Summary
Burada, optik sinirin ve nöronlarının yapısını ve işlevini anlamak için keçi ve rhesus makakında birkaç in vivo testi (flaş görsel uyarılmış potansiyel, desen elektroretinogramı ve optik koherens tomografisi) demostrate ediyoruz.
Abstract
Optik sinir, retina ganglion hücrelerinden akson sinyallerini toplar ve beyne görsel sinyal iletir. Optik sinir hasarının büyük hayvan modelleri, boyut ve anatomi olarak insanlara daha yakın benzerlikleri nedeniyle kemirgen modellerinden klinik uygulamaya yeni terapötik stratejilerin çevrilmesi için gereklidir. Burada, görsel uyarılmış potansiyel (VEP), desen elektroretinogram (PERG) ve optik koherens tomografi (OCT) dahil olmak üzere büyük hayvanlarda retina ganglion hücrelerinin (RGC'ler) ve optik sinirin (ON) işlevini ve yapısını değerlendirmek için bazı in vivo yöntemleri açıklıyoruz. Bu çalışmada hem keçi hem de insan dışı primat istihdam edilmiştir. Bu in vivo yöntemleri adım adım sunarak, farklı laboratuvarlar arasında deneysel tekrarlanabilirliği artırmayı ve optik nöropatilerin büyük hayvan modellerinin kullanımını kolaylaştırmayı umuyoruz.
Introduction
Retina ganglion hücrelerinden (RGC) gelen aksonlardan oluşan optik sinir (ON), retinadan beyne görsel sinyal iletir. Glokom, travmatik veya iskemik optik nöropati gibi ON hastalıkları genellikle geri dönüşü olmayan ON / RGC dejenerasyonuna ve yıkıcı görme kaybına neden oldu. Kemirgen modellerinde ON rejenerasyon ve RGC korumasında şu anda birçok atılım olmasına rağmen1,2,3,4,5,6, ON hastalıklarının çoğu için klinik tedaviler son yarım yüzyılda tatmin edici olmayan sonuçlarla temelde aynı kaldı7,8 . Temel araştırma ve klinik uygulama arasındaki boşluğu doldurmak için, ON hastalıklarının büyük hayvan modelini kullanan çeviri çalışmaları, insanlara kemirgen modellerinden daha yakın anatomik benzerlikleri nedeniyle genellikle gerekli ve faydalıdır.
Keçi ve rhesus makaklar, laboratuvarımızda insanın ON hastalığını modellemek için kullanılan iki büyük hayvan türüdür. Bir keçinin göz küresi, ON ve bitişik yapının büyüklüğü (orbital ve burun boşluğu, kafatası tabanı, vb.) kafatası CT taramasına dayanan bir insanınkine benzer9. Bu nedenle, keçi modeli insanlarda kullanılmadan önce terapötik cihazları veya cerrahi prosedürleri değerlendirmek ve iyileştirmek için bir fırsat sağlar. Rhesus makak, insan olmayan primat (NHP) olarak, diğer türlerde bulunmayan insan benzeri benzersiz bir görsel sisteme sahiptir10,11. Ek olarak, NHP'deki yaralanmalara ve tedavilere verilen patofizyolojik yanıtlar insanlardakine çok benzer12.
ON ve RGC'nin yapısını ve işlevini uzunlamasına değerlendirmek için in vivo testler büyük hayvan çalışmalarında önemlidir. RGC fonksiyonunu değerlendirmek için desen elektroretinogramı (PERG) kullanılmıştır. Flash görsel uyarılmış potansiyel (FVEP), retino-geniculo-kortikal yolun görsel sistemdeki bütünlüğünü yansıtır. Böylece, PERG FVEP ile birlikte ON işlevini yansıtabilir9,13,14 . Retina optik koherens tomografisi (OCT) görüntülemesi, retina ganglion kompleksinin (GCC)9,15 kalınlığının ölçülmesine olanak sağlayan yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip retina yapısını gösterebilir. Bu çalışmadaki elektrofizyolojik incelemeler için, testten önce hayati belirtilerin (ısı oranı, ihlal oranı, kan basıncı) ve oksijen doygunluk seviyesinin (SpO2) izlenmesi çok önemlidir, çünkü bu parametrelerin oküler kan akışı ve dolayısıyla görsel sistemin işlevi üzerinde güçlü etkileri vardır. Ancak, basitlik adına OCT retina görüntüleme yaparken hayati belirtileri izlemedik. Önceki çalışmamıza göre9, OCT retina görüntüleme ile ölçülen GCC kalınlığı oldukça kararlıdır ve seanslar arası değişim katsayısı% 3'e yakındır. Keçi ve rhesus makaklarındaki bu in vivo testler önceki çalışmamızda ayrıntılı olarak açıklanmıştır9. Burada deneysel şeffaflığı ve tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olmak için bu yöntemleri sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler kesinlikle ARRIVE yönergelerine ve Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzuna uygun olarak yapıldı ve Wenzhou Tıp Üniversitesi (WMU) ve Joinn Laboratuvarı'ndaki (Suzhou) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uyuldu. Yaşları 4 ila 6 ay arasında değişen ve ağırlığı 19-23 kg olan erkek Saanen keçileri WMU hayvan tesisinde barındırıldı. Yaşları 5-7 kg olan 5 ila 6 yaş arası erkek Rhesus makakları Joinn hayvan tesisinde barındırıldı. Tüm hayvanlar, gıda ad libitum ile 12 saat ışık / 12 saat karanlık döngü altında kontrollü sıcaklık (21 ± 2 ° C) ile klimalı bir odada muhafaza edildi.
1. Flaş görsel keçi potansiyeli (FVEP) çağrıştırdı
- Genel anestezi
- Rehin kıllarını elektronik jiletle tıraş edin.
- Cildi temizlemek için üç kez% 70 alkolle ovalayarak cildi hazırlayın ve ardından deri altı damarını ortaya çıkarın.
- Periferik venöz kateteri intravenöz (0,9 mm x 25 mm) yerleştirin ve ardından atropin (0,025 mg/kg) ve propofol (5 mg/kg) enjekte edin.
- Keçiyi 6 mm trakeal tüple entübe edin ve suni bir solunum cihazına bağlayın.
- Oksijende %3,5 izofluran ile anesteziyi 2 L/dk sabit bir akış hızında koruyun.
NOT: Keçi birkaç dakika içinde propofolün neden olduğu anesteziden iyileşir, bu nedenle keçiyi entübe etmek için hızlı olun.
- Kardiyopulmoner izleme
- Sıcaklık sensörini dilin altına yerleştirin.
- Nabız oksimetresini kulağın proksimal ucuna bağlayın.
- Kan basıncı manşetini uyluğun tabanına bağlayın.
- EKG klipslerini uzuvlara uygun şekilde sıkıştırın.
NOT: Keçilerin normal kalp atış hızı 68-150 bpm'dir. Gaz anestezisi kullanımı nedeniyle keçilerin kalp atış hızı artacaktır. Bu nedenle, muayene sırasında kalp atış hızımız 170 ± 30 bpm'dir. Normal şartlarda keçilerin sistolik kan basıncı 110-130 mmHg, diyastolik kan basıncı ise 50-60 mmHg'dir. Oksijen soluma durumunda, keçinin kan oksijen doygunluğu her zaman% 99 oranında tutulabilir. Anestezi altındaki keçilerin nefes alma hızı, 10 nefes/ dk olan ventilatörünkiyle senkronize edilir. Sıcaklık çekirdek sıcaklığından değil, keçinin dilinin altından ölçüldüğünden, keçinin sıcaklığı genellikle 35 ± 2 °C'dir.
- Kafatası vidaları implantasyon ve elektrot yerleşimi
- Saçları bir makasla tıraş edin. Betadin ve% 70 alkole batırılmış bir pamuk topu ile üç kez ovalayarak ön kemiğin ortasındaki cildi dezenfekte edin.
- Sterilize edilmiş vidalar ve makas kullanın.
NOT: Sterilizasyon için tüm cerrahi aletleri otoklavlayın (121 °C, 20 dk). - Ön kemiği oftalmik bir makasla ortaya çıkarmak için 5 mm'lik bir cilt kesisi yapın ve ardından bir tornavida kullanarak ön kemiğin ortasına sterilize edilmiş bir vida takın.
- Saçı tıraş edin ve merkezi oksipital kemikteki cildi betadin ve% 70 alkol ile iki kulak arasında dezenfekte edin, biri diğeri üç kez takip eder.
- Oksipital kemiği oftalmik bir makasla ortaya çıkarmak için 5 mm'lik bir cilt kesisi yapın ve ardından oksipital kemiğin ortasına sterilize edilmiş bir vida takın.
NOT: Zemin iğnesi elektrodu, ön kafatası vidasının altına deri altından yerleştirilir. Aktif ve referans elektrotlar sırasıyla oksipital ve ön vidalara elektrot empedansını azaltmak için timsah klipsleri ile bağlanır16.
- Hayvan hazırlığı
- Gözü kapatmak için ışık geçirmez bez kullanın ve bir gözü yamalamak için göz bağından sabitleyin.
- Her iki göze de topikal anestezik damlalar (proparakanin hidroklorür damla damlaları) uygulayın. bilateral gözbebekleri, midriyatik damlaların tropicamid (%5) ve fenilefrin (%5) ile topikal olarak verilmesiyle genişler.
- Keçinin başını Ganzfeld uyarıcısına yerleştirin ve ortam ışığını karartın.
NOT: Keçilerin anestezi altında iyi göz küresi fiksasyonunu sürdürebildiği, bu nedenle ekstra göz küresi fiksasyon operasyonu müdahalesine gerek olmadığı bulunmuştur. - Adaptasyon için uyarıcıyı ve keçinin başını 5 dakika boyunca siyah bir battaniye ile örtün.
- Bulbar konjonktivayı açığa çıkarmak için göz kapağı spekulumunu kullanın. Üst halkayı katlayın, üst göz kapağını yukarı çekin ve üst halkayı önce üst göz kapağının konjonktival kesesine, sonra da alt göz kapağına benzer şekilde yerleştirin.
- Elektrot-doku temas empedansını kontrol etmek için Empedans düğmesine basın ve empedans değerleri her kanalda gösterilecektir.
- Aynı odadaki diğer elektrikli cihazlardan elektromanyetik paraziti önlemek için empedansın her elektrot için 10 kΩ'nin altında olduğundan emin olun.
NOT: 10 kΩ'nin üzerindeyse elektrotu yeniden bağlayın veya değiştirin. Keçinin yattığı elektrik metal cerrahi yatağı takılıysa empedans anormal derecede yüksek görünebilir. Empedans, elektrik parazitini azaltmak için aktif ve referans elektrotlar arasında 1 kΩ'den daha az farklılık göstermektedir17. - Işık stimülasyonu olmadan taban çizgisi gürültüsünü kontrol etmek için Osilograf düğmesine basın.
NOT: Büyük bir taban çizgisi gürültüsü varsa, aynı odadaki diğer tüm elektrikli cihazları çıkarın ve cep telefonlarını kapatın. Temel sorun devam ederse, 1.3.10 adımına geçin. tipik bir FVEP dalga biçiminin ortaya çıkarıp çıkarılamazsa kontrol etmek için. Değilse, FVEP testini başka bir zaman yeniden zamanla. - Sağ üst köşedeki beyaz arka plan kutusunda sırasıyla 0,025, 0,5 ve 3,0 cd·s/m2 ışık yoğunluğunu seçerek FVEP kaydını başlatın. Ardından , Muayene düğmesine basın. Her ışık yoğunluğunda FVEP kaydının iki kez gerçekleştirildiğini unutmayın.
NOT: İki dalga formu açıkça farklı görünüyorsa, bir tekrar daha gereklidir. - Kızılötesi kamerada kuru görünüyorsa, korneayı yapay gözyaşı damlalarıyla nemlendirin.
NOT: Görsel bakışın doğru olduğundan ve öğrencinin tamamen açıkta olduğundan emin olmak için kayıttan önce bir araya getirilmiş kızılötesi kameradan göz pozisyonunu izleyin (böylece flaş uyaranının alan boyutu 90° olur). Uyuşturulmuş bir keçinin göz pozisyonu, başını buna göre çevirerek ayarlanabilir. Gözlemlerimize dayanarak, genel anestezi altında keçide FVEP kaydı (~10 dk) sırasında nadiren dolaşma görülür9. Bu nedenle kayıt yaparken bakışları duraklatmaya ve yeniden ayarlamaya gerek yoktur. - Kontralteral göz için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
- Isoflurane beslemesini durdurun ve keçinin genel anesteziden iyileşmesine yardımcı olmak için ventilatördeki gelgit hacmini biraz artırın.
- Genel anesteziden sonra, enfeksiyonu önlemek için keçiyi gentamisin (4 mg/kg, IM) ve ceftiofur sodyum (sefalosporin, 2 mg/kg, IM) ile tedavi edin.
- FVEP ölçümü ve nicel analiz
NOT: Şekil 1A'da gösterildiği gibi, FVEP dalga formunda ilk pozitif ve negatif tepeler P1 ve N1, ikinci pozitif tepe P2 olarak belirlenmiştir. P1, N1 ve P2'nin tipik örtük zamanı sırasıyla 40, 60 ve 120 ms civarındadır. P1 ve P2 genlikleri sırasıyla N1 dalga biçiminin oluğundan P1 ve P2 dalga formlarının zirvelerine kadar ölçülür.- Monoküler yaralanma durumunda, intersesyon varyasyonunu azaltmaya ve duyarlılığı artırmaya yardımcı olmak için genlik ve örtük sürenin interoküler karşılaştırmasını kullanın17.
2. Rhesus makak içinde PVEP
NOT: Desen VEP'ler rhesus makaks9'da ortaya çıkabilir ve genlik ve örtük zamanda Flash VEP'ten daha kararlıdır17. Bu nedenle PVEP, insan olmayan primatlarda retino-genikülo-kortikal yolun bütünlüğünü tespit etmek için kullanılmıştır.
- Hayvan hazırlığı
- Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam) ile indüksiyondan sonra maymunu izofluran (%1,5-%2) ile uyuşturun.
- Sterilize edilmiş yer elektrodunu kulak memesi başına yerleştirin. Sterilize edilmiş aktif ve referans elektrotları sırasıyla ön ve oksipital kemikteki orta çizgi boyunca deri altı olarak yerleştirin.
- Bulbar konjonktivayı ortaya çıkarmak için göz kapağı spekulum uygulayın.
- Kontralatör gözü yamalamak için yapışkan opak siyah bant kullanın.
- PVEP kaydı
- Elektrot-doku temas empedansını kontrol etmek için Empedans düğmesine basın ve empedans değerleri her kanalda gösterilecektir; 10k Ω altında olduğundan emin olun. Değilse, elektrot'u yeniden bağlayın veya değiştirin.
- Empedans Test Penceresinde empedans değerlerini kontrol edin ve elektrik parazitini azaltmak için empedans aktif ve referans elektrotlar arasında 1 kΩ'dan daha az farklılık gösterdiklerinden emin olun17.
- Temel gürültüyü uyarmadan kontrol etmek için Osilograf düğmesine basın.
NOT: Büyük bir taban çizgisi gürültüsü varsa, aynı odadaki diğer tüm elektrikli cihazları çıkarın ve cep telefonlarını kapatın. Temel sorun devam ederse, PVEP testini başka bir günde yinele. - Sağ üst köşedeki beyaz arka plan kutusunda sırasıyla 0,5 ve 1,0 çevrim/derece ışık yoğunluğunu seçerek düzeltme eki yüklenmemiş gözün PVEP yanıtlarını kaydedin ve ardından Muayene düğmesine basın.
NOT: Her kayıt için, bir dalga formu vermek için ortalama 64 izleme vardır. Her frekans için, PVEP sinyallerinin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için en az iki kayıt elde edilir. - Kontralasyon gözü için prosedürü tekrarlayın.
- Tamamlandığında, maymunu uyandırmak için isoflurane arzını durdurun.
- Genel anesteziden sonra, enfeksiyonu önlemek için maymunu gentamisin (4 mg / kg IM) ve ceftiofur sodyum (2 mg / kg IM) ile tedavi edin.
- PVEP ölçümü ve nicel analiz
- Şekil 1B'de gösterildiği gibi, PVEP dalga formlarındaki ilk negatif ve pozitif zirveler, tipik olarak 50 ve 90 ms civarında meydana gelen N1 ve P1 olarak belirlenmiştir. P1 genliği N1 oluğundan P1'in zirvesine kadar ölçülür.
- Monoküler yaralanma durumunda, intersesyon varyasyonunu azaltmaya ve duyarlılığı artırmaya yardımcı olmak için genlik ve örtük sürenin interoküler karşılaştırmasını kullanın17.
3. Keçi desen ERG (PERG)
NOT: Önceki çalışmada keçilerde PERG sinyalinin interoküler çapraz sapı gözlenmedi, bu nedenle PERG yanıtları her iki gözden de aynı anda kaydedilebilir9.
- Sınav hazırlığı
- Keçiyi ksilazin (3 mg/kg, IM) kullanarak uyuşturun ve bir sınav masasına yerleştirin.
- Keçi dilinin altına bir sıcaklık sensörü yerleştirin.
- Nabız oksimetresini keçi kulağının proksimal ucuna bağlayın.
- Kan basıncı kelepçesini uyluğa bağlayın.
- EKG klipslerini uzuvlara uygun şekilde sıkıştırın.
- Elektrot empedansını azaltmak için, ön kemiğe sterilize edilmiş bir kafatası vidası yerleştirin ve bir timsah klipsi ile zemin elektroduna bağlanın.
- her iki taraftaki yanal kanthi'nin 1 cm arkasına iki sterilize iğne referans elektrodu yerleştirin.
- Bulbar konjonktivayı açığa çıkarmak için göz kapağı spekulumunu kullanın.
- Yapay yırtılmanın topikal uygulamasından sonra iki dezenfekte erg-jet kayıt elektrodunu bilateral korneaların ortasına yerleştirin.
- İki adet 47,6 cm x 26,8 cm LED monitörü 50 cm görüş mesafesine sahip her iki gözün önüne yerleştirin.
- Her monitörü aynı taraftaki öğrenci düzlemine paralel olacak şekilde ayarlayın ve monitörün merkezini öğrenci düzlemine hizalayın.
- Kontrastı tersine çeviren dama tahtasının (zamansal frekans, 2,4 Hz) her iki monitörde de görüntülendiğinden ve ekipman ayarları tarafından ayarlanan maksimum en boy oranı olan 4:3 olduğundan emin olun.
- Beyaz ve siyah dama arasındaki kontrastın %96 oranında kaldığından ve ortalama parlaklığın ışık ölçer tarafından kontrol edilen 200 cd/m2 (metrekare başına candela) olduğundan emin olun.
NOT: ISCEV'e göre, insanlarda ortalama 40-60 cd/m2 fotopik parlaklık gereklidir17. Fare modeli kullanılarak yapılan başka bir çalışmada, desen ortalama 800 cd/m2,18 parlaklıkta kaldı. İnsanlarda standart bir PERG testi için en dar boyutunda en az 15° alan boyutuna ihtiyaç vardır17. Kornea yüzeyinin merkezinde değilse kornea elektrodunun konumunu ayarlayın.
- PERG kaydı
- Ortam ışığını karartın ve elektrot-doku temas empedansını kontrol etmek için Empedans düğmesine basın. Empedans değerleri her kanalda gösterilecektir.
- Empedans Test Penceresinde empedans değerlerini kontrol edin ve empedans 10 kΩ'nin altında olduğundan emin olun. Değilse, elektrot'u yeniden bağlayın veya değiştirin.
- Işık stimülasyonu olmadan taban çizgisi gürültüsünü kontrol etmek için Osilograf düğmesine basın.
NOT: Kırılgan ERG-Jet kayıt elektrotlarını korumaya dikkat edin. PERG'deki temel gürültü genellikle keçideki FVEP'den daha küçüktür. - PERG kaydını her iki gözden aynı anda 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ve 12.6 döngü/derece ardışık olarak uzamsal frekanslarda başlatın. Her uzamsal frekans için, bir okuma sağlamak için 64 izleme ortalaması elde edilir.
- Son olarak, PERG'yi görsel uyaran olmadan negatif kontrol olarak kaydetmek için monitörü kapatın.
NOT: PERG sinyalleri genellikle kararlıdır ve tekrarlanması gerekmez. - Ön kafatası vidasını çıkarın ve ksilazin antagonisti olan Idzoxan (1,5 mg / kg) enjekte ederek keçiyi uyandırın.
- Genel anesteziden sonra enfeksiyonu önlemek için keçiyi gentamisin (4 mg/kg IM) ve ceftiofur sodyum (2 mg/kg IM) ile tedavi edin.
- PERG ölçümü ve nicel analiz
- Bandpass filtresini 1 ila 75 Hz arasında olacak şekilde ayarlayın.
- Şekil 1C'de gösterildiği gibi, dalga formdaki ilk pozitif ve negatif tepeler P1 (genellikle 25 ms civarında) ve N1 (genellikle 55 ms civarında) olarak belirlenmiştir. PERG genliği N1'den P1'e kadar ölçülür.
- Monoküler yaralanma durumunda, intersesyon varyasyonunu azaltmaya ve hassasiyeti azaltmaya yardımcı olmak için genlik ve örtük sürenin interoküler karşılaştırmasını kullanırız17.
4. Rhesus makak perg
NOT: Rhesus makakında PERG sinyalinin interoküler çapraz sap olup olmadığı belirsizdir, bu nedenle her iki gözden PERG yanıtları ayrı ayrı kaydedilir.
- Sınav hazırlığı
- Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam) ve trakeal entübasyon enjeksiyonundan sonra maymunu izofluran (%1.5-%2) ile uyuşturun.
- Ön kemiğe deri altından sterilize edilmiş bir zemin elektrot yerleştirin. Sterilize edilmiş bir iğne referans elektrot deri altından, aynı taraftaki yanal kantusun 1 cm arkasına yerleştirin.
- Yapay yırtılmanın topikal uygulamasından sonra merkezi korneaya dezenfekte edilmiş bir ERG-Jet kayıt elektrot yerleştirin.
NOT: Kornea yüzeyinin merkezinde değilse, kornea elektrodunun konumunu ayarlayın. - Bir gözü yamalamak için yapışkan opak siyah bant kullanın.
- Monitörü (47,6 x 26,8 cm) 50 cm görüş mesafesine yerleştirin.
- Monitörün öğrenci düzlemine paralel olacak şekilde ayarlandığından emin olun. Monitörün merkezini öğrenci düzlemine hizalayın.
- Siyah beyaz dama tahtasının 2,4 Hz frekansta ters çevrildiğinden ve en boy oranının ekipman ayarları tarafından ayarlanan 4:3 olduğundan emin olun.
- Beyaz ve siyah dama arasındaki kontrastın %96 olduğundan ve ortalama parlaklığın ışık ölçer tarafından kontrol edilen 200 cd/m2 kaldığından emin olun.
- PERG kaydı
- Ortam ışığını karartın ve elektrot-doku temas empedansını kontrol edin.
- Empedans 10 kΩ'nin altında olduğundan emin olun. Değilse, elektrot'u yeniden bağlayın veya değiştirin.
- Işık stimülasyonu olmadan taban çizgisi gürültüsünü kontrol edin.
- Bir gözü yamalayıp PERG kaydını diğer gözünden ardışık olarak 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ve 12.6 döngü/derece mekansal frekanslarda başlatın.
- Kontralteral göz için 4.2.1-4.2.4 adımlarını tekrarlayın.
- Maymunu uyandırmak için isoflurane arzını durdurun.
- Genel anesteziden sonra, enfeksiyonu önlemek için maymunu gentamisin (4mg / kg IM) ve ceftiofur sodyum (2 mg / kg IM) ile tedavi edin.
- PERG ölçümü ve nicel analiz
- Şekil 1D'de gösterildiği gibi, dalga şeklindeki ilk pozitif ve negatif tepeler P1 (tipik olarak 40ms civarında) ve N1 (genellikle yaklaşık 85 ms) olarak belirlenmiştir. PERG genliği N1'den P1'e kadar ölçülür.
- Monoküler yaralanma durumunda, intersesyon varyasyonunu azaltmaya ve duyarlılığı artırmaya yardımcı olmak için genlik ve örtük sürenin interoküler karşılaştırmasını kullanırız17.
5. Keçide OCT
- Hayvan hazırlığı
- Keçiyi ksilazin (3mg / kg, IM) kullanarak uyuşturun ve ardından entübe edin.
- Tropicamid (%5) ve fenilefrin (%5) ile midriyatik damlaların topikal uygulaması ile göz bebeğini genişletin.
- Göz bebeğini tamamen açığa çıkarmak için göz kapağı spekulumunu kullanın.
- Keçinin başını çene istırahatine yerleştirin.
NOT: Gaz anestezisi yapılmasa da, hava yolunu çene istirahati tarafından sıkıştırılmaktan korumak için keçiyi düzenli olarak entübe edin.
- OCT görüntüleme
NOT: Retinal OCT görüntüleme, bu çalışmada 870 nm dalga boyunda OCT sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. OCT tarayıcısının optik eksenel çözünürlüğü 12 μm'dir. Dairesel tarama modu, optik sinir kafasını (ONH) yüksek çözünürlüklü modla taramak için kullanılır. Görüntü kalitesini optimize etmek için 100 kare ortalaması vardır. Ayrıntılı eğitim kılavuzu çevrimiçi olarak mevcuttur (bkz. Malzeme Tablosu).- İlk OCT taraması (temel sınav)
- Algılama arabirimine girmek için Başlat düğmesini tıklatın. Makinenin yüklemeyi bitirmesini bekleyin ve görüntülemeyi başlatmak için sarı Başlat düğmesine basın.
- Baş konumunu değiştirerek ONH'yi konfokal Tarama Lazer Oftalmoskopi (cSLO) görüntüsünde ortalamak için keçiyi kızılötesi kamerayla hizalayın.
- Görüntü kalitesini artırmak için tüm kızılötesi görüntüyü eşit şekilde aydınlatmak için oyun çubuğunu ayarlayın.
- Dik ekranda dik retinal OCT görüntüsü gösterilene kadar joystick'i ileri taşıyın.
- Joystick'i eşit yoğunlukta ve yatay olarak yerleştirilmiş bir retina OCT görüntüsüne sahip olacak şekilde değiştirin.
- Görüntüyü otomatik olarak yakalamak için oyun çubuğundaki düğmeye basın ve görüntü alımı tamamlanana kadar canlı görüntü ekranında görüntü kalitesini korumak için oyun çubuğunu basılı tutun. Ardından Acquire tuşuna basın.
- Ksilazin antagonisti olan İdzoxan(1,5 mg/ kg) enjekte ederek keçiyi uyandırın.
NOT: ONH'yi temel sınavda ortalamak, temel tarama ve takip taramasını deneyimlerimize göre hizalamaya yardımcı olur.
- Takip OCT taraması
- Yüksek kaliteli bir ilk OCT görüntüsü seçin; sağ tıklatın ve Başvuru Ayarla'yı seçin.
- Yukarıda belirtildiği gibi OCT görüntülemeyi başlatın.
- Geçerli taramanın referans taramasıyla otomatik olarak eşleşebilmesi için İzleme düğmesine basın.
- Eşleştirildikten sonra (dairesel tarama halkası yeşile döner), Otomatik Gerçek Zamanlı İzleme'yi etkinleştirmek için oyun çubuğundaki düğmeye basın.
- Ksilazin antagonisti olan İdzoxan (1,5 mg/kg) enjekte ederek keçiyi uyandırın.
NOT: Eşleştirme işlemini kolaylaştırmak için, (1) başı buna göre çevirerek canlı pencerede ONH'yi hareket ettirebilirsiniz veya (2) geçerli cSLO görüntüsünün taban çizgisi görüntüsüne daha benzer görünmesini sağlamak için başı eğerek canlı pencerede ONH'yi döndürün. Bu vestibulo-oküler refleks ksilazine anestezi altında iyi çalışır19.
- İlk OCT taraması (temel sınav)
- OCT ölçümü
- Ölçüm penceresine girmek için Ölçüm düğmesini tıklatın.
- Silgi aracını seçin ve program tarafından otomatik olarak etiketlenen RNFL satırını silin.
- IPL ve INL arasındaki sınırı el ile anahatlamak için Çizgi Çizim aracını seçin (Şekil 2).
NOT: Altı peripapillary bölgesinde (T, TS, TI, N, NS, NI) GCC kalınlığı ve ONH (G) etrafındaki ortalama GCC kalınlığı ekranda okunabilir (Şekil 2). Normal dağılım durumunda OCT verilerini ölçmek için öğrenci testi, tek yönlü ANOVA veya iki yönlü ANOVA kullanılabilir.
6. Rhesus makak içinde OCT
- Keçi durumunda yapıldığı gibi aynı ekipman ve prosedürü kullanarak rhesus makakında retinaL OCT görüntüleme gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A keçide FVEP'nin temsili sonuçlarını göstermektedir. Aynı flaş yoğunluğundaki dalga formları göreceli benzerliğe sahip olsa da, dalga formlarını iki kez incelemenizi öneririz. Elektronik cihazlar tarafından oluşturulan elektromanyetik dalgalar toplanan elektrik sinyallerini bozarak yüksek taban çizgisi gürültüsüne ve dalga biçiminin zayıf tekrarlanabilirliğine neden olur. Bu nedenle, bu tür girişimlerden kaçınmak için elektrofizyolojik inceleme sırasında çevreye takılı gereksiz elektronik cihazların bulunmadığından emin olunması ve deneysel sonuçların stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini belirlemek için en az iki ölçümün tekrarlanması önerilir. Her iki gözü yamalarken, dalga formları her iki gözde de tamamen düzdir, bu da dalga formlarının kesinlikle flaş uyaranımızdan oluştuğunu gösterir. Şekil 1B keçide PERG'nin temsili sonuçlarını göstermektedir. Stabilitesi ve yüksek sinyali nedeniyle, her mekansal frekansta sadece bir kez ölçüm yaparak güvenilir dalga formu elde ediyoruz. Mekansal frekans arttıkça, dama tahtasının boyutu keçinin gözlerinin tanınmasını yavaş yavaş aşacaktır. Yani 12.7 cpd'de PVEP dalga biçiminin çok düştüğünü görebiliyoruz. FVEP'ye benzer şekilde, ekranı kapattığımızda dalga formu kaybolur. Şekil 1C , Rhesus makakında PVEP'nin temsili sonuçlarını göstermektedir. Ölçümü her mekansal frekansta iki kez tekrarlıyoruz. Mekansal frekans arttıkça genlik azalacaktır. Bunun nedeni, mekansal frekansın göz algısını aşmasıdır. Şekil 1D , perg'in rhesus makaktaki temsili sonuçlarını göstermektedir. Genliklerin mekansal frekansla azalmasının nedeni yukarıda açıklananla aynıdır. Bu verileri analiz ederken, zirveler ve oluklar arasındaki genliği veya istatistikler olarak tepelerin veya olukların gecikme süresini çözümlemeyi seçebilirsiniz.
Şekil 2 , KEÇI'de OCT'nin temsili sonuçlarını göstermektedir. En soldaki görüntüde kızılötesi kamera tarafından çekilen bir fundus fotoğrafı görülüyor. Sağ tarafta, ONH etrafındaki retinanın genel kalınlığını ve her katmanın kalınlığını gösteren bir retina tomogramı vardır. Resimde gösterildiği gibi, keçilerin maymunlardan daha büyük retina kan damarlarına sahip olduğunu açıkça görebiliyoruz. En sağdaki yeşil diskler, ONH etrafındaki GCC'nin kalınlığının nicel bir analizidir. G genel, T zamansal taraf anlamına gelir, N burun tarafı anlamına gelir, S üstün anlamına gelir ve ben daha düşük anlamına gelir. Siyah yazı tipi mikrometrelerdeki GCC kalınlığı ölçüm değerini temsil eder ve yeşil, bu deney için bir referans olarak değil, insan için klinik referans ölçüm değeridir.
Şekil 1: Keçi ve rhesus makaklarında temsili elektrofizyolojik dalga şekilleri. (A) Temsilci FVEP, aynı anestezik seansta tek bir keçiden farklı ışık yoğunluklarında dalga biçimlerini haline eder. (B,D) Temsilci PERG dalga formları, aynı anestezik seans içinde tek bir keçiden (B) veya rhesus makaktan (D) farklı uzamsal frekanslarda şekil verir. (C) Temsilci PVEP, aynı anestezik seans içinde tek bir rhesus makakından farklı uzamsal frekanslarda dalga biçimlerini büsler. Her dalga biçiminin tipik örtük zamanı protokol bölümünde belirtilmiştir. n = Her test için 1 konu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: OCT sonuçları. Optik sinir kafasının (sol panel) etrafındaki temsili retinaL OCT görüntüleri ve keçi (A) ve rhesus makakında (B) farklı peripapillary bölgelerinde (sağ panel) GCC kalınlığı. n = Her test için 1 konu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada keçi ve rhesus makaklarında VEP, PERG ve OCT protokolünü sunuyoruz. Bu in vivo yöntemler glokom, iskemik veya travmatik optik nöropati ve optik nörit9 gibi çeşitli optik nöropatilerin büyük hayvan modellerinde uygulanabilir9.
PVEP, FVEP17'den daha kararlı ve hassastır; ancak, goat9'da ortaya çıkaramaz. Bu nedenle FVEP keçide, PVEP ise retino-genikülo-kortikal yolun bütünlüğünü değerlendirmek için laboratuvarımızda rhesus makakında gerçekleştirilir. PERG'nin keçide indüklenebildiği ancak PVEP'nin indüklenemeyeceği gözleminin altında kalan mekanizma bilgimize göre hala belirsizdir. Keçiden optik sinir fonksiyonu ve yapısının insandan farklı olması mümkündür.
FVEP'nin genliği gözbebeği boyutundan ve ortam ışığından etkilenebileceğinden, FVEP kaydı sırasında göz bebeğini genişletir ve keçinin kafasına siyah bir battaniye yerleştiririz. Kliniklerde FVEP için gözbebeği genişlemesine gerek olmadığı fark edilmelidir17. Benzer şekilde, kliniklerde FVEP kaydı için karanlık adaptasyon gerekli olmasa da, FVEP kaydından önce ortam ışığına 5 dakikalık bir adaptasyonun genlikte intrasesyon tekrarlanabilirliğini artırabileceğini gördük.
PERG sinyalinin RGC'lerden kaynaklandığı düşünülmektedir ve bu nedenle genliği RGC'lerin işlevini tahmin etmek için kullanılabilir13,20. Scotopik eşik yanıtı (STR) ve fotopik negatif yanıt (PhNR) gibi bazı özel flaş ERG bileşenleriyle karşılaştırıldığında, PERG RGC disfonksiyonu13'e karşı daha hassastır. Bu çalışmada PERG testinin potansiyel sınırlamaları aşağıdaki gibidir. İlk olarak, ISCEV ortalama parlaklığı sabit tutmak için PERG kaydı için klasik CRT (katot ışını tüpü) uyarıcı kullanılmasını önerir. Bununla birlikte, klasik CRT uyarıcı sıvı kristal ekrana (LCD) göre daha az kullanılabilir. LCD'nin ekranı genellikle örüntü tersine çevirme sırasında geçici parlaklık değişiklikleri sunsa da, potansiyel olarak parlaklık objesine neden olsa da, önceki bulgumuza göre keçide PERG genliğine katkıda bulunmamıştır: PERG'nin 12,6 cpd uzamsal frekanstaki genliği genellikle daha düşük mekansal frekanslardakilerle karşılaştırıldığında ihmal edilebilir9 . Diğer bir sınırlama, basitlik adına PERG testinden önce kırılma hatasını düzeltmemiş olmamızdır. Bu sınırlamayı telafi etmek için temel PERG genliği referans olarak kaydedilmelidir.
Önceki çalışmamız VEP ve PERG9'un seans içi ve seans içi varyasyonunu değerlendirmiş ve optimize etmiştir. Ksilazine ile karşılaştırıldığında, izofluranların keçilerde daha tekrarlanabilir FVEP ancak daha değişken PERG dalga formları ile sonuçlendiğini bulduk9. Bu nedenle FVEP testinde izofluran, PERG'de ksilazin ve keçilerde OCT testi kullandık. Ayrıca, PERG ile karşılaştırıldığında, VEP kaydı potansiyel olarak daha değişkendir. Bu nedenle, intrasession varyasyonunu kontrol etmek için vep kaydını her ışık yoğunluğunda veya mekansal frekansta düzenli olarak tekrarlıyoruz. Kontrastta, PERG dalga formları çok daha kararlıdır. Bu nedenle, genellikle PERG kaydını tekrar etmeyiz. Aynı konuda farklı bir günde tekrarlanan kayıt yapılması genel olarak tavsiye edilse de, basitlik ve hayvan etiği adına aynı konuda VEP veya PERG kaydını farklı bir günde düzenli olarak tekrarlamuyoruz. Bununla birlikte, seanslar arası tekrarsız FVEP ve PERG kayıtları, önceki çalışmamıza göre optik sinir yaralanmasını tespit edecek kadar hassastır9.
RetinaL OCT görüntüleme, retina yapısındaki dinamik değişiklikleri uzunlamasına izlemek ve ölçmek için kullanışlı, güvenilir ve invaziv olmayan bir tekniktir. PERG ve VEP ile karşılaştırıldığında, OCT görüntüleme çok daha iyi intersession tekrarlanabilirliğe sahiptir9. Ayrıca, OCT görüntüleme, tüm optik sinir lifini örnekleme hatası olmadan dakikalar içinde yakalayabilir ve ölçebilir ve retina yapısını incelemek için geleneksel histolojik analizden çok daha ucuz ve etkili bir fırsat sunar. Bununla birlikte, mevcut OCT görüntülemenin mekansal çözünürlüğü, bireysel RGC soma veya optik sinir lifini söylemek için hala çok sınırlıdır. Ek olarak, OCT ile ölçülen daha kalın bir GCC'nin mutlaka daha sağlam bir iç retina anlamına gelmediğini fark edilmelidir, çünkü GCC kalınlaşma retina ödemi veya kanamadan kaynaklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma aşağıdaki hibelerle finanse edildi: Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFA1101200); Wenzhou Tıbbi Araştırma Projesi (Y20170188), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFC1101200); Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81770926;81800842); Zhejiang Eyaleti Anahtar Ar-Ge Programı (2018C03G2090634); ve Wenzhou Göz Hastanesi (YNZD1201902) Anahtar Ar-Ge Programı. Sponsor veya finansman kuruluşunun bu araştırmanın tasarımında veya yürütülmesinde hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 47.6 x 26.8 cm monitors | DELL Inc. | E2216HV | The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens |
| 6.0 mm tracheal tube | Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd | PVC 6.0 | ensure the airway |
| alligator clip | |||
| atropine | Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. | reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation | |
| Carbomer Eye Gel | Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb | moisten the cornea and stabilize the recording electrodes | |
| ERG-Jet recording electrodes | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | 2300 La Chaux-De-Fonds | ERG recording |
| eye speculum | Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd | ZYD020 | open palpebral fissure |
| Heidelberg Spectralis OCT system | Heidelberg Engineering | OCT system | |
| Imaging | (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf) | ||
| isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22 | isoflurane anesthesia |
| male Saanen goats | Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) | The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg | |
| needle electrode | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | U51-426-G-D | use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes |
| periphery venous catheter intravenously | BD shanghai Medical Device Co., Ltd | 383019 | intravenous access for atropine and propofol |
| propofol | Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. | induce Isoflurane anesthesia in goat | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | SANTEN OY, Japan | 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride | |
| visual electrophysiology device | Gotec Co., Ltd | GT-2008V-III | use for FVEP & PERG |
| xylazine | Huamu Animal Health Products Co., Ltd. | xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg | |
| zoletil50 | Virbac | induce Isoflurane anesthesia in monkey |
References
- Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
- He, Z., Jin, Y.
- Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
- Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
- Singman, E. L., et al.
- Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
- Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
- Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
- Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
- Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
- You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
- Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
- Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
- Porciatti, V.
