Neuroscience

인 비보 큰 동물의 망막 신경 세포 및 시신경 기능 및 구조를 평가하는 방법

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879

Qian Ye*¹, Zhonghao Yu*¹, Tian Xia*¹, Shengjian Lu¹, Jiaying Sun¹, Mengyun Li¹, Yu Xia¹, Si Zhang¹, Wencan Wu¹, Yikui Zhang¹

¹The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Summary

여기에서 우리는 시신경과 그 뉴런의 구조와 기능을 이해하기 위하여 염소와 rhesus 원숭이에서 생체 내 시험 (플래시 시각적 으로 불러일으킨 잠재력, 패턴 전기 전세노그램 및 광학 일관성 단층 촬영)에서 몇몇을 염판합니다.

Abstract

시신경은 망막 신경절 세포에서 축축절 신호를 수집하고 뇌에 시각적 신호를 전송합니다. 시신경 상해의 큰 동물 모형은 크기와 해부학에 있는 인간에 그들의 가까운 유사성 때문에 설치류 모형에서 임상 응용에 새로운 치료 전략을 번역하기 위해 필수적입니다. 여기서우리는 시각 유발 전위(VEP), 패턴 전백소(PERG) 및 광학 일관성 단층 촬영(OCT)을 포함하여 큰 동물에서 망막 신경절 세포(RGC) 및 시신경(ON)의 기능 및 구조를 평가하는 생체내 방법을 설명한다. 염소와 비 인간 영장류 모두이 연구에서 사용되었다. 생체 내 방법을 단계적으로 제시함으로써, 우리는 다른 실험실 중 실험 재현성을 높이고 시신경병증의 대형 동물 모델의 사용을 용이하게 할 수 있기를 바랍니다.

Introduction

망막 신경절 세포 (RGC)에서 축으로 구성된 시신경 (ON)은 망막에서 뇌로 시각적 신호를 전달합니다. 녹내장, 외상성 또는 허혈성 신경병증과 같은 질병은 종종 돌이킬 수없는 ON / RGC 변성과 파괴적인 시각 손실을 일으켰습니다. 현재 설치류 모델에서 ON 재생 및 RGC 보호에 많은 돌파구가 있지만^1,2,3,4,5,6, ON 질병의 대부분에 대한 임상 치료는 만족스럽지 못한 결과와 지난 반세기 동안 본질적으로 동일하게 유지^7,8 . 기본 연구와 임상 실습 사이의 격차를 메우기 위해 ON 질병의 큰 동물 모델을 사용하는 번역 연구는 설치류 모델보다 인간과의 해부학적 유사성 때문에 종종 필요하고 유익합니다.

염소와 rhesus 원숭이는 인간의 ON 질병을 모델링하기 위해 우리의 실험실에서 사용되는 두 개의 큰 동물 종입니다. 염소의 안구, ON 및 인접한 구조(궤도 및 비강, 두개골 기지 등)의 크기는 두개골 CT 스캔⁹을 기반으로 한 사람의 크기와 유사합니다. 따라서 염소 모델은 인간에서 사용하기 전에 치료 장치 또는 수술 절차를 평가하고 정제 할 수있는 기회를 제공합니다. 비인간 영장류 (NHP)로 rhesus 원숭이는 다른 종^10,11에 존재하지 않는 인간과 같은 독특한 시각 시스템을 가지고 있습니다. 또한, NHP에서 부상과 치료에 대한 병리학적 반응은 인간¹²에서와 훨씬 유사합니다.

ON 및 RGC의 구조와 기능을 세로적으로 평가하는 생체 내에서 는 큰 동물 연구에서 중요합니다. 패턴 전기 전세노그램(PERG)은 RGC 기능을 평가하는 데 사용되어 왔다. 플래시 비주얼 은 전위 (FVEP)는 시각 시스템에서 망막 제니큘로 피질 경로의 무결성을 반영합니다. 따라서, FVEP와 결합된 PERG는 ON 기능을 반영할 수 있다^9,13,14. 망막 광학 일관성 단층 촬영(OCT) 이미징은 망막 신경절 복합체(GCC)^9,15의 두께를 측정할 수 있는 높은 측두및 공간 해상도로 망막 구조를 보여줄 수 있다. 이 연구에서 전기 생리학적 검사의 경우, 이러한 매개 변수가 안구 혈류에 강력한 영향을 미치고 따라서 시각 시스템의 기능에 강력한 영향을 미치기 때문에 테스트 전에 활력 징후 (열속도, 위반 속도, 혈압) 및 산소 포화 수준 (SpO2)을 모니터링하는 것이 중요합니다. 그러나, 우리는 단순성을 위해 OCT 망막 화상 진찰을 수행할 때 생명 징후를 감시하지 않았습니다. 우리의 이전 연구에 따르면⁹, OCT 망막 이미징에 의해 측정 된 GCC 두께는 매우 안정적이다, 3 %에 가까운 변화의 세션 계수와. 염소와 rhesus 원숭이에서 생체 내 시험은 우리의 이전 연구에서 자세히 설명되었습니다⁹. 여기서 우리는 실험적 투명성과 재현성을 높이기 위해 이러한 방법을 제시합니다.

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Protocol

실험은 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 도착 지침 및 국립 보건 원 가이드에 따라 엄격하게 수행되었으며, 원저우 의과 대학 (WMU) 및 조인 연구소 (소주)의 기관 동물 관리 및 사용위원회가 승인 한 프로토콜을 준수했습니다. 체중19-23kg의 4개월에서 6개월까지 의 수컷 사넨 염소는 WMU 동물 시설에 보관되었습니다. 5-7kg의 무게로 5세에서 6세 사이의 수컷 레서스 원숭이는 조인 동물 시설에 보관되었습니다. 모든 동물은 식품 광고 리비툼과 12 h 빛 / 12 시간 어두운 주기에서 제어 온도 (21 ± 2 °C)와 에어컨 방에서 유지되었다.

1. 염소에서 플래시 비주얼이 잠재적 (FVEP)을 불러 일으켰습니다.

일반 마취
1. 전자 면도기로 호크 머리를 면도합니다.
2. 피부를 청소하기 위해 70 %의 알코올을 세 번 문지르면 피부를 준비한 다음 피하 정맥을 노출하십시오.
3. 말초 정맥 카테터를 정맥 내(0.9mm x 25mm)로 삽입한 다음 아트로핀(0.025 mg/kg) 및 프로포폴(5 mg/kg)을 주입합니다.
4. 염소를 6mm 기관관으로 삽관하여 인공 호흡보호구에 연결합니다.
5. 2 L/min의 일정한 유량으로 산소에 있는 3.5%의 이소플루란으로 마취를 유지하십시오.
  참고 : 염소는 몇 분 이내에 propofol에 의해 유도 된 마취에서 회복, 그래서 염소를 삽관하기 위해 빨리.
심폐 모니터링
1. 온도 센서를 혀 아래에 놓습니다.
2. 펄스 산소계를 귀의 근접 끝에 연결합니다.
3. 혈압 커프를 허벅지 바닥에 묶습니다.
4. 심전도 클립을 사지에 고정시하십시오.
  참고: 염소의 정상적인 심박수는 68-150 bpm입니다. 가스 마취의 사용으로 인해 염소의 심박수가 증가합니다. 따라서 검사 중 심박수는 170 ± 30 bpm입니다. 정상적인 조건하에서 염소의 수축기 혈압은 110-130 mmHg이고, 확장기 혈압은 50-60 mmHg입니다. 산소를 흡입하는 상태에서 염소의 혈액 산소 포화도는 항상 99 %로 유지 될 수 있습니다. 마취 하에 염소의 호흡 속도는 10 호흡 / 분인 인공 호흡기의 호흡 속도와 동기화됩니다. 온도는 코어 온도가 아닌 염소의 혀 아래에서 측정되었기 때문에 염소의 온도는 일반적으로 35 ± 2°C입니다.
두개골 나사 이식 및 전극 배치
1. 클리퍼로 머리를 면도합니다. 베타딘에 담근 면공과 70% 알코올을 세 번 문지르면 정면 뼈의 중앙에 있는 피부를 소독합니다.
2. 멸균 된 나사와 가위를 사용합니다.
  참고 : 살균을위한 모든 수술 기구 (121 °C, 20 분)를 자동 클락.
3. 5mm 피부 절개를 만들어 전두엽 뼈를 안과 가위로 노출한 다음 드라이버를 사용하여 전두엽 뼈의 중앙에 멸균 된 나사를 이식하십시오.
4. 모발을 면도하고 베타딘과 70% 알코올을 가진 두 개의 귀 사이에 중앙 후두골뼈의 피부를 소독하고, 하나는 다른 한 번, 세 번.
5. 5mm 피부 절개를 만들어 안과 가위로 후두 뼈를 노출한 다음 후두 뼈의 중앙에 멸균 된 나사를 이식하십시오.
  참고: 접지 바늘 전극은 전두엽 두개골 나사 아래에 피하로 삽입됩니다. 활성 및 기준 전극은 각각 후두 및 전두엽 나사에 연결되어 있으며, 악어 클립으로 전극 임피댄스¹⁶을 감소시한다.
동물 제제
1. 방광 천을 사용하여 눈을 가리고 눈가리개로 고정하여 한쪽 눈을 패치합니다.
2. 국소 마취 점안액 (프로파라카인 염산염 점안)을 양쪽 눈에 바립니다. 양측 학생들은 열대 지방 (5 %)과 페닐레프린 (5 %)과 마이드리아미드 점안액의 국소 투여에 의해 팽창된다.
3. 염소의 머리를 간즈펠트 자극대에 넣고 주변 광원을 어둡게 한다.
  참고 : 염소가 마취 하에 좋은 안구 고정을 유지할 수 있으므로 추가 안구 고정 수술 개입이 필요하지 않습니다.
4. 자극기와 염소의 머리를 검은 담요로 5분 동안 덮어 각색하십시오.
5. 눈꺼풀 스펙럼을 사용하여 불바 결막을 노출하십시오. 상부 링을 접어 서 눈꺼풀 위로 당기고, 윗쪽 링을 먼저 눈꺼풀의 결막 낭에 삽입한 다음 비슷한 방식으로 아래 눈꺼풀에 삽입합니다.
6. 임피던스 버튼을 눌러 전극 조직 접촉 임피던스와 임피던스의 값을 각 채널에 표시합니다.
7. 임피던스가 동일한 방에 있는 다른 전기 장치에서 전자기 간섭을 피하기 위해 각 전극에 대해 10kΩ 미만인지 확인합니다.
  참고: 10kΩ 이상이면 전극을 다시 연결하거나 교체합니다. 염소가 있는 전기 금속 수술용 침대가 연결되어 있으면 임피던스가 비정상적으로 높게 나타날 수 있습니다. 임피던드는 전기 간섭을 줄이기 위해 활성 및 기준 전극 사이에 1kΩ 미만으로 달라야 합니다¹⁷.
8. 진동 버튼을 눌러 조명 자극 없이 베이스라인 노이즈를 확인합니다.
  참고: 큰 기준 노이즈가 있는 경우 같은 방에 있는 다른 모든 전기 장치를 분리하고 휴대폰을 끕니다. 기준 문제가 지속되면 1.3.10 단계로 이동합니다. 일반적인 FVEP 파형이 유도될 수 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 FVEP 테스트의 일정을 다른 시간에 다시 예약합니다.
9. 오른쪽 상단 모서리의 흰색 배경 상자에 각각 0.025, 0.5 및 3.0 cd/^m2의 라이트 강도를 선택하여 FVEP 레코딩을 시작합니다. 그런 다음 검사 버튼을 누릅니다. 각 광 강도에서 FVEP 레코딩이 두 번 수행됩니다.
  참고: 두 파형이 분명히 다르게 나타나면 한 번 더 반복해야 합니다.
10. 적외선 카메라에 건조해 보이는 경우 인공 눈물 점안액으로 각막을 촉촉하게 합니다.
  참고: 녹화 전에 통합 적외선 카메라의 눈 위치를 모니터링하여 시각적 시선이 정확하고 동공이 완전히 노출되었는지 확인합니다(플래시 자극의 필드 크기는 90°입니다. 마취 염소의 눈 위치는 그에 따라 머리를 돌려 조정할 수 있습니다. 우리의 관찰에 따라, 시선 방황은 전신 마취⁹에서 염소에서 FVEP 녹음 (~10 분)동안 거의 발생하지 않습니다. 따라서 녹화하는 동안 시선을 일시 중지하고 다시 조정할 필요가 없습니다.
11. 반대측 눈을 위해 위의 단계를 반복합니다.
12. 이소플루란 공급을 중단하고 염소가 전신 마취에서 회복하는 데 도움이 인공 호흡기에 약간 조수 볼륨을 증가.
13. 전신 마취 후 염소를 겐타미신 (4 mg / kg, IM)과 세프티오푸르 나트륨 (세팔로스 포린, 2 mg / kg, IM)으로 치료하여 감염을 예방하십시오.
FVEP 측정 및 정량 분석
참고: 도 1A에 도시된 바와 같이 FVEP 파형의 첫 번째 양수 및 음수 피크는 P1 및 N1로 지정되고 두 번째 긍정 피크는 P2로 지정됩니다. P1, N1 및 P2의 일반적인 암시적 시간은 각각 약 40, 60 및 120 ms입니다. P1 및 P2 진폭은 각각 P1 및 P2 파형의 피크에 N1 파형의 쓰루에서 측정된다.
1. 단안경 손상의 경우 진폭과 암시적 시간의 인터라큘러 비교를 사용하여 세션 간 변동을 줄이고 감도¹⁷을 증가시면 됩니다.

2. rhesus 원숭이PVEP

참고: 패턴 VEP는 rhesus macaques9에서 유도될 수 있고 진폭 및 암시적 ^time17에서 플래시 VEP보다 더 안정적입니다. 따라서 PVEP는 비인간 영장류에서 망막-제니큘로-피질 경로의 무결성을 검출하는 데 사용되었다.

동물 제제
1. Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, 타일타민/졸라제팜)을 유도한 후 원숭이를 이소플루란(1.5%-2%)으로 마취한다.
2. 멸균 된 접지 전극을 귓불에 배치합니다. 소독 된 활성 및 기준 전극을 각각 전두엽 및 후두 뼈의 중간선을 따라 피하한다.
3. 눈꺼풀 스펙럼을 적용하여 불바 결막을 노출합니다.
4. 접착제 불투명 한 블랙 테이프를 사용 하 여 반대 눈을 패치.
PVEP 레코딩
1. 임피던스 버튼을 눌러 전극 조직 접촉 임피던스와 임피던스의 값을 각 채널에 표시합니다. Ω 10k 미만인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 전극을 다시 연결하거나 교체합니다.
2. 임피던스 테스트 창에서 임피던스의 값을 확인하고 임피던스가 활성 및 기준 전극 사이에 1kΩ 미만으로 다르도록 하여 전기 간섭¹⁷을 줄입니다.
3. 진동 버튼을 눌러 자극 없이 베이스라인 노이즈를 확인합니다.
  참고: 큰 기준 노이즈가 있는 경우 같은 방에 있는 다른 모든 전기 장치를 분리하고 휴대폰을 끕니다. 기준 문제가 지속되면 다른 날에 PVEP 테스트를 다시 수행합니다.
4. 패치되지 않은 눈의 PVEP 응답을 오른쪽 상단 모서리의 흰색 배경 상자에 각각 0.5 및 1.0 사이클/도의 광 강도를 선택한 다음 검사 버튼을 누릅니다.
  참고: 각 레코딩에 대해 평균 64개의 추적이 평균화되어 하나의 파형을 생성합니다. 각 주파수에 대해 PVEP 신호의 재현성을 확인하기 위해 최소 2개의 레코딩이 획득됩니다.
5. 반대측 눈에 대한 절차를 반복합니다.
6. 일단 완료되면, 원숭이를 깨우기 위해 이소플루란 공급을 중단하십시오.
7. 전신 마취 후, 감염을 방지하기 위해 겐타미신 (4 mg / kg IM) 및 세프티오푸르 나트륨 (2 mg / kg IM)로 원숭이를 치료하십시오.
PVEP 측정 및 정량 분석
1. 도 1B에 도시된 바와 같이, PVEP 파형의 첫 번째 음수 및 양성 피크는 N1 및 P1로 지정되었으며, 이는 일반적으로 약 50 및 90 ms에서 발생합니다. P1 진폭은 N1의 쓰루에서 P1의 피크까지 측정됩니다.
2. 단안경 손상의 경우 진폭과 암시적 시간의 인터라큘러 비교를 사용하여 세션 간 변동을 줄이고 감도¹⁷을 증가시면 됩니다.

3. 염소의 패턴 ERG (PERG)

참고: 이전 연구에서는 염소에서 PERG 신호의 인터로컨 크로스토크가 관찰되지 않았기 때문에 PERG 응답은 두 눈에서 동시에 기록될 수 있습니다⁹.

시험 준비
1. 자일라진(3 mg/kg, IM)을 사용하여 염소를 마취하고 시험 테이블에 놓습니다.
2. 염소의 혀 아래에 온도 센서를 놓습니다.
3. 맥박 소시미터를 염소 귀의 근해 끝에 연결합니다.
4. 혈압 커프를 허벅지에 묶습니다.
5. 이에 따라 사지에 심전도 클립을 고정합니다.
6. 전극 임피던스를 줄이려면 전두엽 뼈에 멸균 된 두개골 나사를 놓고 악어 클립으로 지상 전극에 연결하십시오.
7. 두 개의 멸균 된 바늘 참조 전극 피하 1 cm 양쪽에 측면 칸티 뒤에 배치.
8. 눈꺼풀 스펙럼을 사용하여 불바 결막을 노출하십시오.
9. 인공 눈물의 국소 적용 후 양측 각막의 중심에 두 개의 소독 ERG-Jet 기록 전극을 배치합니다.
10. 47.6cm x 26.8cm LED 모니터 2대를 시야 거리 50cm의 두 눈 앞에 놓습니다.
11. 각 모니터를 동측의 동공 평면과 평행하게 조정하고 모니터의 중심을 동공 평면에 정렬합니다.
12. 대비 반전 식 바둑판(시간적 주파수, 2.4Hz)이 모니터 모두에 표시되고 장비 설정에 의해 설정된 최대 종횡비 4:3이 있는지 확인합니다.
13. 흰색과 검은색 체커의 대비가 96%로 유지되고 평균 휘도가 200cd/^m2 (평방 미터당 칸델라)인지 확인하여 휘도 측정기에서 확인합니다.
  참고 : ISCEV에 따르면, 인간¹⁷에서 40-60 cd / ^m2의 평균 광광 휘도가 필요합니다. 마우스 모델을 이용한 또 다른 연구에서는, 패턴은 800 cd/^m2,18의 평균 휘도에 남아 있었다. 가장 좁은 차원에서 최소 15°의 필드 크기는 인간¹⁷의 표준 PERG 테스트에 필요합니다. 각막 표면의 중심이 아닌 경우 각막 전극의 위치를 조정합니다.
PERG 녹음
1. 주변 광채를 어둡게 하고 임피던스 버튼을 눌러 전극 조직 접촉 임피던스를 확인합니다. 임피던스 값은 각 채널에 표시됩니다.
2. 임피던스 테스트 창에서 임피던스 값을 확인하고 임피던스가 10kΩ 미만인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 전극을 다시 연결하거나 교체합니다.
3. 진동 버튼을 눌러 조명 자극 없이 베이스라인 노이즈를 확인합니다.
  참고: 깨지기 쉬운 ERG-Jet 기록 전극을 보호하기 위해 주의를 기울이세요. PERG의 기준선 잡음은 일반적으로 염소의 FVEP보다 작습니다.
4. 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 및 12.6 사이클/도연속의 공간 주파수에서 두 눈에서 동시에 PERG 레코딩을 시작합니다. 각 공간 주파수에 대해 64개의 추적이 평균으로 값값으로 판독을 생성합니다.
5. 마지막으로 모니터를 끄면 시각적 자극 없이 PERG를 음수 제어로 기록합니다.
  참고: PERG 신호는 일반적으로 안정적이며 반복이 필요하지 않습니다.
6. 앞 두개골 나사를 제거하고 자일라진 길항제인 Idzoxan (1.5 mg / kg)을 주입하여 염소를 깨워보십을 피하십시오.
7. 전신 마취 후 염소를 겐타미신 (4 mg / kg IM) 및 세프티오푸르 나트륨 (2 mg / kg IM)으로 치료하여 감염을 예방하십시오.
PERG 측정 및 정량 분석
1. 밴드패스 필터를 1~75Hz범위로 설정합니다. 3.0 cpd PERG의 경우 밴드패스 필터는 진폭에 영향을 주지 않고 트레이스를 부드럽게 하기 위해 1~50Hz로 설정됩니다.
2. 도 1C에 도시된 바와 같이 파형의 첫 번째 양성 및 음수 피크는 P1(일반적으로 약 25ms) 및 N1(일반적으로 약 55ms)으로 지정됩니다. PERG 진폭은 N1에서 P1로 측정됩니다.
3. 단안경 손상의 경우, 우리는 진폭과 암시적 시간의 인터큘러 비교를 사용하여 세션 간 변화를 줄이고 감도¹⁷을 감소시합니다.

4. 렌지 인 레서스 마카크

참고: 레서스 마카크에 PERG 신호의 인터로큘러 크로스토크가 있는지는 불분명하므로 두 눈의 PERG 응답이 별도로 기록됩니다.

시험 준비
1. Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, 틸타민/졸라제팜) 및 기관 삽관 후 이소플루란(1.5%-2%)으로 원숭이를 마취시킵니다.
2. 멸균 된 지상 전극을 정면 뼈에 피하로 놓습니다. 멸균 된 바늘 참조 전극을 피하, 같은 쪽에 측면 캔투스 뒤에 1cm를 삽입하십시오.
3. 인공 눈물의 국소 적용 후 중앙 각막에 소독 된 ERG-Jet 기록 전극을 놓습니다.
  참고: 각막 표면의 중심이 아닌 경우 각막 전극의 위치를 조정합니다.
4. 접착제 불투명 한 검정 테이프를 사용 하 여 한 눈을 패치.
5. 50cm의 시야 거리에 모니터(47.6 x 26.8cm)를 놓습니다.
6. 모니터가 동공 평면과 평행하도록 조정되었는지 확인합니다. 모니터의 중심을 동공 평면에 정렬합니다.
7. 흑백 바둑판이 2.4Hz의 주파수에서 반전되고 가로세로 비율이 장비 설정에 의해 설정된 4:3인지 확인합니다.
8. 흰색과 검은색 체커 사이의 대비가 96%이고 평균 휘도가 200cd/^m2로 유지되어 휘도 측정기를 통해 확인됩니다.
PERG 녹음
1. 주변 광을 어둡게하고 전극 조직 접촉 임피던스를 확인합니다.
2. 임피던스가 10kΩ 미만인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 전극을 다시 연결하거나 교체합니다.
3. 빛 자극 없이 베이스라인 노이즈를 확인합니다.
4. 한쪽 눈을 패치하고 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 및 12.6 사이클/도 연속으로 공간 주파수에서 다른 눈에서 PERG 기록을 시작합니다.
5. 반대쪽 눈을 위해 4.2.1-4.2.4 단계를 반복합니다.
6. 원숭이를 깨우기 위해 이소플루란 공급을 중단하십시오.
7. 전신 마취 후, 감염을 방지하기 위해 겐타미신 (4mg / kg IM) 및 세프티오푸르 나트륨 (2 mg / kg IM)로 원숭이를 치료하십시오.
PERG 측정 및 정량 분석
1. 도 1D에 도시된 바와 같이 파형의 첫 번째 양수 및 음수 피크는 P1(일반적으로 약 40ms) 및 N1(일반적으로 약 85ms)으로 지정됩니다. PERG 진폭은 N1에서 P1로 측정됩니다.
2. 단안경 손상의 경우, 우리는 진폭과 암시적 시간의 인터큘러 비교를 사용하여 세션 간 변화를 줄이고 감도¹⁷을 증가시면 됩니다.

5. 염소에서 10 월

동물 제제
1. 자일라진 (3mg/ kg, IM)을 사용하여 염소를 마취한 다음 삽관합니다.
2. 열대 지방 (5%)과 페닐레프린 (5 %)으로 내드리아성 점안의 국소 투여에 의해 동공을 팽창시킵니다.
3. 눈꺼풀 스펙럼을 사용하여 동공을 완전히 노출시하십시오.
4. 염소 머리를 턱 받침대 위에 놓습니다.
  참고: 가스 마취가 수행되지는 않지만 염소를 정기적으로 삽관하여 공기가 턱 받침대로 압축되는 것을 방지합니다.
OCT 이미징
참고: 망막 OCT 화상 진찰은 이 연구 결과에 있는 870 nm의 파장에서 OCT 시스템을 사용하여 수행됩니다. OCT 스캐너의 광학 축 해상도는 12 μm입니다. 원형 스캔 모드는 고해상도 모드로 시신경 헤드(ONH)를 스캔하는 데 사용됩니다. 100 프레임은 이미지 품질을 최적화하기 위해 평균입니다. 자세한 교육 가이드는 온라인으로 확인할 수 있습니다( 자료 표 참조).
1. 초기 10월 스캔(기준 시험)
  1. 시작 버튼을 클릭하여 감지 인터페이스를 입력합니다. 기기가 로딩을 완료할 때까지 기다린 다음 노란색 시작 버튼을 눌러 이미징을 시작합니다.
  2. 염소를 적외선 카메라와 정렬하여 헤드 위치를 수정하여 공초점 스캐닝 레이저 안과(cSLO) 이미지에서 ONH를 중심으로 합니다.
  3. 조이스틱을 조정하여 전체 적외선 이미지를 고르게 비추어 이미지 품질을 향상시킵니다.
  4. 직립 망막 OCT 이미지가 똑바로 화면에 표시 될 때까지 조이스틱을 앞으로 이동합니다.
  5. 조이스틱을 수정하여 균일하게 조밀하고 수평으로 배치된 망막 OCT 이미지를 갖습니다.
  6. 조이스틱의 버튼을 눌러 이미지를 자동으로 잡고 조이스틱을 잡고 이미지 수집이 완료될 때까지 라이브 이미지 화면에서 이미지 품질을 유지합니다. 그런 다음 , 획득을 누릅니다.
  7. 자일라진 길항제인 Idzoxan (1.5 mg/kg)을 주입하여 염소를 일깨우는다.
    참고: 기준 시험에서 ONH를 중심으로 기준 검사 및 후속 스캔을 경험에 따라 정렬하는 데 도움이 됩니다.
2. 후속 10월 스캐닝
  1. 고품질 초기 OCT 이미지를 선택합니다. 오른쪽 단추를 클릭하고 참조 설정을 선택합니다.
  2. 위에서 언급 한 대로 OCT 이미징을 시작하십시오.
  3. 후속 버튼을 눌러 현재 스캔을 참조 검사에 자동으로 일치시킬 수 있습니다.
  4. 일치하면(원형 스캔 링이 녹색으로 바뀌면) 조이스틱의 버튼을 눌러 자동 실시간 추적을 활성화합니다.
  5. 자일라진 길항제인 Idzoxan (1.5 mg/kg)을 주입하여 염소를 일깨우는다.
    참고: 일치 하는 과정을 용이 하 게 하려면(1) 에 따라 머리를 돌려 라이브 창에서 ONH를 이동하거나 (2) 현재 cSLO 이미지가 기준선 이미지와 더 유사하게 보이게 하기 위해 머리를 기울여 라이브 창에서 ONH를 회전한다. 이 현관 안구 반사는 자일라진 마취¹⁹에서 잘 작동합니다.
10월 측정
1. 측정 버튼을 클릭하여 측정 창을 입력합니다.
2. 지우개 도구를 선택하고 프로그램에 의해 자동으로 레이블이 지정되는 RNFL 라인을 지웁울 수 있습니다.
3. 선 드로잉 도구를 선택하여 IPL과 INL 사이의 경계를 수동으로 간략하게 설명합니다(그림 2).
  참고: 6개의 주변 영역(T, TS, TI, N, NS, NI) 및 ONH(G) 주위의 평균 GCC 두께에서 GCC 두께를 화면에서 읽을 수 있다(그림 2). 학생 시험, 편도 ANOVA 또는 양방향 ANOVA를 사용하여 정상적인 분포의 경우 OCT 데이터를 정량화할 수 있습니다.

6. 10 월 에 rhesus 원숭이

염소의 경우와 동일한 장비와 절차를 사용하여 rhesus 원숭이에서 망막 OCT 이미징을 수행합니다.

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Representative Results

그림 1A 는 염소에서 FVEP의 대표적인 결과를 보여줍니다. 동일한 플래시 강도의 파형은 상대적인 유사성을 가지고 있지만 파형을 두 번 검사하는 것이 좋습니다. 전자 기기에 의해 생성된 전자파는 수집된 전기 신호를 방해하여 높은 기준 소음과 파형의 반복성이 떨어집니다. 따라서, 이러한 간섭을 피하기 위해 전기 생리학적 검사 중에 주변 환경에 연결된 중복 전자 장치가 없는지 확인하는 것이 좋습니다, 실험 결과의 안정성과 반복성을 결정하기 위해 적어도 두 개의 측정을 반복하는 것이 좋습니다. 두 눈을 패치 할 때, 파형은 두 눈에 완전히 평평하며, 이는 파형이 확실히 우리의 플래시 자극에서 생성된다는 것을 보여줍니다. 그림 1B 는 염소에서 PERG의 대표적인 결과를 보여줍니다. 안정성과 높은 신호로 인해 각 공간 주파수에서 단 한 번만 측정하여 신뢰할 수 있는 파형을 얻습니다. 공간 주파수가 증가함에 따라 바둑판의 크기는 점차 염소의 눈 인식을 초과합니다. 따라서 12.7 cpd에서 PVEP 파형이 많이 떨어졌다는 것을 알 수 있습니다. FVEP와 유사하게 화면을 닫으면 파형이 사라집니다. 도 1C 는 계딴 원숭이에서 PVEP의 대표적인 결과를 나타낸다. 각 공간 주파수에서 측정을 두 번 반복합니다. 공간 주파수가 증가함에 따라 진폭이 감소합니다. 이는 공간 주파수가 눈의 지각을 초과한다는 사실 때문입니다. 도 1D 는 레서스 마카크에서 PERG의 대표적인 결과를 나타낸다. 진폭이 공간 주파수로 감소하는 이유는 위에서 설명한 것과 동일합니다. 이러한 데이터를 분석할 때 피크와 쓰루 사이의 진폭 또는 피크 또는 쓰루의 대기 시간을 통계로 분석하도록 선택할 수 있습니다.

그림 2 는 염소에서 OCT의 대표적인 결과를 보여줍니다. 가장 왼쪽 이미지는 적외선 카메라로 촬영한 fundus 사진을 보여줍니다. 오른쪽에 단단히 망막의 토모그램, ONH 주위 망막의 전체 두께와 각 층의 두께를 보여주는. 그림과 같이, 우리는 염소가 원숭이보다 더 큰 망막 혈관을 가지고 있음을 명확하게 알 수 있습니다. 맨 오른쪽에 있는 녹색 디스크는 ONH 주위의 GCC 두께의 정량적 분석입니다. G는 일반을 의미, T는 측측을 의미, N은 비강 측을 의미, S는 우수를 의미하고, 나는 열등한 의미. 검정 글꼴은 마이크로미터에서 GCC 두께 측정 값을 나타내며, 녹색은 이 실험에 대한 참조가 아니라 인간에 대한 임상 기준 측정 값이다.

그림 1: 염소와 계골 원숭이의 대표적인 전기 생리학적 파형. (A) 대표 FVEP는 동일한 마취 세션 내에서 개별 염소로부터 다른 빛 강도에 파형. (B,D) 대표 PERG 파형은 동일한 마취 세션 내에서 개별 염소(B) 또는 rhesus 원숭이(D)로부터 서로 다른 공간 주파수에서 파형을 형성한다. (C) 동일한 마취 세션 내의 개별 rhesus 마카크로부터 다른 공간 주파수에서 대표 PVEP 파형. 각 파형의 일반적인 암시적 시간은 프로토콜 섹션에 언급됩니다. n = 각 테스트에 대해 1 개의 피사체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 10월 결과. 시신경 헤드(왼쪽 패널) 주위의 대표적인 망막 OCT 영상(왼쪽 패널)과 염소(A)와 레서스 마카크(B)의 상이한 주변 지역에서 GCC의 두께(오른쪽 패널). n = 각 테스트에 대해 1 개의 피사체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 연구에서는 염소와 rhesus 원숭이에 VEP, PERG 및 OCT의 프로토콜을 제시합니다. 이러한 생체 내 방법은 녹내장, 허혈성 또는 외상성 시신경병증 및 광학 신경염^과 같은 다양한 시신경병증의 대형 동물 모델에 적용될 수 있다.

PVEP는 ^FVEP17보다 더 안정적이고 민감합니다. 그러나 염소⁹에서는 유도될 수 없습니다. 이와 같이, FVEP는 염소에서 수행되고 PVEP는 망막 -geniculo-피질 통로의 무결성을 평가하기 위해 우리의 실험실에서 rhesus 마카크에서 수행됩니다. PVEP가 아닌 PERG가 염소에서 유도될 수 있다는 관측의 근본적인 메커니즘은 우리의 지식에 따라 여전히 불분명합니다. 염소로부터 의 시신경 기능과 구조가 인간과 다를 수 있습니다.

FVEP의 진폭은 푸필러 크기와 주변 광에 의해 영향을받을 수 있기 때문에, 우리는 동공을 팽창하고 FVEP 녹음 하는 동안 염소의 머리 위에 검은 담요를 배치. 그것은 학생 팽창 클리닉에서 FVEP에 필요한 필요가 없습니다 주목해야한다¹⁷. 마찬가지로, 클리닉에서 FVEP 녹음에 어두운 적응이 필요하지 는 않지만 FVEP 녹음 전에 주변 광에 5 분 적응하면 진폭의 세션 반복성이 증가 할 수 있음을 발견했습니다.

PERG 신호는 RGC에서 유래한 것으로 생각되므로 진폭을 사용하여 RGCs13,20의 기능을 추정할 수 있습니다. scotopic 임계값 응답(STR) 및 광음성 반응(PhNR)과 같은 일부 특수 플래시 ERG 구성 요소에 비해 PERG는 RGC 기능 장애¹³에 더 민감합니다. 이 연구에서 PERG 테스트의 잠재적인 제한은 다음과 같습니다. 첫째, ISCEV는 PERG 레코딩을 위한 클래식 CRT(음극선 튜브) 자극기를 사용하여 평균 휘도를 일정하게 유지하는 것이 좋습니다. 그러나, 고전적인 CRT 자극기는 액정 디스플레이 (LCD)보다 적게 사용할 수 있습니다. LCD의 화면은 일반적으로 패턴 반전 동안 일시적인 휘도 변화를 제시, 잠재적으로 휘도 아티팩트^{를 일으키는 17}, 그것은 우리의 이전 발견에 따라 염소PERG의 진폭에 기여하지 않았다 : 12.6 cpd의 공간 주파수에서 PERG의 진폭은 일반적으로 낮은 공간 주파수에 비해 무시할 수 있습니다⁹⁹ . 또 다른 제한 사항은 단순성을 위해 PERG 테스트 전에 굴절 오류를 수정하지 않았다는 것입니다. 이러한 제한을 만회하려면 기준선 PERG 진폭을 참조로 기록해야 합니다.

우리의 이전 연구는 VEP와 ^PERG9의 세션 내 및 인터 세션 변화를 평가하고 최적화했습니다. 우리는 자일라진과 비교하여, 이소플루란이 더 반복 가능한 FVEP 그러나 염소9에 있는 더 많은 변수 PERG 파형을 초래했다는 것을 ^것을을 발견했습니다. 따라서, 우리는 염소에서 PERG 및 OCT 테스트에서 FVEP 테스트 및 자일라진에서 이소플루란을 사용했습니다. 또한 PERG와 비교하여 VEP 레코딩은 잠재적으로 더 가변적입니다. 따라서 각 광 강도 또는 공간 주파수에서 VEP 레코딩을 정기적으로 반복하여 세션 내 변화를 확인합니다. 대조적으로, PERG 파형은 훨씬 더 안정적입니다. 따라서 일반적으로 PERG 레코딩을 반복하지 않습니다. 같은 주제에 다른 날에 반복 된 녹음은 일반적으로 권장하지만, 우리는 정기적으로 단순과 동물 윤리를 위해 다른 날에 같은 주제에 VEP 또는 PERG 기록을 반복하지 않습니다. 그럼에도 불구 하 고, FVEP와 PERG 반복 없이 기록 은 우리의 이전 연구에 따라 시 신경 부상을 감지 하기에 충분히 민감한 ⁹.

망막 OCT 화상 진찰은 망막 구조의 동적 변화를 세로로 모니터링하고 정량화하는 편리하고 신뢰할 수 있으며 비침습적 기술입니다. PERG 및 VEP에 비해 OCT 이미징은 세션 간 반복성이 훨씬 향상됩니다⁹. 또한 OCT 이미징은 샘플링 오류 없이 몇 분 내에 모든 시신경 섬유를 포착하고 정량화할 수 있어 기존의 조직학적 분석보다 망막 구조를 검사할 수 있는 훨씬 저렴하고 효과적인 기회를 제공합니다. 그러나, 현재 OCT 화상 진찰의 공간 해결책은 아직도 개별 적인 RGC 소마 또는 시신경 섬유를 말하기 위하여 너무 제한됩니다. 또한, OCT에 의해 측정된 두꺼운 GCC가 반드시 GCC 가두화가 망막 부종 또는 출혈에 기인할 수 있기 때문에 더 온전한 내부 망막을 의미하지 않는다는 것을 주의해야 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: 중국의 국가 키 R&D 프로그램 (2021YFA10101200); 원저우 의학 연구 프로젝트 (Y20170188), 중국의 국가 키 R&D 프로그램 (2016YFC1101200); 중국 국립 자연 과학 재단 (81770926;81800842); 저장성 주요 R&D 프로그램 (2018C03G2090634); 원저우안과 병원(YNZD1201902)의 주요 R&D 프로그램. 스폰서 또는 자금 조달 조직은 이 연구의 설계 또는 수행에 아무런 역할을 하지 않았습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
47.6 x 26.8 cm monitors	DELL Inc.	E2216HV	The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube	Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd	PVC 6.0	ensure the airway
alligator clip
atropine	Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd.		reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	2300 La Chaux-De-Fonds	ERG recording
eye speculum	Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd	ZYD020	open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system	Heidelberg Engineering		OCT system
Imaging			(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22	isoflurane anesthesia
male Saanen goats	Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China)		The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	U51-426-G-D	use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously	BD shanghai Medical Device Co., Ltd	383019	intravenous access for atropine and propofol
propofol	Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd.		induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device	Gotec Co., Ltd	GT-2008V-III	use for FVEP & PERG
xylazine	Huamu Animal Health Products Co., Ltd.		xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50	Virbac		induce Isoflurane anesthesia in monkey

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References

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Neuroscience

인 비보 큰 동물의 망막 신경 세포 및 시신경 기능 및 구조를 평가하는 방법

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Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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