Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В городе Виво Методы оценки функции и структуры ганглиозных клеток сетчатки и зрительного нерва у крупных животных

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы проводим несколько тестов in vivo (вспышка визуального вызванного потенциала, электроретинограмма паттерна и оптическая когерентная томография) у коз и макак-резусов, чтобы понять структуру и функцию зрительного нерва и его нейронов.

Abstract

Зрительный нерв собирает сигналы аксонов от ганглиозных клеток сетчатки и передает визуальный сигнал в мозг. Большие животные модели повреждения зрительного нерва необходимы для перевода новых терапевтических стратегий от моделей грызунов к клиническому применению из-за их более близкого сходства с людьми по размеру и анатомии. Здесь мы описываем некоторые методы in vivo для оценки функции и структуры ганглиозных клеток сетчатки (RGC) и зрительного нерва (ON) у крупных животных, включая визуальный вызванный потенциал (VEP), электроретинограмму паттерна (PERG) и оптическую когерентную томографию (OCT). В этом исследовании были задействованы как козы, так и нечеловеческие приматы. Представляя эти методы in vivo шаг за шагом, мы надеемся повысить экспериментальную воспроизводимость среди различных лабораторий и облегчить использование больших животных моделей оптических невропатий.

Introduction

Зрительный нерв (ON), который состоит из аксонов из ганглиозных клеток сетчатки (RGC), передает визуальный сигнал от сетчатки к мозгу. Он-заболевания, такие как глаукома, травматическая или ишемическая оптическая невропатия, часто вызывали необратимую дегенерацию ON/RGC и разрушительную потерю зрения. Хотя в настоящее время существует много прорывов в регенерации ON и защите RGC в моделях грызунов1,2,3,4,5,6, клинические методы лечения большинства заболеваний ON оставались практически неизменными в течение последних полувека с неудовлетворительным исходом7,8 . Чтобы заполнить пробел между фундаментальными исследованиями и клинической практикой, трансляционные исследования с использованием большой модели болезней ON на животных часто необходимы и полезны из-за их более близкого анатомического сходства с людьми, чем модели грызунов.

Козы и макаки-резусы являются двумя крупными видами животных, используемыми в нашей лаборатории для моделирования болезни ON человека. Размер глазного яблока козы, ON и прилегающей структуры (орбитальная и носовая полость, основание черепа и т. Д.) Похож на размер человеческого на основе КТ черепа9. Таким образом, модель козы дает возможность оценивать и совершенствовать терапевтические устройства или хирургические процедуры перед использованием у людей. Макака-резус, как нечеловеческий примат (NHP), имеет человекоподобную уникальную зрительную систему, которая не существует у других видов10,11. Кроме того, патофизиологические реакции на травмы и лечение у НХП очень похожи на реакцию у людей12.

Тесты in vivo для оценки структуры и функции ON и RGC продольно важны в исследованиях на крупных животных. Электроретинограмма паттерна (PERG) была использована для оценки функции RGC. Вспышка визуального вызванного потенциала (FVEP) отражает целостность ретино-геникуло-кортикального пути в зрительной системе. Таким образом, PERG в сочетании с FVEP может отражать функцию ON9,13,14. Оптическая когерентная томография сетчатки (ОКТ) может показать структуру сетчатки с высоким временным и пространственным разрешением, что позволяет измерить толщину ганглиозного комплекса сетчатки (GCC)9,15. Для электрофизиологических исследований в этом исследовании мониторинг жизненно важных показателей (скорость нагрева, скорость нарушения, артериальное давление) и уровня насыщения кислородом (SpO2) перед тестированием имеет решающее значение, поскольку эти параметры оказывают мощное влияние на глазной кровоток и, следовательно, на функцию зрительной системы. Тем не менее, мы не контролировали жизненно важные показатели при проведении OCT-визуализации сетчатки для простоты. Согласно нашему предыдущему исследованию9, толщина GCC, измеренная с помощью OCT-визуализации сетчатки, довольно стабильна, с межсессионным коэффициентом вариации, близким к 3%. Эти тесты in vivo у коз и макак-резусов были подробно описаны в нашем предыдущем исследовании9. Здесь мы представляем эти методы, чтобы помочь повысить прозрачность и воспроизводимость экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты проводились строго в соответствии с руководящими принципами ARRIVE и руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и соответствовали протоколам, одобренным Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Медицинском университете Вэньчжоу (WMU) и Лабораторией Joinn (Сучжоу). Самцы зааненских коз в возрасте от 4 до 6 месяцев с весом 19-23 кг были размещены в животноводческом учреждении WMU. Самцы макак-резусов в возрасте от 5 до 6 лет с весом 5-7 кг были размещены в животноводческом учреждении Joinn. Все животные содержались в кондиционированном помещении с контролируемой температурой (21 ± 2 °C) при 12-часовом светлом / 12-часовом темном цикле с пищей ad libitum.

1. Вспышка визуального вызванного потенциала (FVEP) у козла

  1. Общая анестезия
    1. Побрейте волосы с помощью электронной бритвы.
    2. Подготовьте кожу, втирая 70% спиртом три раза, чтобы очистить кожу, а затем обнажите подкожную вену.
    3. Вводят периферический венозный катетер внутривенно (0,9 мм х 25 мм), а затем вводят атропин (0,025 мг/кг) и пропофол (5 мг/кг).
    4. Интубируйте козу трахеальной трубкой 6 мм и подключите ее к искусственному респиратору.
    5. Поддерживайте анестезию с 3,5% изофлураном в кислороде при постоянной скорости потока 2 л/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коза восстанавливается после анестезии, вызванной пропофолом, в течение нескольких минут, поэтому будьте быстры, чтобы интубировать козу.
  2. Сердечно-легочный мониторинг
    1. Поместите датчик температуры под язык.
    2. Подключите пульсоксиметр к проксимальному концу уха.
    3. Привяжите манжету артериального давления к основанию бедра.
    4. Зажмите зажимы ЭКГ на конечностях соответствующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная частота сердечных сокращений у коз составляет 68-150 ударов в минуту. За счет применения газовой анестезии частота сердечных сокращений у коз увеличится. Поэтому наша частота сердечных сокращений во время осмотра составляет 170 ± 30 ударов в минуту. Систолическое артериальное давление коз в нормальных условиях составляет 110-130 мм рт.ст., а диастолическое артериальное давление составляет 50-60 мм рт.ст. В состоянии вдыхания кислорода насыщение крови козы кислородом всегда можно поддерживать на уровне 99%. Частота дыхания коз под наркозом синхронизирована с частотой дыхания вентилятора, которая составляет 10 вдохов/мин. Поскольку температура измерялась из-под языка козы, а не температура ядра, температура козы обычно составляет 35 ± 2 ° C.
  3. Имплантация винтов черепа и установка электродов
    1. Сбрить волосы машинкой для стрижки. Продезинфицируйте кожу по центру лобной кости, трижды втирая ватный тампон, смоченный в бетадине и 70% спирте.
    2. Используйте стерилизованные винты и ножницы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклав всех хирургических инструментов для стерилизации (121 °C, 20 мин).
    3. Сделайте разрез кожи 5 мм, чтобы обнажить лобную кость офтальмологическими ножницами, а затем имплантируйте стерилизованный винт в центр лобной кости с помощью отвертки.
    4. Сбрить волосы и продезинфицировать кожу на центральной затылочной кости между двумя ушами бетадином и 70% спиртом, один за другим, три раза.
    5. Сделайте разрез кожи 5 мм, чтобы обнажить затылочную кость с помощью офтальмологических ножниц, а затем имплантируйте стерилизованный винт в центр затылочной кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрод заземляющей иглы вставляется подкожно под лобной винт черепа. Активный и опорный электроды соединены с затылочным и фронтальным винтами, соответственно, зажимами аллигатора для уменьшения импеданса электрода16.
  4. Подготовка животных
    1. Используйте светонепроницаемую ткань, чтобы покрыть глаз и зафиксировать завязанные глаза, чтобы залатать один глаз.
    2. Нанесите местные анестетики глазные капли (глазные капли пропаракаина гидрохлорида) на оба глаза. Двусторонние зрачки расширяются при местном введении мидриатических глазных капель с тропикамидом (5%) и фенилэфрином (5%).
    3. Поместите голову козы в стимулятор Ганцфельда и приглушите окружающий свет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было обнаружено, что козы могут поддерживать хорошую фиксацию глазного яблока под наркозом, поэтому не требуется дополнительного вмешательства по фиксации глазного яблока.
    4. Накройте стимулятор и козью голову черным одеялом на 5 минут для адаптации.
    5. Используйте зеркало века, чтобы обнажить бульбарную конъюнктиву. Сложите верхнее кольцо, потяните верхнее веко вверх и вставьте верхнее кольцо сначала в конъюнктивальный мешок верхнего века, а затем в нижнее веко аналогичным образом.
    6. Нажмите кнопку Impedance , чтобы проверить контактное сопротивление электрода и ткани, и значения импеданса будут показаны в каждом канале.
    7. Убедитесь, что импеданс ниже 10 кОм для каждого электрода, чтобы избежать электромагнитных помех от других электрических устройств в той же комнате.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если он превышает 10 кОм, повторно подключите или замените электрод. Импеданс может казаться аномально высоким, если электрическая металлическая хирургическая кровать, где лежит коза, заткнута. Импеданс должен отличаться менее чем на 1 кОм между активным и опорным электродами для уменьшения электрических помех17.
    8. Нажмите кнопку осциллографа , чтобы проверить базовый шум без световой стимуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть большой базовый шум, отключите все другие электрические устройства в той же комнате и выключите сотовые телефоны. Если базовая проблема сохраняется, перейдите к шагу 1.3.10. , чтобы проверить, можно ли вызвать типичную форму сигнала FVEP. Если нет, перенесите тест FVEP на другое время.
    9. Начните запись FVEP, выбрав интенсивность света 0,025, 0,5 и 3,0 кд·с/м2 соответственно в белом фоновом поле в правом верхнем углу. Затем нажмите кнопку Экзамен . Обратите внимание, что запись FVEP при каждой интенсивности света выполняется дважды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если две формы сигнала кажутся явно разными, необходимо еще одно повторение.
    10. Смочите роговицу искусственными слезными каплями глаз, если она окажется сухой на инфракрасной камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте положение глаз со встроенной инфракрасной камеры перед записью, чтобы убедиться, что визуальный взгляд правильный, а зрачок полностью открыт (так что размер поля стимула вспышки составляет 90 °). Положение глаз обезболенной козы можно отрегулировать, повернув голову соответствующим образом. Исходя из наших наблюдений, блуждание взгляда редко происходит во время записи FVEP (~10 мин) у козы под общим наркозом9. Таким образом, нет необходимости делать паузу и заново настраивать взгляд во время записи.
    11. Повторите вышеуказанные шаги для контралатерального глаза.
    12. Прекратите подачу изофлурана и немного увеличьте дыхательный объем на аппарате ИВЛ, чтобы помочь козе восстановиться после общей анестезии.
    13. После общей анестезии обработайте козу гентамицином (4 мг/кг, в/м) и цефтиофуром натрия (цефалоспорин, 2 мг/кг, в/м) для профилактики инфекции.
  5. Измерение FVEP и количественный анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 1A, первые положительные и отрицательные пики в форме сигнала FVEP обозначаются как P1 и N1, а второй положительный пик - как P2. Типичное неявное время P1, N1 и P2 составляет около 40, 60 и 120 мс соответственно. Амплитуды P1 и P2 измеряются от впадины формы сигнала N1 до пиков осциллограмм P1 и P2 соответственно.
    1. В случае повреждения монокуляра используйте межглазное сравнение амплитуды и неявного времени, чтобы помочь уменьшить вариации межсессии и повысить чувствительность17.

2. PVEP у макак-резусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Паттерн VEP может быть обнаружен у макак-резусов9 и более стабилен, чем Flash VEP по амплитуде и неявному времени17. Поэтому PVEP был использован для обнаружения целостности ретино-геникуло-коркового пути у нечеловеческих приматов.

  1. Подготовка животных
    1. Обезболить обезьяну изофлураном (1,5%-2%) после индукции Золетилом50 (4-8 мг/кг в/м, тилетамина/золазепама).
    2. Расположите стерилизованный заземленный электрод у мочки уха. Вводят стерилизованные активные и опорные электроды подкожно вдоль средней линии в лобной и затылочной кости соответственно.
    3. Нанесите зеркало века на обнажение бульбарной конъюнктивы.
    4. Используйте клейкую непрозрачную черную ленту, чтобы залатать контралатеральный глаз.
  2. Запись PVEP
    1. Нажмите кнопку Impedance для проверки контактного импеданса электрод-ткань, и значения импеданса будут показаны в каждом канале; убедитесь, что он ниже 10 тыс. Ω. Если нет, снова подключите или замените электрод.
    2. Проверьте значения импеданса в испытательном окне импеданса и убедитесь, что импеданс отличается менее чем на 1 кОм между активным и опорным электродами, чтобы уменьшить электрические помехи17.
    3. Нажмите кнопку осциллографа , чтобы проверить базовый шум без стимуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть большой базовый шум, отключите все другие электрические устройства в той же комнате и выключите сотовые телефоны. Если базовая проблема сохраняется, повторите тест PVEP в другой день.
    4. Запишите ответы PVEP невыпущенного глаза, выбрав интенсивность света 0,5 и 1,0 цикла/градус соответственно в белом фоновом поле в правом верхнем углу, а затем нажмите кнопку Экзамен .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой записи усредняется 64 следа, чтобы получить одну форму сигнала. Для каждой частоты приобретается минимум две записи для проверки воспроизводимости сигналов PVEP.
    5. Повторите процедуру для контралатерального глаза.
    6. Как только это будет сделано, прекратите подачу изофлурана, чтобы разбудить обезьяну.
    7. После общей анестезии обработайте обезьяну гентамицином (4 мг/кг в/м) и цефтиофуром натрия (2 мг/кг в/м) для предотвращения инфекции.
  3. Измерение PVEP и количественный анализ
    1. Как показано на рисунке 1B, первые отрицательные и положительные пики в форме сигнала PVEP были обозначены как N1 и P1, которые обычно происходят на расстоянии около 50 и 90 мс. Амплитуда P1 измеряется от впадины N1 до пика P1.
    2. В случае повреждения монокуляра используйте межглазное сравнение амплитуды и неявного времени, чтобы помочь уменьшить вариации межсессии и повысить чувствительность17.

3. Рисунок ERG (PERG) у козы

ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущем исследовании у коз не наблюдалось межглазных перекрестных помех сигнала PERG, поэтому ответы PERG могут быть записаны одновременно с обоих глаз9.

  1. Подготовка к экзаменам
    1. Обезболить козу с помощью ксилазина (3 мг/кг, в/м) и поместить на экзаменационный стол.
    2. Поместите датчик температуры под язык козы.
    3. Подключите пульсоксиметр к проксимальному концу уха козы.
    4. Привяжите манжету артериального давления к бедру.
    5. Зажмите зажимы ЭКГ на конечностях соответственно.
    6. Чтобы уменьшить сопротивление электрода, поместите стерилизованный винт черепа на лобную кость и подключите к заземленному электроду с помощью зажима аллигатора.
    7. Поместите два стерилизованных игольчатых опорных электрода подкожно на 1 см позади бокового канти с обеих сторон.
    8. Используйте зеркало века, чтобы обнажить бульбарную конъюнктиву.
    9. Поместите два дезинфицированных регистрирующих электрода ERG-Jet в центр двусторонней роговицы после местного применения искусственной слезы.
    10. Поместите два светодиодных монитора размером 47,6 см х 26,8 см перед обоими глазами с расстоянием просмотра 50 см.
    11. Отрегулируйте каждый монитор так, чтобы он был параллельным плоскости зрачка с той же стороны, и выровняйте центр монитора по плоскости зрачка.
    12. Убедитесь, что шахматная доска с обратным контрастом (временная частота, 2,4 Гц) отображается на обоих мониторах и имеет максимальное соотношение сторон 4:3, которое устанавливается настройками оборудования.
    13. Убедитесь, что контраст между белыми и черными шашками остается на уровне 96%, а средняя яркость составляет 200 кд/м2 (кандела на квадратный метр), которая проверяется измерителем яркости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно ISCEV, средняя фотопическая яркость 40-60 кд/м2 требуется у людей17. В другом исследовании с использованием модели мышей картина оставалась при средней яркости 800 кд/м2,18. Размер поля не менее 15° в самом узком измерении необходим для стандартного теста PERG на людях17. Отрегулируйте положение электрода роговицы, если он не находится в центре поверхности роговицы.
  2. Запись PERG
    1. Приглушите окружающий свет и нажмите кнопку Impedance , чтобы проверить импеданс контакта электрода и ткани. Значения импеданса будут показаны в каждом канале.
    2. Проверьте значения импеданса в окне испытания импеданса и убедитесь, что импеданс ниже 10 кОм. Если нет, снова подключите или замените электрод.
    3. Нажмите кнопку осциллографа , чтобы проверить базовый шум без световой стимуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на защиту хрупких записывающих электродов ERG-Jet. Базовый шум в PERG обычно меньше, чем в FVEP у козы.
    4. Начните запись PERG с обоих глаз одновременно на пространственных частотах 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 и 12,6 циклов / градус последовательно. Для каждой пространственной частоты усредняется 64 трассы, чтобы получить одно считывание.
    5. Наконец, выключите монитор, чтобы записать PERG без визуального стимула в качестве отрицательного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналы PERG обычно стабильны и не нуждаются в повторении.
    6. Удалите винт переднего черепа и разбудите козу, введя Idzoxan (1,5 мг / кг), который является антагонистом ксилазина.
    7. После общей анестезии обработайте козу гентамицином (4 мг/кг в/м) и цефтиофуром натрия (2 мг/кг в/м) для предотвращения инфекции.
  3. Измерение и количественный анализ PERG
    1. Установите полосовой фильтр в диапазоне от 1 до 75 Гц. Для 3.0 cpd PERG полосовой фильтр устанавливается на частоту от 1 до 50 Гц, чтобы сгладить след, не влияя на его амплитуду.
    2. Как показано на рисунке 1C, первые положительные и отрицательные пики в форме сигнала обозначаются как P1 (обычно около 25 мс) и N1 (обычно около 55 мс). Амплитуда PERG измеряется от N1 до P1.
    3. В случае повреждения монокуляра мы используем межглазное сравнение амплитуды и неявного времени, чтобы помочь уменьшить вариации межсессии и снизить чувствительность17.

4. ПЕРГ у макак-резусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Неясно, есть ли межглазные перекрестные помехи сигнала PERG у макак-резусов, поэтому ответы PERG от обоих глаз регистрируются отдельно.

  1. Подготовка к экзаменам
    1. Обезболивают обезьяну изофлураном (1,5%-2%) после инъекции Золетил50 (4-8 мг/кг в/м, тилетамина/золазепама) и интубации трахеи.
    2. Поместите стерилизованный молотый электрод подкожно на лобную кость. Вставьте стерилизованную иглу опорного электрода подкожно, на 1 см позади бокового кантуса с той же стороны.
    3. Поместите продезинфицированный записывающий электрод ERG-Jet на центральную роговицу после местного применения искусственной слезы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте положение электрода роговицы, если он не находится в центре поверхности роговицы.
    4. Используйте клейкую непрозрачную черную ленту, чтобы залатать один глаз.
    5. Поместите монитор (47,6 x 26,8 см) на расстояние просмотра 50 см.
    6. Убедитесь, что монитор настроен параллельно плоскости зрачка. Выровняйте центр монитора по плоскости зрачка.
    7. Убедитесь, что черно-белая шахматная доска движется задним ходом на частоте 2,4 Гц, а соотношение сторон составляет 4:3, которое устанавливается настройками оборудования.
    8. Убедитесь, что контраст между белыми и черными шашками составляет 96%, а усредненная яркость остается 200 кд/м2, что проверяется измерителем яркости.
  2. Запись PERG
    1. Приглушите окружающий свет и проверьте контактное сопротивление электрода и ткани.
    2. Убедитесь, что импеданс ниже 10 кОм. Если нет, снова подключите или замените электрод.
    3. Проверьте базовый шум без световой стимуляции.
    4. Нанесите патч одному глазу и начните запись PERG с другого глаза на пространственных частотах 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 и 12,6 циклов / градус последовательно.
    5. Повторите шаги 4.2.1-4.2.4 для контралатерального глаза.
    6. Прекратите подачу изофлурана, чтобы разбудить обезьяну.
    7. После общей анестезии лечите обезьяну гентамицином (4 мг/кг в/м) и цефтиофуром натрия (2 мг/кг в/м) для предотвращения инфекции.
  3. Измерение и количественный анализ PERG
    1. Как показано на рисунке 1D, первые положительные и отрицательные пики в форме сигнала обозначаются как P1 (обычно около 40 мс) и N1 (обычно около 85 мс). Амплитуда PERG измеряется от N1 до P1.
    2. В случае повреждения монокуляра мы используем межглазное сравнение амплитуды и неявного времени, чтобы помочь уменьшить вариации межсессии и повысить чувствительность17.

5. ОКТ у козла

  1. Подготовка животных
    1. Обезболить козу с помощью ксилазина (3 мг/кг, в/м), а затем интубировать.
    2. Расширяют зрачок путем местного введения мидриатических глазных капель с тропикамидом (5%) и фенилэфрином (5%).
    3. Используйте зеркало века, чтобы полностью обнажить зрачок.
    4. Положите голову козы на подбородок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя газовая анестезия не проводится, регулярно интубируйте козу, чтобы защитить дыхательные пути от сжатия подбородком.
  2. Визуализация центра развертывания Office
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании oct-визуализация сетчатки выполняется с использованием системы OCT на длине волны 870 нм. Оптическое осевое разрешение oct-сканера составляет 12 мкм. Режим кругового сканирования используется для сканирования головки зрительного нерва (ONH) с режимом высокого разрешения. 100 кадров усредняются для оптимизации качества изображения. Подробное руководство по обучению доступно онлайн (см. Таблицу материалов).
    1. Начальное сканирование OCT (базовый экзамен)
      1. Нажмите кнопку Пуск , чтобы войти в интерфейс обнаружения. Подождите, пока устройство завершит загрузку, а затем нажмите желтую кнопку Пуск, чтобы начать создание образа.
      2. Совместите козу с инфракрасной камерой, чтобы центрировать ONH на конфокальном сканирующем лазерном офтальмоскопическом изображении (cSLO), изменив положение его головы.
      3. Отрегулируйте джойстик, чтобы равномерно осветить все инфракрасное изображение для улучшения качества изображения.
      4. Перемещайте джойстик вперед до тех пор, пока на вертикальном экране не появится вертикальное изображение OCT сетчатки.
      5. Измените джойстик, чтобы он имел равномерно плотное и горизонтально расположенное изображение OCT сетчатки.
      6. Нажмите кнопку на джойстике, чтобы автоматически поймать изображение, и удерживайте джойстик, чтобы сохранить качество изображения на экране живого изображения до тех пор, пока получение изображения не будет завершено. Затем нажмите приобрести.
      7. Разбудите козу, введя идзоксан (1,5 мг/кг), который является антагонистом ксилазина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Центрирование ONH в базовом экзамене помогает выровнять базовое сканирование и последующее сканирование в соответствии с нашим опытом.
    2. Последующее сканирование центра развертывания Office
      1. Выберите высококачественное исходное изображение центра развертывания Office; Щелкните правой кнопкой мыши и выберите Задать ссылку.
      2. Инициируйте визуализацию центра развертывания Office, как упоминалось выше.
      3. Нажмите кнопку «Продолжить», чтобы разрешить автоматическое сопоставление текущего сканирования с эталонным сканированием.
      4. После сопоставления (круговое кольцо сканирования становится зеленым) нажмите кнопку на джойстике, чтобы активировать автоматическое отслеживание в режиме реального времени.
      5. Разбудите козу, введя идзоксан (1,5 мг/кг), который является антагонистом ксилазина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить процесс сопоставления, (1) переместите ONH в живом окне, повернув голову соответствующим образом, или (2) поверните ONH в живом окне, наклонив головку, чтобы текущее изображение cSLO выглядело более похожим на базовое изображение. Этот вестибуло-глазной рефлекс хорошо работает под ксилазиновой анестезией19.
  3. Измерение ОКТ
    1. Нажмите на кнопку Измерение , чтобы войти в окно измерения.
    2. Выберите инструмент ластика и сотрите строку RNFL, которая автоматически помечается программой.
    3. Выберите инструмент «Рисование линий», чтобы вручную очертить границу между IPL и INL (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина GCC в шести перипапиллярных областях (T, TS, TI, N, NS, NI) и усредненная толщина GCC вокруг ONH (G) могут быть прочитаны на экране (рисунок 2). Студенческий тест, односторонний ANOVA или двусторонний ANOVA может быть использован для количественной оценки данных OCT в случае нормального распределения.

6. ОКТ у макак-резусов

  1. Выполните ОКТ-визуализацию сетчатки у макак-резусов с использованием того же оборудования и процедуры, что и в случае козы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1А показаны репрезентативные результаты FVEP у коз. Хотя формы сигналов с одинаковой интенсивностью вспышки имеют относительное сходство, мы все же рекомендуем исследовать формы сигналов дважды. Электромагнитные волны, генерируемые электронными устройствами, будут мешать собранным электрическим сигналам, что приведет к высокому базовому шуму и плохой повторяемости формы сигнала. Поэтому во время электрофизиологического исследования рекомендуется убедиться в отсутствии резервных электронных устройств, подключенных к окружающей среде, чтобы избежать таких помех, и рекомендуется повторить не менее двух измерений для определения стабильности и повторяемости экспериментальных результатов. При латании обоих глаз формы сигналов абсолютно плоские на обоих глазах, что показывает, что формы сигналов, безусловно, генерируются нашим вспышкой. На рисунке 1B показаны репрезентативные результаты PERG у коз. Благодаря своей стабильности и высокому сигналу, мы получаем надежную форму сигнала всего за одно время измерения на каждой пространственной частоте. По мере увеличения пространственной частоты размер шахматной доски будет постепенно превышать узнаваемость глаз козы. Таким образом, мы видим, что при 12,7 cpd форма сигнала PVEP сильно упала. По аналогии с FVEP, форма сигнала исчезает, когда мы закрываем экран. На рисунке 1C показаны репрезентативные результаты PVEP у макак-резусов. Мы повторяем измерение дважды на каждой пространственной частоте. По мере увеличения пространственной частоты амплитуда будет уменьшаться. Это связано с тем, что пространственная частота превышает восприятие глаза. На рисунке 1D показаны репрезентативные результаты PERG у макак-резусов. Причина, по которой амплитуда уменьшается с пространственной частотой, та же, что описана выше. При анализе этих данных вы можете выбрать анализ амплитуды между пиками и впадинами или времени задержки пиков или впадин в качестве статистики.

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты ОКТ у козла. На крайнем левом изображении показана фотография глазного дна, сделанная инфракрасной камерой. Плотно справа находится томограмма сетчатки, показывающая общую толщину сетчатки вокруг ONH и толщину каждого слоя. Как показано на рисунке, мы можем ясно видеть, что козы имеют более крупные кровеносные сосуды сетчатки, чем обезьяны. Зеленые диски справа — это количественный анализ толщины GCC вокруг ONH. G означает общее, T означает височную сторону, N означает носовую сторону, S означает высшую, а I означает нижнюю. Черный шрифт представляет значение измерения толщины GCC в микрометрах, а зеленый - клиническое эталонное значение измерения для человека, а не в качестве эталона для этого эксперимента.

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные электрофизиологические формы сигналов у козьих и макак-резусов. (A) Репрезентативные формы сигналов FVEP при различной интенсивности света от отдельной козы в рамках одного и того же анестезиологического сеанса. (Б,Г) Репрезентативный сигнал PERG формируется на разных пространственных частотах от отдельной козы (B) или макаки-резуса (D) в течение одного сеанса анестезии. (C) Репрезентативные формы сигналов PVEP на разных пространственных частотах от отдельной макаки-резуса в течение одного сеанса анестезии. Типичное неявное время каждой формы сигнала указано в разделе Протокол. n = 1 субъект для каждого теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Результаты OCT. Репрезентативные изображения ОКТ сетчатки вокруг головки зрительного нерва (левая панель) и толщины GCC в различных перипапиллярных областях (правая панель) у козы (А) и макаки-резуса (В). n = 1 субъект для каждого теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании мы представляем протокол VEP, PERG и OCT у коз и макак-резусов. Эти методы in vivo могут применяться на крупных животных моделях различных оптических невропатий, таких как глаукома, ишемическая или травматическая оптическая невропатия и неврит зрительного нерва9.

PVEP более стабилен и чувствителен, чем FVEP17; тем не менее, это не может быть вызвано в goat9. Таким образом, FVEP выполняется у коз, а PVEP выполняется у макак-резусов в нашей лаборатории для оценки целостности ретино-геникуло-кортикального пути. Механизм, лежащий в основе наблюдения, что PERG, но не PVEP, может быть индуцирован у козы, до сих пор неясен в соответствии с нашими знаниями. Возможно, что функция и структура зрительного нерва у козла может отличаться от человеческого.

Поскольку амплитуда FVEP может зависеть от размера зрачков и окружающего света, мы расширяем зрачок и помещаем черное одеяло на голову козы во время записи FVEP. Следует отметить, что расширение зрачка не требуется при ФВЭП в клиниках17. Аналогичным образом, хотя темная адаптация не является необходимой для записи FVEP в клиниках, мы обнаружили, что 5-минутная адаптация к окружающему свету перед записью FVEP может увеличить повторяемость внутри сессии в амплитуде.

Считается, что сигнал PERG происходит от RGC, и поэтому его амплитуда может быть использована для оценки функции RGC13,20. По сравнению с некоторыми специальными компонентами вспышки ERG, такими как стотопический пороговый ответ (STR) и фотопик отрицательный ответ (PhNR), PERG более чувствителен к дисфункции RGC13. Потенциальные ограничения теста PERG в этом исследовании заключаются в следующем. Во-первых, ISCEV рекомендует использовать классический стимулятор ЭЛТ (электронно-лучевой трубки) для записи PERG, чтобы поддерживать постоянную среднюю яркость. Однако классический ЭЛТ-стимулятор менее доступен, чем жидкокристаллический дисплей (LCD). Хотя экран ЖК-дисплея обычно представляет переходные изменения яркости во время разворота паттерна, потенциально вызывая артефакт яркости17, он не способствовал амплитуде PERG у козла в соответствии с нашим предыдущим открытием: амплитуда PERG на пространственной частоте 12,6 cpd обычно пренебрежительна по сравнению с амплитудой на более низких пространственных частотах9 . Другим ограничением является то, что мы не исправили ошибку рефракции перед тестом PERG для простоты. Чтобы компенсировать это ограничение, базовая амплитуда PERG должна быть записана в качестве эталона.

В нашем предыдущем исследовании оценивались и оптимизировались внутри- и межсессионные вариации VEP и PERG9. Мы обнаружили, что по сравнению с ксилазином изофлуран приводит к более повторяемому FVEP, но более изменчивым формам сигналов PERG у коз9. Поэтому мы использовали изофлуран в тесте FVEP и ксилазин в тесте PERG и OCT у коз. Кроме того, по сравнению с PERG, запись VEP потенциально более изменчива. Таким образом, мы регулярно повторяем запись VEP при каждой интенсивности света или пространственной частоте, чтобы проверить вариации внутри сессии. На контрасте формы сигналов PERG гораздо более стабильны. Поэтому мы, как правило, не повторяем запись PERG. Хотя повторная запись в другой день на одну и ту же тему, как правило, рекомендуется, мы не регулярно повторяем запись VEP или PERG на одну и ту же тему в другой день ради простоты и этики животных. Тем не менее, записи FVEP и PERG без межсессионного повтора достаточно чувствительны, чтобы обнаружить повреждение зрительного нерва в соответствии с нашим предыдущим исследованием9.

OCT-визуализация сетчатки является удобным, надежным и неинвазивным методом продольного мониторинга и количественной оценки динамических изменений в структуре сетчатки. По сравнению с PERG и VEP, OCT-визуализация имеет гораздо лучшую повторяемость между сессиями9. Кроме того, OCT-визуализация может захватывать и количественно оценивать все волокно зрительного нерва в течение нескольких минут без ошибки отбора проб, предлагая гораздо более дешевую и эффективную возможность исследовать структуру сетчатки, чем традиционный гистологический анализ. Тем не менее, пространственное разрешение текущей ВИЗУАЛИЗАЦИИ OCT все еще слишком ограничено, чтобы сказать об отдельной соме RGC или волоконе зрительного нерва. Кроме того, следует отметить, что более толстый GCC, измеренный OCT, не обязательно означает более неповрежденную внутреннюю сетчатку, потому что утолщение GCC может быть вызвано отеком сетчатки или кровоизлиянием.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют каких-либо конфликтов интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось за счет следующих грантов: Национальная ключевая программа исследований и разработок Китая (2021YFA1101200); Медицинский исследовательский проект Вэньчжоу (Y20170188), Национальная ключевая программа исследований и разработок Китая (2016YFC1101200); Национальный фонд естественных наук Китая (81770926;81800842); Ключевая программа исследований и разработок провинции Чжэцзян (2018C03G2090634); и Ключевая программа исследований и разработок глазной больницы Вэньчжоу (YNZD1201902). Спонсор или финансирующая организация не играли никакой роли в разработке или проведении этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
  2. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  3. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
  4. Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
  7. Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
  8. Singman, E. L., et al. Indirect traumatic optic neuropathy. Military Medical Research. 3, 2 (2016).
  9. Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
  10. Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
  11. Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
  12. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  13. Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
  14. Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
  15. Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
  16. You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
  17. Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
  18. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
  19. Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
  20. Porciatti, V. The mouse pattern electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).

Tags

Неврология выпуск 180
<em>В городе Виво</em> Методы оценки функции и структуры ганглиозных клеток сетчатки и зрительного нерва у крупных животных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter