt 40 μL 20% SDS til 0,7 ml total RNA eller IP-eluering. Luk og vend et par gange. Proteinudfældning skal gøre prøverne hvide.
    3. Der tilsættes 0,75 ml forvarmt syre-phenol:chloroform til prøverne. Forsegl rørene tæt og ryst i en termisk mixer ved 1.400 o / min i 5 minutter og ved 65 °C. Afkøl prøver på is i 5 min.
    4. Røret centrifugeres fra trin 5.1.3. ved 20.000 x g i 2 min. Overfør det øverste vandige lag til et frisk rør og tilsæt 0,7 ml syre-phenol: chloroform.
    5. Inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur, lejlighedsvis hvirvel. Centrifuger i 2 min ved 20.000 x g. Overfør det øverste vandige lag til et frisk rør og tilsæt 0,6 ml chloroform og hvirvel.
    6. Centrifuger i 1 min ved 20.000 x g. Overfør det øverste vandige lag til et frisk rør.
    7. Bundfælde nukleinsyrer ved tilsætning af 78 μL 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL GlycoBlue og 0,75 ml isopropanol. Vortex grundigt i 5 min. Inkuberes i mindst 1 time ved -80 °C eller 16 timer ved -20 °C.
    8. Centrifuger i 30 minutter ved 20.000 x g og ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Pellets vaskes med iskold 0,75 ml 80% ethanol. Vend rørene for en grundig vask. Centrifuger ved 20.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kassér derefter supernatanten.
    9. Centrifuger ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s, og fjern den resterende ethanol, og kassér væskerne. Tør pelleten med et åbent låg i 5 minutter ved 65 °C. Resuspender prøverne som følger: for IP resuspend prøven i 10 μL 10 mM Tris-HCi, pH 7,0. Til total translatomanalyse resuspenderes prøven i 20 μL 10 mM Tris-HCI, pH 7,0.
      STOPPUNKT: RNA kan opbevares ved -80 °C i flere måneder.
  2. Kvantificer total RNA-koncentration ved fluorometri
    BEMÆRK: Alle følgende materialer og overflader skal være RNase-fri, mens cDNA-biblioteket forberedes til næste generations sekventering. Brug handsker under håndtering af RNA-prøver.
    1. 1 μL syrephenolekstrakteret totalt RNA fortyndes i 9 μL 10 mM Tris-HCI, pH 7,0. Kvantificer ved hjælp af et fluorometer, som beskrevet på producentens hjemmeside.
    2. Prøverne indeholdende 50 μg RNA fortyndes med 10 μL 10 mM Tris-HCI, pH 7,0.
      BEMÆRK: Mål ikke IP-prøver, brug alt til næste trin.
  3. Gelrensende ribosombeskyttede fodaftryksfragmenter
    1. Indstil en 15% TBE-urea polyacrylamidgel og nedsænk i 1x TBE-løbebuffer. Kør i 30 minutter ved 200 V før prøveindlæsning. Til hver prøve tilsættes 20 μL 2x TBE-urea-prøvebuffer.
      BEMÆRK: Forventet båndstørrelse er omkring 25-35 nt.
    2. Optø en 10 bp DNA-stige og denaturer prøver (ikke stige) ved 80 ° C i 2 minutter, og afkøl derefter på is. Læg hver prøve på hver anden bane. Kør gelen i 50-70 min ved 200 V.
    3. Fortynd 6 μL SYBR-guld (10.000 x koncentrat) i 60 ml 1x TBE-buffer og plet, mens du ryster i lysbeskyttede kasser i 15-20 minutter. Mens du farter gelen, skal du forberede en steril skalpel og 0,5 ml gelbryderrør i mærkede 1,5 ml rør.
    4. Skær de ønskede bånd med en steril skalpel (brug en frisk eller rengør godt mellem prøverne) og læg hvert gelstykke i et gelbryderrør.
    5. Tag et billede af gelen for at sikre, at der ikke er nogen prøverester tilbage i gelen.
    6. Rørene med udskårne skiver centrifugeres ved 20.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og de resterende gelstykker overføres fra gelbryderrøret til 1,5 ml-røret.
    7. Tilsæt 0,5 ml 10 mM Tris, pH 7,0. Omryst i en termisk mixer ved 1.400 o /min i 10 minutter ved 70 °C.
    8. Overføres til en celluloseacetatsøjle med en bred borepipettespids, og centrifuger ved 20.000 x g i 3 minutter ved 4 °C.
    9. Overfør gennemstrømning til et nyt 1,5 ml rør og afkøl på is.
    10. For at udfælde nukleinsyrerne tilsættes: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc og 2 μL GlycoBlue og hvirvel for at blande grundigt. Prøverne anbringes ved -80 °C i mindst 1 time.
    11. Centrifuger i mindst 1 time ved 20.000 x g og 4 °C, og supernatanten kasseres. Vask pellets med 0,75 ml iskold 80% ethanol. Vend rørene for en grundig vask, indtil pellets adskilles fra bunden. Centrifuger igen ved 20.000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kassér supernatanten.
    12. Centrifugering ved 450 x g, 4 °C i 20 s og fjern den resterende ethanol. Tør pillerne med et åbent låg i 5 minutter ved 65 °C.
    13. Tilsæt 15 μL 10 mM Tris, pH 7,0 og resuspend pellets grundigt. Der spinnes ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s, og prøven overføres til et nyt 1,5 ml rør.
      STOPPESTED: Renset RNA kan opbevares ved -80 °C i et par måneder.
  4. Dephosphorylation
    1. Der anvendes 3 μL af følgende blanding for hver prøve: Der tilsættes 1 μL RNase-hæmmer til 2 μL 10x T4 polynukleotidkinasereaktionsbuffer uden ATP. Der tilsættes 2 μL T4 polynukleotidkinase til hver prøve. Pipetter forsigtigt for at blande godt og inkuberes ved 37 °C i 2 timer uden at ryste.
    2. For at inaktivere enzymet inkuberes prøven ved 75 °C i 10 minutter og spinnes ned ved 450 x g, 4 °C, i 20 s. Der tilsættes 0,5 ml 10 mM Tris, pH 7,0.
    3. For at udfælde nukleinsyre tilsættes 2 μL GlycoBlue, 550 μL IPA og 55 μL 3 M NaOAc.
    4. Vortex blandes grundigt og afkøles ved -80 °C i mindst 1 time.
      STOPPESTED: Prøverne kan opbevares ved -80 °C natten over eller længere.
    5. Trin 5.3.11-5.3.13 gentages.
      STOPPESTED: Dephosphorylateret RNA kan opbevares ved -80 °C i flere måneder.
  5. Kvantificering ved hjælp af en bioanalysator
    1. Der foretages en 1:4 fortynding af hver RNA-prøve ved at blande 1 μL prøve og 4 μL DEPC-behandlet vand.
      FORSIGTIG: DEPC er kræftfremkaldende. Brug handsker og arbejd omhyggeligt.
    2. Kør en Bioanalyzer Small RNA Chip/TapeStation. Følg producentens protokol.
      BEMÆRK: Forventet ribosombeskyttet RNA-fragmentstørrelse er omkring 28-30 nt.
  6. Ligate 3' afslutning med Linker-1
    1. Fortynd 5 pmol små RNA-fragmenter til 10 μL med 10 mM Tris, pH 7,0. Denaturprøver ved 80 °C i 2 minutter og afkøl på is.
    2. Masterblandingen forberedes som beskrevet i tabel 4 , og der anvendes 29 μL pr. prøve.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
50 % sterilfiltreret PEG 8000 16 20%
DMSO 4 10%
10× T4 RNA ligase 2 buffer 4 1x
SUPERase-In RNase-hæmmer 2 2 U
10 mM adenyleret linker 3-L1 0.1 25 μM
DEPC-behandlet vand 2.9
Sidste bind 29

Tabel 4: Opskrift på 3' endeligationsmastermix.

  1. Der tilsættes 1 μL T4 RNA-ligase 2, og pipetter forsigtigt for at blande godt. Inkuberes ved 23 °C i 2 timer.
  2. For at udfælde nukleinsyrerne tilsættes: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL 3 M NaOAc og 2 μL GlycoBlue. Vortex blandes grundigt, og prøverne placeres ved -80 °C i mindst 1 time.
    STOPPESTED: Opbevar prøverne ved -80 °C natten over eller længere.
  3. Trin 5.3.2-5.3.12 gentages.
  4. Resuspender pelleten i 6 μL 10 mM Tris, pH 7,0. Nedspin ved 450 x g, 4 °C i 20 s, og overfør prøven til et nyt 1,5 ml rør.
    STOPPESTED: Prøverne kan opbevares ved -80 °C i månedsvis.
  1. Gelrensning af 3' bundne fodaftryk
    1. Indstil en 10% TBE-urea polyacrylamidgel og nedsænk i 1x TBE løbende buffer. Kør i 30 minutter ved 200 V før prøveindlæsning. Til hver prøve tilsættes 6 μL 2x TBE-urea-prøvebuffer.
      BEMÆRK: Forventet båndstørrelse er omkring 71-73 nt.
    2. Gentag trin 5.3.2-5.3.13.
      STOPPESTED: Prøverne kan opbevares ved -80 °C i månedsvis.
  2. Omvendt transskribering af 3ʹ sammenkædede fodaftryksfragmenter for at generere ssDNA
    1. Forbered en masterblanding som beskrevet i tabel 5 , og brug 3 μL pr. Prøve.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
10 mM dNTP'er 1 0,5 mM
25 μM Linker L(rt) 0.5 625 nM
DEPC-behandlet vand 1.5
Sidste bind 3

Tabel 5: Opskrift på den omvendte transkriptionsbuffermasterblanding før nukleinsyrers denaturering.

  1. Vortex og spin ned prøven.
  2. Prøverne inkuberes ved 65 °C i 5 min.
  3. Chill prøver på is.
  4. Forbered en masterblanding som beskrevet i tabel 6 , og brug 6 μL pr. Prøve. Vortex og spin ned prøven. Der tilsættes 1 μL Superscript III til hver prøve, og pipetter forsigtigt for at blande godt og inkuberes i 30 minutter ved 50 °C.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
5× FS-buffer 4 1x
SUPERase-In RNase-hæmmer 1 2 U
DTT 0,1 M 1 5 mM
Sidste bind 6

Tabel 6: Opskrift på den omvendte transkriptionsbuffermasterblanding efter nukleinsyrers denaturering.

  1. Tilsæt 2,3 μL 1 N NaOH, som hydrolyserer RNA og slukker den omvendte transkription.
    FORSIGTIG: NaOH er meget ætsende. Brug handsker og øjenbeskyttelse.
  2. Der inkuberes i 15 minutter ved 95 °C, indtil prøven bliver lyserød.
  3. Indstil en 10% TBE-urea polyacrylamidgel og nedsænk i 1x TBE løbende buffer. Kør i 30 minutter ved 200 V før prøveindlæsning. Til hver prøve tilsættes 23 μL 2x TBE-urea-prøvebuffer.
    BEMÆRK: Den forventede DNA-båndstørrelse er 115-117 nt.
  4. Trin 5.3.2-5.3.12 gentages.
  5. Resuspender pelleten i 15 μL 10 mM Tris, pH 8,0. Der spinnes ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s, og prøven overføres til et nyt 1,5 ml rør.
    STOPPESTED: Prøverne kan opbevares ved -80 °C i månedsvis.
  1. ssDNA-rundkredsering
    1. Der fremstilles følgende hovedblanding, og der indlæses 4 μL pr. prøve som beskrevet i tabel 7.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
10× CircLigase II buffer 2 1x
5 M Betain (valgfrit) 1 0,25 mio. kr.
50 mM MnCl2 1 2,5 mM
Sidste bind 4

Tabel 7: Opskrift på ssDNA-rundcirkuleringsmasterblanding .

  1. Der tilsættes 1 μL CircLigase II ssDNA ligase til hver prøve, og der inkuberes i 1 time ved 60 °C.
    BEMÆRK: Effektiviteten af dette trin kan øges ved at tilsætte 1 μL CircLigase II ssDNA ligase til hver prøve efter 1 times inkubation.
  2. Enzymet inaktiveres ved inkubation ved 80 °C i 10 min.
  3. Afkøl på is og fortsæt til PCR-forstærkning eller opbevar ved -80 ° C.
    STOPPESTED: Prøver kan opbevares ved -80 °C i årevis.
  1. PCR-forstærkning
    1. Forbered følgende PCR-masterblanding og indlæs 82 μL pr. prøve som beskrevet i tabel 8.
Reagens Mængde pr. prøve (μL) Endelig fusion
DEPC-behandlet vand 61.6
5× Phusion HF-reaktionsbuffer 17.6 1x
10 mM dNTP'er 1.8 200 μM
100 μM PCR fremadgående primer 0.2 225 nM
HF Phusion polymerase 0.8 1,6 mio. kr.
Sidste bind 82

Tabel 8: Opskrift på PCR-forstærkningsmasterblanding.

  1. Til hvert rør, der indeholder masterblanding, tilsættes 5 μL cirklet DNA.
    BEMÆRK: Opbevar resten af de cirkulære DNA-prøver ved -80 °C.
  2. Tilsæt en anden 1 μL 20 μM PCR omvendt stregkodeprimer til hver prøve (se tabel 9) og hvirvel for at blande grundigt.
  3. Aliquot hvert rør i fire separate PCR-rør, hver vil blive brugt til et andet antal PCR-cyklusser.
  4. Kør en PCR-reaktion i henhold til følgende program, som beskrevet i tabel 10.
Cykle Denatur (98 °C) Udglødning (60 °C) Forlængelse (72 °C)
1 30 s
2-16 10 s 10 s 5 s

Tabel 10: PCR-program til PCR-reaktion.

  1. Efter cyklus 8, 9, 10 og 11 fjernes PCR-rør (for IP-prøver varierer cyklusser fra 9 til 15) som et første forsøg. Efter hver cyklus skal du sætte programmet på pause, tage en aliquot ud og lægge den på is og derefter hurtigt genoptage programmet.
    BEMÆRK: Antallet af cyklusser skal justeres baseret på mængden af cirklet DNA i hver reaktion. Se figur 4 for et eksempel og yderligere præcisering.
  2. Til hver 17 μL reaktion tilsættes 3,5 μL 6x DNA-belastende farvestof.
  3. Optø en 10 bp DNA stige.
  4. Til dimensionsadskillelse ved gelelektroforese nedsænkes 8% TBE-polyacrylamid i 1x TBE-løbebuffer og lægges prøverne af hvert andet cyklusnummer i tilstødende brønde og køre gelen i 50 minutter ved 180 V.
  5. Fortynd 6 μL SYBR-guld (10.000 x koncentrat) i 60 ml 1x TBE-buffer og plet, mens du ryster i lysbeskyttede kasser i 15-20 minutter.
  6. Mens du farter gelen, skal du forberede en steril skalpel og 0,5 ml gelbryderrør i mærkede 1,5 ml rør.
  7. Tag et billede af de farvede nukleinsyrer.
  8. Skær det ønskede bånd med en forventet båndstørrelse på 174-176 bp med den sterile skalpel, og læg gelskiven i det forberedte 0,5 ml gelbryderrør (rengør grundigt mellem prøverne og brug RNase-inaktiveringsmiddel, eller skift til et nyt blad).
  9. Rørene centrifugeres i 5 minutter ved 20.000 x g og 4 °C, og de resterende gelstykker overføres derefter fra 0,5 ml gelbryderrøret til 1,5 ml rør.
  10. Der tilsættes 500 μL 10 mM Tris, pH 8,0 og omrystes i en termisk mixer ved 1.400 o/min i 10 minutter og 70 °C.
  11. Overfør den opløste gel til en celluloseacetatsøjle med en bred borepipettespids.
  12. Centrifuger søjlen i 3 minutter ved 20.000 x g og 4 °C, og overfør gennemstrømningen til et nyt 1,5 ml rør, og afkøl på is.
  13. For at udfælde nukleinsyren tilsættes: 550 μL IPA, 32 μL 5 M NaCl, 1 μL 0,5 M EDTA og 2 μL GlycoBlue og hvirvel for at blande grundigt.
  14. Prøverne opbevares i mindst 1 time ved -80 °C eller -20 °C natten over.
    STOPPESTED: Prøverne kan opbevares ved -80 °C natten over eller længere.
  15. Trin 5.3.11-5.3.12 gentages.
  16. Resuspend i 11 μL af 10 mM Tris, pH 8,0. Der spinnes ned ved 450 x g, 4 °C i 20 s, og prøven overføres til et nyt 1,5 ml rør.
    STOPPESTED: Prøver kan opbevares ved -80 °C i årevis.
  1. Kvantificer størrelsesfordeling efter Bioanalyzer
    1. Der foretages en 1:4 fortynding af hver prøve ved at blande 1 μL prøve med 4 μL DEPC-behandlet vand.
    2. Kør Bioanalyzer Small RNA Chip. Følg producentens protokol.
      BEMÆRK: Den forventede længde er 175 ± 5 bp.
  2. Kvantificer DNA-koncentration ved fluorometer
    1. Udfør en dsDNA højfølsom koncentrationskontrol med et fluorometer i henhold til producentens anbefalinger.
    2. Multiplex- og sekvensprøver i henhold til Illumina-anbefalingerne (Index Adapters Pooling Guide12).

6. Analyse af data

  1. Udfør analyse som beskrevet i den supplerende fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som illustreret i rutediagrammet for denne protokol (figur 1) blev celler dyrket til logfase og derefter opsamlet hurtigt ved filtrering og lyset ved kryogen slibning. Lysatet blev derefter opdelt i to: et for samlede ribosombeskyttede mRNA-fodaftryk og det andet for udvalgte ribosombeskyttede mRNA-fodspor, hvorpå vi udførte affinitetsrensning for at trække de mærkede protein-ribosom-spirende kæder komplekser ned. Vi sikrede mærket proteinekspression og succesen med pull-down ved western blot-analyse, som det kan ses i figur 2. Vi validerede isoleringen af ribosombeskyttede fodaftryk, som typisk er 20-45 nt lange ved lille RNA-elektroforese (2100 BioAnalyzer-system), hvilket giver mulighed for 5-10 nt skift i størrelsesdetektering, ifølge systemmanualen (figur 3). Derefter genererede vi et cDNA-bibliotek til dyb sekventering og big data-analyse. Mens du genererer cDNA-biblioteket, skal du bemærke, at undercykling kan føre til lavt udbytte (som det kan ses i bane 2 i figur 3), men genforstærkning er mulig for at gendanne det genererede bibliotek. Overcykling kan forekomme, når PCR-primere er udtømt, men reaktionen fortsætter. Når dNTP'er stadig er til stede, fortsætter reaktionen og genererer længere PCR-artefakter med kimære sekvenser på grund af PCR-produkter, der primer sig selv13 (som det kan ses i bane 3-4 i figur 3, angivet med den synlige udtværing). Hvis dNTP'ernes koncentration også bliver begrænsende, kan der forekomme produkter, der indikerer tilstedeværelsen af heteroduplexer, der kun består af delvist homologe biblioteksfragmenter. Figur 4 fungerer som reference, hvor bane 2 repræsenterer optimal forstærkning, og bane 3 en acceptabel forstærkning. Prøver fra bane 4 og 5 (cyklus 10 og 11) bør ikke anvendes på grund af muligheden for at indføre PCR-dubletter og artefakter. Det genererede bibliotek blev yderligere valideret ved højfølsom DNA-elektroforese (det samme BioAnalyzer-system blev brugt) til nøjagtig størrelsesfordeling og kvantificering (figur 5). Efter 3' endelinkerligation, omvendt transkription og PCR-forstærkning forventes en cDNA-længdefordeling som sådan med en skarp top omkring 175 nt.

Vi trimmede og fjernede adaptere og stregkoder fra det sekventerede bibliotek, og kun læsningerne mellem 20 og 45 nt blev udvalgt til yderligere analyse. Figur 6 viser den resulterende længdefordeling. Læsningerne blev opdelt i forskellige grupper af: kodende sekvenser, introns og intergene sekvenser (figur 7) og yderligere klassificeret som vist i figur 8.

Endelig analyse til påvisning og karakterisering af co-translationelle interaktioner blev udført baseret på berigelsen af ribosombeskyttede mRNA-fragmenter, hvilket producerer graferne i figur 9. Vi sammenlignede den normaliserede ribosombelægning (ved hvert nukleotid langs hver orf) af det samlede translatom med dets tilsvarende valgte translatom (spirende-interactom). Sammenligning af nukleotid eliminerer artefakter i oversættelseshastigheder. Reproducerbarhed mellem biologiske replikater blev evalueret ved Pearson-korrelation (tærskel > 0,6). Vi præsenterer selektive ribosomprofiler, der analyserer co-translationelle interaktioner af Vma2p med tre proteiner: ribosomassocieret chaperone Ssb1p, Pfk2p (Phosphofructokinase) og Fas1p (fedtsyresyntase), med hvert protein C 'terminalt mærket af GFP. Vi udførte protokollen i biologiske replikater. Figur 9 A, D og G viser det eksperimentelle skema for hver affinitetsrensning. Vi viser derefter ribosombelægningen af samlede translatomer sammenlignet med Ssb1-interaktionomer langs Vma2p-orf, der koder for en underenhed af den vakuolære H + -ATPase (figur 9 B, E og H). Endelig udførte vi forholdsbaseret ribosomberigelsesprofilering (IP / Total) ved hver ribosomposition i [codon / aa] langs orf (figur 9 C, F og I). Sammenligning af de co-translationelle interaktioner mellem disse tre proteiner med Vma2p, som syntetiseres af ribosomet, afslørede, at Ssb1 chaperone engagerer den spirende Vma2p i fire forskellige regioner langs orf, da vi identificerede fire signifikante berigelsestoppe af SeRP. På en anden måde viser Pfk2p kun én signifikant berigelsestop, som identificeret af SeRP, i en anden position sammenlignet med den co-translationelle chaperone Ssb1. Analyse af Fas1 co-translationelle interaktioner med spirende Vma2p påviste ingen signifikant berigelse. Sammenligningen af disse forholdsbaserede berigelsesribosomprofiler demonstrerer således denne protokols kraft til detektion og karakterisering af forskellige co-translationelle interaktioner i nær codonopløsning.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativt western blot-resultat efter affinitetsrensning af BY4741-stamme med HA-mærket Naa10. Repræsentativt western blot resultat efter affinitetsrensning af BY4741 stamme med HA-mærket Naa10, der viser et bånd omkring 27,8 kDa, mens vildtypen som negativ kontrol ikke viser noget bånd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativt bioanalytikerresultat efter fodaftryksisolering og RNA-ekstraktion med syre-phenol: chloroform og en gennemsnitlig størrelse på 25 nt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ gelelektroforese af PCR-amplifikation. Repræsentativ gelelektroforese af PCR-forstærkning med baner 2-5 fyldt med PCR-produkter fra cyklus 8-11 og stiger på begge sider. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentativt BioAnalyzer-resultat opnået efter oprettelsen af et cDNA-bibliotek.

Figure 6
Figur 6: Forventet længdefordeling af aflæsninger efter fjernelse af adapterne med Cutadapt (fjernelse af aflæsninger kortere end 20 eller længere end 45). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Forventet justeringssuccesprocent efter fjernelse af ikke-kodende RNA-læsninger med Bowtie2 og brug af TopHat til at justere de resterende aflæsninger til forskellige organismer. Prøven blev taget fra S. cerevisiae (en muteret variant af BY4741). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: En graf genereret med RiboToolkit, der repræsenterer forventet kodning versus ikke-kodende forhold mellem justerede aflæsninger efter brug af Bowtie2 til at fjerne rRNA-elementer i læsningerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Co-translationelle interaktioner mellem tre forskellige proteiner: Ssb1p, Pfk2p og Fas1p med Vma2p, som syntetiseres af ribosomet, analyseret af SeRP. Alle y-akser vises i læsninger pr. million (RPM). (A, D, G) Eksperimentelt skema af SeRP af henholdsvis Ssb1p, Pfk2p og Fas1p C', der er terminalt mærket af GFP. (B, E, H) Ribosombelægning langs orf af samlede translatomer sammenlignet med henholdsvis Ssb1, Pfk2p og Fas1p interaktionomer (i biologiske replikater). (C, F, I) Gennemsnitlig berigelse af Ssb1p, Pfk2p og Fas1p (IP/Total ratio) ved hver ribosomposition i henholdsvis [codon/aa] langs orf. Variation mellem biologiske replikater er angivet med det skraverede område. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 9: 3' Linker- og primersekvenser. 3' Linker L1: Linker 3-L1 med 5ʹ adenylering og 3ʹ dideoxy-cytidin unikke molekylære identifikatorer ('NN...') (RNase-fri HPLC-rensning; Omvendt transkriptionslinker: omvendt transkription (L(rt)) med 5ʹ phosphorylerede, unikke molekylære identifikatorer (RNase-fri HPLC-oprensning); PCR fremad primer: PCRf; HPLC renset. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver protokollen selective ribosome profileringsmetoden til indfangning af co-translationelle interaktioner i nær codonopløsning. Da ribosomet stiger som et knudepunkt for koordinering af den spirende kæde fremkomst i den overfyldte cytoplasma, er dette en afgørende metode til at identificere og karakterisere de forskellige co-translationelle interaktioner, der kræves for at sikre et funktionelt proteom samt til at studere forskellige sygdomme. Til dato er SeRP den eneste metode, der kan fange og karakterisere disse interaktioner på en direkte måde in vivo 14,15,16.

Det første og mest kritiske trin er celleindsamling og lysis. Det er bydende nødvendigt inden for få sekunder at fange løbende oversættelse ved flashfrysning efterfulgt af lysis i frossen tilstand. Celleindsamling skal ske hurtigt for at undgå ribosomal afstrømning samt inducere stresstranslationelle reaktioner, som kan forekomme hurtigt. Det andet kritiske trin er affinitetsrensningstrinnet. Det er bydende nødvendigt at reducere baggrundsbinding ved streng vask og samtidig sikre, at de samtranslationelle interaktioner opretholdes, hvilket kan lettes ved in vivo-tværbinding . Da denne protokol er baseret på den meget følsomme NGS (Next Generation Sequencing), kan høj baggrund i de første trin forstærkes i de følgende cDNA-biblioteksforberedelsestrin, hvilket fører til lave signal-støj-forhold.

Nukleasebehandling for at fordøje alle ikke-beskyttede mRNA'er bør evalueres ved polysomprofilering17 sammen med omhyggelig evaluering af den isolerede ribosomale fodaftryksstørrelsesfordeling (som beskrevet ovenfor) for at undgå over eller under RNA-fordøjelse. Kalibrering af nukleasekoncentration og fordøjelsestider kan lette nøjagtig fodaftryksgendannelse, da overfordøjelse kan føre til ribosomal rRNA-fordøjelse, hvilket fører til tab af ribosombeskyttede fodaftryk. Det er vigtigt at bemærke, at underfordøjelse også kan føre til lavere opdagelseshastigheder for ribosombeskyttede fodaftryk, da cDNA-bibliotekets forberedelsestrin samt dataanalysetrin, der er beskrevet her, kasserer lange, ukarakteristiske læsninger.

Mens rRNA-udtømning ikke altid udgør et kritisk trin og ikke er obligatorisk, har det nogle fordele såsom renere prøver og derfor en højere hastighed af genomkortlagte læsninger. På den anden side er der mulighed for forstyrrelser, da mange rRNA-udtømningsprotokoller også kan forårsage udtømning af de ønskede ribosombeskyttede fragmenter. Man bør også tage højde for omkostningerne ved rRNA-udtømningssættene. rRNA-udtømning kan udføres efter ribosom-fodaftryksisoleringstrinnet eller efter cDNA-cirkulariseringstrinnet.

cDNA-biblioteksforberedelsestrin som beskrevet her er optimeret til lavt mRNA-input, da affinitets- og ribosomrensningstrinnene i høj grad reducerer mRNA-inputmængden sammenlignet med RNA-seq-ekspressionsundersøgelser. Opskalering af den oprindelige mængde cellekulturer kan i høj grad lette cDNA-biblioteksgenerering. Alternativt kan enhver valgt cDNA-biblioteksprotokol passe med de trin til affinitetsrensning og fodaftrykisolering, der er beskrevet her. Det er vigtigt at bemærke, at nukleasebehandlingen, der genererer de ribosomale fodaftryk, kræver den resulterende mRNA-endereparation (cDNA-biblioteksforberedelse, dephosphorylationstrin) for at tillade følgende linkerligationstrin i cDNA-protokollen beskrevet her i din valgte protokol.

Under sekventering er det vigtigt at differentiere SeRP fra RNA-Seq, da de genererede bibliotekers heterogenitet varierer meget afhængigt af de affinitetsmærkede faktorer. Molekylære chaperoner og målretningsfaktorer er ofte mere promiskuøse i binding og interagerer med hundreder eller tusinder af substrater under oversættelse, hvilket fører til meget forskellige cDNA-biblioteker. Imidlertid kan meget specifikke interagerere, såsom co-translationelle komplekse samlingsinteraktioner, ofte føre til generering af meget mindre forskelligartede cDNA-biblioteker. Spike i af forskellige og ikke-forskelligartede biblioteker på samme bane kan i høj grad forbedre sekventering og følge dataanalyseresultater.

Et andet unikt træk ved SeRP er dets evne til at fange lokale variationer i ribosombelægninger langs orf , hvilket giver mulighed for opdagelse af ribosomale skift i oversættelseshastighed forbundet med hvert sæt interaktioner. Det er derfor bydende nødvendigt at sammenligne ribosombelægninger i hvert kodon langs orf for korrekt at identificere berigelse. Brug af orfs gennemsnit kan føre til tab af forbigående interaktioner eller falsk opdagelse.

Korrekt brug af SeRP-metoden åbner mange co-translationelle veje til direkte analyse, opdager nye mekanistiske træk såvel som nye ribosomassocierede faktorer, der revolutionerer protein-biosyntesefeltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke alle laboratoriemedlemmerne for frugtbare diskussioner og Muhammad Makhzumy for den kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af ISF (Israeli Science Foundation) bevilling 2106/20.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631 6×
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876 2×
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019).
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).

Tags

Biologi udgave 176
Global identifikation af co-translationelle interaktionsnetværk ved selektiv ribosomprofilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, … More

Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter