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Neuroscience

In vivo Méthodes d’évaluation de la fonction et de la structure des cellules ganglionnaires rétiniennes et du nerf optique chez les grands animaux

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Nous démostosons ici plusieurs tests in vivo (potentiel évoqué visuel flash, électrorétinogramme de motif et tomographie par cohérence optique) chez le macaque caprin et rhésus pour comprendre la structure et la fonction du nerf optique et de ses neurones.

Abstract

Le nerf optique recueille les signaux axones des cellules ganglionnaires de la rétine et transmet le signal visuel au cerveau. Les grands modèles animaux de lésion du nerf optique sont essentiels pour traduire de nouvelles stratégies thérapeutiques des modèles de rongeurs à l’application clinique en raison de leurs similitudes plus étroites avec les humains en taille et en anatomie. Nous décrivons ici quelques méthodes in vivo pour évaluer la fonction et la structure des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et du nerf optique (ON) chez les grands animaux, y compris le potentiel évoqué visuel (VEP), l’électrorétinogramme de motif (PERG) et la tomographie par cohérence optique (OCT). Des primates caprins et non humains ont été utilisés dans cette étude. En présentant ces méthodes in vivo étape par étape, nous espérons augmenter la reproductibilité expérimentale entre différents laboratoires et faciliter l’utilisation de grands modèles animaux de neuropathies optiques.

Introduction

Le nerf optique (ON), qui est constitué d’axones des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC), transmet le signal visuel de la rétine au cerveau. Les maladies onéreuses, comme le glaucome, la neuropathie optique traumatique ou ischémique, ont souvent causé une dégénérescence irréversible de l’ON/RGC et une perte visuelle dévastatrice. Bien qu’il existe actuellement de nombreuses percées dans la régénération des ON et la protection RGC dans les modèles de rongeurs1,2,3,4,5,6, les traitements cliniques pour la plupart des maladies on sont restés essentiellement les mêmes au cours du dernier demi-siècle avec des résultats insatisfaisants7,8 . Pour combler le fossé entre la recherche fondamentale et la pratique clinique, les études translationnelles utilisant de grands modèles animaux de maladies ON sont souvent nécessaires et bénéfiques en raison de leur similitude anatomique plus étroite avec les humains que les modèles de rongeurs.

Les macaques de chèvre et les macaques rhésus sont deux grandes espèces animales utilisées dans notre laboratoire pour modéliser la maladie ON humaine. La taille du globe oculaire d’une chèvre, ON, et de la structure adjacente (cavité orbitale et nasale, base du crâne, etc.) est similaire à celle d’un humain sur la base de la tomodensitométrie du crâne9. En tant que tel, le modèle de chèvre offre l’occasion d’évaluer et d’affiner les dispositifs thérapeutiques ou les procédures chirurgicales avant leur utilisation chez l’homme. Le macaque rhésus, en tant que primate non humain (PSN), a un système visuel unique semblable à celui de l’homme qui n’existe pas chez d’autres espèces10,11. De plus, les réponses physiopathologiques aux blessures et aux traitements dans les PSN sont très similaires à celles des humains12.

Les essais in vivo visant à évaluer longitudinalement la structure et la fonction de l’ON et du RGC sont importants dans les études sur de grands animaux. L’électrorétinogramme de modèle (PERG) a été utilisé pour évaluer la fonction RGC. Le potentiel évoqué visuel flash (FVEP) reflète l’intégrité de la voie rétino-géniculo-corticale dans le système visuel. Ainsi, PERG combiné avec FVEP peut refléter la fonction ON9,13,14 . L’imagerie par tomographie par cohérence optique rétinienne (OCT) peut montrer la structure rétinienne avec une résolution temporelle et spatiale élevée, ce qui permet de mesurer l’épaisseur du complexe ganglionnaire rétinien (CCG)9,15. Pour les examens électrophysiologiques de cette étude, la surveillance des signes vitaux (taux de chaleur, taux de rupture, pression artérielle) et du niveau de saturation en oxygène (SpO2) avant les tests est cruciale car ces paramètres ont des impacts puissants sur le flux sanguin oculaire et donc sur la fonction du système visuel. Cependant, nous n’avons pas surveillé les signes vitaux lors de la réalisation de l’imagerie rétinienne OCT par souci de simplicité. Selon notre étude précédente9, l’épaisseur du CCG mesurée par imagerie rétinienne OCT est assez stable, avec un coefficient de variation inter-session proche de 3%. Ces tests in vivo chez le macaque caprin et le macaque rhésus ont été décrits en détail dans notre étude précédente9. Nous présentons ici ces méthodes pour aider à augmenter la transparence expérimentale et la reproductibilité.

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Protocol

Les expériences ont été menées en stricte conformité avec les directives ARRIVE et le guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et respectent les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Wenzhou (WMU) et du laboratoire Joinn (Suzhou). Les chèvres Saanen mâles, âgées de 4 à 6 mois et pesant de 19 à 23 kg, étaient hébergées dans l’animalerie de l’UMM. Les macaques rhésus mâles, âgés de 5 à 6 ans et pesant de 5 à 7 kg, étaient logés dans l’animalerie joinn. Tous les animaux ont été maintenus dans une pièce climatisée à température contrôlée (21 ± 2 °C) sous un cycle de lumière de 12 h/ 12 h d’obscurité avec de la nourriture ad libitum.

1. Potentiel évoqué visuel Flash (FVEP) chez la chèvre

  1. Anesthésie générale
    1. Rasez les poils du jarret avec un rasoir électronique.
    2. Préparez la peau en frottant trois fois avec de l’alcool à 70% pour nettoyer la peau, puis exposez la veine sous-cutanée.
    3. Insérez un cathéter veineux périphérique par voie intraveineuse (0,9 mm x 25 mm), puis injectez de l’atropine (0,025 mg/kg) et du propofol (5 mg/kg).
    4. Intuber la chèvre avec un tube trachéal de 6 mm et le connecter à un respirateur artificiel.
    5. Maintenir l’anesthésie avec 3,5% d’isoflurane dans l’oxygène à un débit constant de 2 L / min.
      REMARQUE: La chèvre récupère de l’anesthésie induite par le propofol en quelques minutes, alors soyez rapide pour intuber la chèvre.
  2. Surveillance cardiopulmonaire
    1. Placez le capteur de température sous la languette.
    2. Connectez l’oxymètre de pouls à l’extrémité proximale de l’oreille.
    3. Attachez le brassard de pression artérielle à la base de la cuisse.
    4. Serrez les clips ECG sur les membres en conséquence.
      REMARQUE: La fréquence cardiaque normale des chèvres est de 68-150 bpm. En raison de l’utilisation de l’anesthésie gazeuse, la fréquence cardiaque des chèvres augmentera. Par conséquent, notre fréquence cardiaque pendant l’inspection est de 170 ± 30 bpm. La pression artérielle systolique des chèvres dans des conditions normales est de 110-130 mmHg et la pression artérielle diastolique est de 50-60 mmHg. Dans l’état d’inhalation d’oxygène, la saturation en oxygène du sang de la chèvre peut toujours être maintenue à 99%. Le rythme respiratoire des chèvres sous anesthésie est synchronisé avec celui du ventilateur, qui est de 10 respirations / min. Étant donné que la température a été mesurée sous la langue de la chèvre, et non la température centrale, la température de la chèvre est généralement de 35 ± 2 °C.
  3. Implantation de vis crâniennes et placement d’électrodes
    1. Rasez les cheveux avec une tondeuse. Désinfectez la peau au centre de l’os frontal en frottant trois fois avec une boule de coton imbibée de bétadine et d’alcool à 70%.
    2. Utilisez des vis et des ciseaux stérilisés.
      REMARQUE: Autoclavez tous les instruments chirurgicaux pour la stérilisation (121 °C, 20 min).
    3. Faites une incision cutanée de 5 mm pour exposer l’os frontal avec un ciseau ophtalmique, puis implantez une vis stérilisée au centre de l’os frontal à l’aide d’un tournevis.
    4. Rasez les cheveux et désinfectez la peau de l’os occipital central entre deux oreilles avec de la bétadine et 70% d’alcool, l’une suivie de l’autre, trois fois.
    5. Faites une incision cutanée de 5 mm pour exposer l’os occipital avec un ciseau ophtalmique, puis implantez une vis stérilisée au centre de l’os occipital.
      REMARQUE: L’électrode de l’aiguille de terre est insérée par voie sous-cutanée sous la vis frontale du crâne. Les électrodes actives et de référence sont reliées aux vis occipitales et frontales, respectivement, avec des clips en alligator pour réduire l’impédance de l’électrode16.
  4. Préparation des animaux
    1. Utilisez un chiffon anti-lumière pour couvrir l’œil et fixez-le par le bandeau pour colmater un œil.
    2. Appliquer des gouttes ophtalmiques anesthésiques topiques (gouttes ophtalmiques au chlorhydrate de proparacaïne) sur les deux yeux. Les pupilles bilatérales sont dilatées par l’administration topique de collyre mydriatiques avec du tropicamide (5%) et de la phényléphrine (5%).
    3. Placez la tête de la chèvre dans le stimulateur Ganzfeld et atténuez la lumière ambiante.
      REMARQUE: Il a été constaté que les chèvres peuvent maintenir une bonne fixation du globe oculaire sous anesthésie, de sorte qu’aucune intervention supplémentaire de l’opération de fixation du globe oculaire n’est nécessaire.
    4. Couvrez le stimulateur et la tête de chèvre avec une couverture noire pendant 5 min pour l’adaptation.
    5. Utilisez le spéculum des paupières pour exposer la conjonctive bulbaire. Pliez l’anneau supérieur, tirez la paupière supérieure vers le haut et insérez l’anneau supérieur d’abord dans le sac conjonctival de la paupière supérieure, puis dans la paupière inférieure de la même manière.
    6. Appuyez sur le bouton Impédance pour vérifier l’impédance de contact électrode-tissu et les valeurs d’impédance seront affichées dans chaque canal.
    7. Assurez-vous que l’impédance est inférieure à 10 kΩ pour chaque électrode afin d’éviter les interférences électromagnétiques provenant d’autres appareils électriques dans la même pièce.
      REMARQUE: S’il est supérieur à 10 kΩ, reconnectez ou remplacez l’électrode. L’impédance peut apparaître anormalement élevée si le lit chirurgical en métal électrique, où se trouve la chèvre, est bouché. L’impédance doit différer de moins de 1 kΩ entre les électrodes actives et de référence pour réduire les interférences électriques17.
    8. Appuyez sur le bouton Oscillographe pour vérifier le bruit de base sans stimulation lumineuse.
      REMARQUE: S’il y a un bruit de base important, débranchez tous les autres appareils électriques dans la même pièce et éteignez les téléphones cellulaires. Si le problème de référence persiste, passez à l’étape 1.3.10. pour vérifier si une forme d’onde FVEP typique peut être déclenchée. Si ce n’est pas le cas, reprogrammez le test FVEP à un autre moment.
    9. Démarrez l’enregistrement FVEP en choisissant l’intensité lumineuse de 0,025, 0,5 et 3,0 cd·s/m2, respectivement dans la zone de fond blanc dans le coin supérieur droit. Ensuite, appuyez sur le bouton Examen . Notez que l’enregistrement FVEP à chaque intensité lumineuse est effectué deux fois.
      REMARQUE: Si les deux formes d’onde semblent manifestement différentes, une répétition supplémentaire est nécessaire.
    10. Humidifiez la cornée avec des gouttes oculaires artificielles, si elle apparaît sèche sur la caméra infrarouge.
      REMARQUE: Surveillez la position des yeux à partir de la caméra infrarouge intégrée avant l’enregistrement pour vous assurer que le regard visuel est correct et que la pupille est complètement exposée (de sorte que la taille du champ d’un stimulus de flash est de 90 °. La position des yeux d’une chèvre anesthésiée peut être ajustée en tournant la tête en conséquence. D’après notre observation, l’errance du regard se produit rarement pendant l’enregistrement FVEP (~10 min) chez la chèvre sous anesthésie générale9. Il n’est donc pas nécessaire de mettre en pause et de réajuster le regard pendant l’enregistrement.
    11. Répétez les étapes ci-dessus pour l’œil controlatéral.
    12. Cesser l’apport en isoflurane et augmenter légèrement le volume courant sur le ventilateur pour aider la chèvre à se remettre de l’anesthésie générale.
    13. Après anesthésie générale, traiter la chèvre avec de la gentamicine (4 mg/kg, IM) et du ceftiofur sodique (une céphalosporine, 2 mg/kg, IM) pour prévenir l’infection.
  5. Mesure FVEP et analyse quantitative
    REMARQUE : Comme le montre la figure 1A, les premiers pics positifs et négatifs de la forme d’onde FVEP sont désignés comme P1 et N1, et le deuxième pic positif comme P2. Le temps implicite typique de P1, N1 et P2 est d’environ 40, 60 et 120 ms, respectivement. Les amplitudes P1 et P2 sont mesurées à partir du creux de la forme d’onde N1 jusqu’aux pics des formes d’onde P1 et P2, respectivement.
    1. En cas de lésion monoculaire, utilisez la comparaison interoculaire de l’amplitude et du temps implicite pour aider à réduire la variation d’intersession et augmenter la sensibilité17.

2. PVEP chez le macaque rhésus

REMARQUE: Les VEP de modèle pourraient être déclenchés chez les macaques rhésus9 et sont plus stables que flash VEP en amplitude et en temps implicite17. Par conséquent, le PVEP a été utilisé pour détecter l’intégrité de la voie rétino-géniculo-corticale chez les primates non humains.

  1. Préparation des animaux
    1. Anesthésier le singe avec de l’isoflurane (1,5%-2%) après induction avec Zoletil50 (4-8 mg / kg IM, tilétamine / zolazépam).
    2. Positionnez l’électrode de terre stérilisée au niveau du lobe de l’oreille. Insérez les électrodes actives et de référence stérilisées par voie sous-cutanée le long de la ligne médiane au niveau de l’os frontal et occipital, respectivement.
    3. Appliquer le spéculum des paupières pour exposer la conjonctive bulbaire.
    4. Utilisez du ruban adhésif opaque noir pour colmater l’œil controlatéral.
  2. Enregistrement PVEP
    1. Appuyez sur le bouton Impédance pour vérifier l’impédance de contact électrode-tissu et les valeurs d’impédance seront affichées dans chaque canal; assurez-vous qu’il est inférieur à 10k Ω. Si ce n’est pas le cas, reconnectez ou remplacez l’électrode.
    2. Vérifiez les valeurs d’impédance dans la fenêtre d’essai d’impédance et assurez-vous que l’impédance diffère de moins de 1 kΩ entre les électrodes actives et de référence afin de réduire les interférences électriques17.
    3. Appuyez sur le bouton Oscillographe pour vérifier le bruit de base sans stimulation.
      REMARQUE: S’il y a un bruit de base important, débranchez tous les autres appareils électriques dans la même pièce et éteignez les téléphones cellulaires. Si le problème de base persiste, refaites le test PVEP un autre jour.
    4. Enregistrez les réponses PVEP de l’œil non corrigé en choisissant l’intensité lumineuse de 0,5 et 1,0 cycle/degré, respectivement dans la zone de fond blanc dans le coin supérieur droit, puis appuyez sur le bouton Examen .
      REMARQUE: Pour chaque enregistrement, 64 traces sont moyennes pour donner une forme d’onde. Pour chaque fréquence, un minimum de deux enregistrements est acquis pour vérifier la reproductibilité des signaux PVEP.
    5. Répétez la procédure pour l’œil controlatéral.
    6. Une fois cela fait, cessez l’approvisionnement en isoflurane pour réveiller le singe.
    7. Après anesthésie générale, traiter le singe avec de la gentamicine (4 mg/kg IM) et du ceftiofur sodique (2 mg/kg IM) pour prévenir l’infection.
  3. Mesure PVEP et analyse quantitative
    1. Comme le montre la figure 1B, les premiers pics négatifs et positifs de la forme d’onde PVEP ont été désignés comme N1 et P1, qui se produisent généralement à environ 50 et 90 ms. L’amplitude P1 est mesurée du creux de N1 au pic de P1.
    2. En cas de lésion monoculaire, utilisez la comparaison interoculaire de l’amplitude et du temps implicite pour aider à réduire la variation d’intersession et augmenter la sensibilité17.

3. Modèle ERG (PERG) chez la chèvre

REMARQUE: Dans l’étude précédente, aucune diaphonie interoculaire du signal PERG n’a été observée chez les chèvres, de sorte que les réponses PERG peuvent être enregistrées simultanément à partir des deux yeux9.

  1. Préparation à l’examen
    1. Anesthésier la chèvre à l’aide de xylazine (3 mg/kg, IM) et la placer sur une table d’examen.
    2. Placez un capteur de température sous la langue de la chèvre.
    3. Connectez l’oxymètre de pouls à l’extrémité proximale de l’oreille de la chèvre.
    4. Attachez le brassard de pression artérielle à la cuisse.
    5. Serrez les clips ECG sur les membres en conséquence.
    6. Pour réduire l’impédance de l’électrode, placez une vis crânienne stérilisée sur l’os frontal et connectez-la à l’électrode de terre avec un clip en alligator.
    7. Placez deux électrodes de référence à aiguille stérilisées par voie sous-cutanée à 1 cm derrière le canthi latéral des deux côtés.
    8. Utilisez le spéculum de la paupière pour exposer la conjonctive bulbaire.
    9. Placez deux électrodes d’enregistrement ERG-Jet désinfectées au centre des cornées bilatérales après application topique de larme artificielle.
    10. Placez deux moniteurs LED de 47,6 cm x 26,8 cm devant les deux yeux avec une distance de vision de 50 cm.
    11. Réglez chaque moniteur pour qu’il soit parallèle au plan de la pupille du même côté et alignez le centre du moniteur sur le plan de la pupille.
    12. Assurez-vous que le damier à contraste inversé (fréquence temporelle, 2,4 Hz) est affiché sur les deux moniteurs et a un rapport d’aspect maximal de 4:3, qui est défini par les paramètres de l’équipement.
    13. Assurez-vous que le contraste entre les dames blanches et noires reste de 96% et que la luminance moyenne est de 200 cd / m2 (Candela par mètre carré), qui est vérifiée par le luminancemètre.
      NOTE: Selon l’ISCEV, une luminance photopique moyenne de 40-60 cd / m2 est nécessaire chez l’homme17. Dans une autre étude utilisant un modèle de souris, le motif est resté à une luminance moyenne de 800 cd / m2,18. Une taille de champ d’au moins 15° dans sa dimension la plus étroite est nécessaire pour un test PERG standard chez l’homme17. Ajustez la position de l’électrode cornéenne si elle n’est pas au centre de la surface cornéenne.
  2. Enregistrement PERG
    1. Atténuez la lumière ambiante et appuyez sur le bouton Impédance pour vérifier l’impédance de contact électrode-tissu. Les valeurs d’impédance seront affichées dans chaque canal.
    2. Vérifiez les valeurs d’impédance dans la fenêtre de test d’impédance et assurez-vous que l’impédance est inférieure à 10 kΩ. Si ce n’est pas le cas, reconnectez ou remplacez l’électrode.
    3. Appuyez sur le bouton Oscillographe pour vérifier le bruit de base sans stimulation lumineuse.
      REMARQUE: Faites attention à protéger les électrodes d’enregistrement ERG-Jet fragiles. Le bruit de base dans perg est généralement plus faible que celui dans FVEP chez la chèvre.
    4. Commencez l’enregistrement PERG à partir des deux yeux simultanément aux fréquences spatiales de 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 et 12,6 cycles / degré consécutivement. Pour chaque fréquence spatiale, 64 traces sont moyennées pour donner une lecture.
    5. Enfin, éteignez le moniteur pour enregistrer PERG sans stimulus visuel comme contrôle négatif.
      REMARQUE: Les signaux PERG sont généralement stables et n’ont pas besoin d’être répétés.
    6. Retirez la vis frontale du crâne et réveillez la chèvre en injectant Idzoxan (1,5 mg / kg), qui est un antagoniste de la xylazine.
    7. Après anesthésie générale, traiter la chèvre avec de la gentamicine (4 mg/kg IM) et du ceftiofur sodium (2 mg/kg IM) pour prévenir l’infection.
  3. Mesure PERG et analyse quantitative
    1. Réglez le filtre passe-bande sur une plage de 1 à 75 Hz. Pour un PERG de 3,0 cpd, le filtre passe-bande est réglé sur une plage de 1 à 50 Hz pour lisser la trace sans affecter son amplitude.
    2. Comme le montre la figure 1C, les premiers pics positifs et négatifs de la forme d’onde sont désignés comme P1 (généralement autour de 25 ms) et N1 (généralement autour de 55 ms). L’amplitude PERG est mesurée de N1 à P1.
    3. En cas de lésion monoculaire, nous utilisons la comparaison interoculaire de l’amplitude et du temps implicite pour aider à réduire la variation d’intersession et à réduire la sensibilité17.

4. PERG chez le macaque rhésus

REMARQUE: Il n’est pas clair s’il y a une diaphonie interoculaire du signal PERG chez le macaque rhésus, de sorte que les réponses PERG des deux yeux sont enregistrées séparément.

  1. Préparation à l’examen
    1. Anesthésier le singe avec de l’isoflurane (1,5%-2%) après injection de Zoletil50 (4-8 mg / kg IM, tilétamine / zolazépam) et intubation trachéale.
    2. Placez une électrode de masse stérilisée par voie sous-cutanée sur l’os frontal. Insérez une électrode de référence à aiguille stérilisée par voie sous-cutanée, à 1 cm derrière le canthus latéral du même côté.
    3. Placez une électrode d’enregistrement ERG-Jet désinfectée sur la cornée centrale après application topique de larme artificielle.
      REMARQUE: Ajustez la position de l’électrode cornéenne, si elle n’est pas au centre de la surface cornéenne.
    4. Utilisez du ruban adhésif opaque noir pour colmater un œil.
    5. Placez un moniteur (47,6 x 26,8 cm) à une distance de visualisation de 50 cm.
    6. Assurez-vous que le moniteur est réglé pour être parallèle au plan de la pupille. Alignez le centre du moniteur sur le plan pupillaire.
    7. Assurez-vous que le damier noir et blanc s’inverse à une fréquence de 2,4 Hz et que le rapport d’aspect est de 4:3, ce qui est défini par les paramètres de l’équipement.
    8. Assurez-vous que le contraste entre les dames blanches et noires est de 96% et que la luminance moyenne reste de 200 cd / m2, ce qui est vérifié par luminance mètre.
  2. Enregistrement PERG
    1. Atténuez la lumière ambiante et vérifiez l’impédance de contact électrode-tissu.
    2. Assurez-vous que l’impédance est inférieure à 10 kΩ. Si ce n’est pas le cas, reconnectez ou remplacez l’électrode.
    3. Vérifiez le bruit de base sans stimulation lumineuse.
    4. Patchez un œil et commencez l’enregistrement PERG à partir de l’autre œil à des fréquences spatiales de 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 et 12,6 cycles / degré consécutivement.
    5. Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.4 pour l’œil controlatéral.
    6. Cessez l’approvisionnement en isoflurane pour réveiller le singe.
    7. Après anesthésie générale, traiter le singe avec de la gentamicine (4 mg / kg IM) et du ceftiofur sodium (2 mg / kg IM) pour prévenir l’infection.
  3. Mesure PERG et analyse quantitative
    1. Comme le montre la figure 1D, les premiers pics positifs et négatifs de la forme d’onde sont désignés comme P1 (généralement autour de 40 ms) et N1 (généralement autour de 85 ms). L’amplitude PERG est mesurée de N1 à P1.
    2. En cas de lésion monoculaire, nous utilisons la comparaison interoculaire de l’amplitude et du temps implicite pour aider à réduire la variation d’intersession et augmenter la sensibilité17.

5. PTOM chez la chèvre

  1. Préparation des animaux
    1. Anesthésier la chèvre à l’aide de xylazine (3 mg/kg, IM), puis l’intuber.
    2. Dilater la pupille par administration topique de gouttes oculaires mydriatiques avec du tropicamide (5%) et de la phényléphrine (5%).
    3. Utilisez le spéculum de la paupière pour exposer complètement la pupille.
    4. Placez la tête de la chèvre sur le repose-menton.
      REMARQUE: Bien que l’anesthésie au gaz ne soit pas effectuée, intuber la chèvre régulièrement pour protéger les voies respiratoires d’être comprimées par le repose-menton.
  2. Imagerie de l’OPO
    REMARQUE: L’imagerie OCT rétinienne est réalisée à l’aide du système OCT à une longueur d’onde de 870 nm dans cette étude. La résolution axiale optique du scanner OCT est de 12 μm. Le mode de balayage circulaire est utilisé pour scanner la tête du nerf optique (ONH) avec le mode haute résolution. 100 images sont moyennées pour optimiser la qualité de l’image. Le guide de formation détaillé est disponible en ligne (voir tableau des matériaux).
    1. Analyse initiale de l’OPO (examen de base)
      1. Cliquez sur le bouton Démarrer pour accéder à l’interface de détection. Attendez que la machine termine le chargement, puis appuyez sur le bouton jaune Démarrer pour lancer l’imagerie.
      2. Alignez la chèvre avec la caméra infrarouge pour centrer l’ONH dans l’image confocale d’ophtalmoscopie laser à balayage (cSLO) en modifiant la position de sa tête.
      3. Ajustez le joystick pour éclairer uniformément l’ensemble de l’image infrarouge afin d’améliorer la qualité de l’image.
      4. Déplacez le joystick vers l’avant jusqu’à ce qu’une image OCT rétinienne verticale s’affiche sur l’écran vertical.
      5. Modifiez le joystick pour avoir une image OCT rétinienne uniformément dense et placée horizontalement.
      6. Appuyez sur le bouton du joystick pour capter l’image automatiquement et maintenez le joystick enfoncé pour maintenir la qualité de l’image sur l’écran d’image en direct jusqu’à ce que l’acquisition de l’image soit terminée. Ensuite, appuyez sur Acquérir.
      7. Réveillez la chèvre en injectant idzoxane (1,5 mg/kg), qui est un antagoniste de la xylazine.
        REMARQUE: Centrer l’ONH dans l’examen de base permet d’aligner l’analyse de base et l’analyse de suivi en fonction de notre expérience.
    2. Analyse de suivi de l’OPO
      1. Sélectionnez une image initiale de l’OPO de haute qualité ; cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Définir la référence.
      2. Lancez l’imagerie de l’OPO comme mentionné ci-dessus.
      3. Appuyez sur le bouton Suivi pour permettre la correspondance automatique de l’analyse en cours avec l’analyse de référence.
      4. Une fois apparié (l’anneau de balayage circulaire devient vert), appuyez sur le bouton du joystick pour activer le suivi automatique en temps réel.
      5. Réveillez la chèvre en injectant Idzoxan (1,5 mg/kg), qui est un antagoniste de la xylazine.
        REMARQUE: Pour faciliter le processus de correspondance, (1) déplacez l’ONH dans la fenêtre en direct en tournant la tête en conséquence ou (2) faites pivoter l’ONH dans la fenêtre en direct en inclinant la tête pour que l’image cSLO actuelle ressemble davantage à l’image de base. Ce réflexe vestibulo-oculaire fonctionne bien sous anesthésie à la xylazine19.
  3. Mesure des PTOM
    1. Cliquez sur le bouton Mesure pour accéder à la fenêtre de mesure.
    2. Choisissez l’outil gomme et essuyez la ligne RNFL, qui est automatiquement étiquetée par le programme.
    3. Choisissez l’outil Dessin au trait pour tracer manuellement la frontière entre IPL et INL (Figure 2).
      REMARQUE : L’épaisseur du CCG dans six régions périapillaires (T, TS, TI, N, NS, NI) et l’épaisseur moyenne du CCG autour de l’ONH (G) peuvent être lues à l’écran (Figure 2). Le test de l’étudiant, l’ANOVA unidirectionnelle ou l’ANOVA bidirectionnelle peuvent être utilisés pour quantifier les données de l’OCT en cas de distribution normale.

6. OCT chez le macaque rhésus

  1. Effectuer l’imagerie OCT rétinienne chez le macaque rhésus en utilisant le même équipement et la même procédure que dans le cas de la chèvre.

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Representative Results

La figure 1A montre des résultats représentatifs du FVEP chez la chèvre. Bien que les formes d’onde de même intensité de flash aient une similitude relative, nous recommandons toujours d’examiner les formes d’onde deux fois. Les ondes électromagnétiques générées par les appareils électroniques interféreront avec les signaux électriques collectés, ce qui entraînera un bruit de base élevé et une mauvaise répétabilité de la forme d’onde. Par conséquent, il est recommandé de s’assurer qu’il n’y a pas d’appareils électroniques redondants branchés dans l’environnement environnant pendant l’examen électrophysiologique pour éviter de telles interférences, et il est recommandé de répéter au moins deux mesures pour déterminer la stabilité et la répétabilité des résultats expérimentaux. Lors du patching des deux yeux, les formes d’onde sont totalement plates sur les deux yeux, ce qui montre que les formes d’onde sont certainement générées à partir de notre stimulus flash. La figure 1B montre les résultats représentatifs du PERG chez la chèvre. En raison de sa stabilité et de son signal élevé, nous acquérons une forme d’onde fiable par une seule mesure temporelle à chaque fréquence spatiale. Au fur et à mesure que la fréquence spatiale augmente, la taille du damier dépassera progressivement la reconnaissance des yeux de la chèvre. Nous pouvons donc voir qu’à 12,7 cpd, la forme d’onde PVEP a beaucoup chuté. Analogue à FVEP, la forme d’onde disparaît lorsque nous fermons l’écran. La figure 1C montre les résultats représentatifs du PVEP chez le macaque rhésus. Nous répétons la mesure deux fois à chaque fréquence spatiale. Au fur et à mesure que la fréquence spatiale augmente, l’amplitude diminue. Cela est dû au fait que la fréquence spatiale dépasse la perception de l’œil. La figure 1D montre des résultats représentatifs du PERG chez le macaque rhésus. La raison pour laquelle l’amplitude diminue avec la fréquence spatiale est la même que celle décrite ci-dessus. Lors de l’analyse de ces données, vous pouvez choisir d’analyser l’amplitude entre les pics et les creux ou le temps de latence des pics ou des creux comme statistiques.

La figure 2 montre les résultats représentatifs de l’OCT chez la chèvre. L’image la plus à gauche montre une photographie du fond d’œil prise par une caméra infrarouge. Étroitement à droite se trouve un tomogramme de la rétine, montrant l’épaisseur globale de la rétine autour de l’ONH et l’épaisseur de chaque couche. Comme le montre l’image, nous pouvons clairement voir que les chèvres ont des vaisseaux sanguins rétiniens plus gros que les singes. Les disques verts à l’extrême droite sont une analyse quantitative de l’épaisseur du CCG autour de l’ONH. G signifie général, T signifie côté temporel, N signifie côté nasal, S signifie supérieur et I signifie inférieur. La police noire représente la valeur de mesure de l’épaisseur du CCG en micromètres, et le vert est la valeur de mesure de référence clinique pour l’homme, et non comme référence pour cette expérience.

Figure 1
Figure 1 : Formes d’onde électrophysiologiques représentatives chez les macaques caprins et rhésus. (A) Formes d’onde FVEP représentatives à différentes intensités lumineuses d’une chèvre individuelle au cours de la même séance d’anesthésie. (B,D) Formes d’onde PERG représentatives à différentes fréquences spatiales d’une chèvre individuelle (B) ou d’un macaque rhésus (D) au cours de la même séance d’anesthésie. (C) Formes d’onde PVEP représentatives à différentes fréquences spatiales d’un macaque rhésus individuel au cours de la même séance d’anesthésie. Le temps implicite typique de chaque forme d’onde est mentionné dans la section Protocole. n = 1 sujet pour chaque test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Résultats des PTOM. Images OCT rétiniennes représentatives autour de la tête du nerf optique (panneau de gauche) et de l’épaisseur du CCG dans différentes régions péripapillaires (panneau de droite) chez le macaque de chèvre (A) et le macaque rhésus (B). n = 1 sujet pour chaque test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans cette étude, nous présentons un protocole de VEP, PERG et OCT chez le macaque de chèvre et de rhésus. Ces méthodes in vivo peuvent être appliquées dans de grands modèles animaux de diverses neuropathies optiques, telles que le glaucome, la neuropathie optique ischémique ou traumatique et la névrite optique9.

Le PVEP est plus stable et sensible que le FVEP17 ; cependant, il ne peut pas être obtenu chez la chèvre9. En tant que tel, le FVEP est effectué chez la chèvre et le PVEP est effectué chez le macaque rhésus dans notre laboratoire pour évaluer l’intégrité de la voie rétino-géniculo-corticale. Le mécanisme sous-jacent à l’observation que le PERG, mais pas le PVEP, peut être induit chez la chèvre n’est pas encore clair selon nos connaissances. Il est possible que la fonction et la structure du nerf optique de la chèvre soient différentes de celles de l’homme.

Étant donné que l’amplitude du FVEP peut être affectée par la taille pupillaire et la lumière ambiante, nous dilatons la pupille et plaçons une couverture noire sur la tête de la chèvre pendant l’enregistrement du FVEP. Il convient de noter que la dilatation des pupilles n’est pas nécessaire pour le FVEP dans les cliniques17. De même, bien que l’adaptation à l’obscurité ne soit pas nécessaire pour l’enregistrement FVEP dans les cliniques, nous avons constaté qu’une adaptation de 5 minutes à la lumière ambiante avant l’enregistrement FVEP peut augmenter la répétabilité intrasession en amplitude.

On pense que le signal PERG provient des RGC et que son amplitude pourrait donc être utilisée pour estimer la fonction des CGR13,20. Comparé à certains composants spéciaux de l’ERG flash, tels que la réponse seuil scotopique (STR) et la réponse négative photopique (PhNR), le PERG est plus sensible au dysfonctionnement du RGC13. Les limites potentielles du test PERG dans cette étude sont les suivantes. Tout d’abord, l’ISCEV recommande d’utiliser un stimulateur CRT (tube cathodique) classique pour l’enregistrement PERG afin de maintenir la luminance moyenne constante. Cependant, le stimulateur CRT classique est moins disponible que l’écran à cristaux liquides (LCD). Bien que l’écran lcd présente généralement des changements de luminance transitoires lors de l’inversion du motif, provoquant potentiellement un artefact de luminance17, il n’a pas contribué à l’amplitude du PERG chez la chèvre selon notre découverte précédente: l’amplitude du PERG à la fréquence spatiale de 12,6 cpd est généralement négligée par rapport à celles des fréquences spatiales inférieures9 . Une autre limitation est que nous n’avons pas corrigé l’erreur de réfraction avant le test PERG par souci de simplicité. Pour compenser cette limitation, l’amplitude PERG de base doit être enregistrée comme référence.

Notre étude précédente avait évalué et optimisé la variation intra- et inter session de VEP et PERG9. Nous avons constaté que par rapport à la xylazine, l’isoflurane entraînait des formes d’onde FVEP plus reproductibles mais plus variables chez les chèvres9. Par conséquent, nous avons utilisé l’isoflurane dans le test FVEP et la xylazine dans le test PERG et OCT chez les chèvres. De plus, par rapport à PERG, l’enregistrement VEP est potentiellement plus variable. En tant que tel, nous répétons régulièrement l’enregistrement VEP à chaque intensité lumineuse ou fréquence spatiale pour vérifier la variation intrasession. En revanche, les formes d’onde PERG sont beaucoup plus stables. Par conséquent, nous ne répétons généralement pas l’enregistrement PERG. Bien que l’enregistrement répété un jour différent sur le même sujet soit généralement recommandé, nous ne répétons pas régulièrement l’enregistrement VEP ou PERG sur le même sujet un jour différent par souci de simplicité et d’éthique animale. Néanmoins, les enregistrements FVEP et PERG sans répétition inter-session sont suffisamment sensibles pour détecter les lésions du nerf optique selon notre étude précédente9.

L’imagerie OCT rétinienne est une technique pratique, fiable et non invasive pour surveiller et quantifier longitudinalement les changements dynamiques dans la structure rétinienne. Par rapport au PERG et au VEP, l’imagerie OCT offre une bien meilleure répétabilité entre les sessions9. En outre, l’imagerie OCT peut capturer et quantifier toute la fibre du nerf optique en quelques minutes sans erreur d’échantillonnage, offrant une occasion beaucoup moins coûteuse et efficace d’examiner la structure rétinienne que l’analyse histologique traditionnelle. Cependant, la résolution spatiale de l’imagerie OCT actuelle est encore trop limitée pour indiquer un soma RGC individuel ou une fibre nerveuse optique. De plus, il convient de noter qu’un CCG plus épais mesuré par OCT ne signifie pas nécessairement une rétine interne plus intacte, car l’épaississement du CCG peut être causé par un œdème rétinien ou une hémorragie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par les subventions suivantes : National Key R&D Program of China (2021YFA1101200); Projet de recherche médicale de Wenzhou (Y20170188), Programme national clé de R&D de Chine (2016YFC1101200); Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81770926;81800842); Programme clé de R&D de la province du Zhejiang (2018C03G2090634); et le programme clé de R&D de l’hôpital ophtalmologique de Wenzhou (YNZD1201902). Le promoteur ou l’organisme de financement n’a joué aucun rôle dans la conception ou la conduite de cette recherche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

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References

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Neurosciences numéro 180
<em>In vivo</em> Méthodes d’évaluation de la fonction et de la structure des cellules ganglionnaires rétiniennes et du nerf optique chez les grands animaux
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Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

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