Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ב-Vivo שיטות להערכת תפקוד ומבנה תאי גנגליון רשתית ועצבי הראייה בבעלי חיים גדולים

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מורידים בדרגה מספר בדיקות ויואו (פוטנציאל מעורר חזותי פלאש, אלקטרורטינוגרמה דפוס וטומוגרפיה קוהרנטיות אופטית) במקוק עזים ורזוס כדי להבין את המבנה והתפקוד של עצב הראייה והנוירונים שלו.

Abstract

עצב הראייה אוסף אותות אקסונים מתאי הגנגליון ברשתית ומשדר אות חזותי למוח. מודלים גדולים של בעלי חיים של פגיעה בעצב הראייה חיוניים לתרגום אסטרטגיות טיפוליות חדשניות ממודלים מכרסמים ליישום קליני בשל הדמיון הקרוב יותר שלהם לבני אדם בגודל ובאנטומיה. כאן אנו מתארים כמה שיטות vivo כדי להעריך את הפונקציה והמבנה של תאי גנגליון הרשתית (RGCs) ועצב הראייה (ON) בבעלי חיים גדולים, כולל פוטנציאל מעורר חזותי (VEP), אלקטרורטינוגרמה דפוס (PERG) וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT). במחקר זה הועסקו גם עיזים וגם פרימטים לא אנושיים. על ידי הצגת שיטות ויוו אלה צעד אחר צעד, אנו מקווים להגדיל את הרבייה הניסיונית בין מעבדות שונות ולהקל על השימוש במודלים בעלי חיים גדולים של נוירופתיות אופטיות.

Introduction

עצב הראייה (ON), המורכב אקסונים מתאי הגנגליון ברשתית (RGC), משדר אות חזותי מהרשתית למוח. מחלות ON, כגון גלאוקומה, נוירופתיה אופטית טראומטית או איסכמית, גרמו לעתים קרובות ניוון ON/ RGC בלתי הפיך ואובדן חזותי הרסני. למרות שיש כיום פריצות דרך רבות בהתחדשות ON והגנה על RGC במודלים מכרסמים1,2,3,4,5,6, טיפולים קליניים עבור רוב מחלות ON נותרו זהים במהותם בחצי המאה האחרונה עם תוצאה לא מספקת7,8 . כדי למלא את הפער בין מחקר בסיסי לפרקטיקה קלינית, מחקרים תרגומיים המשתמשים במודל בעלי חיים גדול של מחלות ON נחוצים ומועילים לעתים קרובות בגלל הדמיון האנטומי הקרוב יותר שלהם לבני אדם מאשר מודלים מכרסמים.

מקוק עזים ורזוס הם שני מינים גדולים של בעלי חיים המשמשים במעבדה שלנו לדגם מחלת ON של האדם. גודל גלגל העין של עז, ON, והמבנה הסמוך (חלל מסלולית ואף, בסיס הגולגולת וכו ') דומה לזה של אדם המבוסס על סריקת CT גולגולת9. ככזה, מודל עז מספק הזדמנות להעריך ולשכלל מכשירים טיפוליים או הליכים כירורגיים לפני השימוש בבני אדם. מקוק רזוס, כמו פרימט לא אנושי (NHP), יש מערכת חזותית ייחודית דמוית אדם שאינו קיים במינים אחרים10,11. בנוסף, תגובות פתולוגיות לפציעות וטיפולים ב- NHP דומה בהרבה לזה אצל בני אדם12.

בבדיקות vivo להערכת המבנה והתפקוד של ON ו- RGC חשובים במחקרים בבעלי חיים גדולים. אלקטרורטינוגרמה דפוס (PERG) שימש להערכת הפונקציה RGC. פוטנציאל עורר חזותי פלאש (FVEP) משקף את השלמות של מסלול רטינו-geniculo-קליפת המוח במערכת הראייה. לכן, PERG בשילוב עם FVEP יכול לשקף את הפונקציה ON9,13,14 . הדמיית טומוגרפיה של קוהרנטיות רשתית אופטית (OCT) יכולה להראות את מבנה הרשתית ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה, המאפשרת מדידה של עובי קומפלקס הגנגליון ברשתית (GCC)9,15. לבדיקות אלקטרופיזיולוגיות במחקר זה, ניטור סימנים חיוניים (קצב חום, קצב הפרה, לחץ דם) ורמת רוויית החמצן (SpO2) לפני הבדיקה הם קריטיים שכן לפרמטרים אלה יש השפעות חזקות על זרימת הדם העין ולכן על תפקוד מערכת הראייה. עם זאת, לא עקבנו אחר הסימנים החיוניים בעת ביצוע הדמיית רשתית OCT למען הפשטות. על פי המחקר הקודם שלנו9, עובי GCC נמדד על ידי הדמיית רשתית OCT הוא יציב למדי, עם מקדם בין מפגשים של וריאציה קרוב ל 3%. אלה במבחני vivo במקוק עז ורזוס תוארו בפירוט במחקר הקודם שלנו9. כאן אנו מציגים שיטות אלה כדי לסייע בהגברת השקיפות והשחזור הניסיוניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים נערכו אך ורק בהתאם להנחיות ARRIVE ומדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ודבקים בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה הרפואית וונג'ואו (WMU) ובמעבדה להצטרפות (סוג'ואו). זכרי עזי סאנן, בגילאי 4 עד 6 חודשים במשקל של 19-23 ק"ג, שוכנו במתקן בעלי החיים WMU. הזכרים מקוק רזוס, בגילאי 5 עד 6 שנים עם משקל של 5-7 ק"ג, שוכנו במתקן החיות Joinn. כל בעלי החיים נשמרו בחדר ממוזג עם טמפרטורה מבוקרת (21 ± 2 °C (70 °F) תחת מחזור אור 12 שעות / 12 שעות כהה עם ליביטום ad מזון.

1. פוטנציאל מעורר חזותי פלאש (FVEP) בעז

  1. עשיית עשייה כללית
    1. תגלח את השיער עם סכין גילוח אלקטרוני.
    2. הכן את העור על ידי שפשוף עם 70% אלכוהול שלוש פעמים כדי לנקות את העור, ולאחר מכן לחשוף את הווריד התת עורי.
    3. הכנס קטטר ורידי היקפי תוך ורידי (0.9 מ"מ x 25 מ"מ), ולאחר מכן הזריק אטרופין (0.025 מ"ג/ק"ג) ופרופופול (5 מ"ג/ קילוגרם).
    4. לצנרר את העז עם צינור קנה הנשימה 6 מ"מ ולחבר אותו למכונת הנשמה מלאכותית.
    5. לשמור על הרדמה עם 3.5% איזופלוראן בחמצן בקצב זרימה קבוע של 2 L/min.
      הערה: העז מתאוששת מן ההרדמה המושרה על ידי propofol בתוך דקות, כדי להיות מהיר לצנרר את העז.
  2. ניטור לב-ריאה
    1. מניחים את חיישן הטמפרטורה מתחת ללשון.
    2. חבר את אוקסימטר הדופק לקצה הפרוקסימלי של האוזן.
    3. לקשור את שרוול לחץ הדם לבסיס הירך.
    4. מהדקים את קליפי האק"ג על הגפיים בהתאם.
      הערה: קצב הלב הרגיל של עזים הוא 68-150 bpm. בשל השימוש בהרדמה גז, קצב הלב של עזים יגדל. לכן, קצב הלב שלנו במהלך הבדיקה הוא 170 ± 30 bpm. לחץ הדם הסיסטולי של עזים בתנאים רגילים הוא 110-130 מ"מ כ"ג, ולחץ הדם הדיאסטולי הוא 50-60 מ"מ ליש"ג. במצב של שאיפת חמצן, רוויית החמצן בדם של העז תמיד יכולה להישמר ב 99%. קצב הנשימה של עזים תחת הרדמה מסונכרן עם זה של מכונת ההנשמה, שהוא 10 נשימות / דקה. מאז הטמפרטורה נמדדה מתחת ללשון של העז, לא טמפרטורת הליבה, הטמפרטורה של העז היא בדרך כלל 35 ± 2 °C (70 °F).
  3. גולגולת ברגים השתלה ומיקום אלקטרודות
    1. תגלח את השיער עם קוצץ. לחטא את העור במרכז העצם הקדמית על ידי שפשוף עם כדור כותנה ספוג betadine ו 70% אלכוהול שלוש פעמים.
    2. השתמש ברגים מעוקרים ומספריים.
      הערה: מנעו אוטומטית את כל המכשירים הכירורגיים לעיקור (121 °C (20 דקות).
    3. בצע תפירת עור 5 מ"מ כדי לחשוף את העצם הקדמית עם מספריים עיניים, ולאחר מכן להשתיל בורג מעוקר במרכז העצם הקדמית באמצעות מברג.
    4. לגלח את השיער ולחטא את העור על עצם העורף המרכזית בין שתי אוזניים עם betadine ו 70% אלכוהול, אחד ואחריו השני, שלוש פעמים.
    5. בצע תפירת עור 5 מ"מ כדי לחשוף את עצם העורף עם מספריים עיניים, ולאחר מכן להשתיל בורג מעוקר במרכז העצם העורפית.
      הערה: המחט הקרקע לחשמל מוכנסת תת עורית מתחת בורג הגולגולת הקדמית. האלקטרודות הפעילות והמתייחסות מחוברות לברגים העורפיים והחזיתיים, בהתאמה, עם קליפים תנין כדי להפחית את המכשול האלקטרודה16.
  4. הכנת בעלי חיים
    1. השתמש בד עמיד לאור כדי לכסות את העין ולתקן על ידי כיסוי העיניים כדי תיקון עין אחת.
    2. יש למרוח טיפות עיניים הרדמה אקטואליות (טיפות עיניים הידרוכלוריד פרופראקאיות) על שתי העיניים. אישונים דו-צדדיים מתרחבים על ידי ניהול אקטואלי של טיפות עיניים רידריאטיות עם טרופיקמיד (5%) ופנילפרין (5%).
    3. מניחים את ראש העז לתוך ממריץ גנזפלד ומעמעמים את אור הסביבה.
      הערה: נמצא כי עזים יכולות לשמור על קיבוע גלגל העין טוב תחת הרדמה, ולכן אין צורך בהתערבות נוספת בפעולת קיבעון גלגל העין.
    4. מכסים את הממריץ ואת ראש העז בשמיכה שחורה במשך 5 דקות להסתגלות.
    5. השתמש בספקולום עפעפיים כדי לחשוף את הלחמית בולבאר. מקפלים את הטבעת העליונה, מושכים את העפעף העליון למעלה, ומכניסים תחילה את הטבעת העליונה לרק הלחמית של העפעף העליון ולאחר מכן לעפעף התחתון באופן דומה.
    6. לחץ על לחצן עקשנות כדי לבדוק את עקשמת המגע של רקמת האלקטרודה וערכי העכבה יוצגו בכל ערוץ.
    7. ודא כי המכשול הוא מתחת 10 kΩ עבור כל אלקטרודה כדי למנוע הפרעות אלקטרומגנטיות ממכשירים חשמליים אחרים באותו החדר.
      הערה: אם הוא מעל 10 kΩ, להתחבר מחדש או להחליף את האלקטרודה. העכבה עשויה להיראות גבוהה באופן חריג אם המיטה הכירורגית המתכת החשמלית, שבה שוכנת העז, מחוברת. העכבה צריכה להיות שונה בפחות מ-1 ק"ג בין האלקטרודות הפעילות והייחוסיות כדי להפחית הפרעות חשמליות17.
    8. לחץ על לחצן התנודה כדי לבדוק את רעש הבסיס ללא גירוי אור.
      הערה: אם יש רעש בסיסי גדול, נתק את כל המכשירים החשמליים האחרים באותו חדר וכבה טלפונים סלולריים. אם הבעיה הבסיסית נמשכת, עבור לשלב 1.3.10. כדי לבדוק אם ניתן לעורר צורת גל טיפוסית של FVEP. אם לא, תזמן מחדש את בדיקת FVEP במועד אחר.
    9. הפעל את הקלטת FVEP על-ידי בחירת עוצמת האור של 0.025, 0.5 ו- 3.0 cd·s/m2, בהתאמה בתיבת הרקע הלבנה בפינה השמאלית העליונה. לאחר מכן, לחץ על לחצן בדיקה . שים לב שהקלטת FVEP בכל עוצמת אור מתבצעת פעמיים.
      הערה: אם שני צורות הגל נראות שונות בעליל, יש צורך בחזרה אחת נוספת.
    10. להחית הקרנית עם טיפות עיניים דומעות מלאכותיות, אם היא נראית יבשה במצלמת האינפרא אדום.
      הערה: נטר את מיקום העין ממצלמת האינפרא-אדום המשולבת לפני ההקלטה כדי לוודא שהמבט החזותי נכון והמתון חשוף לחלוטין (כך שגודל השדה של גירוי הבזק הוא 90°. ניתן לכוונן את תנוחת העין של עז מרדים על ידי סיבוב ראשה בהתאם. בהתבסס על התצפית שלנו, נדידת מבט מתרחשת לעתים רחוקות במהלך הקלטת FVEP (~ 10 דקות) בעז תחת הרדמה כללית9. לכן אין צורך להשהות ולהתאים מחדש את המבט בעת ההקלטה.
    11. חזור על השלבים לעיל עבור העין הנגדית.
    12. הפסק את אספקת איזופלוראן והגדיל מעט את נפח הגאות והשפל במכונת ההנשמה כדי לעזור לעז להתאושש מהרדמה כללית.
    13. לאחר הרדמה כללית, לטפל בעז עם גנטמיצין (4 מ"ג/ קילוגרם, IM) ונתרן ceftiofur (צפלוספורין, 2 מ"ג / קילוגרם, IM) כדי למנוע זיהום.
  5. מדידת FVEP וניתוח כמותי
    הערה: כפי שמוצג באיור 1A, הפסגות החיוביות והשליליות הראשונות בטופס הגל FVEP מוגדרות כ-P1 ו-N1, והשיא החיובי השני הוא P2. הזמן המשתמע הטיפוסי של P1, N1 ו- P2 הוא בסביבות 40, 60 ו- 120 אלפיות שני, בהתאמה. משרעת P1 ו- P2 נמדדת מה שוקת של צורת גל N1 לפסגות של צורות גל P1 ו- P2, בהתאמה.
    1. במקרה של פגיעה חד-עינית, השתמש בהשוואה בין-עינית של משרעת וזמן מרומז כדי לסייע בהפחתת השונות הבין-עינית והגברה של הרגישות17.

2. PVEP במקוק רזוס

הערה: VEPs דפוס יכול להיות עורר מקוק רזוס9 והם יציבים יותר מאשר VEP פלאש משרעת וזמן מרומז17. לכן, PVEP שימש כדי לזהות את השלמות של מסלול רטינו-geniculo-קליפת המוח בפרימטים שאינם אנושיים.

  1. הכנת בעלי חיים
    1. מרדים את הקוף עם איזופלוראן (1.5%-2%) לאחר אינדוקציה עם Zoletil50 (4-8 מ"ג / קילוגרם IM, טילטמין / זולאזפאם).
    2. מקם את אלקטרודה הקרקע מעוקרת על תנוך האוזן. הכנס את הפעילות המעוקרת ומחשמלות הייחוס באופן תת עורי לאורך קו האמצע בעצם הקדמית והמערבית, בהתאמה.
    3. החל ספקולום עפעפיים כדי לחשוף את הלחמית בולוואר.
    4. השתמש בסרט שחור אטום דבק כדי לתקן את העין contralateral.
  2. הקלטת PVEP
    1. לחץ על לחצן עקשנות כדי לבדוק את עקשמת המגע של רקמת האלקטרודה וערכי העכבה יוצגו בכל ערוץ; ודא שהוא מתחת ל-10 ק"מ Ω. אם לא, להתחבר מחדש או להחליף את האלקטרודה.
    2. בדוק את ערכי העכבה בחלון בדיקת העכבה וודא שהעישול שונה בפחות מ- 1 kΩ בין האלקטרודות הפעילות והייחוסיות כדי להפחית הפרעות חשמליות17.
    3. לחץ על לחצן התנודה כדי לבדוק את רעש הבסיס ללא גירוי.
      הערה: אם יש רעש בסיסי גדול, נתק את כל המכשירים החשמליים האחרים באותו החדר וכבה את הטלפונים הסלולריים. אם הבעיה הבסיסית נמשכת, בצע שוב את בדיקת PVEP ביום אחר.
    4. הקלט תגובות PVEP של העין הלא מנוטרלת על-ידי בחירת עוצמת האור של מחזור/מעלה של 0.5 ו- 1.0, בהתאמה בתיבת הרקע הלבנה בפינה השמאלית העליונה ולאחר מכן לחץ על לחצן בדיקה .
      הערה: עבור כל הקלטה, 64 עקבות הם בממוצע כדי להניב צורת גל אחת. עבור כל תדר, מינימום של שתי הקלטות נרכשות כדי לאמת את יכולת הרבייה של אותות PVEP.
    5. חזור על ההליך לעין הנגדית.
    6. לאחר שתסיים, הפסק את אספקת האיזופלוראן כדי להעיר את הקוף.
    7. לאחר הרדמה כללית, לטפל בקוף עם gentamicin (4 מ"ג / קילוגרם IM) ונתרן ceftiofur (2 מ"ג / קילוגרם IM) כדי למנוע זיהום.
  3. מדידת PVEP וניתוח כמותי
    1. כפי שניתן לראות באיור 1B, הפסגות השליליות והחיוביות הראשונות בגלי PVEP הוגדרו כ-N1 ו-P1, המתרחשות בדרך כלל בסביבות 50 ו-90 מיליות. משרעת P1 נמדדת מה שוקת N1 לשיא של P1.
    2. במקרה של פגיעה חד-עינית, השתמש בהשוואה בין-עינית של משרעת וזמן מרומז כדי לסייע בהפחתת השונות ההדדית ולהגברת הרגישות17.

3. תבנית ERG (PERG) בעז

הערה: במחקר הקודם, לא נצפתה שום צלב בין-עיני של אות PERG בעזים, כך שניתן להקליט תגובות PERG בו זמנית משתי העיניים9.

  1. הכנה לבדיקה
    1. להרדים את העז באמצעות קסילאסין (3 מ"ג/ק"ג, IM), ומניחים על שולחן בחינות.
    2. מניחים חיישן טמפרטורה מתחת ללשון העז.
    3. חבר את אוקסימטר הדופק לקצה הפרוקסימלי של אוזן העז.
    4. לקשור את שרוול לחץ הדם לירך.
    5. מהדקים את קליפסים אק"ג על הגפיים בהתאם.
    6. כדי להפחית את עכום האלקטרודה, הנח בורג גולגולת מעוקר על העצם הקדמית והתחבר לאלקטרודה הקרקעית עם קליפ תנין.
    7. מניחים שתי אלקטרודות מחט מעוקרות מתחת לת עורית 1 ס"מ מאחורי הקנתי הצדדי משני הצדדים.
    8. השתמש בספקולום העפעפיים כדי לחשוף את הלחמית בולבאר.
    9. מניחים שתי אלקטרודות הקלטה ERG-Jet מחוטאות במרכז קרניות דו-צדדיות לאחר יישום אקטואלי של קרע מלאכותי.
    10. הנח שני צגי LED בגודל 47.6 ס"מ על 26.8 ס"מ מול שתי העיניים עם מרחק צפייה של 50 ס"מ.
    11. כוונן כל צג כך שיהיה מקביל למישור האישון באותו צד ויישר את מרכז הצג למישור האישון.
    12. ודא שלוח הסימון היפוך הניגודיות (תדר זמני, 2.4 הרץ) מוצג בשני הצגים ויש לו יחס גובה-רוחב מרבי של 4:3, המוגדר על-ידי הגדרות הציוד.
    13. ודא כי הניגודיות בין דמקה לבנה לשחור נשארה 96%, ואת הזוהר הממוצע הוא 200 cd / m2 (קנדלה למ"ר), אשר נבדק על ידי מד הזוהר.
      הערה: על פי ISCEV, זוהר פוטוסקופי ממוצע של 40-60 cd/m2 נדרש בבני אדם17. במחקר אחר באמצעות מודל עכברים, התבנית נשארה זוהר ממוצע של 800 cd / m2,18. גודל שדה של לפחות 15° בממד הצר ביותר שלו נדרש לבדיקת PERG סטנדרטית בבני אדם17. התאם את המיקום של אלקטרודה קרנית אם זה לא במרכז פני הקרנית.
  2. הקלטת PERG
    1. עמעמו את אור הסביבה ולחצו על כפתור העכבה כדי לבדוק את עקשמת המגע של רקמת האלקטרודה. ערכי העכבה יוצגו בכל ערוץ.
    2. בדוק את ערכי העכבה בחלון בדיקת העכבה וודא שהעישול הוא מתחת ל- 10 kΩ. אם לא, להתחבר מחדש או להחליף את האלקטרודה.
    3. לחץ על לחצן התנודה כדי לבדוק את רעש הבסיס ללא גירוי אור.
      הערה: שימו לב כדי להגן על אלקטרודות ההקלטה השברירית ERG-Jet. רעש בסיסי ב- PERG הוא בדרך כלל קטן יותר מזה ב- FVEP בעז.
    4. התחל הקלטה PERG משתי העיניים בו זמנית בתדרים המרחביים של 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ו 12.6 מחזורים/ מעלה ברציפות. עבור כל תדר מרחבי, 64 עקבות הם בממוצע כדי להניב קריאה אחת.
    5. לבסוף, כבה את הצג כדי להקליט PERG ללא גירוי חזותי כשליטה שלילית.
      הערה: אותות PERG הם בדרך כלל יציבים ואינם צריכים לחזור על עצמם.
    6. הסר את בורג הגולגולת הקדמית להעיר את העז על ידי הזרקת Idzoxan (1.5 מ"ג / קילוגרם), שהוא אנטגוניסט קסילאצין.
    7. לאחר הרדמה כללית, לטפל בעז עם גנטמיצין (4 מ"ג/ קילוגרם IM) ונתרן ceftiofur (2 מ"ג / קילוגרם IM) כדי למנוע זיהום.
  3. מדידת PERG וניתוח כמותי
    1. הגדר את מסנן bandpass לטווח שבין 1 ל- 75 הרץ. עבור 3.0 cpd PERG, מסנן bandpass מוגדר להיות מ- 1 עד 50 הרץ כדי להחליק את המעקב מבלי להשפיע על המשרעת שלו.
    2. כפי שניתן לראות באיור 1C, הפסגות החיוביות והשליליות הראשונות בטופס הגל מוגדרות כ-P1 (בדרך כלל בסביבות 25 מיל') ו-N1 (בדרך כלל כ-55 מיל'). משרעת PERG נמדדת מ- N1 ל- P1.
    3. במקרה של פגיעה חד-עינית, אנו משתמשים בהשוואה בין-עינית של משרעת וזמן מרומז כדי לסייע בהפחתת השונות ההדדית ולהפחית את הרגישות17.

4. פרג במקוק רזוס

הערה: לא ברור אם יש שיחה צולבת בין-עינית של אות PERG במקוק רזוס, ולכן תגובות PERG משתי העיניים נרשמות בנפרד.

  1. הכנה לבדיקה
    1. מרדים את הקוף עם איזופלוראן (1.5%-2%) לאחר הזרקת Zoletil50 (4-8 מ"ג / קילוגרם IM, טילאמין / זולאזפאם) וצנרול קנה הנשימה.
    2. מניחים אדמה מעוקרת מתחשמלת תת עורית על העצם הקדמית. הכנס מחט מחט מעוקרת לחשמל תת עורית, 1 ס"מ מאחורי הקנתוס לרוחב באותו צד.
    3. מניחים אלקטרודה הקלטה ERG-Jet מחוטא על הקרנית המרכזית לאחר יישום אקטואלי של קרע מלאכותי.
      הערה: התאם את המיקום של אלקטרודה קרנית, אם זה לא במרכז פני הקרנית.
    4. השתמש בסרט שחור אטום דבק כדי לתקן עין אחת.
    5. מקם צג (47.6 x 26.8 ס"מ) במרחק צפייה של 50 ס"מ.
    6. ודא שהצג מותאם להיות מקביל למישור האישון. ישר את מרכז הצג למישור האישון.
    7. ודא שלוח הסימון בשחור-לבן מתהפך בתדר של 2.4 הרץ, ויחס הרוחב-גובה הוא 4:3, המוגדר על-ידי הגדרות הציוד.
    8. ודא כי הניגוד בין דמקה לבנה ושחורה הוא 96%, ואת הזוהר הממוצע נשאר 200 cd/m2, אשר נבדק על ידי מד זוהר.
  2. הקלטת PERG
    1. עמעמו את אור הסביבה ובדקו את עכומת המגע של רקמת האלקטרודה.
    2. ודא כי העכבה היא מתחת 10 kΩ. אם לא, להתחבר מחדש או להחליף את האלקטרודה.
    3. בדוק את הרעש הבסיסי ללא גירוי אור.
    4. תיקון עין אחת ולהתחיל הקלטה PERG מהעין השנייה בתדרים מרחביים של 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, ו 12.6 מחזורים / מעלה ברציפות.
    5. חזור על השלבים 4.2.1-4.2.4 עבור העין הנגדית.
    6. הפסק אספקת איזופלוראן כדי להעיר את הקוף.
    7. לאחר הרדמה כללית, לטפל בקוף עם gentamicin (4 מ"ג/ק"ג IM) ונתרן ceftiofur (2 מ"ג / קילוגרם IM) כדי למנוע זיהום.
  3. מדידת PERG וניתוח כמותי
    1. כפי שניתן לראות באיור 1D, הפסגות החיוביות והשליליות הראשונות בצורת הגל מוגדרות כ-P1 (בדרך כלל בסביבות 40 אלפיות השנייה) ו-N1 (בדרך כלל בסביבות 85 אלפיות השנייה). משרעת PERG נמדדת מ- N1 ל- P1.
    2. במקרה של פגיעה חד-עינית, אנו משתמשים בהשוואה בין-עינית של משרעת וזמן מרומז כדי לסייע בהפחתת השונות ההדדית והגברה של הרגישות17.

5. OCT בעז

  1. הכנת בעלי חיים
    1. מרדים את העז באמצעות קסיליזין (3 מ"ג/ק"ג, IM), ולאחר מכן צנרור.
    2. להרחיב את האישון על ידי ניהול אקטואלי של טיפות עיניים רידריאטיות עם טרופיקמיד (5%) ו פנילפרין (5%).
    3. השתמש בספקולום העפעפיים כדי לחשוף את האישון באופן מלא.
    4. מניחים את ראש העז על משענת הסנטר.
      הערה: למרות המרדים גז אינו מבוצע, לצנרר את העז באופן קבוע כדי להגן על דרכי הנשימה מפני דחיסה על ידי שאר הסנטר.
  2. הדמיית OCT
    הערה: הדמיית OCT הרשתית מבוצעת באמצעות מערכת OCT אורך גל של 870 ננומטר במחקר זה. הרזולוציה צירית אופטית של סורק OCT היא 12 מיקרומטר. מצב סריקה מעגלית משמש לסריקת ראש עצב הראייה (ONH) במצב ברזולוציה גבוהה. 100 מסגרות משויכות בממוצע כדי למטב את איכות התמונה. מדריך ההדרכה המפורט זמין באינטרנט (ראה טבלת חומרים).
    1. סריקת OCT ראשונית (בחינה בסיסית)
      1. לחץ על לחצן התחל כדי להיכנס לממשק הזיהוי. המתן עד שהמחשב יסיים לטעון ולאחר מכן לחץ על לחצן התחל הצהוב כדי להתחיל את ההדמיה.
      2. יישר את העז עם מצלמת האינפרא-אדום כדי למרכז את ה- ONH בתמונת הלייזר אופטלמוסקופיה (cSLO) של הסריקה הקונפוקלרית על-ידי שינוי תנוחת הראש שלה.
      3. התאם את הג'ויסטיק כדי להאיר באופן שווה את כל תמונת האינפרא-אדום כדי לשפר את איכות התמונה.
      4. הזז את הג'ויסטיק קדימה עד שתמונת OCT של רשתית זקופה מוצגת על המסך הזקוף.
      5. שנה את הג'ויסטיק כך שתהיה לו תמונת OCT רשתית צפופה ואופקית.
      6. לחץ על הכפתור על הג'ויסטיק כדי לתפוס את התמונה באופן אוטומטי ולהחזיק את הג'ויסטיק כדי לשמור על איכות התמונה במסך התמונה החיה עד להשלמת רכישת התמונה. לאחר מכן, לחץ על רכוש.
      7. להעיר את העז על ידי הזרקת Idzoxan (1.5 מ"ג/ קילוגרם), שהוא אנטגוניסט קסילאצין.
        הערה: מיקוד ה- ONH במבחן הבסיס מסייע ליישר את הסריקה הבסיסית ואת סריקת המעקב בהתאם לניסיון שלנו.
    2. סריקת OCT להמשך טיפול
      1. בחר תמונת OCT ראשונית באיכות גבוהה; לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הגדר הפניה.
      2. ליזום הדמיית OCT כאמור לעיל.
      3. לחץ על לחצן המשך טיפול כדי לאפשר התאמה אוטומטית של הסריקה הנוכחית לסריקת הייחוס.
      4. לאחר ההתאמה (טבעת הסריקה המעגלית הופכת לירוקה), לחץ על הלחצן על הג'ויסטיק כדי להפעיל מעקב אוטומטי בזמן אמת.
      5. להעיר את העז על ידי הזרקת Idzoxan (1.5 מ"ג/ קילוגרם ), שהוא אנטגוניסט קסילאצין.
        הערה: כדי להקל על תהליך ההתאמה, (1) להזיז את ONH בחלון החי על-ידי סיבוב הראש בהתאם או (2) לסובב את ONH בחלון החי על-ידי הטיית הראש כדי להפוך את התמונה הנוכחית cSLO להיראות דומה יותר לתמונת הבסיס. רפלקס זה של עינית וסטיבולו עובד היטב תחת הרדמה קסילסין19.
  3. מדידת OCT
    1. לחץ על לחצן מדידה כדי להזין את חלון המדידה.
    2. בחר את כלי המחק ומחק את קו RNFL, המסומן באופן אוטומטי על-ידי התוכנית.
    3. בחרו בכלי ציור קו כדי לחלק באופן ידני את הגבול בין IPL ל- INL (איור 2).
      הערה: ניתן לקרוא עובי GCC בשישה אזורים peripapillary (T, TS, TI, N, NS, NI) ועובי GCC ממוצע סביב ONH (G) על המסך (איור 2). מבחן התלמיד, ANOVA בכיוון אחד או ANOVA דו כיווני ניתן להשתמש כדי לכמת את נתוני OCT במקרה של הפצה נורמלית.

6. OCT במקוק רזוס

  1. בצע הדמיית OCT רשתית מקוק רזוס באמצעות אותו ציוד והליך כמו שנעשה במקרה של עז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1A מציג תוצאות מייצגות של FVEP בעז. למרות צורות הגל באותה עוצמת הבזק יש דמיון יחסי, אנו עדיין ממליצים לבחון את צורות הגל פעמיים. גלים אלקטרומגנטיים הנוצרים על ידי מכשירים אלקטרוניים יפריעו לאותות החשמליים שנאספו, וכתוצאה מכך רעש בסיסי גבוה ויכולת חזרה לקויה של צורת הגל. לכן, מומלץ לוודא כי אין מכשירים אלקטרוניים מיותרים המחוברים לסביבה שמסביב במהלך בדיקה אלקטרופיזיולוגית כדי למנוע הפרעות כאלה, ומומלץ לחזור על לפחות שתי מדידות כדי לקבוע את היציבות ואת החזרה של תוצאות ניסיוניות. כאשר תיקון שתי העיניים, צורות הגל שטוחות לחלוטין על שתי העיניים, מה שמראה כי צורות הגל בהחלט מייצרות מגירוי הפלאש שלנו. איור 1B מציג תוצאות מייצגות של PERG בעז. בשל יציבותו והאות הגבוה, אנו רוכשים צורת גל אמינה רק על ידי מדידה חד פעמית בכל תדר מרחבי. ככל שתדר המרחב גדל, גודל לוח הסימון יעלה בהדרגה על ההכרה בעיני העז. אז אנחנו יכולים לראות שב 12.7 CPD, צורת הגל PVEP ירדה הרבה. בדומה ל- FVEP, צורת הגל נעלמת כאשר אנו סוגרים את המסך. איור 1C מציג תוצאות מייצגות של PVEP במקוק רזוס. אנחנו חוזרים על המדידה פעמיים בכל תדר מרחבי. ככל שתדר המרחבי יגדל, המשרעת תרד. זאת בשל העובדה כי התדירות המרחבית עולה על התפיסה של העין. איור 1D מציג תוצאות מייצגות של PERG במקוק רזוס. הסיבה לכך שהמשרעת פוחתת עם התדר המרחבי זהה למתואר לעיל. בעת ניתוח נתונים אלה, באפשרותך לבחור לנתח את המשרעת בין הפסגות והאבוסים או את זמן ההשהיה של הפסגות או שוקת כסטטיסטיקה.

איור 2 מציג את התוצאות הייצוגיות של OCT בעז. התמונה השמאלית ביותר מציגה תמונת פונדוס שצולמה על ידי מצלמת אינפרא אדום. בחוזקה ימינה הוא טומוגרמה של הרשתית, מראה את העובי הכולל של הרשתית סביב ONH ואת העובי של כל שכבה. כפי שניתן לראות בתמונה, אנו יכולים לראות בבירור כי עזים יש כלי דם רשתית גדולים יותר מאשר קופים. הדיסקים הירוקים בצד ימין הקיצוני הם ניתוח כמותי של עובי ה- GCC סביב ONH. G מייצג כללי, T מייצג את הצד הזמני, N מייצג את צד האף, S מייצג מעולה, ואני מייצג נחות. הגופן השחור מייצג את ערך מדידת עובי GCC במיקרומטרים, והירוק הוא ערך מדידת הייחוס הקליני עבור בני אדם, ולא כהתייחסות לניסוי זה.

Figure 1
איור 1: צורות גל אלקטרופיזיולוגיות מייצגות במקוק עזים ורזוס. (A) צורת גל FVEP מייצגת בעוצמות אור שונות מעז בודדת באותה פגישת הרדמה. (ב,ד) צורת גל PERG מייצגת בתדרים מרחביים שונים מעיז בודד (B) או מקוק רזוס (D) באותה פגישת הרדמה. (C) צורות גל PVEP מייצגות בתדרים מרחביים שונים ממקוק רזוס בודד באותה הרדמה. הזמן המשתמע האופייני של כל צורת גל מוזכר במקטע פרוטוקול. n = נושא אחד עבור כל בדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות OCT. תמונות OCT רשתית מייצגות סביב ראש עצב הראייה (פאנל שמאלי) ועובי GCC באזורים שונים peripapillary (פאנל ימני) בעז (A) ו רזוס מקוק (B). n = נושא אחד עבור כל בדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול של VEP, PERG, ו- OCT במקוק עז ורזוס. שיטות ויואו אלה ניתן ליישם במודלים בעלי חיים גדולים של נוירופתיות אופטיות שונות, כגון גלאוקומה, איסכמי, או נוירופתיה אופטית טראומטית ודלקת עצבים אופטית9.

PVEP יציב ורגיש יותר מאשר FVEP17; עם זאת, זה לא יכול להיות עורר goat9. ככזה, FVEP מבוצע עז ו PVEP מבוצע מקוק רזוס במעבדה שלנו כדי להעריך את השלמות של מסלול רטינו-geniculo-קליפת המוח. המנגנון שבבינס התצפית כי PERG, אבל לא PVEP, יכול להיות מושרה עז עדיין לא ברור על פי הידע שלנו. ייתכן כי תפקוד עצב הראייה ומבנה עז עשוי להיות שונה מבני אדם.

מאז המשרעת של FVEP עשוי להיות מושפע גודל אישון ואור הסביבה, אנו להרחיב את האישון ומניחים שמיכה שחורה על ראש העז במהלך הקלטת FVEP. יש לשים לב כי רחבת אישונים אינה נחוצה עבור FVEP במרפאות17. באופן דומה, למרות הסתגלות כהה אינו הכרחי להקלטת FVEP במרפאות, מצאנו כי הסתגלות 5 דקות לאור הסביבה לפני הקלטת FVEP עשוי להגביר את יכולת חזרה אינטרזיה משרעת.

אות PERG הוא חשב שמקורו RGCs ולכן המשרעת שלה יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציה של RGCs13,20. בהשוואה לכמה רכיבי ERG פלאש מיוחדים, כגון תגובת סף scotopic (STR) ותגובה שלילית פוטופית (PhNR), PERG רגיש יותר לתפקוד לקוי של RGC13. המגבלות הפוטנציאליות של מבחן PERG במחקר זה הן כדלקמן. ראשית, ISCEV ממליצה להשתמש ממריץ CRT (צינור קרן קתודה) קלאסי להקלטת PERG כדי לשמור על זוהר ממוצע קבוע. עם זאת, ממריץ CRT הקלאסי זמין פחות מתצוגת קריסטל נוזלי (LCD). למרות המסך של LCD בדרך כלל מציג שינויים זוהר חולף במהלך היפוך דפוס, פוטנציאל גרימת ממצא זוהר17, זה לא תרם למשרעת של PERG בעז על פי הממצא הקודם שלנו: המשרעת של PERG בתדר המרחבי של 12.6 cpd הוא בדרך כלל מוזנח לעומת אלה בתדרים מרחביים נמוכים9 . מגבלה נוספת היא שלא תיקנו שגיאת שבירה לפני בדיקת PERG למען הפשטות. כדי לפצות על מגבלה זו, יש לרשום משרעת PERG בסיסית כהפניה.

המחקר הקודם שלנו העריך ומיטב את השונות תוך-מפגשית של VEP ו- PERG9. מצאנו כי בהשוואה קסילסילאזין, איזופלוראן הביא FVEP חוזר יותר אבל צורות גל PERG משתנות יותר בעזים9. לכן, השתמשנו איזופלוריין במבחן FVEP וקסילסין במבחן PERG ו OCT בעזים. בנוסף, בהשוואה ל- PERG, הקלטת VEP עשויה להיות משתנה יותר. ככזה, אנו חוזרים באופן קבוע על הקלטת VEP בכל עוצמת אור או תדר מרחבי כדי לבדוק את וריאציית האינטרס-ession. לעומת זאת, צורות גל PERG הרבה יותר יציבות. לכן, אנחנו בדרך כלל לא חוזרים על הקלטת PERG. למרות הקלטה חוזרת ביום אחר באותו נושא מומלץ בדרך כלל, אנחנו לא חוזרים באופן קבוע VEP או הקלטת PERG באותו נושא ביום אחר למען פשטות ואתיקה בעלי חיים. עם זאת, הקלטות FVEP ו- PERG ללא חזרה בין מפגשים רגישות מספיק כדי לזהות פגיעה בעצב הראייה על פי המחקר הקודם שלנו9.

הדמיית רשתית OCT היא טכניקה נוחה, אמינה ולא פולשנית לניטור אורך וכימות שינויים דינמיים במבנה הרשתית. בהשוואה ל- PERG ו- VEP, להדמיית OCT יש יכולת חזרה הדדית טובה בהרבה9. יתר על כן, הדמיית OCT יכולה ללכוד ולכומת את כל סיבי עצב הראייה בתוך דקות ללא טעות דגימה, ומציעה הזדמנות זולה ויעילה בהרבה לבחון את מבנה הרשתית מאשר ניתוח היסטולוגי מסורתי. עם זאת, הרזולוציה המרחבית של הדמיית OCT הנוכחית עדיין מוגבלת מכדי לספר לסומה או סיבי עצב אופטיים בודדים של RGC. בנוסף, יש לשים לב כי GCC עבה יותר נמדד על ידי OCT לא בהכרח אומר רשתית פנימית שלם יותר כי עיבוי GCC עלול להיגרם על ידי בצלקת רשתית או דימום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי המענקים הבאים: תוכנית המפתח הלאומית של סין (2021YFA1101200); פרויקט המחקר הרפואי של וונג'ואו (Y20170188), תוכנית המחקר והמחקר הלאומית של סין (2016YFC1101200); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81770926;81800842); תוכנית מפתח למו"פ של מחוז ג'ה-ג'יאנג (2018C03G2090634); ותוכנית מפתח מו"פ של בית החולים עין וונג'ואו (YNZD1201902). לארגון החסות או למימון לא היה כל תפקיד בעיצוב או בהתנהלות של מחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
  2. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  3. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
  4. Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
  7. Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
  8. Singman, E. L., et al. Indirect traumatic optic neuropathy. Military Medical Research. 3, 2 (2016).
  9. Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
  10. Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
  11. Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
  12. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  13. Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
  14. Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
  15. Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
  16. You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
  17. Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
  18. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
  19. Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
  20. Porciatti, V. The mouse pattern electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).

Tags

מדעי המוח גיליון 180
<em>ב-Vivo</em> שיטות להערכת תפקוד ומבנה תאי גנגליון רשתית ועצבי הראייה בבעלי חיים גדולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter