Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Metoder til vurdering retinal ganglion celle og optisk nerve funktion og struktur i store dyr

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Her demostrate flere in vivo tests (flash visuelle fremkaldte potentiale, mønster elektroretinogram og optisk sammenhæng tomografi) i ged og rhesus makak at forstå strukturen og funktionen af synsnerven og dens neuroner.

Abstract

Synsnerven indsamler axoner signaler fra retinal ganglion celler og sender visuelt signal til hjernen. Store dyremodeller af synsnerveskader er afgørende for at oversætte nye terapeutiske strategier fra gnavermodeller til klinisk anvendelse på grund af deres tættere ligheder med mennesker i størrelse og anatomi. Her beskriver vi nogle in vivo metoder til at evaluere funktionen og strukturen af retinale ganglion celler (RGCs) og synsnerven (ON) i store dyr, herunder visuelle fremkaldte potentiale (VEP), mønster elektroretinogram (PERG) og optisk sammenhæng tomografi (OKT). Både ged og ikke-menneskelige primat blev ansat i denne undersøgelse. Ved at præsentere disse in vivo metoder trin for trin, håber vi at øge eksperimentel reproducerbarhed blandt forskellige laboratorier og lette brugen af store dyremodeller af optiske neuropatier.

Introduction

Synsnerven (ON), som består af axoner fra de retinale ganglionceller (RGC), overfører visuelt signal fra nethinden til hjernen. ON sygdomme, såsom grøn stær, traumatisk eller iskæmisk optisk neuropati, ofte forårsaget irreversibel ON / RGC degeneration og ødelæggende visuelle tab. Selv om der i øjeblikket er mange gennembrud inden for ON regenerering og RGC-beskyttelse i gnavermodeller1,2,3,4,5,6, forblev kliniske behandlinger for de fleste ON-sygdomme stort set de samme i løbet af det sidste halve århundrede med utilfredsstillende resultat7,8 . For at udfylde kløften mellem grundforskning og klinisk praksis er translationelle undersøgelser ved hjælp af stor dyremodel af ON-sygdomme ofte nødvendige og gavnlige på grund af deres tættere anatomiske lighed med mennesker end gnavermodeller.

Ged og rhesus makakaber er to store dyrearter, der anvendes i vores laboratorium til at modellere menneskets ON sygdom. Størrelsen af en ged øjeæble, ON, og den tilstødende struktur (orbital og næsehulen, kraniet base, osv.) svarer til et menneske baseret på kraniet CT-scanning9. Som sådan giver gedemodellen mulighed for at evaluere og forfine terapeutiske anordninger eller kirurgiske procedurer før brug hos mennesker. Rhesus macaque, som ikke-menneskelige primat (NHP), har menneskelignende unikt visuelt system, der ikke findes i andre arter10,11. Hertil kommer, patofysiologiske reaktioner på skader og behandlinger i NHP er meget lig den hos mennesker12.

In vivo-test for at vurdere ON- og RGC's struktur og funktion i længderetningen er vigtige i store dyreforsøg. Mønsterelektroretinogram (PERG) er blevet brugt til at evaluere RGC-funktionen. Flash visuelle fremkaldte potentiale (FVEP) afspejler integriteten af retino-geniculo-kortikale vej i det visuelle system. Perg kombineret med FVEP kan således afspejle FUNKTIONEN ON9,13,14 . Den retinale optiske sammenhæng tomografi (OCT) billeddannelse kan vise retinal struktur med høj tidsmæssig og rumlig opløsning, som muliggør måling af tykkelsen af retinal ganglion kompleks (GCC)9,15. Til elektrofysiologiske undersøgelser i denne undersøgelse er overvågning af vitale tegn (varmehastighed, brudshastighed, blodtryk) og niveauet af iltmætning (SpO2) før test afgørende, da disse parametre har potente virkninger på okulær blodgennemstrømning og dermed det visuelle systems funktion. Men vi overvågede ikke de vitale tegn, når de udfører OCT retinal billeddannelse af hensyn til enkelhed. Ifølge vores tidligere undersøgelse9, GCC tykkelse målt ved OCT retinal billeddannelse er ganske stabil, med inter-session variationskoefficient tæt på 3%. Disse in vivo-test i ged og rhesus makak er blevet beskrevet i detaljer i vores tidligere undersøgelse9. Her præsenterer vi disse metoder for at bidrage til at øge eksperimentel gennemsigtighed og reproducerbarhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter blev udført strengt i overensstemmelse med ARRIVE retningslinjer og National Institutes of Health guide for pleje og brug af laboratoriedyr, og overholde de protokoller, der er godkendt af den institutionelle Animal Care and Use Committee i Wenzhou Medical University (WMU) og Joinn Laboratory (Suzhou). De mandlige Saanen geder, i alderen fra 4 til 6 måneder med vægt på 19-23 kg, blev opstaldt i WMU dyrefaciliteten. De mandlige Rhesus makakaber, i alderen fra 5 til 6 år med vægt på 5-7 kg, blev anbragt i Joinn dyrefaciliteten. Alle dyrene blev opretholdt i et klimatiseret rum med kontrolleret temperatur (21 ± 2 °C) under en 12 timers lys/12 timers mørk cyklus med mad ad libitum.

1. Flash visuelle fremkaldt potentiale (FVEP) i ged

  1. Generel bedøvelse
    1. Barber hock håret med en elektronisk barbermaskine.
    2. Forbered huden ved at gnide med 70% alkohol tre gange for at rense huden, og derefter udsætte den subkutane vene.
    3. Et perifert venekatet intravenøst (0,9 mm x 25 mm), og indsprøjt derefter atropin (0,025 mg/kg) og propofol (5 mg/kg).
    4. Intuberere geden med et 6 mm luftrør og tilslut den til en kunstig åndedrætsværn.
    5. Bevar anæstesi med 3,5% isoflurane i ilt ved en konstant strømningshastighed på 2 L/min.
      BEMÆRK: Geden kommer sig efter bedøvelsen forårsaget af propofol inden for få minutter, så vær hurtig til at intubere geden.
  2. Overvågning af kardiopulmonal
    1. Placer temperatursensoren under tungen.
    2. Forbind pulsoximeteret til den proksimale ende af øret.
    3. Bind blodtryksmanchetten til bunden af låret.
    4. Fastgør EKG-clipsene på lemmerne i overensstemmelse hermed.
      BEMÆRK: Den normale puls for geder er 68-150 bpm. På grund af brugen af gasbedøvelse vil hjertefrekvensen for geder stige. Derfor er vores puls under inspektionen 170 ± 30 bpm. Det systoliske blodtryk af geder under normale forhold er 110-130 mmHg, og det diastoliske blodtryk er 50-60 mmHg. I tilstanden af indånding af ilt kan gedens iltmætning af blodet altid opretholdes på 99%. Vejrtrækningshastigheden for geder under anæstesi synkroniseres med ventilatorens, som er 10 vejrtrækninger / min. Da temperaturen blev målt fra under gedens tunge, ikke kernetemperaturen, er gedens temperatur generelt 35 ± 2 °C.
  3. Kranieskruer implantation og elektroder placering
    1. Barber håret med en klipper. Desinficer huden på midten af frontalbenet ved at gnide med en bomuldskugle gennemblødt i betadin og 70% alkohol tre gange.
    2. Brug steriliserede skruer og saks.
      BEMÆRK: Autoklave alle kirurgiske instrumenter til sterilisering (121 °C, 20 min).
    3. Lav en 5 mm hud snit til at udsætte frontal knogle med en oftalmologisk saks, og derefter implantere en steriliseret skrue i midten af frontal knoglen ved hjælp af en skruetrækker.
    4. Barber håret og desinficere huden på den centrale occipital knogle mellem to ører med betadin og 70% alkohol, den ene efterfulgt af den anden, tre gange.
    5. Lav en 5 mm hud snit til at udsætte occipital knogle med en oftalmisk saks, og derefter implantere en steriliseret skrue i midten af occipital knoglen.
      BEMÆRK: Jordnålelektroden indsættes subkutant under den forreste kranieskrue. De aktive og referenceelektroder er forbundet med henholdsvis occipital og frontal skruer med alligatorclips for at reducere elektrode impedans16.
  4. Tilberedning af dyr
    1. Brug lystæt klud til at dække øjet og fast ved bind for øjnene for at lappe det ene øje.
    2. Påfør topiske bedøvelse øjendråber (proparacain hydrochlorid øjendråber) på begge øjne. Bilaterale elever er udvidet af aktuel administration af mydriaterhavet øjendråber med tropicamid (5%) og phenylephrine (5%).
    3. Placer gedens hoved i Ganzfeld-stimulatoren og dæm det omgivende lys.
      BEMÆRK: Det blev konstateret, at geder kan opretholde god øjeæble fiksering under anæstesi, så ingen ekstra øjeæble fiksering operation intervention er påkrævet.
    4. Dæk stimulatoren og gedehovedet med et sort tæppe i 5 minutter til tilpasning.
    5. Brug øjenlågs speculum til at eksponere bulbar conjunctiva. Fold den øverste ring, træk det øverste øjenlåg op, og indsæt først den øverste ring i den konjunktivale sæk i det øvre øjenlåg og derefter ind i det nederste øjenlåg på samme måde.
    6. Tryk på impedansknappen for at kontrollere elektrodevævets kontakt impedans, og impedansværdierne vil blive vist i hver kanal.
    7. Sørg for, at impedansen er under 10 kΩ for hver elektrode for at undgå elektromagnetisk interferens fra andre elektriske enheder i samme rum.
      BEMÆRK: Hvis den er over 10 kΩ, skal du tilslutte eller udskifte elektroden igen. Impedansen kan forekomme unormalt høj, hvis den elektriske metal kirurgiske seng, hvor geden ligger, er tilsluttet. Impedansen skal variere med mindre end 1 kΩ mellem de aktive og referenceelektroder for at reducere elektrisk interferens17.
    8. Tryk på oscillograph-knappen for at kontrollere baseline støj uden lysstimulering.
      BEMÆRK: Hvis der er en stor baseline støj, skal du tage stikket ud af alle andre elektriske enheder i samme rum og slukke mobiltelefoner. Hvis problemet med grundlinjen fortsætter, skal du gå til trin 1.3.10. for at kontrollere, om en typisk FVEP-bølgeform kan fremkaldes. Hvis ikke, skal du omlægge FVEP-testen på et andet tidspunkt.
    9. Start FVEP-optagelsen ved at vælge lysintensiteten på henholdsvis 0,025, 0,5 og 3,0 cd·s/m2 i den hvide baggrundsboks i øverste højre hjørne. Tryk derefter på knappen Undersøgelse . Bemærk, at FVEP-optagelse ved hver lysintensitet udføres to gange.
      BEMÆRK: Hvis de to bølgeformer ser naturligvis forskellige ud, er der brug for endnu en gentagelse.
    10. Fugt hornhinden med kunstige tåre øjendråber, hvis det ser tørt ud på det infrarøde kamera.
      BEMÆRK: Overvåg øjenpositionen fra det indbyggede infrarøde kamera før optagelsen for at sikre, at det visuelle blik er korrekt, og at eleven er fuldt eksponeret (så feltstørrelsen på en flash stimulus er 90°. Øjepositionen af en bedøvet ged kan justeres ved at dreje hovedet i overensstemmelse hermed. Baseret på vores observation forekommer blikvandring sjældent under FVEP-optagelse (~ 10 min) i ged under generel anæstesi9. Så der er ingen grund til at sætte blikket på pause og justere blikket igen under optagelsen.
    11. Gentag ovenstående trin for det kontralaterale øje.
    12. Stop isofluraneforsyningen og øg tidevandsvolumen lidt i respiratoren for at hjælpe geden med at komme sig efter generel anæstesi.
    13. Efter generel anæstesi behandles geden med gentamicin (4 mg/kg, IM) og ceftiofur natrium (en cephalosporin, 2 mg/kg, IM) for at forhindre infektion.
  5. FVEP-måling og kvantitativ analyse
    BEMÆRK: Som vist i figur 1A er de første positive og negative toppe i FVEP-bølgeformen udpeget som P1 og N1 og den anden positive top som P2. Den typiske implicitte tid på P1, N1 og P2 er henholdsvis omkring 40, 60 og 120 ms. P1- og P2-amplituder måles fra trug af N1-bølgeform til toppe af henholdsvis P1- og P2-bølgeformer.
    1. I tilfælde af monokulær skade skal du bruge interokulær sammenligning af amplitud og implicit tid for at hjælpe med at reducere variation mellemsessionen og øge følsomheden17.

2. PVEP i rhesus makak

BEMÆRK: Mønster VEP'er kan fremkaldes i rhesus macaques9 og er mere stabile end Flash VEP i amplitud og implicit tid17. Derfor blev PVEP brugt til at opdage integriteten af retino-geniculo-kortikale vej i ikke-menneskelige primater.

  1. Tilberedning af dyr
    1. Bedøve aben med isoflurane (1,5%-2%) efter induktion med Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam).
    2. Placer den steriliserede jordelektrode ved øreflippen. Sæt de steriliserede aktive og referenceelektroder subkutant langs midterlinjen på henholdsvis frontal- og occipital knoglen.
    3. Påfør øjenlåg speculum at udsætte bulbar conjunctiva.
    4. Brug klæbende uigennemsigtig sort tape til at lappe det kontralaterale øje.
  2. PVEP-optagelse
    1. Tryk på impedansknappen for at kontrollere elektrodevævets impedans, og impedansværdierne vises i hver kanal. sikre, at det er under 10k Ω. Hvis ikke, skal du tilslutte eller udskifte elektroden igen.
    2. Kontroller impedansværdierne i Impedanstestvinduet , og sørg for, at impedansen afviger med mindre end 1 kΩ mellem de aktive elektroder og referenceelektroderne for at reducere elektrisk interferens17.
    3. Tryk på oscillograph-knappen for at kontrollere baseline støj uden stimulering.
      BEMÆRK: Hvis der er en stor baseline støj, skal du frakoble alle andre elektriske enheder i samme rum og slukke for mobiltelefonerne. Hvis problemet med grundlinjen fortsætter, skal du gentage PVEP-testen på en anden dag.
    4. Optag PVEP-respons fra det ikke-sendte øje ved at vælge lysintensiteten på henholdsvis 0,5 og 1,0 cyklus/grad i den hvide baggrundsboks i øverste højre hjørne, og tryk derefter på undersøgelsesknappen .
      BEMÆRK: For hver optagelse er 64 spor i gennemsnit for at give en bølgeform. For hver frekvens erhverves der et minimum af to optagelser for at kontrollere reproducerbarheden af PVEP-signaler.
    5. Gentag proceduren for det kontralaterale øje.
    6. Når det er gjort, ophør isoflurane levering til at vække aben.
    7. Efter generel anæstesi behandles aben med gentamicin (4 mg/kg IM) og ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) for at forhindre infektion.
  3. PVEP-måling og kvantitativ analyse
    1. Som vist i figur 1B blev de første negative og positive toppe i PVEP-bølgeformen udpeget som N1 og P1, som typisk forekommer på omkring 50 og 90 ms. P1 amplituden måles fra trug af N1 til toppen af P1.
    2. I tilfælde af monokulær skade skal du bruge interokulær sammenligning af amplitud og implicit tid for at hjælpe med at reducere variationen mellemsessionen og øge følsomheden17.

3. Mønster ERG (PERG) i ged

BEMÆRK: I den foregående undersøgelse blev der ikke observeret interokulær krydstale af PERG-signal hos geder, så PERG-respons kan registreres samtidigt fra begge øjne9.

  1. Forberedelse af eksamen
    1. Bedøve geden ved hjælp af xylazin (3 mg/kg, IM), og placere på en eksamen tabel.
    2. Placer en temperatursensor under gedens tunge.
    3. Forbind pulsoximeteret til den proksimale ende af gedeøret.
    4. Bind blodtryksmanchetten til låret.
    5. Fastgør EKG-clipsene på lemmerne i overensstemmelse hermed.
    6. For at reducere elektrode impedans, placere en steriliseret kranieskrue på frontal knoglen og forbinde til jorden elektrode med en alligator klip.
    7. Placer to steriliserede nålereferenceelektroder subkutant 1 cm bag den laterale canthi på begge sider.
    8. Brug øjenlågsspektret til at eksponere bulbar conjunctiva.
    9. Placer to desinficerede ERG-Jet optagelse elektroder i centrum af bilaterale hornhinder efter aktuel anvendelse af kunstig tåre.
    10. Placer to 47,6 cm x 26,8 cm LED-skærme foran begge øjne med en visningsafstand på 50 cm.
    11. Juster hver skærm, så den er parallel med elevplanet på samme side, og juster midten af skærmen til elevplanet.
    12. Sørg for, at det kontrastskiftende skakbræt (tidsmæssig frekvens, 2,4 Hz) vises på begge skærme og har et maksimalt billedforhold på 4:3, som er indstillet af udstyrsindstillinger.
    13. Sørg for, at kontrasten mellem hvide og sorte brikker forbliver 96%, og den gennemsnitlige luminans er 200 cd/m2 (Candela pr. kvadratmeter), som kontrolleres af luminansmåleren.
      BEMÆRK: Ifølge ISCEV kræves en gennemsnitlig fotopic luminans på 40-60 cd/m2 hos mennesker17. I en anden undersøgelse ved hjælp af mus model, mønsteret forblev på en gennemsnitlig luminans på 800 cd/m2,18. En feltstørrelse på mindst 15° i den smalleste dimension er nødvendig for en standard PERG-test hos mennesker17. Juster placeringen af hornhindeeelektrode, hvis den ikke er i midten af hornhindeoverfladen.
  2. PERG-optagelse
    1. Dæmp det omgivende lys, og tryk på impedansknappen for at kontrollere elektrodevævets impedans. Værdierne af impedans vil blive vist i hver kanal.
    2. Kontroller impedansværdierne i Impedans testvindue , og sørg for, at impedansen er under 10 kΩ. Hvis ikke, skal du tilslutte eller udskifte elektroden igen.
    3. Tryk på oscillograph-knappen for at kontrollere baseline støj uden lysstimulering.
      BEMÆRK: Vær opmærksom på at beskytte de skrøbelige ERG-Jet-optageelektroder. Baseline støj i PERG er normalt mindre end i FVEP i ged.
    4. Start PERG-optagelse fra begge øjne samtidigt ved de rumlige frekvenser på 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 og 12,6 cyklusser/grad i træk. For hver rumlig frekvens er 64 spor i gennemsnit for at give en udlæsning.
    5. Endelig skal du slukke for skærmen for at optage PERG uden visuel stimulus som en negativ kontrol.
      BEMÆRK: PERG-signaler er normalt stabile og behøver ikke gentagelse.
    6. Fjern den forreste kranieskrue og vågen geden ved at injicere Idzoxan (1,5 mg/kg), som er en xylazine antagonist.
    7. Efter generel anæstesi behandles geden med gentamicin (4 mg/kg IM) og ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) for at forhindre infektion.
  3. PERG-måling og kvantitativ analyse
    1. Indstil båndpassfilteret til at variere fra 1 til 75 Hz. For 3,0 cpd PERG er bandpassfilteret indstillet til at være fra 1 til 50 Hz for at udjævne sporet uden at påvirke dets amplitud.
    2. Som vist i figur 1C er de første positive og negative toppe i bølgeformen udpeget som P1 (typisk omkring 25 ms) og N1 (typisk omkring 55 ms). PERG amplituden måles fra N1 til P1.
    3. I tilfælde af monokulær skade bruger vi interokulær sammenligning af amplitud og implicit tid til at hjælpe med at reducere variation mellemsessionen og reducere følsomhed17.

4. PERG i rhesus makak

BEMÆRK: Det er uklart, om der er interokulær krydstale af PERG-signal i rhesus makak, så PERG-svar fra begge øjne registreres separat.

  1. Forberedelse af eksamen
    1. Bedøve aben med isoflurane (1,5%-2%) efter injektion af Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam) og luftrør.
    2. Placer en steriliseret jordelektrode subkutant på frontalbenet. Indsæt en steriliseret nål referenceelektrode subkutant, 1 cm bag den laterale canthus på samme side.
    3. Placer en desinficeret ERG-Jet optagelseselektrode på den centrale hornhinde efter aktuel påføring af kunstig tåre.
      BEMÆRK: Juster placeringen af hornhindeeelektrode, hvis den ikke er i midten af hornhindeoverfladen.
    4. Brug klæbende uigennemsigtig sort tape til at lappe det ene øje.
    5. Placer en skærm (47,6 x 26,8 cm) i en visningsafstand på 50 cm.
    6. Sørg for, at skærmen justeres, så den er parallel med elevplanet. Juster midten af skærmen til elevplanet.
    7. Sørg for, at det sorte og hvide skakternet bakker med en frekvens på 2,4 Hz, og højde-bredde-forholdet er 4:3, som er indstillet af udstyrsindstillinger.
    8. Sørg for, at kontrasten mellem de hvide og sorte brikker er 96%, og den gennemsnitlige luminans forbliver 200 cd/m2, som kontrolleres af luminansmåler.
  2. PERG-optagelse
    1. Dæmp det omgivende lys og kontroller elektrodevævets kontakt impedans.
    2. Sørg for, at impedansen er under 10 kΩ. Hvis ikke, skal du tilslutte eller udskifte elektroden igen.
    3. Kontroller baseline støj uden lysstimulering.
    4. Lappe det ene øje og starte PERG optagelse fra det andet øje ved rumlige frekvenser på 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, og 12,6 cyklusser / grad fortløbende.
    5. Trinnene 4.2.1-4.2.4 for det kontralaterale øje gentages.
    6. Stop isofluraneforsyningen for at vække aben.
    7. Efter generel anæstesi, behandle aben med gentamicin (4mg/kg IM) og ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) for at forhindre infektion.
  3. PERG-måling og kvantitativ analyse
    1. Som vist i figur 1D er de første positive og negative toppe i bølgeformen udpeget som P1 (typisk omkring 40 ms) og N1 (typisk omkring 85 ms). PERG amplituden måles fra N1 til P1.
    2. I tilfælde af monokulær skade bruger vi interokulær sammenligning af amplitud og implicit tid til at hjælpe med at reducere variation mellemsessioner og øge følsomheden17.

5. OKT i ged

  1. Tilberedning af dyr
    1. Bedøve geden ved hjælp af xylazin (3mg/kg, IM), og derefter intubere.
    2. Spile eleven ved aktuel administration af mydriaterhavet øjendråber med tropicamid (5%) og phenylephrine (5%).
    3. Brug øjenlågsspektret til fuldt ud at eksponere eleven.
    4. Placer hovedet af geden på hagen resten.
      BEMÆRK: Selvom gasbedøvelse ikke udføres, intuberer du geden regelmæssigt for at beskytte luftvejene mod at blive komprimeret af hagestøtten.
  2. OKT-billeddannelse
    BEMÆRK: Den retinale OCT billeddannelse udføres ved hjælp af OCT-systemet ved en bølgelængde på 870 nm i denne undersøgelse. OLT-scannerens optiske aksiale opløsning er 12 μm. Cirkulær scanningstilstand bruges til at scanne synsnerven (ONH) med høj opløsningstilstand. 100 billeder er i gennemsnit for at optimere billedkvaliteten. Den detaljerede vejledning er tilgængelig online (se Materialetabel).
    1. Indledende OLT-scanning (baseline eksamen)
      1. Klik på knappen Start for at komme ind i registreringsgrænsefladen. Vent på, at maskinen er færdig med at indlæse, og tryk derefter på den gule startknap for at starte billeddannelsen.
      2. Juster geden med det infrarøde kamera for at centrere ONH i det konfokale scanningslaser-optalmoscopybillede (cSLO) ved at ændre hovedpositionen.
      3. Juster joysticket for at belyse hele det infrarøde billede jævnt for at forbedre billedkvaliteten.
      4. Flyt joysticket fremad, indtil et opretstående retinal OKT-billede vises på den opretstående skærm.
      5. Rediger joysticket, så det har et jævnt tæt og vandret placeret retinal OLT-billede.
      6. Tryk på knappen på joysticket for at fange billedet automatisk og holde joysticket nede for at bevare billedkvaliteten på skærmen med levende billeder, indtil billederhvervelsen er fuldført. Tryk derefter på Hent.
      7. Opvåg geden ved at injicere Idzoxan (1,5 mg/kg), som er en xylazine antagonist.
        BEMÆRK: Centrering af ONH i baseline eksamen hjælper med at justere baseline scanning og opfølgende scanning i henhold til vores erfaring.
    2. Opfølgende OLT-scanning
      1. Vælg et indledende OLT-billede i høj kvalitet. højreklik, og vælg Angiv reference.
      2. Start OLT billeddannelse som nævnt ovenfor.
      3. Tryk på opfølgningsknappen for at tillade automatisk match af den aktuelle scanning med referencescanningen.
      4. Når den cirkulære scanningsring bliver grøn), skal du trykke på knappen på joysticket for at aktivere Automatisk realtidssporing.
      5. Opvåg geden ved at injicere Idzoxan (1,5 mg/kg ), som er en xylazine antagonist.
        BEMÆRK: For at lette processen med matchning skal du (1) flytte ONH'en i det levende vindue ved at dreje hovedet i overensstemmelse hermed eller (2) rotere ONH'en i det levende vindue ved at vippe hovedet for at få det aktuelle cSLO-billede til at se mere ligner det oprindelige billede. Denne vestibulo-okulære refleks fungerer godt under xylazine anæstesi19.
  3. OLT-måling
    1. Klik på knappen Måling for at angive målevinduet.
    2. Vælg viskelæderværktøjet, og slet RNFL-linjen, som automatisk mærkes af programmet.
    3. Vælg værktøjet Stregtegning for manuelt at skitsere grænsen mellem IPL og INL (Figur 2).
      BEMÆRK: GCC tykkelse i seks periskpapir regioner (T, TS, TI, N, NS, NI) og i gennemsnit GCC tykkelse omkring ONH (G) kan læses på skærmen (Figur 2). Den studerende test, envejs ANOVA eller to-vejs ANOVA kan bruges til at kvantificere OLT data i tilfælde af normal fordeling.

6. OKT i rhesus makak

  1. Udfør retinal OLT billeddannelse i rhesus makak ved hjælp af det samme udstyr og procedure som gjort i tilfælde af ged.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser repræsentative resultater af FVEP hos geder. Selvom bølgeformerne i samme flashintensitet har relativ lighed, anbefaler vi stadig at undersøge bølgeformene to gange. Elektromagnetiske bølger genereret af elektroniske enheder vil forstyrre de indsamlede elektriske signaler, hvilket resulterer i høj baseline støj og dårlig repeterbarhed af bølgeformen. Derfor anbefales det at sikre, at der ikke er redundante elektroniske enheder tilsluttet det omgivende miljø under elektrofysiologisk undersøgelse for at undgå en sådan interferens, og det anbefales at gentage mindst to målinger for at bestemme stabiliteten og repeterbarheden af eksperimentelle resultater. Når lappe begge øjne, bølgeforme er helt flad på begge øjne, hvilket viser, at bølgeforme er helt sikkert genererer fra vores flash stimulus. Figur 1B viser repræsentative resultater af PERG hos geder. På grund af dens stabilitet og høje signal erhverver vi pålidelig bølgeform bare ved en gang måling ved hver rumlig frekvens. Efterhånden som den rumlige frekvens øges, vil skakternets størrelse gradvist overstige genkendelsen af gedens øjne. Så vi kan se, at ved 12,7 cpd, pvep bølgeform er faldet en masse. Svarende til FVEP forsvinder bølgeformen, når vi lukker skærmen. Figur 1C viser repræsentative resultater af PVEP i rhesus makak. Vi gentager målingen to gange ved hver rumlig frekvens. Efterhånden som den rumlige frekvens øges, vil amplituden falde. Dette skyldes det faktum, at den rumlige frekvens overstiger opfattelsen af øjet. Figur 1D viser repræsentative resultater af PERG i rhesus makak. Grunden til, at amplituden falder med den rumlige frekvens, er den samme som beskrevet ovenfor. Når du analyserer disse data, kan du vælge at analysere amplituden mellem toppe og trug eller ventetiden for toppe eller lavpunkter som statistik.

Figur 2 viser oltets repræsentative resultater i ged. Billedet til venstre viser et fundus-fotografi taget af infrarødt kamera. Tæt til højre er et tomogram af nethinden, der viser den samlede tykkelse af nethinden omkring ONH og tykkelsen af hvert lag. Som vist på billedet kan vi tydeligt se, at geder har større retinale blodkar end aber. De grønne skiver yderst til højre er en kvantitativ analyse af tykkelsen af GCC omkring ONH. G står for general, T står for tidsmæssig side, N står for nasal side, S står for overlegen, og jeg står for ringere. Den sorte skrifttype repræsenterer GCC-tykkelsesmålingsværdien i mikrometer, og det grønne er den kliniske referencemålingsværdi for mennesker, ikke som reference for dette eksperiment.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative elektrofysiologiske bølgeformer hos gede- og rhesus-makakaber. A) Repræsentative FVEP-bølgeformer ved forskellige lysintensiteter fra en individuel ged inden for samme bedøvelsessession. (B,D) Repræsentative PERG-bølgeformer ved forskellige rumlige frekvenser fra en individuel ged (B) eller rhesus makak (D) inden for samme bedøvelsessession. C) Repræsentative PVEP-bølgeformer ved forskellige rumlige frekvenser fra en individuel rhesus macaque inden for samme bedøvelsessession. Den typiske implicitte tid for hver bølgeform er nævnt i protokolafsnittet. n = 1 forsøgsperson for hver test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: OLT-resultater. Repræsentative retinale OLT billeder omkring synsnerven hoved (venstre panel) og tykkelsen af GCC i forskellige peripapillary regioner (højre panel) i ged (A) og rhesus makak (B). n = 1 forsøgsperson for hver test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol af VEP, PERG og OCT i ged og rhesus makak. Disse in vivo metoder kan anvendes i store dyremodeller af forskellige optiske neuropatier, såsom grøn stær, iskæmisk, eller traumatisk optisk neuropati og optisk neuritis9.

PVEP er mere stabil og følsom end FVEP17; Det kan dog ikke fremkaldes i gede9. Som sådan udføres FVEP i ged, og PVEP udføres i rhesus makak i vores laboratorium for at evaluere integriteten af den retino-geniculo-kortikale vej. Den mekanisme, der ligger til grund for observationen af, at PERG, men ikke PVEP, kan induceres hos ged, er stadig uklar i henhold til vores viden. Det er muligt, at synsnerven funktion og struktur fra ged kan være forskellig fra mennesket.

Da amplituden af FVEP kan blive påvirket af pupilstørrelse og omgivende lys, udvider vi eleven og placerer et sort tæppe over gedehovedet under FVEP-optagelsen. Det skal bemærkes, at elevudvidelse ikke er nødvendig for FVEP i klinikker17. Tilsvarende, selv om mørk tilpasning ikke er nødvendig for FVEP optagelse i klinikker, fandt vi, at en 5 minutters tilpasning til det omgivende lys før FVEP optagelse kan øge intrasession repeterbarhed i amplitud.

PERG signal menes at stamme fra RGCs og dermed dens amplitud kunne bruges til at estimere funktionen af RGCs13,20. Sammenlignet med nogle specielle flash ERG komponenter, såsom scotopic threshold response (STR) og fotopic negativ respons (PhNR), PERG er mere følsom over for RGC dysfunktion13. Potentielle begrænsninger af PERG-test i denne undersøgelse er som følger. For det første anbefaler ISCEV at bruge klassisk CRT (katodestrålerør) stimulator til PERG-optagelse for at holde den gennemsnitlige luminans konstant. Den klassiske CRT-stimulator er dog mindre tilgængelig end LCD (Liquid Crystal Display). Selv om skærmen af LCD normalt præsenterer forbigående luminans ændringer under mønster vending, potentielt forårsager luminans artifact17, det ikke bidrage til amplituden af PERG i ged i henhold til vores tidligere konstatering: amplituden af PERG på den rumlige frekvens på 12,6 cpd er normalt forsømmelig i forhold til dem ved lavere rumlige frekvenser9 . En anden begrænsning er, at vi ikke korrigerer brydningsfejl før PERG-test af hensyn til enkelhed. For at kompensere for denne begrænsning skal den oprindelige PERG-amplitud registreres som reference.

Vores tidligere undersøgelse havde vurderet og optimeret variationen inden for og mellem sessionerne af VEP og PERG9. Vi fandt, at sammenlignet med xylazin resulterede isoflurane i mere gentagelig FVEP, men mere variable PERG-bølgeformer hos geder9. Derfor brugte vi isoflurane i FVEP-test og xylazin i PERG- og OCT-test hos geder. Sammenlignet med PERG er optaget på vep desuden potentielt mere variabel. Som sådan gentager vi regelmæssigt VEP-optagelse ved hver lysintensitet eller rumlig frekvens for at kontrollere intrasessionvariationen. På kontrasten er PERG-bølgeformer meget mere stabile. Derfor gentager vi generelt ikke PERG-optagelse. Selvom gentagen optagelse på en anden dag om samme emne generelt anbefales, gentager vi ikke regelmæssigt VEP- eller PERG-optagelse om samme emne på en anden dag af hensyn til enkelhed og dyreetik. Ikke desto mindre, FVEP og PERG optagelser uden inter-session gentage er følsomme nok til at opdage synsnerve skade i henhold til vores tidligere undersøgelse9.

Retinal OCT billeddannelse er en bekvem, pålidelig og ikke-invasiv teknik til langsgående overvåge og kvantificere dynamiske ændringer i nethinden struktur. Sammenlignet med PERG og VEP, OCT billeddannelse har meget bedre intersession repeterbarhed9. Desuden kan OCT imaging fange og kvantificere alle de optiske nervefibre inden for få minutter uden prøveudtagning fejl, der giver en meget billigere og effektiv mulighed for at undersøge nethinden struktur end traditionelle histologiske analyse. Men den rumlige opløsning af nuværende OLT billeddannelse er stadig for begrænset til at fortælle individuelle RGC soma eller optisk nerve fiber. Derudover skal det bemærkes, at en tykkere GCC målt ved OCT ikke nødvendigvis betyder en mere intakt indre nethinde, fordi GCC fortykkelse kan være forårsaget af retinale ødem eller blødning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev finansieret af følgende tilskud: National Key F & Program of China (2021YFA1101200); Medicinsk forskningsprojekt i Wenzhou (Y20170188), National Key R &D Program of China (2016YFC1101200); Kinas National Natural Science Foundation (81770926;81800842); Zhejiangprovins vigtigste F&U-program (2018C03G2090634); og Key R &D Program af Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). Sponsoren eller finansieringsorganisationen havde ingen rolle i udformningen eller udførelsen af denne forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
  2. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  3. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
  4. Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
  7. Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
  8. Singman, E. L., et al. Indirect traumatic optic neuropathy. Military Medical Research. 3, 2 (2016).
  9. Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
  10. Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
  11. Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
  12. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  13. Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
  14. Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
  15. Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
  16. You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
  17. Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
  18. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
  19. Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
  20. Porciatti, V. The mouse pattern electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).

Tags

Neurovidenskab udgave 180
<em>In vivo</em> Metoder til vurdering retinal ganglion celle og optisk nerve funktion og struktur i store dyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter