Summary
Her presenterer vi en rørledning for 3D-korrelativ fokusert ionstrålefresing for å veilede fremstillingen av cellulære prøver for kryo-elektrontomografi. 3D-posisjonen til fluorescerende merkede proteiner av interesse bestemmes først ved kryofluorescensmikroskopi, og deretter målrettet for fresing. Protokollen er egnet for pattedyr-, gjær- og bakterieceller.
Abstract
Kryo-elektrontomografi (kryo-ET) har blitt den valgte metoden for å undersøke cellulær ultrastruktur og molekylære komplekser i deres innfødte, frosne hydrerte tilstand. Kryo-ET krever imidlertid at prøvene er tynne nok til ikke å spre eller blokkere den innfallende elektronstrålen. For tykke celleprøver kan dette oppnås ved kryofokusert ionstråle (FIB) fresing. Denne protokollen beskriver hvordan man målretter mot spesifikke cellulære steder under FIB-fresing ved hjelp av en 3D-korrelativ tilnærming, som kombinerer tredimensjonale fluorescensmikroskopidata med informasjon fra FIB-skanningselektronmikroskopet. Ved hjelp av denne teknikken kan sjeldne cellulære hendelser og strukturer målrettes med høy nøyaktighet og visualiseres ved molekylær oppløsning ved hjelp av kryotransmisjonselektronmikroskopi (cryo-TEM).
Introduction
Fokusert ionstrålefresing tillater fremstilling av tynne biologiske prøver fra kryofaste prøver uten problemene som vanligvis er forbundet med mekaniske seksjoneringer som knivmerker og kompresjonsartefakter1. Når parret med kryo-elektrontomografi, muliggjør FIB-fresing høyoppløselige biologiske studier av cellulær morfologi og bestemmelse av strukturen til makromolekylære komplekser direkte fra celler ved sub-nanometeroppløsning 2,3,4. Mens rikelig arter, som ribosomer, lett finnes i tilfeldig kuttede FIB-lameller, er mange cellulære prosesser avhengige av samlokalisering av flere komplekser eller er lokalisert til bestemte steder i cellen. Følgelig kreves effektiv målretting for ikke å miste den biologiske egenskapen av interesse under freseprosessen og være begrenset til tilfeldige treff. En korrelativ tilnærming som kombinerer data fra skanningselektronmikroskopet (SEM)-FIB og et kryofluorescenslysmikroskop (FLM) er derfor nødvendig. Selv om det er mulig å utelate den opprinnelige korrelasjonen og kombinere FLM- og kryo-ET-data først etter TEM-oppkjøp5,6, muliggjør fluorescensstyrt fokusert ionstrålefresing et nøyaktig valg av freseområdet på forhånd, noe som resulterer i mer effektiv datainnsamling. Siden unnfangelsen7 hadde anvendelsen av 3D-korrelert FIB-fresing i biologiske studier vært begrenset til vi nylig rapporterte å identifisere et nytt væske-væske faseseparert (LLPS) rom i gjær ved hjelp av denne teknikken8.
Beskrevet her er en generalisert 3D-kryokorrelert lys- og elektronmikroskopi (CLEM) protokoll, som kan brukes til å studere et bredt spekter av prøver som spenner fra bakterier til gjær og pattedyrceller. Mens eksperimentene ble utført ved hjelp av et bestemt sett med instrumenter, er de enkelte trinnene ikke bundet til spesifikk maskinvare og kan enkelt overføres til andre systemer som en utvidelse til eksisterende protokoller 3,5. En liste over testet utstyr og foreslåtte innstillinger er gitt i materialfortegnelsen og tabell 1. De fire hovedtrinnene i rørledningen er (1) prøvepreparering, (2) lokalisering av egenskaper av interesse ved kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korrelert fokusert ionstrålefresing og (4) lokalisering av målrettede strukturer for kryo-ET-datainnsamling på lamellene i kryotransmisjonselektronmikroskopet (figur 1).
Protocol
Figur 1: Sammendrag av arbeidsflyten med et utvalg kritiske trinn. Hele protokollen er delt inn i fire trinn i henhold til utstyret som brukes: Prøvepreparering, inkludert dypfrysing, kryofluorescensmikroskopi, kryofokusert ionstrålefresing og kryo-elektronmikroskopi. For hvert trinn fremheves flere viktige punkter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Cellekultur og stupefrysing av rutenett
- Kulturceller av valg og optimalisere merking og behandlingsstrategier ved romtemperatur før du går over til kryo-eksperimenter. Mål av interesse er enten merket ved hjelp av fluorescerende proteinfusjoner eller levende farging (f.eks. Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, levende antistofffarging, etc.). Hvis behandling med kjemiske eller biologiske agenser (små molekyler, spesielle medier, siRNA, etc.) er nødvendig for å undersøke den biologiske prosessen av interesse, optimaliser forholdene (f.eks. tid, konsentrasjon) ved hjelp av levende celle FLM-avbildning.
- Sørg for at interesseområdene kan lokaliseres vellykket over bakgrunnen i et tilstrekkelig antall celler ved hjelp av bildeinnstillinger som samsvarer med senere kryoforhold så nært som mulig (dvs. NA, eksponeringstid osv.).
- Valg og forberedelse av rutenett
- Velg rutenett med hullstørrelse og avstand som passer for cellene og fiducialmarkørene som brukes (se trinn 1.3.1). Ikke bruk kontinuerlig film uten hull, da dette kan føre til for mye gjenværende buffer etter blotting og dermed redusere vitrifikasjonseffektiviteten og hemme påvisning av fiducial perler. For langvarig kontakt av cellene med ristene, sørg for at gitterstøtten og filmmaterialet er biokompatible.
- Plasmarens kryo-EM-ristene for å gjøre dem mer hydrofile. For bruk i klebende cellekulturer, steriliser ristene etter plasmarengjøring med UV-stråling i 20 minutter i en laminær strømningshette. Eventuelt kan rister forbehandles med forbindelser som hjelper med celleadhesjon, slik som poly-L-lysin eller concanavalin A, som beskrevet nedenfor.
MERK: Generelt har følgende rutenett-/utvalgskombinasjoner blitt brukt i den korrelative kryo-FIB-arbeidsflyten: Gjær: Cu eller Au, 200 mesh, R1/4 karbon eller SiO2-film , eventuelt belagt med concanavalin A; Escherichia coli: Cu eller Au, 200 mesh, R1/4 karbon eller SiO2 film; Chlamydomonas reinhardtii: Cu eller Au, 200 mesh, R1/2 eller R1/4 karbon eller SiO2 film; HeLa: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2 film, belagt med poly-L-lysin; HEK293: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2 film, belagt med poly-L-lysin. - Concanavalin Et belegg for å forbedre vedlegget av gjærceller:
- Lag en belegningsløsning på 1 mg/ml concanavalin A i 10 mM HEPES-buffer med 100 μMCaCl2, pH 8,5. Plasser en dråpe (50 μL) av beleggløsningen og to dråper destillert vann separat på et stykke parafinfilm.
- Ta opp det plasmarensede rutenettet med pinsett med omvendt kraft og sett det forsiktig inn i dråpen på beleggløsningen, unngå bevegelser vinkelrett på rutenettet for å forhindre skade på filmen.
- Etter ~ 5 s inkubasjon, vask rutenettet to ganger ved å sette det inn i vanndråpene på lignende måte. Til slutt, fjern overflødig væske ved å påføre et filterpapir på baksiden av rutenettet og la rutenettet tørke helt før du slipper det fra pinsetten. Bruk de tørkede ristene til stupfrysing.
- Poly-L-lysinbelegg for suspensjonskultur og adherente celler:
- Lag en beleggingsløsning på 1 mg/ml poly-L-lysin i 0,1 M natriumboratbuffer, pH 8,5.
- Plasser plasmarensede rister i en egnet tallerken for cellekultur og steriliser i 20 minutter ved UV-stråling.
- Tilsett forsiktig nok beleggløsning til å dekke alle ristene og inkuber ved 37 °C i minst 2 timer. Aspirer væsken og vask ristene forsiktig to ganger med PBS før du sår cellene til ønsket konsentrasjon.
- Forberedelse av celler og fiducial perler
MERK: Fiducial perler kreves for 3D-registrering av fluorescensdataene med bilder tatt i FIB / SEM mikroskop for å tillate 3D-korrelativ FIB fresing.- Velg perler som er gjenkjennelige i alle bildemodaliteter, dvs. FLM, SEM og IB (anbefalt diameter 0,5-1 μm), men sørg for at disse ikke overskrider den cellulære målstrukturen under fluorescensavbildning for å gjøre det lettere å skille perlene og den biologiske egenskapen av interesse. Fjern cytotoksiske konserveringsmidler i fiduciale perler (f.eks. NaN3) som instruert av produsenten.
MERK: For et enklere skille mellom de biologiske egenskapene av interesse og fiducials, er det nyttig hvis fluorescensutslippsspektra bare delvis overlapper slik at signaler kan skilles basert på intensitetsforskjeller i FLM-kanalene. - Hvis suspensjonskultur brukes, vokser cellene til en passende tetthet (f.eks. gjær OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii 1500 celler / μL) og utfør behandlinger som kreves for forsøket, for eksempel endring av medium, tilsetning av kjemikalier, sult, etc. Fest de plasmarensede ristene til pinsett etter behov for stupmetoden (manuell / automatisk), og påfør 4 μL av cellesuspensjonen blandet med ~ 1 x 105 perler / μL fiducial perleoppheng til filmsiden av rutenettene.
MERK: Bestem optimal fortynning av celler og fiducials i titreringseksperimenter (f.eks. ved å sjekke på cryo-FLM eller FIB/SEM, se nedenfor). For de fleste celler dyrket i suspensjon har imidlertid en endelig konsentrasjon på ~1 x 105 perler/μL av 1 μm fiducialperler (1:20 fortynning fra lager; se materialfortegnelse for detaljer) vist seg å være et godt utgangspunkt. - Hvis adherent kultur brukes, rengjør og steriliser ristene ved hjelp av UV-stråling for aseptisk kultur. Om nødvendig, forhåndsbelegg rister med forbindelser som hjelper celleadhesjon (f.eks. poly-l-lysin, fibronektin, laminin; se trinn 1.2.2). Frø og vokse celler på rutenettene i normale kulturretter eller retter med underavdelinger for rutenett.
- Behandle prøvene som nødvendig for forsøket og hold cellene under optimale forhold like til stupefrysing (f.eks. 37 °C / 5% CO2 for HEK / HeLa). Fjern ristene forsiktig fra kulturfatet og fest dem til pinsetten. Påfør 4 μL av kulturmediet blandet med fiducials (1 x 105 perler / μL for 1 μm fiducials) til den cellebærende siden.
- Velg perler som er gjenkjennelige i alle bildemodaliteter, dvs. FLM, SEM og IB (anbefalt diameter 0,5-1 μm), men sørg for at disse ikke overskrider den cellulære målstrukturen under fluorescensavbildning for å gjøre det lettere å skille perlene og den biologiske egenskapen av interesse. Fjern cytotoksiske konserveringsmidler i fiduciale perler (f.eks. NaN3) som instruert av produsenten.
- Plunge-fryse cellene ved hjelp av enten en manuell eller en automatisert fryseprosedyre. Hvis mulig, bare fjern rutenettet fra motsatt side av cellene for å forhindre mekanisk skade på cellene (figur 2A). På toarmede automatiserte stupesystemer oppnår du dette ved å plassere et polytetrafluoretylenark (f.eks. Teflon) i stedet for å blotte papir på puten som vender mot cellene. Overfør ristene til oppbevaringsbokser og oppbevar dem i flytende nitrogen (lN2) til bruk.
FORSIKTIG: lN2 og andre kryogener kan forårsake alvorlig skade på øyne og hud. Bruk personlig verneutstyr (PPE) og arbeid bare i et godt ventilert rom for å unngå oppbygging av farlige N2-konsentrasjoner .
MERK: Alle påfølgende trinn bør best utføres i væskefasen av lN2 for å unngå kontaminering av celle- og lamelloverflatene, da dette kan komplisere nedstrøms behandling. Reduser kontakten med flytende iskrystaller ved alltid å bruke rent flytende nitrogen (f.eks. filter for å fjerne flytende is), eliminere unødvendige overføringstrinn og, om mulig, arbeide i et fuktighetskontrollert miljø. - Monter og fest de stupefrosne ristene i AutoGrids med utskjæring og cellene vendt opp (figur 2A) for påfølgende kryofluorescensavbildning og FIB-fresing. For å sikre riktig justering av prøvene i TEM, må freseretningen være ortogonal til kryo-ET-tiltaksen. Plasser derfor orienteringsmerkene (f.eks. LASERGRAVERING eller flyttbare markørpunkter) på AutoGrids før klipping for å hjelpe med denne justeringen (figur 2A).
- Kontroller rutenettkvaliteten (figur 2B) på cryo-FLM og FIB/SEM. Optimaliser celletettheten, blotting tid og kraft for å få en jevn fordeling av celler og perler. Bruk reflektert lysavbildning på et kryofluorescensmikroskop eller bruk kryo-FIB-SEM for å sikre at både celler og fiducialperler er tydelig synlige (figur 2B, hvite piler).
- Gjenta om nødvendig stuping med bedre betingelser, f.eks. varierende cellekonsentrasjon og/eller blottingstid. Når passende stupparametere er funnet, må du ikke gjenta gridscreening for hver ny runde med eksperimenter.
Figur 2: Screening for egnede rutenett ved bruk av SEM og IB . (A) Orienteringsmerker bør plasseres på AutoGrids vinkelrett på freseretningen for å forenkle riktig lasting i TEM. Cellene er montert med forsiden opp i det sammensatte AutoGrid. (B) Etter stupefrysing inspiseres ristene i SEM for å evaluere og optimalisere stupeforholdene: a) Det bør ikke være for mange celler per rutenett. For HeLa-celler, for eksempel, ikke bruk mer enn 1-4 celler / firkant. For mindre celler som Saccharomyces cerevisiae (vist her), har klumper på 4-6 celler blitt funnet nyttige. b) Fiducial perler (hvite piler) skal være tydelig synlige, og det bør ikke være for mye buffer rundt cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Kryo-fluorescens lysmikroskopi
- For hvert rutenett får du oversikt i (bredfelt) fluorescens og differensialinterferenskontrast (DIC) eller reflektert modus og velger egnede rutenettruter med fluorescenssignal. Velg synsfelt som inneholder både cellene av interesse og et tilstrekkelig antall fiducial markører (6-12).
- Sørg for at cellene og perlene er jevnt fordelt, ikke for tette, og mot midten av hver firkant. Velg bare firkanter som er tilgjengelige både for FIB-SEM- og TEM-instrumentet, derav de som er minst tre kvadrater unna rutenettkanten på 200 nettrutenett (figur 3A, inne i den røde sirkelen).
- På hver av de valgte rutene får du en fluorescerende stabel med et fokustrinn som passer for senere dekonvolusjon, dvs. <1/2 den aksiale oppløsningsgrensen. Hvis mulig, bruk mål med høy numerisk blenderåpning (NA) for å øke fotonantallet og lokaliseringsnøyaktigheten.
- I et konfokalmikroskop med NA 0.9-mål, skaff stabler med 300 nm trinnstørrelse, oversampling av Nyquist-verdien. Ta om nødvendig opp flere fargestakker (figur 2B). Oppbevar rutenett under lN2 inntil videre bruk.
MERK: For å bestemme den optimale trinnstørrelsen, velg verdiene beregnet av mikroskopkontrollprogramvaren eller bruk elektroniske verktøy9. Se etter gjennomblødning av signal mellom kanaler, siden overdreven gjennomblødning er skadelig for samlokaliseringseksperimenter. Noen kan imidlertid være fordelaktige å korrigere for kromatiske avvik i flerfargede stabler.
- I et konfokalmikroskop med NA 0.9-mål, skaff stabler med 300 nm trinnstørrelse, oversampling av Nyquist-verdien. Ta om nødvendig opp flere fargestakker (figur 2B). Oppbevar rutenett under lN2 inntil videre bruk.
- Deconvolve stabler med passende programvare10,11 og skjær7 dem på nytt hvis en isotropisk pikselstørrelse er nødvendig. Dekonvolusjon - akkurat som ved romtemperatur - renser opp FLM-signalet og kan forbedre lokaliseringsnøyaktigheten (figur 3C).
Figur 3: Velge kvadrater for FLM-stakkinnsamling og forbedring av data ved dekonvolusjon. (A) Oversikt over et rutenett stupt med gjærceller som uttrykker eGFP-Ede1 (grønn) og mCherry-Atg8 (magenta). Velg posisjoner med god fordeling av perler og celler, men unngå kantene på rutenettet (skyggelagt rødt). Boksene angir posisjoner med god cellefordeling der fluorescensstabler ble tatt. (B) Maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) av flerfargestakken tatt på den gule boksfirkanten (fra A) etter dekonvolusjon. Dekonvolusjon av FLM-stablene rydder betydelig opp uønskede bakgrunnssignaler og bidrar til å lokalisere perler i z mer nøyaktig, som tydelig fra gaussiske anfall før (C) og etter dekonvolusjon (D) (anfall ble utført i 3DCT og vises for perlen merket med 1). Bilder viser innzoomede MIP-visninger av den røde kanalen (eksitasjon: 552 nm, utslipp: 585-650 nm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Fokusert ionstrålefresing
- Legg ristene inn i kryo-FIB-SEM-instrumentet og bruk enten utskjærings- og/eller orienteringsmerkene for å sikre riktig orientering for senere plassering i TEM (figur 2A). Kontroller at freseretningen er vinkelrett på vippeaksen til TEM.
- Bruk et gassinjeksjonssystem (GIS; CpMePtMe3) på sceneposisjonene forhåndsdefinert av FIB-SEM-oppsettet for å belegge ristene med et beskyttende organometallisk lag. Ikke bruk for mye, da dette kan forstyrre fiducial perle lokalisering i TEM senere. Bruk et plasmabelegg for å påføre metallisk platina for å redusere prøvelading.
MERK: Hvis ingen innstillinger for GIS-belegg er tilgjengelige, kan de enkelt bli funnet ved å utføre påfølgende runder med kort belegg (~ 2 s), etterfulgt av FIB-fresing. Sørg for at prøven fortsatt kan kuttes vellykket ved middels strøm (~ 100 pA) uten tilsynelatende frynsing av det beskyttende organometalliske laget rundt lamellkantene. Både tid og avstand til GIS-nålen (i forhold til prøven) er viktige parametere å vurdere. GIS-nålen må ikke brukes i romtemperatur (dvs. 45 °C), men så kald som mulig for likevel å gi et jevnt belegg (25-27 °C). - Registrer en SEM-rutenettoversikt og utfør en 2D-korrelasjon med FLM-oversikter for å finne rutenettrutene som fluorescerende stabler er registrert for. Kontroller begge visningene manuelt eller bruk forskjellige programvarepakker 7,10,12 for å finne rutenettrutene. Her er fokuset på verktøykassen for 3D-korrelasjon (3DCT)7, som bruker 3D-stiv kroppstransformasjon med isotrop skalering mellom visninger. En utmerket gjennomgang av 3DCTs funksjoner er tilgjengelig online13.
- Velg og merk minst fire tilsvarende posisjoner, for eksempel landemerker som gitterstolper eller hull i støttefilmen, i både FLM- og SEM-rutenettoversikten (høyreklikk) og beregn transformasjonen mellom de markerte punktene (korrelat).
- Deretter plasserer du markørene i midten av de tilsvarende rutenettrutene som FLM-stabler er anskaffet for, og forutsier deres posisjon i SEM-visningen (korrelat; Figur 4A).
- For hver korrelerte rutenettfirkant tar du et IB-bilde (Low-Current (≤10 pA) ved den valgte FIB-fresevinkelen (10°-25° for 45° forvipping). Velg et synsfelt (dvs. posisjon og forstørrelse) som samsvarer med fluorescensdataene. For 200 mesh-nett, innhent fluorescens- og FIB/SEM-data for å inneholde enkeltrutenett, inkludert rutenettstolpene (se figur 3A og figur 4A).
MERK: Fresing bør utføres i så grunn vinkel som mulig for å unngå å miste betydelig vinkelområde under kryo-ET og for å tillate identifisering av et tilstrekkelig antall fiducial perler. For eksempel: med en trinnhelling på 17°, en skyttel-fortilt på 45° og en FIB-strålehelling på 52° i forhold til plummet, er lamellens fortilt 10°, som omtrent oppfyller det foretrukne vinkelområdet på ±60° i TEM ved å vippe fra -50° til +70°, maksimum for mange TEM-kryoholdere. - Ta et SEM-bilde av samme firkant for å hjelpe til med identifisering av tilsvarende perler i fluorescens- og ionstrålevisningen.
- Utfør registrering av den deconvolved 3D FLM-stakken og 2D-ionstrålevisningen for hver posisjon med 3DCT som beskrevet i følgende (figur 4B) trinn.
- Last inn tilsvarende oppstykket 3D FLM-stakk og ionstrålevisning (IB) i 3DCT.
MERK: Flerfargede fluorescensdata kan lastes inn som opptil tre separate enkeltkanals stakkfiler. - Velg 4 fiducial perler i fluorescensdataene og høyreklikk på posisjonslisten for å bestemme deres 3D-posisjon via Gaussisk montering av signalet i x, y og z. Velg de tilsvarende perlene i IB-bildet og utfør en innledende 3D-korrelasjon (korrelat).
- Legg iterativt til flere perler i fluorescensbildet, finjuster 3D-posisjonen og forutsi posisjonen i IB-visningen for raskt å legge til flere perler i registreringen og for å kontrollere nøyaktigheten av korrelasjonen. I 3DCT er verdier for rotmiddelkvadratfeil (RMSE) gitt for å vurdere korrelasjonskonsistensen7.
- Kontroller at RMSE-verdiene er små og i samme rekkefølge som lokaliseringsnøyaktigheten (~300 nm). For å bestemme nøyaktigheten av korrelasjonen, la ut noen fiducial perler tydelig identifiserbare i både fluorescens og ionstråle bevisst under registreringstrinnet. Gjør dette ved å sjekke deres forutsagte versus faktiske plassering i ionstrålebildet. Hvis den forutsagte posisjonen avviker vesentlig fra den virkelige, gjenta den opprinnelige korrelasjonen med et nytt sett med fiducials.
MERK: Korrelerende 6-8 perler har vist seg tilstrekkelig for nøyaktig registrering av FLM-stablene og IB-visningene. Å legge til flere fiducials (opptil 12-15) over et bredt spekter av z-verdier (f.eks. ved å velge perler på rutenettlinjen eller i nærliggende firkanter) kan imidlertid forbedre nøyaktigheten av korrelasjonen.
- Kontroller at RMSE-verdiene er små og i samme rekkefølge som lokaliseringsnøyaktigheten (~300 nm). For å bestemme nøyaktigheten av korrelasjonen, la ut noen fiducial perler tydelig identifiserbare i både fluorescens og ionstråle bevisst under registreringstrinnet. Gjør dette ved å sjekke deres forutsagte versus faktiske plassering i ionstrålebildet. Hvis den forutsagte posisjonen avviker vesentlig fra den virkelige, gjenta den opprinnelige korrelasjonen med et nytt sett med fiducials.
- Velg de målrettede mobilsignalene, tilpass deres 3D-posisjon i FLM-stakken og bruk transformasjonen til å forutsi målposisjonene i IB-visningen (figur 4B).
MERK: Enhver oppføring i FLM-posisjonslisten, som ikke har en motpart i IB-listen, vil bli behandlet som et signal som skal forutsies.
- Last inn tilsvarende oppstykket 3D FLM-stakk og ionstrålevisning (IB) i 3DCT.
- For hver korrelerte firkant, overfør predikerte posisjoner av funksjonene av interesse til FIB-SEM-instrumentet og plasser lamellfresemønstre (figur 4C). Overfør posisjoner manuelt (f.eks. ved å måle avstanden til synlige landemerker, for eksempel celler eller tillitsperler) eller bruk automatisering og skripting som implementert, for eksempel i SerialFIB14. Hvis det er flere signaler per celle, plasserer du mønstrene for å inkludere så mange interessepunkter som mulig i samme lamell for å øke gjennomstrømmingen.
- Først grov, og deretter fin frese lamellene til en endelig tykkelse på 150-250 nm. Unngå trinn (f.eks. stressavlastningskutt15) som forårsaker sagging av lamellen og dermed resulterer i bevegelse av den faktiske egenskapen av interesse med hensyn til de tidligere anskaffede FLM-stablene. Bruk enten manuell3 eller automatisert14,16,17,18 FIB freseprosedyrer. Med begge metodene, sørg for at funksjonen av interesse forblir i midten av lamellen ved å symmetrisk tynne den fra topp og bunn.
- Hvis du vil evaluere nøyaktigheten av fresingen for hver lamell, utfører du samme registrering som i trinn 3.4. Denne gangen bruker du imidlertid det endelige IB-bildet etter FIB-fresing og kontrollerer om de forutsagte posisjonene til funksjonene av interesse er inneholdt i den endelige lamellen. Alternativt kan du legge over de roterte projeksjonene av FLM-stakkene, hentet fra 3DCTs utdata og tilpassede skript19, med det endelige IB-bildet (figur 4C, liten innsats).
Figur 4: 3D-korrelativ FIB-freseprosedyre . (A) 2D-2D-korrelasjon av FLM (venstre) og SEM (høyre) oversikter over rutenettet brukes til å lokalisere rutenettrutene som fluorescerende stabler ble tatt på tidligere. (B) For hver valgte firkant, etter 3D-2D-registrering av tilsvarende fiducialposisjoner i 3DCT (fargede bokser), velges posisjoner av biologiske egenskaper av interesse i FLM-dataene. Basert på prediksjonen av tilsvarende posisjoner i ionstrålebildet (røde sirkler), velges steder for lamellpreparasjon. (C) Skanning elektronmikroskop (SEM) og ionstråle (IB) bilder brukes til å holde målet sentrert under fresing. Endelige tykkelser på 150-250 nm har blitt funnet tilstrekkelig for videre nedstrøms prosessering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Korrelativ TEM
- Last rutenettene inn i TEM, og kontroller at lamellretningen (som vist fra utskjærings- eller orienteringsmerker) er vinkelrett på vippeaksen.
MERK: Mikroskoper fra forskjellige produsenter kan styres ved hjelp av forskjellige programvare, for eksempel Tomo5, TOM eller SerialEM20. Her er fokuset på sistnevnte. - Skaff deg rutenettmontasje og oversikter for hvert rutenett som inneholder lameller. Sørg for at forstørrelsen og eksponeringstiden er egnet til å visualisere fiducialperlene i TEM-bildene uten å legge vesentlig til den totale elektrondosen. Skaff høyoppløselige TEM-kart (montasjer) av hver lamell.
- Registrer og 3D-2D korrelerer FLM-stakken med TEM-rutenettet og lamelloversiktene i 3DCT. Bruk samme fremgangsmåte som beskrevet i trinn 3.6 ved å velge tilsvarende dråpeposisjoner i bildene av fluorescens (x, y, z - gaussisk passform) og transmisjonselektronmikroskop. Velg deretter interesseposisjonene i FLM-kanalene og overfør dem til TEM-oversiktene. Bruk om nødvendig en totrinnsprosedyre som omfatter en første korrelasjon mellom FLM og TEM med lav forstørrelse, og den andre fra lav til høy forstørrelse TEM (figur 5).
- Overfør posisjoner enten manuelt (ved å måle avstander til landemerker), registrerings- og kartverktøyene som er tilgjengelige i SerialEM20, eller ekstern programvare som CorRelator21.
- Definer og kjør vippeserier i korrelerte posisjoner. Bruk en passende forstørrelse, defokusering og total dose (se materialfortegnelse og tabell 1 for detaljer). Start oppkjøpet ved pre-tilt bestemt av lamellen (se også notatet i trinn 3.4) og bruk et dosesymmetrisk tiltskjema22. Bruk enten manuell eller satsvis anskaffelse.
Figur 5: Lokalisering av korrelerte posisjoner i TEM. Etter vellykket 3D-korrelativ FIB-fresing og overføring til transmisjonselektronmikroskopet, utføres 3D-2D-registrering for hver frest firkant mellom fiducialperler (fargede bokser) i FLM-stabler og TEM-oversikter for å lokalisere potensielle steder for cryo-ET (røde sirkler). Lamelloversikter med høyere forstørrelse (zoom inn) kan deretter anskaffes for å sette opp tomogrammer mer presist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Protokollen gir en gjennomgang av rørledningen som brukes til å oppdage det EH-domeneholdige og endocytoseproteinet 1 (Ede1)-avhengige endocytiske proteinavsetningen (END) og dets nedbrytning og fangst i autofagiske legemer8. END er et væske-væske faseseparert rom i S. cerevisiae, som bufrer en rekke proteiner involvert i clathrin-mediert endocytose (CME) etter mislykkede endocytiske hendelser. En av hovedkomponentene er Ede1, som også fungerer som en CME-komponent og som en selektiv autofagireseptor for nedbrytning av dette nye LLPS-rommet. Følgelig ble en EGFP-fusjon av Ede1 (EGFP-Ede1) under kontroll av alkoholdehydrogenase (ADH) -promotoren brukt til å visualisere ENDs siden Ede1-overekspresjon forstyrrer de tidlige stadiene av endocytose og derfor konstitutivt induserer LLPS.
På et stupfrosset rutenett med EGFP-Ede1 overuttrykkende gjærceller og 1 μm fiducial markører ble fem posisjoner valgt for FLM-stakkoppkjøp i GFP-kanalen (figur 6A; TFS Korrsight; konfokalmodus, 300 nm fokustrinnstørrelse, 10 μm rekkevidde). Rutenettet ble overført til FIB-instrumentet (Quanta 3D FEG), og rutenettene som FLM-stabler var anskaffet for, ble identifisert ved å utføre en 2D-2D-korrelasjon mellom fluorescens- og SEM-rutenettoversiktene (sammenlign trinn 3.2).
For hver av de valgte rutene ble ionstrålebilder tatt ved lav strøm (10 pA, 1200x forstørrelse), og tilsvarende fiducialposisjoner ble registrert i 3DCT. Etter valg av posisjoner med den biologiske egenskapen av interesse og tilpasning av deres 3D-posisjon i FLM-stakken, ble den funnet transformasjonen påført antatte END-posisjoner, og stedene for lamellpreparasjon ble valgt (figur 6B). En FIB-stråle skråstilt 11° i forhold til rutenettoverflaten ble brukt i eksemplene vist her (45° FIB shuttle pre-tilt; 18° trinnhelling). Posisjoner av interesse ble overført, og FIB-mønstre ble tegnet manuelt (figur 6D) ved å måle avstanden til de forutsagte posisjonene i forhold til fremtredende landemerker i FIB-bildet (f.eks. hull, isforurensninger, fiducialperler). Nøyaktigheten av registreringen ble evaluert ved bevisst å utelate perler som tydelig kunne identifiseres i FLM- og IB-bildet, og deretter sammenligne deres faktiske og forutsagte posisjoner i ionstrålevisningen (f.eks. diamant i figur 6B, C). Korrelasjonen for kvadratet vist i figur 6C ble funnet å være nøyaktig (dvs. den forutsagte posisjonen til FLM-perleposisjoner falt perfekt sammen med deres tilsvarende IB-plassering og 3DCT rapporterte subpiksel-RMSE-verdier for registreringen). Dermed ble lameller kuttet ved de forutsagte posisjonene (Site B) og finmalt til en tykkelse på ~ 200 nm (endelig mønsterforskyvning).
Figur 6: Representative resultater for 3D-korrelativ målretting av endocytiske proteinavleiringer (END) i gjær. (A) SEM oversikt over nettet før fresing. De fargede boksene indikerer rutenett for hvilke fluorescensstabler ble tatt på forhånd. (B-C) 3D-korrelasjon i et rutenett firkant. Etter å ha registrert flere tilsvarende fiduciale perler (fargede bokser) i FLM-dataene (B, her vist som maksimal intensitetsprojeksjon) og ionstrålebildet (C), ble nøyaktigheten av 3D-registreringen verifisert ved å forutsi posisjonen til perlen indikert med diamanten. Deretter ble posisjonene til målsignalet (røde sirkler) spådd i ionstrålevisningen for to potensielle fresesteder. (D) Zoom inn på område B som viser de anslåtte posisjonene til tre målpuncta (røde sirkler) og de første fresemønstrene (gule bokser). En fjerde fluorescens punctum ble spådd å være mye lavere enn den andre puncta og derfor ikke målrettet under fresing (grå sirkel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter vellykket FIB-fresing og overføring av nettet til kryo-transmisjonselektronmikroskopet (Titan Krios opererte på 300 kV og utstyrt med en Gatan K2 direkte elektrondetektor og Bioquantum energifilter), ble en rutenettoversikt registrert i SerialEM og brukt til å finne firkanter med lameller. For hver lamell ble det samlet inn oversiktsbilder, og FLM-dataene ble registrert i 3DCT (3D-2D) med tilsvarende fiducialperler. Posisjonene til de biologiske egenskapene av interesse (figur 7A) ble deretter forutsagt ved hjelp av transformasjonen beregnet fra fiducialperlene. Lamelloversikter registrert ved høyere forstørrelse ble sydd, og steder av interesse korrelerte ved hjelp av tydelig synlige landemerker (f.eks. fiducial perler). Alternativt kan klassiske CLEM-oversikter produseres i ulike programvarer10,12.
Basert på korrelasjonen ble det funnet fire potensielle steder for tomogramoppkjøp for lamellen vist i figur 7A. Dette inkluderer imidlertid også en posisjon som ikke var målrettet under den 3D-korrelerte FIB-fresingen (sammenlign figur 6D; grå sirkel) og en posisjon blokkert av isforurensning (figur 7; grå bokser). Følgelig kunne tomogrammer bare registreres for to posisjoner (figur 7B). Samlet sett ble det oppnådd en korrelasjonssuksess på ~ 75%, dvs. lameller som overlevde overføringen til TEM- og END-strukturene på de forutsagte stedene (12 korrelerte steder). Etter tomogramrekonstruksjon, segmentering og malmatching, kan individuelle END-strukturer visualiseres i sin opprinnelige kontekst (figur 7C, D). Dette inkluderer det fenestrerte endoplasmatiske retikulumet (ER) som omgir END, lipiddråper som av og til tar kontakt, og ribosomer, som er ekskludert fra LLPS-rommet. Samlet viser dette hvordan 3D-korrelativ FIB-fresing kan gi molekylær informasjon om sjeldne biologiske prosesser fra intakte celler.
Figur 7: Representative resultater for visualisering av END med cryo-ET. (A) TEM-oversikten med lav forstørrelse av fresestedet vist i figur 6 kan lett korreleres med FLM maksimal intensitetsprojeksjon (figur 6B) for å lokalisere biologiske trekk av interesse (røde kryss). (B) I et andre trinn kan en høyere forstørrelse (sydd) visning korreleres, og posisjoner for tomogramoppkjøp (gule bokser) er satt opp. Steder som følge av signalet utenfor planet (grå boks, sammenlign figur 6D) ble ignorert. (VG Nett) Ved hjelp av denne 3D-korrelative FIB-tilnærmingen kan endocytisk proteinforekomst (END) visualiseres i sitt opprinnelige miljø. Strukturer som endoplasmatisk retikulum (ER), ribosomer, membraner og lipiddråper kan identifiseres og visualiseres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Innstillinger for plasmarenser | |||
| Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG: | Radiofrekvens setiing: "HI", 30 s; N2 plasma | ||
| Innstillinger for stempel | |||
| TFS Vitrobot Mk IV: | 100% fuktighet; blotforce = 8; blottime = 10 s; ventetid 0 s; (Dette skal fungere for de fleste suspensjons- og adherentceller) | ||
| FIB GIS-posisjoner og tidspunkter | |||
| Quanta 3D FEG: | Vipp = 0, Rotasjon = -180, Z-posisjon = 13,5, Temperatursettpunkt = 26,15° , Tid = 8 s | ||
| TFS Scios: | Vipp = 0, Rotasjon = -180, Z-posisjon = 9,8, Temperatursettpunkt = 28 ° C, Tid = 7 s | ||
| TFS Aquilos 1: | Forhåndsdefinert posisjon for programvare, Temperatursettpunkt = 28° , Tid = 7 s | ||
| TFS Aquilos 2: | Programvare forhåndsdefinert posisjon, Temperatursettpunkt = 28°, Tid = 7 s | ||
| Innstillinger for FIB Sputter Coater | |||
| Quorumssystem: | I quorum prep kammer: 10 mA, 40 s | ||
| TFS Scios: | 10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s | ||
| TFS Aquilos 1: | 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| TFS Aquilos 2: | 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| Tomogram Oppkjøp | |||
| Titan Krios Gi2 | K2 kamera, Gatan Bioquantum energifilter | ||
| 20 eV spalte; dosesymmetrisk tiltskjema (Hagen) med 2° trinn; Start på +10° (lamellforvipp!) til +70°og -50° | |||
| Titan Krios Gi4 | Falcon 4; Selectris X energifilter | ||
| 10 eV spalte; dosesymmetrisk tiltskjema (Hagen) med 2° trinn; Start på +10° (lamellforvipp!) til +70° og -50° | |||
| FLM-oppkjøp | |||
| Korrsight (konfokal modus) | Mål: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; Parametere for stakkinnhenting: x-y pikselstørrelse = 161,25 nm, z-trinnstørrelse = 300 nm. | ||
| Leica SP8 kryo-konfokal | Mål: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; Parametere for stakkinnhenting: x-y pikselstørrelse = 84 nm, z-trinnstørrelse = 300 nm. | ||
Tabell 1: Liste over testet utstyr og foreslåtte innstillinger.
Discussion
1. Kritiske trinn i protokollen
Optimalisering av cellekultur og gitterstupeparametere er grunnleggende for denne arbeidsflyten. I begynnelsen av et prosjekt er det verdt å investere tid for å optimalisere merkingsstrategier, fordeling av celler og fiducialperler, og teste forskjellige rutenettforberedelses- og blottingsparametere. Arbeid med en optimalt stupfrosen prøve vil legge betydelig til rette for nedstrømsbehandling.
Når det gjelder ethvert TEM-eksperiment, er det nødvendig med glassprøver. For store pattedyrceller som HeLa, er 1-2 celler per rutenettkvadrat å foretrekke, men celler kan fortsatt være glassaktige ved høyere tetthet. Eventuelt kan vitrifisering forbedres i pattedyrceller (f.eks. HEK293, HeLa) ved å inkubere dem med 2,5-10% (v / v) glyserol tilsatt til kulturmediet 10 minutter før det stuper23. Hvis tilgjengelig, kan rutemønster brukes til å sikre perfekt plassering og distribusjon av cellene, og dermed forbedre vitrifikasjon og senere korrelasjon24.
Mens spesifikke celler kan velges under arbeidsflyten, vil for få celler som viser den biologiske egenskapen av interesse, redusere den totale gjennomstrømningen betydelig. For å forbedre korrelasjonen i POI-positive celler, bør tilstrekkelig lyse fluoroforer brukes. Dette er spesielt viktig på endogene uttrykksnivåer. Vi fant ut at under kryoforhold presterte mVenus ofte bedre enn EGFP på grunn av den økte lysstyrken25 og det hypsokrome skiftet, noe som holder den egnet for standard GFP-filteroppsett under kryoforhold26. For ikke-punktlignende målstrukturer bør også avveiningen mellom bølgelengde og lokaliseringsnøyaktighet (Abbe-diffraksjonsgrense) vurderes.
Effektiv 3D-korrelasjon krever også at nettene er mekanisk stabile og håndteres med stor forsiktighet. Mens standard gull- eller kobbergitter med karbonstøtte kan brukes, kan suksessraten økes betydelig ved å bruke stive SiO2-filmer , avhengig av prosjektet. Imidlertid er det ennå ikke endelig bestemt om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchende termiske ekspansjonskoeffisienter (substrat vs. film) for å redusere kryorynker27, er den mest avgjørende faktoren for vellykket 3D-korrelasjon. Videre, for å plukke opp skjøre Au-nett, kan polydimetylsiloksanbelagte retter brukes5.
I tillegg til å sikre prøvestabilitet, er et nøye valg av FLM-bildeparametere nødvendig for å oppnå fluorescensstabler av høy kvalitet som er egnet for optimal målretting under FIB-fresing. I denne forbindelse anbefales det også å teste forskjellige denoising28 - eller dekonvolusjonsteknikker på FLM-dataene, da det kan forbedre lokaliseringen av fiducials og cellulære signaler betydelig. Når fluorescenssignalet korreleres til FIB-SEM-bilder, er det viktig med en god prøvetaking av fiducialperler. De skal være godt fordelt rundt cellene og eventuelt i ulike z-høyder. Det er også god praksis å validere konsistensen av korrelasjonen ved å sjekke de forutsagte vs. faktiske posisjonene til perler som bevisst ble utelatt fra fiducialmodellen, men som tydelig kan korreleres med øyet. 3DCTs RMSE-verdier bør også alltid vurderes for å kontrollere registreringskonsistensen.
Siden avsetning av frest materiale og restvann fra FIB-SEM-kammeret (dvs. rekontaminering) øker den effektive lamelltykkelsen ved å tilsette amorft materiale på begge sider av det, reduserer finmalte lameller i mikroskopet i lengre tid generelt TEM-datakvaliteten på grunn av ytterligere elektronspredningshendelser. Følgelig utføres fresing oftest på en to-trinns måte: først blir alle posisjoner malt omtrent (dvs. til ca. 800 nm), og deretter fint (til ~ 150-250 nm), og rutenettet blir umiddelbart losset etter at den siste lamellen er fullført. Bedre korrelasjonssuksess kan imidlertid oppnås ved å behandle posisjonene av interesse på en stedsvis måte, og dermed utføre grov og fin fresing på samme lamell rett etter hverandre, siden dette ikke gir tid til bøying eller deformasjon. Dette reduserer imidlertid det maksimale antallet lameller som kan produseres per rutenett, avhengig av rekontamineringshastigheten til systemet. For en hastighet på 20 nm / t produseres 4-6 lameller innen 1-1,5 timer.
Bevegelse av hele risten eller de grovmalte lamellene >300 nm vil resultere i dårlig eller mislykket korrelasjon (se også begrensninger diskutert nedenfor). Det bør derfor kontrolleres jevnlig, for eksempel ved å sammenligne IB-bilder før, under og etter FIB-fresing. Nettsteder som viser betydelig bevegelse (>300 nm) bør kastes. Optimaliser prøveprepareringen (dvs. valg av rutenetttype, celletetthet og stupende parametere; se protokollseksjon 1) og fresestrategi for å unngå disse bevegelsene. Lamellbøying kan reduseres betydelig ved stedsvis fresing som beskrevet i trinn 3.6 og ved å redusere lamellbredden. Som nevnt tidligere, mens stressavlastningskutt15 er designet for å redusere lamellbøying, resulterer de ofte i en samordnet bevegelse av den frakoblede lamellen, og forhindrer dermed korrelasjon effektivt. Integrerte FLM-systemer kan brukes til å løse dette problemet.
2. Modifikasjoner og feilsøking av metoden
Det anbefales sterkt å utføre en grundig karakterisering av prøven i levende celleavbildning før du går til kryoforhold. Optimalisering av celleprøver, behandlingsskjemaer og å vite hva slags signal du kan forvente før du går inn i kryoarbeidsflyten, kan forbedre suksessraten betydelig.
I arbeidsflyten som presenteres her, brukes et frittstående fluorescensmikroskop med et kryotrinn til å avbilde prøvene, etterfulgt av en overføring av rutenettene til det fokuserte ionstrålemikroskopet. Det har imidlertid blitt testet på systemer der et fluorescensmikroskop er integrert i FIB-SEM-kammeret, og derfor er det ikke nødvendig med prøveoverføring for å skaffe fluorescensbilder 29,30,31. Ved hjelp av slike integrerte systemer kan interesseposisjoner avbildes under og etter FIB-fresing for å kontrollere tilstedeværelsen av målfluorescenssignalet uten å øke risikoen for kontaminering av de endelige lamellene. Det er imidlertid viktig å huske på de optiske parametrene til de brukte mikroskopene, da for eksempel et lavt NA-mål vil begrense presisjonen som fiducial perler og målsignaler kan lokaliseres med. Ikke desto mindre vil integrerte FLM-oppsett bidra til å håndtere små deformasjoner av rutenett og lameller, da FLM-stabler kontinuerlig kan oppdateres og sammenlignes med oppdaterte SEM- og IB-visninger.
Som et alternativ til fluorescensavbildning av lamellen mellom FIB-fresing og TEM-datainnsamling, kan post-TEM-korrelasjon brukes til å verifisere riktig plassering og fresing av lamellene 5,6.
Under alle trinnene i den korrelative arbeidsflyten, men spesielt under TEM, anbefales det å lage et overlegg av de projiserte fluorescensdataene på FIB-SEM/TEM-bildene. Slike klassiske CLEM-visninger hjelper til med å forstå mer intuitivt hvilken del av cellene som finnes i lamellene. Dette fungerer også som en nyttig tilregnelighetskontroll for å verifisere nøyaktigheten av korrelasjonen.
3. Begrensninger av metoden
Den 3D-korrelative FIB-tilnærmingen krever prøver som kan leveres med fiducial perler. Følgelig er denne metoden for tiden begrenset til stupfrosne rister. For høytrykks (HPF) frosne (vev) prøver, for tiden kan bare 2D-2D korrelasjoner utføres. Potensielt kan interne fiducial markører (f.eks. organeller, fargede lipiddråper) være en løsning på dette problemet32,33. Den endelige korrelasjonssuksessraten avhenger av mange faktorer, inkludert prøvekvaliteten, fluorescensmikroskopioppsettet, lamelltykkelsen og størrelsen på den målrettede strukturen. Korrelasjonsnøyaktigheten ved hjelp av den beskrevne 3D-registreringsmetoden er estimert til å være i området 200-300 nm på det endelige IB-bildet, omtrent tilsvarende den typiske tykkelsen på FIB-fresede lameller7. Følgelig vil cellulære strukturer som er mye mindre enn dette være vanskelig å målrette for øyeblikket. I tillegg reduserer overdreven bevegelse på fresestedet (>300 nm) også nøyaktigheten av korrelasjonen, et problem som potensielt kan løses med FLM-oppsett integrert i FIB / SEM-instrumenter. Lameller som viser sterk deformasjon eller bøyning under fresing, bør uansett utelukkes fra arbeidsflyten nedstrøms.
Samlet sett er kryofluorescensavbildning for tiden begrenset av Abbe-diffraksjonskriteriet. Med mer rutinemessig anvendelse (og kommersialisering) av superoppløste kryo-FLM-metoder, kan mer nøyaktig målretting av cellulære strukturer bli mulig, spesielt når integrert i FIB / SEM for on-the-fly drift.
4. Betydningen av metoden
Spesielt i forhold til ikke-målrettede og post-korrelasjonsteknikker, tillater den 3D-korrelerte FIB-fresemetoden valg av passende posisjoner før det tid- og ressurskrevende TEM-trinnet. Det muliggjør dermed mer effektiv datainnsamling og prosjektplanlegging. Videre legger de korrelerte fluorescensdataene til et lag med informasjon som kan være avgjørende for å tolke tomogrammene og for å integrere kryo-ET-resultatene i multiskalaprosjekter, spesielt når det gjelder ikke-strukturerte proteinsamlinger eller de som er for små for malmatching og subtomogramgjennomsnitt.
5. Betydning og potensielle fremtidige applikasjoner
I kombinasjon med avanserte arbeidsflyter som kryoløft ut av HPF-prøver 34,35, cryo-FIB-SEM volum 36 og superoppløselig fluorescensavbildning26,37,38,39, gir 3D-målrettet lamellpreparering utsikter til ikke bare å dissekere biologiske prosesser i isolerte celler, men også å gjøre vevs- og pasientprøver tilgjengelige for FIB-fresing og kryo-elektrontomografi. Som sådan vil det tillate disseksjon av patologiske prosesser ved høy oppløsning og dermed være en integrert byggestein mot en biopsi på nanoskala.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Inga Wolf for støtte til IT-infrastrukturen, Florian Beck for beregningsstøtte og Oda H. Schiøtz for kritisk lesning av manuskriptet. Finansiering ble gitt delvis gjennom et Alexander von Humboldt returners fellowship til Philipp S. Erdmann og et EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 til Florian Wilfling. Anna Bieber ble støttet av et Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
| C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
| Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
| Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
| EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
| Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
| FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
| FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
| K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
| Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
| Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
| Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
| THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
| Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |
References
- Beck, M., Baumeister, W. Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).
- Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
- Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
- Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells. Methods in Cell Biology. 162, Elsevier Inc. 273-302 (2021).
- Klein, S., et al. Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies. Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).
- Arnold, J., et al. Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
- Wilfling, F., et al. A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits. Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).
- Scientific volume imaging, Nyquist calculator. , Available from: https://svi.nl/NyquistCalculator (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Huygens Professional version 19.04. , Scientific Volume Imaging. The Netherlands. Available from: http://svi.nl (2021).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Arnold, J. 3DCT. , Available from: https://3dct.semper.space/ (2021).
- Klumpe, S., et al. A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows. bioRxiv. , 444745 (2021).
- Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 0-3 (2019).
- Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
- Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. bioRxiv. , 963033 (2020).
- Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, e52286 (2020).
- Fung, H. K. H. tools3dct. , Available from: https://github.com/hermankhfung/tools3dct (2021).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- Bäuerlein, F. J. B., et al. In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions. Cell. 171 (1), 179-187 (2017).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kaufmann, R., et al. Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions. Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).
- Booy, F. P., Pawley, J. B. Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature. Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-Learning denoising from single noisy images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).
- Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. eLife. 8, 1-15 (2019).
- Delmic METEOR. , Available from: https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor (2021).
- T. F. Scientific. iFLM. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf (2021).
- Mahamid, J., et al. Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).
- Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging. iScience. 24 (7), 102714 (2021).
- Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).
- Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
- Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
- Liu, B., et al. Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context. Scientific Reports. 5, 13017 (2015).
- Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision. SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).
- Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
