Summary
Hier analyseren we verschillende in vivo tests (flash visual evoked potential, patroonelektroretinogram en optische coherentietomografie) bij geiten- en resusaap om de structuur en functie van de oogzenuw en zijn neuronen te begrijpen.
Abstract
De oogzenuw verzamelt axonensignalen van de retinale ganglioncellen en stuurt visueel signaal naar de hersenen. Grote diermodellen van oogzenuwletsel zijn essentieel voor het vertalen van nieuwe therapeutische strategieën van knaagdiermodellen naar klinische toepassing vanwege hun nauwere overeenkomsten met mensen in grootte en anatomie. Hier beschrijven we enkele in vivo methoden om de functie en structuur van de retinale ganglioncellen (RGC's) en oogzenuw (ON) bij grote dieren te evalueren, waaronder visueel opgeroepen potentieel (VEP), patroonelektroretinogram (PERG) en optische coherentietomografie (OCT). Zowel geiten- als niet-menselijke primaten werden in deze studie gebruikt. Door deze in vivo methoden stap voor stap te presenteren, hopen we de experimentele reproduceerbaarheid tussen verschillende laboratoria te vergroten en het gebruik van grote diermodellen van optische neuropathieën te vergemakkelijken.
Introduction
De oogzenuw (ON), die bestaat uit axonen van de retinale ganglioncellen (RGC), zendt een visueel signaal van het netvlies naar de hersenen. ON-ziekten, zoals glaucoom, traumatische of ischemische optische neuropathie, veroorzaakten vaak onomkeerbare ON / RGC-degeneratie en verwoestend gezichtsverlies. Hoewel er momenteel veel doorbraken zijn in ON-regeneratie en RGC-bescherming in knaagdiermodellen1,2,3,4,5,6, bleven de klinische behandelingen voor de meeste ON-ziekten de afgelopen halve eeuw in wezen hetzelfde met een onbevredigend resultaat7,8 . Om de kloof tussen fundamenteel onderzoek en klinische praktijk te dichten, zijn translationele studies met behulp van grote diermodellen van ON-ziekten vaak noodzakelijk en nuttig vanwege hun nauwere anatomische gelijkenis met mensen dan knaagdiermodellen.
Geiten- en resusapen zijn twee grote diersoorten die in ons laboratorium worden gebruikt om de ON-ziekte van de mens te modelleren. De grootte van de oogbol van een geit, ON, en de aangrenzende structuur (orbitale en nasale holte, schedelbasis, enz.) is vergelijkbaar met die van een mens op basis van schedel CT-scan9. Als zodanig biedt het geitenmodel de mogelijkheid om therapeutische apparaten of chirurgische procedures te evalueren en te verfijnen voorafgaand aan gebruik bij mensen. De resusaap heeft als niet-menselijke primaat (NHP) een mensachtig uniek visueel systeem dat bij andere soorten niet bestaat10,11. Bovendien zijn pathofysiologische reacties op verwondingen en behandelingen bij NHP vergelijkbaar met die bij mensen12.
In vivo tests om de structuur en functie van de ON en RGC longitudinaal te beoordelen zijn belangrijk in grote dierstudies. Patroon elektroretinogram (PERG) is gebruikt om de RGC-functie te evalueren. Flash visual evoked potential (FVEP) weerspiegelt de integriteit van retino-geniculo-corticale route in het visuele systeem. Zo kan PERG in combinatie met FVEP de AAN-functie weerspiegelen9,13,14 . De beeldvorming van retinale optische coherentietomografie (OCT) kan de retinale structuur met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie laten zien, waardoor de dikte van het retinale ganglioncomplex (GCC) kan worden gemeten 9,15. Voor elektrofysiologische onderzoeken in deze studie zijn het monitoren van vitale functies (warmtesnelheid, breuksnelheid, bloeddruk) en het niveau van zuurstofverzadiging (SpO2) vóór het testen cruciaal, omdat deze parameters een krachtige invloed hebben op de oculaire bloedstroom en dus de functie van het visuele systeem. We hebben echter niet de vitale functies gecontroleerd bij het uitvoeren van OCT retinale beeldvorming omwille van de eenvoud. Volgens onze eerdere studie9 is de GCC-dikte gemeten door OCT retinale beeldvorming vrij stabiel, met een variatiecoëfficiënt tussen sessies van bijna 3%. Deze in vivo tests bij geiten en resusapen zijn in detail beschreven in onze eerdere studie9. Hier presenteren we deze methoden om de experimentele transparantie en reproduceerbaarheid te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten werden uitgevoerd strikt in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen en de National Institutes of Health-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en houden zich aan de protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee in Wenzhou Medical University (WMU) en Joinn Laboratory (Suzhou). De mannelijke Saanen geiten, in de leeftijd van 4 tot 6 maanden met een gewicht van 19-23 kg, werden gehuisvest in de WMU-dierenfaciliteit. De mannelijke resusapen, van 5 tot 6 jaar oud met een gewicht van 5-7 kg, werden gehuisvest in de Joinn-dierenfaciliteit. Alle dieren werden gehouden in een ruimte met airconditioning en gecontroleerde temperatuur (21 ± 2 °C) onder een 12 uur licht / 12 uur donkere cyclus met voedsel ad libitum.
1. Flash visual evoked potential (FVEP) bij geit
- Algemene verdoving
- Scheer het spronggewricht haar met een elektronisch scheermes.
- Bereid de huid voor door drie keer met 70% alcohol te wrijven om de huid te reinigen en vervolgens de onderhuidse ader bloot te leggen.
- Breng intraveneus een perifere veneuze katheter in (0,9 mm x 25 mm) en injecteer vervolgens atropine (0,025 mg/kg) en propofol (5 mg/kg).
- Intubeer de geit met een tracheale buis van 6 mm en sluit deze aan op een kunstmatig gasmasker.
- Handhaaf anesthesie met 3,5% isofluraan in zuurstof bij een constante stroomsnelheid van 2 l / min.
OPMERKING: De geit herstelt binnen enkele minuten van de anesthesie veroorzaakt door propofol, dus wees snel om de geit te intuberen.
- Cardiopulmonale monitoring
- Plaats de temperatuursensor onder de tong.
- Sluit de pulsoximeter aan op het proximale uiteinde van het oor.
- Bind de bloeddrukmanchet aan de basis van de dij.
- Klem de ECG-clips dienovereenkomstig op de ledematen.
OPMERKING: De normale hartslag van geiten is 68-150 bpm. Door het gebruik van gasanesthesie zal de hartslag van geiten toenemen. Daarom is onze hartslag tijdens inspectie 170 ± 30 bpm. De systolische bloeddruk van geiten onder normale omstandigheden is 110-130 mmHg en de diastolische bloeddruk is 50-60 mmHg. In de toestand van het inademen van zuurstof kan de zuurstofverzadiging van het bloed van de geit altijd op 99% worden gehouden. De ademhalingsfrequentie van geiten onder narcose is gesynchroniseerd met die van de beademingsmachine, die 10 ademhalingen / min is. Omdat de temperatuur werd gemeten van onder de tong van de geit, niet de kerntemperatuur, is de temperatuur van de geit over het algemeen 35 ± 2 °C.
- Schedelschroeven implantatie en plaatsing van elektroden
- Scheer het haar met een tondeuse. Desinfecteer de huid op het midden van het voorhoofdsbeen door drie keer te wrijven met een watje gedrenkt in betadine en 70% alcohol.
- Gebruik gesteriliseerde schroeven en scharen.
OPMERKING: Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voor sterilisatie (121 °C, 20 min). - Maak een huidincisie van 5 mm om het frontale bot bloot te leggen met een oogheelkundige schaar en implanteer vervolgens een gesteriliseerde schroef in het midden van het frontale bot met behulp van een schroevendraaier.
- Scheer het haar en desinfecteer de huid op het centrale achterhoofdsbeen tussen twee oren met betadine en 70% alcohol, de ene gevolgd door de andere, drie keer.
- Maak een huidincisie van 5 mm om het achterhoofdsbeen bloot te leggen met een oogheelkundige schaar en implanteer vervolgens een gesteriliseerde schroef in het midden van het achterhoofdsbeen.
OPMERKING: De geslepen naaldelektrode wordt subcutaan onder de frontale schedelschroef ingebracht. De actieve en referentie-elektroden zijn verbonden met respectievelijk de occipitale en frontale schroeven met alligatorclips om de elektrode-impedantie te verminderen16.
- Dierbereiding
- Gebruik een lichtdichte doek om het oog te bedekken en bevestig met de blinddoek om één oog te patchen.
- Breng topische verdovingsoogdruppels (proparacaïnehydrochloride oogdruppels) aan op beide ogen. Bilaterale pupillen worden verwijd door topische toediening van mydriatische oogdruppels met tropicamide (5%) en fenylefrine (5%).
- Plaats de kop van de geit in de Ganzfeld-stimulator en dim het omgevingslicht.
OPMERKING: Het bleek dat geiten een goede oogbolfixatie onder anesthesie kunnen behouden, dus er is geen extra oogbolfixatie-operatie-interventie nodig. - Bedek de stimulator en de kop van de geit met een zwarte deken gedurende 5 minuten voor aanpassing.
- Gebruik ooglidspeculum om het bulbaire bindvlies bloot te leggen. Vouw de bovenste ring, trek het bovenste ooglid omhoog en steek de bovenste ring eerst in de conjunctivale zak van het bovenste ooglid en vervolgens op een vergelijkbare manier in het onderste ooglid.
- Druk op de impedantieknop om de impedantie van het elektrodeweefselcontact te controleren en de waarden van de impedantie worden in elk kanaal weergegeven.
- Zorg ervoor dat de impedantie lager is dan 10 kΩ voor elke elektrode om elektromagnetische interferentie van andere elektrische apparaten in dezelfde ruimte te voorkomen.
OPMERKING: Als deze hoger is dan 10 kΩ, sluit u de elektrode opnieuw aan of vervangt u deze. De impedantie kan abnormaal hoog lijken als het elektrische metalen operatiebed, waar de geit ligt, is aangesloten. De impedantie moet minder dan 1 kΩ verschillen tussen de actieve en referentie-elektroden om elektrische interferentie te verminderen17. - Druk op de oscillograafknop om de basislijnruis zonder lichtstimulatie te controleren.
OPMERKING: Als er een groot basisgeluid is, koppelt u alle andere elektrische apparaten in dezelfde kamer los en schakelt u mobiele telefoons uit. Als het basislijnprobleem zich blijft voordoen, gaat u naar stap 1.3.10. om te controleren of een typische FVEP-golfvorm kan worden opgewekt. Zo niet, plan de FVEP-test dan op een ander moment opnieuw. - Start de FVEP-opname door de lichtintensiteit van respectievelijk 0,025, 0,5 en 3,0 cd·s/m2 te kiezen in het witte achtergrondvak in de rechterbovenhoek. Druk vervolgens op de knop Onderzoeken . Merk op dat FVEP-opname bij elke lichtintensiteit twee keer wordt uitgevoerd.
OPMERKING: Als de twee golfvormen duidelijk verschillend lijken, is nog een herhaling nodig. - Bevochtig het hoornvlies met kunstmatige traandruppels, als het droog lijkt op de infraroodcamera.
OPMERKING: Controleer de oogpositie van de ingebouwde infraroodcamera voordat u opneemt om ervoor te zorgen dat de visuele blik correct is en de pupil volledig wordt belicht (zodat de veldgrootte van een flitsprikkel 90 ° is. De oogpositie van een verdoofde geit kan worden aangepast door zijn hoofd dienovereenkomstig te draaien. Op basis van onze observatie komt het ronddwalen van de blik zelden voor tijdens FVEP-opname (~ 10 min) bij geiten onder algemene anesthesie9. Het is dus niet nodig om de blik te pauzeren en opnieuw aan te passen tijdens het opnemen. - Herhaal de bovenstaande stappen voor het contralaterale oog.
- Stop met de isofluraantoevoer en verhoog het getijdenvolume iets op de beademingsmachine om de geit te helpen herstellen van algemene anesthesie.
- Behandel de geit na algemene anesthesie met gentamicine (4 mg / kg, IM) en ceftiofurnatrium (een cefalosporine, 2 mg / kg, IM) om infectie te voorkomen.
- FVEP-meting en kwantitatieve analyse
OPMERKING: Zoals weergegeven in figuur 1A, worden de eerste positieve en negatieve pieken in de FVEP-golfvorm aangeduid als P1 en N1 en de tweede positieve piek als P2. De typische impliciete tijd van P1, N1 en P2 ligt respectievelijk rond de 40, 60 en 120 ms. P1- en P2-amplitudes worden gemeten vanaf de trog van N1-golfvorm tot de pieken van respectievelijk P1- en P2-golfvormen.- Gebruik in geval van monoculair letsel interoculaire vergelijking van amplitude en impliciete tijd om intersessievariatie te verminderen en de gevoeligheid te verhogen17.
2. PVEP bij resusaap
OPMERKING: Patroon-VEPs kunnen worden opgewekt in resusapen9 en zijn stabieler dan Flash VEP in amplitude en impliciete tijd17. Daarom werd PVEP gebruikt om de integriteit van de retino-geniculo-corticale route bij niet-menselijke primaten te detecteren.
- Dierbereiding
- Anesthetiseer de aap met isofluraan (1,5%-2%) na inductie met Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamine/zolazepam).
- Plaats de gesteriliseerde grondelektrode bij de oorlel. Breng de gesteriliseerde actieve en referentie-elektroden subcutaan in langs de middellijn bij respectievelijk het frontale en occipitale bot.
- Breng ooglidspeculum aan om het bulbaire bindvlies bloot te leggen.
- Gebruik zelfklevende ondoorzichtige zwarte tape om het contralaterale oog te patchen.
- PVEP-opname
- Druk op de impedantieknop om de elektrode-weefselcontactimpedantie te controleren en de waarden van de impedantie worden in elk kanaal weergegeven; zorg ervoor dat het minder dan 10k Ω is. Zo niet, sluit de elektrode dan opnieuw aan of vervang deze.
- Controleer de impedantiewaarden in het impedantietestvenster en zorg ervoor dat de impedantie minder dan 1 kΩ verschilt tussen de actieve en referentie-elektroden om elektrische interferentie te verminderen17.
- Druk op de oscillograafknop om de basislijnruis zonder stimulatie te controleren.
OPMERKING: Als er een groot basisgeluid is, koppelt u alle andere elektrische apparaten in dezelfde kamer los en schakelt u de mobiele telefoons uit. Als het basislijnprobleem aanhoudt, voert u de PVEP-test op een andere dag opnieuw uit. - Registreer PVEP-reacties van het ongepatchte oog door de lichtintensiteit van respectievelijk 0,5 en 1,0 cyclus/graad te kiezen in het witte achtergrondvak in de rechterbovenhoek en druk vervolgens op de knop Onderzoek .
OPMERKING: Voor elke opname worden 64 sporen gemiddeld om één golfvorm op te leveren. Voor elke frequentie worden minimaal twee opnames gemaakt om de reproduceerbaarheid van PVEP-signalen te verifiëren. - Herhaal de procedure voor het contralaterale oog.
- Als je klaar bent, stop dan met de isofluraantoevoer om de aap wakker te maken.
- Behandel de aap na algemene anesthesie met gentamicine (4 mg/kg IM) en ceftiofurnatrium (2 mg/kg IM) om infectie te voorkomen.
- PVEP-meting en kwantitatieve analyse
- Zoals te zien is in figuur 1B, werden de eerste negatieve en positieve pieken in de PVEP-golfvorm aangeduid als N1 en P1, die meestal optreden bij ongeveer 50 en 90 ms. De P1-amplitude wordt gemeten vanaf de trog van N1 tot de piek van P1.
- Gebruik in geval van monoculair letsel interoculaire vergelijking van amplitude en impliciete tijd om intersessievariatie te verminderen en de gevoeligheid te verhogen17.
3. Patroon ERG (PERG) bij geit
OPMERKING: In de vorige studie werd geen interoculaire overspraak van HET PERG-signaal waargenomen bij geiten, dus PERG-reacties kunnen tegelijkertijd vanuit beide ogen worden geregistreerd9.
- Examenvoorbereiding
- Verdoof de geit met xylazine (3 mg/kg, IM) en leg op een onderzoekstafel.
- Plaats een temperatuursensor onder de tong van de geit.
- Sluit de pulsoximeter aan op het proximale uiteinde van het oor van de geit.
- Bind de bloeddrukmanchet aan de dij.
- Klem de ECG-clips dienovereenkomstig op de ledematen.
- Om de elektrode-impedantie te verminderen, plaatst u een gesteriliseerde schedelschroef op het frontale bot en sluit u deze aan op de grondelektrode met een alligatorclip.
- Plaats twee gesteriliseerde naaldreferentie-elektroden subcutaan 1 cm achter de laterale canthi aan beide zijden.
- Gebruik het ooglidspeculum om het bulbaire bindvlies bloot te leggen.
- Plaats twee gedesinfecteerde ERG-Jet-opname-elektroden in het midden van bilaterale hoornvliezen na plaatselijke toepassing van kunstmatige scheur.
- Plaats twee LED-monitoren van 47,6 cm x 26,8 cm voor beide ogen met een kijkafstand van 50 cm.
- Pas elke monitor aan om evenwijdig aan het pupilvlak aan dezelfde kant te zijn en lijn het midden van de monitor uit op het pupilvlak.
- Zorg ervoor dat het omkerende dambord voor contrast (temporele frequentie, 2,4 Hz) op beide monitoren wordt weergegeven en een maximale beeldverhouding van 4:3 heeft, die wordt ingesteld door de apparatuurinstellingen.
- Zorg ervoor dat het contrast tussen witte en zwarte ruiten 96% blijft en dat de gemiddelde luminantie 200 cd/m2 (Candela per vierkante meter) is, wat wordt gecontroleerd door de luminantiemeter.
OPMERKING: Volgens ISCEV is een gemiddelde fotopische luminantie van 40-60 cd/m2 vereist bij mensen17. In een andere studie met behulp van muizenmodel bleef het patroon op een gemiddelde luminantie van 800 cd / m2,18. Een veldgrootte van ten minste 15° in de smalste afmeting is nodig voor een standaard PERG-test bij mensen17. Pas de positie van de hoornvlieselektrode aan als deze zich niet in het midden van het hoornvliesoppervlak bevindt.
- PERG opname
- Dim het omgevingslicht en druk op de impedantieknop om de contactimpedantie van het elektrodeweefsel te controleren. De waarden van impedantie worden in elk kanaal weergegeven.
- Controleer de impedantiewaarden in het impedantietestvenster en zorg ervoor dat de impedantie lager is dan 10 kΩ. Zo niet, sluit de elektrode dan opnieuw aan of vervang deze.
- Druk op de oscillograafknop om de basislijnruis zonder lichtstimulatie te controleren.
OPMERKING: Let op de bescherming van de fragiele ERG-Jet opname-elektroden. Baseline ruis in PERG is meestal kleiner dan die in FVEP bij geiten. - Start perg-opname van beide ogen tegelijkertijd op de ruimtelijke frequenties van 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 en 12,6 cycli / graad achter elkaar. Voor elke ruimtelijke frequentie worden 64 sporen gemiddeld om één uitlezing op te leveren.
- Schakel ten slotte de monitor uit om PERG op te nemen zonder visuele stimulus als een negatieve controle.
OPMERKING: PERG-signalen zijn meestal stabiel en hoeven niet te worden herhaald. - Verwijder de schedelschroef aan de voorkant en maak de geit wakker door Idzoxan (1,5 mg / kg) te injecteren, een xylazineantagonist.
- Behandel de geit na algehele anesthesie met gentamicine (4 mg/kg IM) en ceftiofurnatrium (2 mg/kg IM) om infectie te voorkomen.
- PERG-meting en kwantitatieve analyse
- Stel het bandpassfilter in op een bereik van 1 tot 75 Hz. Voor 3,0 cpd PERG is het bandpassfilter ingesteld op 1 tot 50 Hz om het spoor glad te strijken zonder de amplitude te beïnvloeden.
- Zoals weergegeven in figuur 1C, worden de eerste positieve en negatieve pieken in de golfvorm aangeduid als P1 (meestal rond 25 ms) en N1 (meestal rond 55 ms). De PERG-amplitude wordt gemeten van N1 tot P1.
- In geval van monoculair letsel gebruiken we interoculaire vergelijking van amplitude en impliciete tijd om intersessievariatie te verminderen en de gevoeligheid te verminderen17.
4. PERG bij resusaap
OPMERKING: Het is onduidelijk of er interoculaire overspraak van PERG-signaal is in resusaap, dus PERG-reacties van beide ogen worden afzonderlijk geregistreerd.
- Examenvoorbereiding
- Anesthetiseer de aap met isofluraan (1,5%-2%) na injectie van Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamine/zolazepam) en tracheale intubatie.
- Plaats een gesteriliseerde gemalen elektrode subcutaan op het frontale bot. Breng een gesteriliseerde naaldreferentie-elektrode subcutaan in, 1 cm achter de laterale canthus aan dezelfde kant.
- Plaats een gedesinfecteerde ERG-Jet-opname-elektrode op het centrale hoornvlies na plaatselijke toepassing van kunstmatige scheur.
OPMERKING: Pas de positie van de hoornvlieselektrode aan als deze zich niet in het midden van het hoornvliesoppervlak bevindt. - Gebruik zelfklevende ondoorzichtige zwarte tape om één oog te patchen.
- Plaats een monitor (47,6 x 26,8 cm) op een kijkafstand van 50 cm.
- Zorg ervoor dat de monitor is afgesteld om evenwijdig aan het pupilvlak te zijn. Lijn het midden van de monitor uit op het pupilvlak.
- Zorg ervoor dat het zwart-wit dambord achteruitrijdt met een frequentie van 2,4 Hz en dat de beeldverhouding 4:3 is, wat wordt ingesteld door de instellingen van de apparatuur.
- Zorg ervoor dat het contrast tussen de witte en zwarte ruiten 96% is en dat de gemiddelde luminantie 200 cd/m2 blijft, wat wordt gecontroleerd door de luminantiemeter.
- PERG opname
- Dim het omgevingslicht en controleer de impedantie van het elektrodeweefselcontact.
- Zorg ervoor dat de impedantie lager is dan 10 kΩ. Zo niet, sluit de elektrode dan opnieuw aan of vervang deze.
- Controleer het basisgeluid zonder lichtstimulatie.
- Patch één oog en start perg-opname van het andere oog bij ruimtelijke frequenties van 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 en 12,6 cycli / graad achter elkaar.
- Herhaal de stappen 4.2.1-4.2.4 voor het contralaterale oog.
- Stop met de isofluraantoevoer om de aap wakker te maken.
- Behandel de aap na algemene anesthesie met gentamicine (4 mg/kg IM) en ceftiofurnatrium (2 mg/kg IM) om infectie te voorkomen.
- PERG-meting en kwantitatieve analyse
- Zoals te zien is in figuur 1D, worden de eerste positieve en negatieve pieken in de golfvorm aangeduid als P1 (meestal rond 40 ms) en N1 (meestal rond 85 ms). De PERG-amplitude wordt gemeten van N1 tot P1.
- In geval van monoculair letsel gebruiken we interoculaire vergelijking van amplitude en impliciete tijd om intersessievariatie te verminderen en de gevoeligheid te verhogen17.
5. LGO in geit
- Dierbereiding
- Verdoof de geit met xylazine (3 mg / kg, IM) en intubeer vervolgens.
- Verwijd de pupil door topische toediening van mydriatische oogdruppels met tropicamide (5%) en fenylefrine (5%).
- Gebruik het ooglidspeculum om de pupil volledig bloot te leggen.
- Plaats de kop van de geit op de kinsteun.
OPMERKING: Hoewel gasverdoving niet wordt uitgevoerd, intubeer de geit regelmatig om de luchtweg te beschermen tegen samendruk door de kinsteun.
- OCT beeldvorming
OPMERKING: De retinale OCT-beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van het OCT-systeem op een golflengte van 870 nm in deze studie. De optische axiale resolutie van de OCT scanner is 12 μm. Cirkelvormige scanmodus wordt gebruikt om de oogzenuwkop (ONH) te scannen met hoge resolutie modus. 100 frames worden gemiddeld om de beeldkwaliteit te optimaliseren. De gedetailleerde trainingsgids is online beschikbaar (zie Materiaaltabel).- Eerste OCT-scan (basislijnexamen)
- Klik op de knop Start om de detectie-interface te openen. Wacht tot het apparaat klaar is met laden en druk vervolgens op de gele knop Start om de beeldvorming te starten.
- Lijn de geit uit met de infraroodcamera om de ONH te centreren in de confocale Scanning Laser Ophthalmoscopy (cSLO) -afbeelding door de koppositie te wijzigen.
- Pas de joystick aan om het hele infraroodbeeld gelijkmatig te verlichten om de beeldkwaliteit te verbeteren.
- Beweeg de joystick naar voren totdat een rechtopstaand retinaal OCT-beeld op het rechtopstaande scherm wordt weergegeven.
- Pas de joystick aan voor een gelijkmatig dicht en horizontaal geplaatst retinaal OCT-beeld.
- Druk op de knop op de joystick om het beeld automatisch op te vangen en houd de joystick ingedrukt om de beeldkwaliteit op het livebeeldscherm te behouden totdat de beeldacquisitie is voltooid. Druk vervolgens op Verwerven.
- Maak de geit wakker door Idzoxan (1,5 mg / kg) te injecteren, een xylazine-antagonist.
OPMERKING: Het centreren van de ONH in het basislijnexamen helpt bij het afstemmen van de basislijnscan en vervolgscan op basis van onze ervaring.
- Follow-up OCT scanning
- Selecteer een eerste OCT-afbeelding van hoge kwaliteit; klik met de rechtermuisknop en selecteer Referentie instellen.
- Start OCT-beeldvorming zoals hierboven vermeld.
- Druk op de knop Follow-up om de huidige scan automatisch te laten afstemmen op de referentiescan.
- Eenmaal afgestemd (de cirkelvormige scanring wordt groen), drukt u op de knop op de joystick om Automatische real-time tracking te activeren.
- Maak de geit wakker door Idzoxan (1,5 mg / kg ) te injecteren, een xylazine-antagonist.
OPMERKING: Om het proces van matching te vergemakkelijken, (1) verplaats de ONH in het live-venster door de kop dienovereenkomstig te draaien of (2) draai de ONH in het live-venster door de kop te kantelen om het huidige cSLO-beeld meer op het basislijnbeeld te laten lijken. Deze vestibulo-oculaire reflex werkt goed onder xylazine-anesthesie19.
- Eerste OCT-scan (basislijnexamen)
- LGO meting
- Klik op de knop Meten om het meetvenster te openen.
- Kies het gummetje en veeg de RNFL-lijn, die automatisch door het programma wordt gelabeld.
- Kies het gereedschap Lijntekenen om handmatig de grens tussen IPL en INL te schetsen (afbeelding 2).
OPMERKING: GCC-dikte in zes peripapillaire gebieden (T, TS, TI, N, NS, NI) en gemiddelde GCC-dikte rond de ONH (G) kunnen op het scherm worden afgelezen (figuur 2). De studententest, eenrichtings-ANOVA of tweerichtings-ANOVA kan worden gebruikt om de OCT-gegevens te kwantificeren in geval van normale verdeling.
6. OCT bij resusaap
- Voer retinale OCT-beeldvorming uit bij resusaap met dezelfde apparatuur en procedure als in het geval van een geit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont representatieve resultaten van FVEP bij geiten. Hoewel de golfvormen in dezelfde flitsintensiteit relatief vergelijkbaar zijn, raden we toch aan om de golfvormen twee keer te onderzoeken. Elektromagnetische golven gegenereerd door elektronische apparaten zullen interfereren met de verzamelde elektrische signalen, wat resulteert in hoge basislijnruis en slechte herhaalbaarheid van de golfvorm. Daarom wordt aanbevolen ervoor te zorgen dat er tijdens elektrofysiologisch onderzoek geen redundante elektronische apparaten op de omgeving zijn aangesloten om dergelijke interferentie te voorkomen, en het wordt aanbevolen om ten minste twee metingen te herhalen om de stabiliteit en herhaalbaarheid van experimentele resultaten te bepalen. Bij het patchen van beide ogen zijn de golfvormen op beide ogen volledig vlak, wat aantoont dat de golfvormen zeker worden gegenereerd door onze flitsprikkel. Figuur 1B toont representatieve resultaten van PERG bij geiten. Door de stabiliteit en het hoge signaal verkrijgen we een betrouwbare golfvorm door slechts één keer meting op elke ruimtelijke frequentie. Naarmate de ruimtelijke frequentie toeneemt, zal de grootte van het dambord geleidelijk de herkenning van de ogen van de geit overschrijden. We kunnen dus zien dat bij 12,7 cpd de PVEP-golfvorm veel is gedaald. Analoog aan FVEP verdwijnt de golfvorm wanneer we het scherm sluiten. Figuur 1C toont representatieve resultaten van PVEP bij resusaap. We herhalen de meting twee keer op elke ruimtelijke frequentie. Naarmate de ruimtelijke frequentie toeneemt, zal de amplitude afnemen. Dit komt door het feit dat de ruimtelijke frequentie de waarneming van het oog overschrijdt. Figuur 1D toont representatieve resultaten van PERG bij resusaap. De reden waarom de amplitude afneemt met de ruimtelijke frequentie is dezelfde als hierboven beschreven. Bij het analyseren van deze gegevens kunt u ervoor kiezen om de amplitude tussen de pieken en dalen of de latentietijd van de pieken of dalen als de statistieken te analyseren.
Figuur 2 toont de representatieve resultaten van LGO bij geiten. De meest linkse afbeelding toont een fundusfoto gemaakt door een infraroodcamera. Strak rechts is een tomogram van het netvlies, dat de totale dikte van het netvlies rond de ONH en de dikte van elke laag laat zien. Zoals op de foto te zien is, kunnen we duidelijk zien dat geiten grotere retinale bloedvaten hebben dan apen. De groene schijven uiterst rechts is een kwantitatieve analyse van de dikte van de GCC rond de ONH. G staat voor algemeen, T staat voor temporale kant, N staat voor nasale zijde, S staat voor superieur en ik staat voor inferieur. Het zwarte lettertype vertegenwoordigt de GCC-diktemeetwaarde in micrometers en het groen is de klinische referentiemeetwaarde voor de mens, niet als referentie voor dit experiment.
Figuur 1: Representatieve elektrofysiologische golfvormen bij geiten- en resusapen. (A) Representatieve FVEP-golfvormen met verschillende lichtintensiteiten van een individuele geit binnen dezelfde verdovingssessie. (B,D) Representatieve PERG-golfvormen op verschillende ruimtelijke frequenties van een individuele geit (B) of resusaap (D) binnen dezelfde verdovingssessie. (C) Representatieve PVEP-golfvormen op verschillende ruimtelijke frequenties van een individuele resusaap binnen dezelfde verdovingssessie. De typische impliciete tijd van elke golfvorm wordt vermeld in de sectie Protocol. n = 1 proefpersoon voor elke test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Resultaten LGO. Representatieve retinale OCT-beelden rond de oogzenuwkop (linkerpaneel) en de dikte van GCC in verschillende peripapillaire gebieden (rechterpaneel) bij geit (A) en resusaap (B). n = 1 proefpersoon voor elke test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie presenteren we een protocol van VEP, PERG en OCT bij geiten- en resusaap. Deze in vivo methoden kunnen worden toegepast in grote diermodellen van verschillende optische neuropathieën, zoals glaucoom, ischemische of traumatische optische neuropathie en optische neuritis9.
PVEP is stabieler en gevoeliger dan FVEP17; het kan echter niet worden uitgelokt in goat9. Als zodanig wordt FVEP uitgevoerd bij geiten en PVEP wordt uitgevoerd bij resusaap in ons laboratorium om de integriteit van de retino-geniculo-corticale route te evalueren. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de waarneming dat PERG, maar niet PVEP, bij geiten kan worden geïnduceerd, is volgens onze kennis nog onduidelijk. Het is mogelijk dat de oogzenuwfunctie en -structuur van geit anders is dan die van de mens.
Omdat de amplitude van FVEP kan worden beïnvloed door pupilgrootte en omgevingslicht, verwijden we de pupil en leggen we een zwarte deken over het hoofd van de geit tijdens FVEP-opname. Opgemerkt moet worden dat pupilverwijding niet nodig is voor FVEP in klinieken17. Evenzo, hoewel donkere aanpassing niet nodig is voor FVEP-opname in klinieken, vonden we dat een aanpassing van 5 minuten aan het omgevingslicht vóór FVEP-opname de intrasessieherhaalbaarheid in amplitude kan verhogen.
Perg-signaal wordt verondersteld afkomstig te zijn van de RGC's en dus kan de amplitude ervan worden gebruikt om de functie van de RGC's13,20 te schatten. Vergeleken met sommige speciale flash ERG-componenten, zoals scotopic threshold response (STR) en photopic negative response (PhNR), is PERG gevoeliger voor RGC-disfunctie13. Mogelijke beperkingen van perg-test in deze studie zijn als volgt. Ten eerste beveelt ISCEV aan om klassieke CRT-stimulator (kathodestraalbuis) te gebruiken voor PERG-opname om de gemiddelde luminantie constant te houden. De klassieke CRT-stimulator is echter minder beschikbaar dan liquid crystal display (LCD). Hoewel het scherm van LCD meestal voorbijgaande luminantieveranderingen vertoont tijdens patroonomkering, wat mogelijk luminantieartefact17 veroorzaakt, droeg het volgens onze eerdere bevinding niet bij aan de amplitude van PERG bij geiten: de amplitude van PERG bij de ruimtelijke frequentie van 12,6 cpd is meestal verwaarloosbaar in vergelijking met die bij lagere ruimtelijke frequenties9 . Een andere beperking is dat we de brekingsfout vóór de PERG-test omwille van de eenvoud niet hebben gecorrigeerd. Om deze beperking te compenseren, moet baseline PERG-amplitude als referentie worden geregistreerd.
Onze vorige studie had de intra- en intersessievariatie van VEP en PERG9 beoordeeld en geoptimaliseerd. We ontdekten dat in vergelijking met xylazine isofluraan resulteerde in meer herhaalbare FVEP maar meer variabele PERG-golfvormen bij geiten9. Daarom gebruikten we isofluraan in FVEP-test en xylazine in PERG- en OCT-test bij geiten. Bovendien is VEP-opname in vergelijking met PERG mogelijk meer variabel. Als zodanig herhalen we regelmatig VEP-opname bij elke lichtintensiteit of ruimtelijke frequentie om de intrasessievariatie te controleren. Daarentegen zijn PERG-golfvormen veel stabieler. Daarom herhalen we over het algemeen geen PERG-opname. Hoewel herhaalde opname op een andere dag over hetzelfde onderwerp over het algemeen wordt aanbevolen, herhalen we niet regelmatig VEP- of PERG-opname over hetzelfde onderwerp op een andere dag omwille van de eenvoud en de ethiek van dieren. Niettemin zijn FVEP- en PERG-opnames zonder herhaling tussen sessies gevoelig genoeg om oogzenuwletsel te detecteren volgens onze eerdere studie9.
Retinale OCT-beeldvorming is een handige, betrouwbare en niet-invasieve techniek om dynamische veranderingen in de retinale structuur longitudinaal te monitoren en te kwantificeren. In vergelijking met PERG en VEP heeft OCT-beeldvorming een veel betere herhaalbaarheid van intersession9. Bovendien kan OCT-beeldvorming alle oogzenuwvezels binnen enkele minuten vastleggen en kwantificeren zonder bemonsteringsfout, wat een veel goedkopere en effectieve mogelijkheid biedt om de retinale structuur te onderzoeken dan traditionele histologische analyse. De ruimtelijke resolutie van de huidige OCT-beeldvorming is echter nog steeds te beperkt om individuele RGC-soma of optische zenuwvezels te vertellen. Bovendien moet worden opgemerkt dat een dikkere GCC gemeten door OCT niet noodzakelijkerwijs een meer intact binnenste netvlies betekent, omdat GCC-verdikking kan worden veroorzaakt door retinaal oedeem of bloeding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door de volgende beurzen: National Key R& D Program of China (2021YFA1101200); Medisch onderzoeksproject van Wenzhou (Y20170188), Nationaal Belangrijk R & D-programma van China (2016YFC1101200); National Natural Science Foundation of China (81770926;81800842); Belangrijk R & D-programma van de provincie Zhejiang (2018C03G2090634); en key R&D-programma van wenzhou eye hospital (YNZD1201902). De sponsor of financierende organisatie had geen rol in het ontwerp of de uitvoering van dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 47.6 x 26.8 cm monitors | DELL Inc. | E2216HV | The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens |
| 6.0 mm tracheal tube | Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd | PVC 6.0 | ensure the airway |
| alligator clip | |||
| atropine | Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. | reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation | |
| Carbomer Eye Gel | Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb | moisten the cornea and stabilize the recording electrodes | |
| ERG-Jet recording electrodes | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | 2300 La Chaux-De-Fonds | ERG recording |
| eye speculum | Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd | ZYD020 | open palpebral fissure |
| Heidelberg Spectralis OCT system | Heidelberg Engineering | OCT system | |
| Imaging | (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf) | ||
| isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22 | isoflurane anesthesia |
| male Saanen goats | Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) | The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg | |
| needle electrode | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | U51-426-G-D | use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes |
| periphery venous catheter intravenously | BD shanghai Medical Device Co., Ltd | 383019 | intravenous access for atropine and propofol |
| propofol | Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. | induce Isoflurane anesthesia in goat | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | SANTEN OY, Japan | 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride | |
| visual electrophysiology device | Gotec Co., Ltd | GT-2008V-III | use for FVEP & PERG |
| xylazine | Huamu Animal Health Products Co., Ltd. | xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg | |
| zoletil50 | Virbac | induce Isoflurane anesthesia in monkey |
References
- Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
- He, Z., Jin, Y.
- Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
- Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
- Singman, E. L., et al.
- Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
- Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
- Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
- Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
- Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
- You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
- Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
- Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
- Porciatti, V.
