Summary
ここでは、ヤギとアカゲザルのいくつかの in vivo テスト(フラッシュビジュアル呼び起こされる電位、パターン電気レチノグラムおよび視共体断層撮影)を分解して、視神経とそのニューロンの構造と機能を理解します。
Abstract
視神経は、眼球神経節細胞から軸索信号を収集し、脳に視覚信号を伝達する。視神経損傷の大型動物モデルは、サイズと解剖学の人間との類似性が高いため、げっ歯類モデルから臨床応用に新しい治療戦略を翻訳するために不可欠です。ここでは、視覚誘発電位(VEP)、パターン電解質(PERG)および光コヘレンス断層撮影(OCT)を含む大型動物における眼球神経節細胞(RGC)および視神経(ON)の機能および構造を評価するためのイン ビボ 法について説明する。ヤギと非ヒトの霊長類の両方がこの研究で採用された。 これらのインビボ 法を段階的に提示することで、異なる実験室間で実験再現性を高め、視神経障害の大型動物モデルの使用を促進したいと考えています。
Introduction
視神経(ON)は、神経節細胞(RGC)の軸索で構成され、眼窩から脳に視覚信号を伝達する。緑内障、外傷性または虚血性視神経障害などのON疾患は、しばしば不可逆的なON / RGC変性および壊滅的な視力喪失を引き起こした。げっ歯類モデルのON再生およびRGC保護には現在多くのブレークスルーがありますが、ON疾患の大部分の臨床治療は、不十分な結果で過去半世紀にわたって本質的に同じままでした7,87,8.基礎研究と臨床実践のギャップを埋めるために、ON疾患の大型動物モデルを用いた翻訳研究は、げっ歯類モデルよりも人間との解剖学的類似性が高いため、しばしば必要であり有益である。
ヤギとアカゲザルは、人間のON病をモデル化するために私たちの研究室で使用される2つの大きな動物種です。ヤギの眼球の大きさ、ON、および隣接する構造(眼窩および鼻腔、頭蓋骨の基盤など)は、頭蓋骨CTスキャン9に基づく人間のそれと同様である。このように、ヤギモデルは、ヒトで使用する前に治療装置または外科的処置を評価し、改良する機会を提供する。アカゲザルは、ヒト以外の霊長類(NHP)として、他の種に存在しない人間のようなユニークな視覚システムを有する10,11。さらに、NHPにおける傷害および治療に対する病態生理学的反応は、ヒト12におけるそれとはるかに類似している。
ONおよびRGCの構造と機能を縦方向に評価するためのインビボ試験は、大型動物実験において重要である。パターン電気レティノグラム(PERG)は、RGC機能を評価するために使用されています。フラッシュ視覚誘発電位(FVEP)は、視覚系におけるレチノ-ジェノロ-コルチカル経路の完全性を反映する。したがって、PerGとFVEPを組み合わせることで、ON関数9,13,14を反映することができる。このレチナル視コテレンス断層撮影(OCT)イメージングは、高い時間的および空間的分解能を有する眼窩構造を示し、この場合、眼球団(GCC)9,15の厚さの測定を可能にする。本研究における電気生理学的検査では、これらのパラメータが眼血流および視覚システムの機能に強力な影響を及ぼすため、検査前のバイタルサイン(熱率、違反率、血圧)および酸素飽和度(SpO2)のレベルを監視することは非常に重要である。しかし、簡単にするためにOCTのレチンイメージングを行う際のバイタルサインは監視しませんでした。我々の前の研究9によると、OCTのレチナルイメージングによって測定されたGCC厚は非常に安定しており、セッション間変動係数は3%に近い。ヤギおよびアカゲザルにおけるこれらのインビボ試験は、これまでの研究9で詳細に説明されている。ここでは、実験の透明性と再現性を高めるためにこれらの方法を紹介します。
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Protocol
実験は、実験動物のケアと使用のためのARRIVEガイドラインと国立衛生研究所ガイドに従って厳密に行われ、温州医科大学(WMU)とジョネン研究所(蘇州)の施設動物ケアと使用委員会によって承認されたプロトコルに従いました。雄のザーネンヤギは、体重19〜23kgの4〜6ヶ月齢で、WMU動物施設に収容された。5〜7kgの体重で5歳から6歳までのオスのアカゲザルは、ジョニン動物施設に収容されました。すべての動物は、食品アドリビタムと12時間の光/12時間の暗いサイクルの下で制御された温度(21±2°C)を備えたエアコン付きの部屋に維持されました。
1. ヤギのフラッシュビジュアル呼び起こされる可能性(FVEP)
- 全身麻酔
- 電子カミソリでホックの髪を剃ります。
- 70%のアルコールを3回こすって皮膚をきれいにし、皮下静脈を露出させます。
- 末梢静脈カテーテルを静脈内(0.9mm x 25mm)に挿入し、アトロピン(0.025mg/kg)とプロポフォール(5mg/kg)を注入します。
- 6 mm気管チューブでヤギを挿管し、人工呼吸器に接続します。
- 酸素中のイオブルラン3.5%で2 L/minの一定の流量で麻酔を維持します。
注:ヤギは数分以内にプロポフォールによって誘発される麻酔から回復するので、ヤギを挿管するために速くしてください。
- 心肺モニタリング
- 温度センサーを舌の下に置きます。
- パルスオキシメーターを耳の近位端に接続します。
- 血圧カフを太ももの基部に結びます。
- それに応じて、ECGクリップを手足にクランプします。
注:ヤギの通常の心拍数は68-150 bpmです。ガス麻酔の使用により、ヤギの心拍数が増加します。したがって、検査中の心拍数は170±30 bpmです。正常な条件下でのヤギの収縮期血圧は110-130 mmHgであり、拡張期血圧は50-60 mmHgである。酸素を吸い込む状態では、ヤギの血中酸素飽和度は常に99%に維持することができる。麻酔下のヤギの呼吸数は、10呼吸/分である人工呼吸器の呼吸数と同期します。温度は、コア温度ではなく、ヤギの舌下から測定したので、ヤギの温度は、一般的に35±2°Cである。
- スカルねじのインプラントおよび電極の配置
- 髪をクリッパーで剃ります。ベタジンと70%アルコールを3回浸した綿球でこすり、前頭骨の中央の皮膚を消毒する。
- 滅菌されたねじおよびはさみを使用してください。
注意:殺菌のためのすべての外科器具をオートクレーブ(121°C、20分)。 - 5mmの皮膚切開を行い、眼科用はさみで前頭骨を露出させ、ドライバーを使用して前頭骨の中央に滅菌されたネジを埋め込みます。
- 髪を剃り、ベタジンと70%アルコールで2つの耳の間の中央後頭部骨の皮膚を消毒し、1つは他の3回消毒します。
- 5mmの皮膚切開を行い、後頭部骨を眼科用はさみで露出させ、後頭部骨の中心に殺菌ねじを埋め込みます。
メモ:接地針電極は、前頭頭蓋骨ねじの下に皮下に挿入されます。アクティブ電極とリファレンス電極は、それぞれ後頭および前頭ねじに接続され、ワニクリップが電極インピーダンス16を低減します。
- 動物の準備
- 目を覆い、目隠しで固定して片目にパッチを当てるには、防明布を使用してください。
- 両眼に局所麻酔用点眼薬(塩酸プロパラカイン点眼薬)を塗布します。二国間の瞳孔は、熱帯アミド(5%)およびフェニレフリン(5%)を有する無数の点眼薬の局所投与によって拡張される。
- ヤギの頭をガンツフェルト刺激装置に入れ、周囲光を暗くします。
注:ヤギは麻酔下で良好な眼球固定を維持できることが判明したので、余分な眼球固定操作の介入は必要ありません。 - 適応のために5分間黒い毛布で刺激装置とヤギの頭を覆います。
- 眼瞼鏡を使用して、ブルバー結膜を露出します。上輪を折り、上まぶたを上に引き上げ、上の輪を上まぶたの結膜嚢に挿入し、次に同様の方法で下まぶたに挿入します。
- インピーダンスボタンを押して電極組織接触インピーダンスを確認し、各チャンネルにインピーダンスの値が表示されます。
- 同じ部屋の他の電気機器からの電磁干渉を避けるために、各電極のインピーダンスが10 kΩ以下であることを確認します。
メモ:10kΩを超える場合は、電極を再接続するか交換してください。ヤギが置かれている電気金属外科用ベッドが差し込まれている場合、インピーダンスが異常に高く見えることがあります。インピーダンスは、電気的干渉を低減するために、アクティブ電極とリファレンス電極の間で1kΩ未満で異なるものでなければなりません17。 - オシログラフボタンを押して、光刺激を受けずにベースラインノイズを確認します。
メモ:ベースラインノイズが大きい場合は、同じ部屋の他のすべての電気機器を取り外し、携帯電話の電源を切ります。ベースラインの問題が解決しない場合は、手順 1.3.10 に進みます。一般的なFVEP波形が引き出すことができるかどうかを確認します。設定されていない場合は、FVEP テストのスケジュールを変更してください。 - 右上隅の白い背景ボックスで 0.025、0.5、3.0 cd·s/m2 の光強度を選択して、FVEP 記録を開始します。次に、 検査 ボタンを押します。なお、各光強度でのFVEP記録は2回行われる。
メモ:2つの波形が明らかに異なって見える場合は、もう1つの繰り返しが必要です。 - 人工涙点眼で角膜を湿らします, それは赤外線カメラに乾燥しているように見える場合.
注:記録する前に、組み込まれた赤外線カメラから目の位置を監視して、視線が正しく、瞳孔が完全に露出していることを確認します(フラッシュ刺激のフィールドサイズが90°になるようにします)。麻酔ヤギの目の位置は、それに応じて頭を回すことによって調整することができます。我々の観察に基づいて、一般麻酔下でのヤギのFVEP記録(〜10分)中に視線放浪はほとんど起こらない9。だから、記録中に視線を一時停止し、再調整する必要はありません。 - 対側目について上記の手順を繰り返します。
- イオブルランの供給を停止し、ヤギが全身麻酔から回復するのを助けるために人工呼吸器の潮量をわずかに増加させます。
- 全身麻酔の後、ヤギをゲンタマイシン(4mg/kg、IM)とセフティオフールナトリウム(セファロスポリン、2mg/kg、IM)で治療し、感染を防ぎます。
- FVEP測定および定量分析
注: 図 1A に示すように、FVEP 波形の最初の正と負のピークは P1 と N1、2 番目の正のピークは P2 として指定されます。P1、N1、および P2 の典型的な暗黙の時間は、それぞれ約 40、60、および 120 ミリ秒です。P1とP2振幅は、それぞれN1波形のトラフからP1波形とP2波形のピークまで測定されます。- 単眼損傷の場合は、振幅と暗黙の時間の間比を使用して、セッション間変動を減らし、感度を高めます17。
2. アカゲザルのPVEP
メモ:パターンVEPはアカゲザル9 で引き出され、振幅と暗黙のtime17でフラッシュVEPよりも安定しています。従って、PVEPはヒト以外の霊長類におけるレチノ-ジェロ-コルチカル経路の完全性を検出するために使用された。
- 動物の準備
- ゾレティル50(4-8 mg/kg IM、タイルタミン/ゾラゼパム)で誘導した後、イソフルラン(1.5%-2%)でサルを麻酔します。
- 殺菌したグランド電極を耳たぶに置きます。滅菌された活性電極と基準電極を、それぞれ前頭骨と後頭骨の正中に沿って皮下に挿入します。
- まぶたの鏡を適用して、ブルバー結膜を露出します。
- 接着剤不透明な黒いテープを使用して、対側の目にパッチを当てるようにします。
- PVEP記録
- インピーダンスボタンを押して電極組織接触インピーダンスを確認し、インピーダンスの値が各チャンネルに表示されます。10k Ω以下であることを確認してください。接続されていない場合は、電極を再接続するか、交換してください。
- インピーダンステストウィンドウでインピーダンスの値を確認し、電気干渉を低減するために、アクティブ電極とリファレンス電極の間でインピーダンスが1kΩ未満であることを確認します。
- オシログラフボタンを押して、刺激を受けずにベースラインノイズを確認します。
メモ:ベースラインノイズが大きい場合は、同じ部屋の他のすべての電気機器を取り外し、携帯電話の電源を切ります。ベースラインの問題が解決しない場合は、別の日に PVEP テストをやり直します。 - パッチされていない目の PVEP 応答を記録するには、右上隅の白い背景ボックスで 0.5 と 1.0 サイクル/度の光強度を選択し、 次に [検査] ボタンを押します。
注:各記録では、64のトレースが平均化され、1つの波形が生成されます。各周波数について、PVEP信号の再現性を検証するために、2つの録音の最小数が取得されます。 - 対側の目の手順を繰り返します。
- 一度行われ、サルを目覚めさせるためにイオブルランの供給を停止します。
- 全身麻酔後、サルをゲンタマイシン(4mg/kg IM)とセフティオフグルナトリウム(2mg/kg IM)で治療し、感染を防ぎます。
- PVEP測定・定量分析
- 図1Bに示すように、PVEP波形の最初の負および正のピークは、通常50と90ミリ秒前後で発生するN1とP1として指定されました。P1振幅は、N1のトラフからP1のピークまで測定されます。
- 単眼損傷の場合は、振幅と暗黙の時間の眼間比較を使用して、セッション間変動を減らし、感度を高めます17。
3. ヤギのパターンERG(PERG)
注:前回の研究では、ヤギではPERG信号の間クロストークは認められていないため、PERG応答は両眼9から同時に記録できます。
- 試験準備
- キシラジン(3mg / kg、IM)を使用してヤギを麻酔し、試験テーブルの上に置きます。
- ヤギの舌の下に温度センサーを置きます。
- パルスオキシメーターをヤギの耳の近位端に接続します。
- 血圧カフを太ももに結びます。
- それに応じて、手足のECGクリップをクランプします。
- 電極インピーダンスを低減するには、前頭骨に滅菌したスカルスクリューを置き、ワニクリップで接地電極に接続します。
- 2つの滅菌された針参照電極を皮下に1cm両側の側面の側面カンティの後ろに置きます。
- 眼瞼鏡を使用して、ブルバー結膜を露出します。
- 人工涙の局所適用後に、2つの分解されたERG-Jet記録電極を両側角膜の中心に置く。
- 2つの47.6 cm x 26.8 cmのLEDモニターを、50cmの視聴距離で両眼の前に置きます。
- 各モニタを同じ側の瞳孔面に平行に調整し、モニターの中心を瞳孔面に合わせます。
- 両方のモニタにコントラスト反転チェッカーボード(時間周波数、2.4 Hz)が表示され、機器の設定で設定された最大アスペクト比4:3であることを確認します。
- 白と黒のチェッカーのコントラストが96%のまま、平均輝度が200 cd/m2 (1平方メートル当たりカンデラ)であることを確認し、輝度メーターでチェックします。
注:ISCEVによると、40-60 cd/m2の平均光光輝度は、ヒト17で必要とされます。マウスモデルを用いた別の研究では、パターンは平均輝度800cd/m2,18にとどまった。ヒト17の標準PERG試験には、最も狭い次元で少なくとも15°のフィールドサイズが必要です。角膜電極の中心に角膜電極がない場合は、角膜電極の位置を調整します。
- PERG録音
- 周囲光を暗くし、 インピーダンス ボタンを押して電極組織接触インピーダンスを確認します。インピーダンスの値は各チャンネルに表示されます。
- インピーダンステストウィンドウでインピーダンスの値を確認し、インピーダンスが10 kΩ以下であることを確認します。接続されていない場合は、電極を再接続するか、交換してください。
- オシログラフボタンを押して、光刺激を受けずにベースラインノイズを確認します。
注:壊れやすいERG-Jet記録電極を保護するために注意してください。PERGのベースラインノイズは、通常、ヤギのFVEPのそれよりも小さいです。 - 0.1、0.3、1.0、3.0、および12.6サイクル/度の空間周波数で、両方の目から同時にPERG記録を開始します。空間周波数ごとに、64 のトレースが平均化され、1 回の読み出しが得られます。
- 最後に、モニタをオフにして、視覚刺激を負のコントロールとして記録せずにPERGを記録します。
注: PERG 信号は通常安定しており、繰り返しの必要はありません。 - 前部スカルスクリューを取り外し、キシラジンアンタゴニストであるイドゾキサン(1.5mg/kg)を注入してヤギを起こします。
- 全身麻酔の後、ヤギをゲンタマイシン(4mg/kg IM)とセフティオフールナトリウム(2mg/kg IM)で治療し、感染を防ぎます。
- PERG測定および定量分析
- バンドパスフィルタを1~75 Hzに設定します。
- 図 1C に示すように、波形の最初の正と負のピークは P1 (通常は約 25 ミリ秒) と N1 (通常は約 55 ミリ秒) として指定されます。PERGの振幅はN1からP1まで測定されます。
- 単眼損傷の場合、我々は、セッション間変動を減らし、感度を低減するために振幅と暗黙の時間の間視比較を使用します17。
4. アカゲザルのPERG
注:アカゲザルにPERG信号の間クロストークがあるかどうかは不明であるため、両眼からのPERG応答は別々に記録されます。
- 試験準備
- ゾレティル50(4-8 mg/kg IM、タイルタミン/ゾラゼパム)および気管挿管の注射後、イソフルラン(1.5%-2%)でサルを麻酔する。
- 前頭骨に殺菌した接地電極を皮下に置きます。滅菌された針参照電極を皮下に挿入し、同じ側の側カンサスの後ろに1cm挿入します。
- 人工涙液の局所適用後に、中央角膜に、分解したERG-Jet記録電極を置きます。
注:角膜電極が角膜表面の中心にない場合は、角膜電極の位置を調整します。 - 片目に貼り付けるには、接着不透明な黒いテープを使用します。
- モニター(47.6 x 26.8 cm)を50cmの視聴距離に設置します。
- モニタが瞳孔面に平行になるように調整されていることを確認します。モニターの中央を瞳孔面に合わせます。
- 黒と白のチェッカーボードが 2.4 Hz の周波数で反転し、アスペクト比が 4:3 であることを確認します。
- 白と黒のチェッカーのコントラストが96%であり、平均輝度が 200 cd/m2 のままであることを確認し、輝度メーターでチェックします。
- PERG録音
- 周囲光を暗くし、電極組織接触インピーダンスを確認します。
- インピーダンスが10 kΩ以下であることを確認します。接続されていない場合は、電極を再接続するか、交換してください。
- 光刺激を受けずにベースラインノイズを確認します。
- 片方の目にパッチを当て、0.1、0.3、1.0、3.0、および12.6サイクル/度の空間周波数で、もう一方の目からPERG記録を連続して開始します。
- 反対側の目に対して、手順 4.2.1 ~4.2.4 を繰り返します。
- サルを目覚めさせるためにイオブルランの供給を停止します。
- 全身麻酔の後、サルをゲンタマイシン(4mg/kg IM)とセフティオフルナトリウム(2mg/kg IM)で治療し、感染を防ぎます。
- PERG測定および定量分析
- 図 1D に示すように、波形の最初の正と負のピークは P1 (通常は約 40ms) と N1 (通常は約 85 ミリ秒) として指定されます。PERGの振幅はN1からP1まで測定されます。
- 単眼損傷の場合、我々は、セッション間変動を減らし、感度を増加させるために振幅と暗黙の時間の間視を使用します17。
5. ヤギの10月
- 動物の準備
- キシラジン(3mg/kg、IM)を使用してヤギを麻酔し、次に挿管する。
- 熱帯アミド(5%)およびフェニレフリン(5%)で無数点眼薬の局所投与によって瞳孔を拡張する。
- 瞳孔を完全に露出させるためにまぶたの鏡を使用してください。
- ヤギの頭をあごの残りの部分に置きます。
注:ガス麻酔は行われませんが、ヤギを定期的に挿管して、あごの残りで空気道が圧縮されるのを防いでください。
- OCT イメージング
注: この研究では、870 nm の波長で OCT システムを使用して、レティナル OCT イメージングを行います。OCTスキャナの光学軸解像度は12 μmです。円形スキャンモードは、高解像度モードで視神経ヘッド(ONH)をスキャンするために使用されます。100 フレームは、画像の品質を最適化するために平均化されます。詳細トレーニングガイドはオンラインで入手できます( 資料表を参照)。- OCT の初期スキャン (ベースライン試験)
- [スタート]ボタンをクリックして、検出インターフェースに入ります。マシンの読み込みが完了するのを待ち、黄色の[スタート]ボタンを押してイメージングを開始します。
- ヘッド位置を変更して、ヤギを赤外線カメラに合わせて共焦点走査レーザー眼科(cSLO)画像のONHを中央に配置します。
- ジョイスティックを調整して、赤外線画像全体を均等に照らし、画質を向上させます。
- 直立した RET-0 画像が直立した画面に表示されるまで、ジョイスティックを前方に移動します。
- ジョイスティックを変更して、均一に密集し、水平に配置されたレティナル OCT 画像を持ちます。
- ジョイスティックのボタンを押して自動的に画像をキャッチし、ジョイスティックを保持して画像取得が完了するまでライブ画像画面の画質を維持します。次に、[ 取得] を押します。
- キシラジンアンタゴニストであるイドゾキサン(1.5mg/kg)を注入してヤギを目覚めさせる。
注: ベースライン試験で ONH を中心にして、ベースライン スキャンとフォローアップ スキャンを経験に応じて調整できます。
- フォローアップ OCT スキャン
- 高品質の初期 OCT イメージを選択します。右クリックして、[ 参照の設定]を選択します。
- 上記のとおり、OCT イメージングを開始します。
- [フォローアップ]ボタンを押して、現在のスキャンを参照スキャンに自動的に一致させます。
- マッチした(円形のスキャンリングが緑色に変わる)、ジョイスティックのボタンを押して 自動リアルタイムトラッキングを有効にします。
- キシラジンアンタゴニストであるイドゾキサン(1.5mg/kg)を注入してヤギを目覚めさせる。
注:マッチングのプロセスを容易にするために、(1)それに応じて頭を回してライブウィンドウでONHを動かすか、(2)現在のcSLO画像がベースライン画像に似ているように見えるように頭を傾けてライブウィンドウでONHを回転させます。この前庭眼反射はキシラジン麻酔19の下でうまく機能します。
- OCT の初期スキャン (ベースライン試験)
- OCT測定
- 測定ボタンをクリックして、 測定 ウィンドウに入ります。
- 消しゴムツールを選択し、プログラムによって自動的にラベルが付いているRNFLラインを拭きます。
- IPL と INL の境界を手動でアウトライン化するには 、線描画 ツールを選択します (図 2)。
注:6つの周頭領域(T、TS、TI、N、NS、NI)のGCC厚さとONH(G)の周囲の平均GCC厚さは、画面で読み取ることができます(図2)。学生テスト、一方向ANOVAまたは双方向ANOVAを使用して、正規分布の場合にOCTデータを定量化することができます。
6. アカゲザルの10月
- ヤギの場合と同じ装置と手順を使用して、アカゲザルでのレチナルOCTイメージングを行います。
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Representative Results
図1A は、ヤギにおけるFVEPの代表的な結果を示す。同じフラッシュ強度の波形は相対的に類似していますが、波形を2回調べることをお勧めします。電子機器によって発生する電磁波は、収集された電気信号に干渉し、ベースラインノイズが高く、波形の再現性が悪くなります。したがって、このような干渉を避けるために、電気生理学的検査中に周囲の環境に接続された冗長な電子機器がないことを確認することが推奨され、実験結果の安定性と再現性を決定するために少なくとも2つの測定を繰り返すことをお勧めします。両眼にパッチを当てると、両眼の波形は完全に平坦で、フラッシュ刺激から波形が発生していることを示しています。 図1B は、ヤギにおけるPERGの代表結果を示す。安定性と高い信号により、各空間周波数で一度だけ測定して信頼性の高い波形を取得します。空間周波数が大きくなると、チェッカーボードのサイズが徐々にヤギの目の認識を超えていきます。だから我々は12.7 cpdで、PVEP波形が多く落ちたことを見ることができます。FVEPに似た、画面を閉じると波形が消えます。 図1C は、アカゲザルにおけるPVEPの代表的な結果を示す。各空間周波数で2回測定を繰り返します。空間周波数が大きくなると、振幅が減少します。これは、空間周波数が眼の知覚を超えているためです。 図1D は、アカゲザルにおけるPERGの代表的な結果を示す。空間周波数とともに振幅が減少する理由は、上記と同じである。これらのデータを分析する際には、ピークと谷の間の振幅を分析するか、ピークまたはトラフの待機時間を統計として分析するかを選択できます。
図2 は、ヤギにおけるOCTの代表結果を示す。一番左の画像は赤外線カメラで撮影した眼深い写真です。右にぴりとは、RETInaの断層のトモグラムであり、ONHの周りのレチナの全体的な厚さと各層の厚さを示しています。写真に示すように、ヤギはサルよりも大きな残線血管を持っていることがわかります。右端の緑色のディスクは、ONHの周りのGCCの厚さの定量分析です。Gは一般的な略、Tは側側を表し、Nは鼻側を表し、Sは優れた略で、私は劣った略です。黒のフォントは、マイクロメートルのGCC厚さ測定値を表し、緑は、この実験の基準としてではなく、人間のための臨床基準測定値です。
図1:ヤギとアカゲザルにおける代表的な電気生理学的波形 (A) 代表FVEPは、同じ麻酔セッション内で個々のヤギから異なる光強度で波形を形成します。(B,D)代表PERGは、同じ麻酔セッション内で、個々のヤギ(B)またはアカゲザル(D)から異なる空間周波数で波形を形成します。(C) 代表PVEPは、同じ麻酔セッション内で個々のアカゲザルから異なる空間周波数で波形を形成します。各波形の典型的な暗黙の時間は、プロトコルセクションで説明されています。n = 各検定の被験者 1 つ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:OCTの結果 補助的な眼圧性OCT画像は、ヤギ(A)およびアカゲザル(B)の異なる周囲領域(右パネル)における視神経頭部(左パネル)およびGCCの厚さ。n = 各検定の被験者 1 つ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、ヤギとアカゲザルにおけるVEP、PERG、OCTのプロトコルを発表する。これらの インビボ 法は、緑内障、虚血性、外傷性視神経障害および視神経炎9などの様々な視神経障害の大規模な動物モデルに適用することができる。
PVEPはFVEP17より安定し、敏感である;しかし、goat9では引き出すものではありません。したがって、FVEPはヤギで行われ、PVEPは我々の研究室のアカゲザルで行われ、レチノ-ジェノロ-コルチカル経路の完全性を評価する。PERGがヤギに誘導できるがPVEPではなく、観測の根底にあるメカニズムは、我々の知見によればまだ不明である。ヤギの視神経機能と構造が人間と異なる可能性があります。
FVEPの振幅は瞳孔サイズと周囲光の影響を受ける可能性があるため、FVEP記録中に瞳孔を広げ、ヤギの頭の上に黒い毛布を置きます。クリニック17のFVEPには瞳孔拡張は必要ないことに注意する必要があります。同様に、診療所でのFVEP記録には暗い適応は必要ないが、FVEP記録前の周囲光への5分間の適応は、振幅におけるセッション内反復性を高める可能性があることがわかった。
PERG信号は、RMCから発生したと考えられるので、その振幅は、RMC13,20の機能を推定するために使用することができます。所性閾値応答(STR)や光陰性応答(PhNR)などの特殊なフラッシュERG成分と比較すると、PERGはRGC機能不全13に対してより敏感である。本研究におけるPERG試験の潜在的な制限は以下の通りである。まず、ISCEVは、平均輝度を一定に保つためにPERG記録のための古典的なCRT(陰極線管)刺激装置を使用することを推奨する。しかし、従来のCRT刺激装置は液晶ディスプレイ(LCD)よりも利用が少ない。LCDの画面は通常、パターン反転中に一過性の輝度の変化を示し、輝度artifact17を引き起こす可能性がありますが、以前の発見に従ってヤギのPERGの振幅に寄与しませんでした:12.6 cpdの空間周波数でのPERGの振幅は、通常、低い空間周波数の場合と比較して無視可能です9.もう 1 つの制限は、単純化のために PERG テストの前に屈折エラーを修正しなかったことです。この制限を補うためには、基準PERG振幅を基準として記録する必要があります。
我々の以前の研究は、VEPとPERG9のセッション内およびセッション間の変動を評価し、最適化していた。シラジンと比較すると、イゾフルランはヤギ9でより反復可能なFVEPが、より可変的なPERG波形をもたらしたことを発見した。そこで、ヤギでは、FVEP試験でイゾフルラン、ヤギではPERGおよびOCT試験でキシラジンを用いた。さらに、PERGと比較して、VEP記録はより可変的である可能性がある。そのため、各光強度または空間周波数でVEP記録を定期的に繰り返し、セッション内変動を確認します。対照的に、PERG波形ははるかに安定しています。したがって、一般的にPERG記録を繰り返しません。同じ主題に関する別の日に繰り返し記録することは一般的に推奨されますが、我々は、単純さと動物倫理のために、別の日に同じ主題にVEPまたはPERGの記録を定期的に繰り返しません。それにもかかわらず、セッション間の繰り返しのないFVEPおよびPERGの記録は、我々の以前の研究9によると視神経損傷を検出するのに十分敏感である。
レティナルOCTイメージングは、長手方向に監視し、レチン構造の動的変化を定量化するための便利で信頼性の高い非侵襲的な技術です。PERGおよびVEPと比較して、OCTのイメージ投射はずっとよい間セッションの反復性9を有する。さらに、OCTイメージングは、サンプリングエラーなしで数分以内にすべての視神経線維を捕捉して定量化することができ、従来の組織学的分析よりもはるかに安価で効果的な方法で、レチナル構造を調べる機会を提供します。しかし、現在のOCTイメージングの空間分解能は、個々のRGCソーマまたは視神経線維を伝えるには依然として制限されすぎている。さらに、OCTによって測定された厚いGCCは、GCCの肥厚が、腎浮腫または出血によって引き起こされる可能性があるため、必ずしもより無傷の内性のレチナを意味するわけではないことに注意すべきである。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、次の助成金によって資金提供されました: 中国の国家キーR&Dプログラム (2021YFA1101200);中国の国家主要研究開発プログラム(2016YFC1101200)、温州の医学研究プロジェクト(Y20170188)。中国国立自然科学財団(81770926;81800842);浙江省の主要な研究開発プログラム(2018C03G2090634);温州眼科病院の主要な研究開発プログラム(YNZD1201902)。スポンサーや資金調達組織は、この研究の設計や実施に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 47.6 x 26.8 cm monitors | DELL Inc. | E2216HV | The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens |
| 6.0 mm tracheal tube | Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd | PVC 6.0 | ensure the airway |
| alligator clip | |||
| atropine | Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. | reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation | |
| Carbomer Eye Gel | Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb | moisten the cornea and stabilize the recording electrodes | |
| ERG-Jet recording electrodes | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | 2300 La Chaux-De-Fonds | ERG recording |
| eye speculum | Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd | ZYD020 | open palpebral fissure |
| Heidelberg Spectralis OCT system | Heidelberg Engineering | OCT system | |
| Imaging | (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf) | ||
| isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22 | isoflurane anesthesia |
| male Saanen goats | Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) | The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg | |
| needle electrode | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | U51-426-G-D | use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes |
| periphery venous catheter intravenously | BD shanghai Medical Device Co., Ltd | 383019 | intravenous access for atropine and propofol |
| propofol | Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. | induce Isoflurane anesthesia in goat | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | SANTEN OY, Japan | 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride | |
| visual electrophysiology device | Gotec Co., Ltd | GT-2008V-III | use for FVEP & PERG |
| xylazine | Huamu Animal Health Products Co., Ltd. | xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg | |
| zoletil50 | Virbac | induce Isoflurane anesthesia in monkey |
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