Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Prøveforberedelse ved 3D-korrelativfokuseret ionstrålefræsning til kryo-elektrontomografi med høj opløsning

Published: October 25, 2021 doi: 10.3791/62886
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,3
1Max Planck Institute of Biochemistry, 2Max Planck Institute for Biophysics, 3Fondazione Human Technopole
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en pipeline til 3D-korrelativfokuseret ionstrålefræsning til styring af forberedelsen af cellulære prøver til kryo-elektrontomografi. 3D-positionen af fluorescerende mærkede proteiner af interesse bestemmes først ved kryofluorescensmikroskopi og målrettes derefter til fræsning. Protokollen er velegnet til pattedyr, gær og bakterieceller.

Abstract

Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er blevet den valgte metode til undersøgelse af cellulære ultrastruktur og molekylære komplekser i deres oprindelige, frosne hydratiserede tilstand. Kryo-ET kræver dog, at prøverne er tynde nok til ikke at sprede eller blokere den indfaldende elektronstråle. For tykke cellulære prøver kan dette opnås ved kryofokuseret ionstrålefræsning (FIB). Denne protokol beskriver, hvordan man målretter mod specifikke cellulære steder under FIB-fræsning ved hjælp af en 3D-korrelativ tilgang, der kombinerer tredimensionelle fluorescensmikroskopidata med information fra FIB-scanningelektronmikroskopet. Ved hjælp af denne teknik kan sjældne cellulære begivenheder og strukturer målrettes med høj nøjagtighed og visualiseres ved molekylær opløsning ved hjælp af kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM).

Introduction

Fokuseret ionstrålefræsning muliggør forberedelse af tynde biologiske prøver fra kryofikserede prøver uden de problemer, der ofte er forbundet med mekaniske sektioner såsom knivmærker og kompressionsartefakter1. Når FIB-fræsning parres med kryo-elektrontomografi, muliggør FIB-fræsning biologiske undersøgelser med høj opløsning af den cellulære morfologi og bestemmelse af strukturen af makromolekylære komplekser direkte inde fra celler ved subnanometeropløsning 2,3,4. Mens rigelige arter, såsom ribosomer, let findes i tilfældigt skårne FIB-lameller, er mange cellulære processer afhængige af colokalisering af flere komplekser eller er lokaliseret til bestemte steder i cellen. Derfor kræves effektiv målretning for ikke at miste det biologiske træk af interesse under fræseprocessen og være begrænset til tilfældige hits. En korrelativ tilgang, der kombinerer data fra scanningelektronmikroskopet (SEM)-FIB og et kryofluorescenslysmikroskop (FLM), er derfor nødvendig. Selvom det er muligt at udelade den oprindelige korrelation og først kombinere FLM- og kryo-ET-data efter TEM-erhvervelse5,6, muliggør fluorescensstyret fokuseret ionstrålefræsning en nøjagtig udvælgelse af fræseområdet på forhånd, hvilket resulterer i mere effektiv dataindsamling. Siden sin undfangelse7 havde anvendelsen af 3D-korreleret FIB-fræsning i biologiske undersøgelser været begrænset, indtil vi for nylig rapporterede at identificere et nyt væske-væskefase-adskilt (LLPS) rum i gær ved hjælp af denne teknik8.

Her beskrives en generaliseret 3D-kryo-korreleret lys- og elektronmikroskopi (CLEM) protokol, som kan bruges til at studere en bred vifte af prøver lige fra bakterier til gær- og pattedyrceller. Mens eksperimenterne blev udført ved hjælp af et bestemt sæt instrumenter, er de enkelte trin ikke bundet til specifik hardware og kan let overføres til andre systemer som en udvidelse til eksisterende protokoller 3,5. En liste over testet udstyr og foreslåede indstillinger findes i materialetabellen og tabel 1. De fire vigtigste trin i rørledningen er (1) prøveforberedelse, (2) lokalisering af funktioner af interesse ved kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korreleret fokuseret ionstrålefræsning og (4) lokalisering af de målrettede strukturer til kryo-ET-dataindsamling på lamellerne i kryotransmissionselektronmikroskopet (figur 1).

Protocol

Figure 1
Figur 1: Oversigt over arbejdsprocessen med et udvalg af kritiske trin. Hele protokollen er opdelt i fire trin i henhold til det anvendte udstyr: Prøveforberedelse, herunder nedfrysning, kryofluorescensmikroskopi, kryofokuseret ionstrålefræsning og kryo-elektronmikroskopi. For hvert trin fremhæves flere nøglepunkter. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Cellekultur og dykfrysning af gitter

  1. Dyrk celler efter eget valg og optimer mærknings- og behandlingsstrategier ved stuetemperatur, før du går over til kryo-eksperimenter. Mål af interesse er enten mærket ved hjælp af fluorescerende proteinfusioner eller levende farvning (f.eks. Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, levende antistoffarvning osv.). Hvis behandling med kemiske eller biologiske agenser (små molekyler, specielle medier, siRNA osv.) er nødvendig for at undersøge den biologiske proces af interesse, skal du optimere betingelserne (f.eks. tid, koncentration) ved hjælp af levende celle FLM-billeddannelse.
    1. Sørg for, at de interessante steder kan lokaliseres med succes over baggrunden i et tilstrækkeligt antal celler ved hjælp af billeddannelsesindstillinger, der matcher senere kryo-betingelser så tæt som muligt (dvs. NA, eksponeringstid osv.).
  2. Udvælgelse og forberedelse af gitre
    1. Vælg gitre med hulstørrelse og afstand, der passer til cellerne og de anvendte fiduciale markører (se trin 1.3.1). Brug ikke kontinuerlig film uden huller, da dette kan resultere i for meget resterende buffer efter blotting og dermed reducere forglasningseffektiviteten og hæmme detekteringen af fiduciale perler. Ved langvarig kontakt mellem cellerne og gitterene skal du sikre dig, at gitterstøtten og filmmaterialet er biokompatible.
    2. Plasmarens cryo-EM-ristene for at gøre dem mere hydrofile. Til brug i vedhængende cellekultur steriliseres gitterene efter plasmarensning med UV-stråling i 20 minutter i en laminær strømningshætte. Eventuelt kan gitter forbehandles med forbindelser, der hjælper med celleadhæsion, såsom poly-L-lysin eller concanavalin A, som beskrevet nedenfor.
      BEMÆRK: Generelt er følgende gitter-/prøvekombinationer med succes blevet anvendt i den korrelative kryo-FIB-arbejdsgang: Gær: Cu eller Au, 200 mesh, R1/4 kulstof eller SiO2-film , eventuelt belagt med concanavalin A; Escherichia coli: Cu eller Au, 200 mesh, R1/4 kulstof eller SiO2 film; Chlamydomonas reinhardtii: Cu eller Au, 200 mesh, R1/2 eller R1/4 carbon eller SiO2 film; HeLa: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2 film, belagt med poly-L-lysin; HEK293: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2 film, belagt med poly-L-lysin.
    3. Concanavalin En belægning til forbedring af fastgørelsen af gærceller:
      • Forbered en overfladebehandlingsopløsning af 1 mg/ml concanavalin A i 10 mM HEPES-buffer med 100 μMCaCl2, pH 8,5. En dråbe (50 μL) af belægningsopløsningen og to dråber destilleret vand anbringes separat på et stykke paraffinfilm.
      • Tag det plasmarensede gitter op med pincet med omvendt kraft, og indsæt det forsigtigt i dråben af belægningsopløsningen, undgå bevægelser vinkelret på gitteret for at forhindre beskadigelse af filmen.
      • Efter ~ 5 s inkubation vaskes gitteret to gange ved at indsætte det i vanddråberne på lignende måde. Til sidst tørres den overskydende væske af ved at påføre et filterpapir på bagsiden af gitteret, og lad risten tørre helt, før du frigør den fra pincetten. Brug de tørrede gitter til frysning.
    4. Poly-L-lysinbelægning til suspensionskultur og klæbende celler:
      • Forbered en belægningsopløsning af 1 mg/ml poly-L-lysin i 0,1 M natriumboratbuffer, pH 8,5.
      • Anbring plasmarensede riste i en passende skål til cellekultur og steriliser i 20 minutter ved UV-stråling.
      • Der tilsættes forsigtigt tilstrækkelig overfladebehandlingsopløsning til at dække alle ristene og inkuberes ved 37 °C i mindst 2 timer. Opsug væsken og vask forsigtigt ristene to gange med PBS, før cellerne sås til den ønskede koncentration.
  3. Forberedelse af celler og fiduciale perler
    BEMÆRK: Fiducialperler er nødvendige for 3D-registrering af fluorescensdata med billeder taget i FIB / SEM-mikroskopet for at muliggøre 3D-korreleret FIB-fræsning.
    1. Vælg perler, der kan genkendes i alle billedbehandlingsmetoder, dvs. FLM, SEM og IB (anbefalet diameter 0,5-1 μm), men sørg for, at disse ikke overstråler den cellulære målstruktur under fluorescensbilleddannelse for at gøre det lettere at differentiere perlerne og det biologiske træk af interesse. Fjern cytotoksiske konserveringsmidler i fiduciale perler (f.eks. NaN3) som anvist af producenten.
      BEMÆRK: For lettere at skelne mellem de biologiske egenskaber af interesse og fiducialerne er det nyttigt, hvis fluorescensemissionsspektre kun delvis overlapper hinanden, så signaler kan skelnes baseret på intensitetsforskelle i FLM-kanalerne.
    2. Hvis suspensionskultur anvendes, dyrk cellerne til en passende densitet (f.eks. gær OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii 1500 celler / μL) og udfør behandlinger efter behov for eksperimentet, såsom skift af medium, tilsætning af kemikalier, sult osv. De plasmarensede riste fastgøres til pincetten efter behov for dykningsmetoden (manuel/automatisk), og der påføres 4 μL af cellesuspensionen blandet med ~1 x 105 perler/μL fiducial perlesuspension på filmsiden af ristene.
      BEMÆRK: Bestem den optimale fortynding af celler og fiducialer i titreringseksperimenter (f.eks. ved at kontrollere cryo-FLM eller FIB/SEM, se nedenfor). For de fleste celler, der dyrkes i suspension, har en endelig koncentration på ~ 1 x 105 perler / μL af de 1 μm fiduciale perler (1:20 fortynding fra lager; se materialetabel for detaljer) vist sig at være et godt udgangspunkt.
    3. Hvis der anvendes vedhængende kultur, skal gitterene renses og steriliseres ved hjælp af UV-stråling til aseptisk kultur. Om nødvendigt præ-coat gitre med forbindelser, der hjælper celleadhæsion (fx poly-l-lysin, fibronectin, laminin; se trin 1.2.2). Frø og dyrk celler på gitterene i normale dyrkningsfade eller fade med underopdelinger til gitter.
    4. Behandl prøverne efter behov for eksperimentet, og hold cellerne under optimale forhold lige indtil frysning (f.eks. 37 °C/5% CO2 for HEK/HeLa). Fjern forsigtigt gitterene fra kulturskålen og fastgør dem til den dybe pincet. Påfør 4 μL af dyrkningsmediet blandet med fiducialer (1 x 105 perler/μL for 1 μm fiducials) på den cellebærende side.
  4. Dyk-frys cellerne ved hjælp af enten en manuel eller en automatiseret fryseprocedure. Hvis det er muligt, skal du kun slette gitteret fra den modsatte side af cellerne for at forhindre mekanisk beskadigelse af cellerne (figur 2A). På toarmede automatiserede kastesystemer opnås dette ved at placere et polytetrafluorethylenark (f.eks. Teflon) i stedet for at blotte papir på puden, der vender mod cellerne. Ristene overføres til opbevaringsbokse og opbevares i flydende nitrogen (lN2) indtil brug.
    FORSIGTIG:lN2 og andre kryogener kan forårsage alvorlig skade på øjne og hud. Brug personlige værnemidler (PPE) og arbejd kun i et godt ventileret rum for at undgå opbygning af farligeN2-koncentrationer .
    BEMÆRK: Alle efterfølgende trin bør bedst udføres i væskefasen aflN2 for at undgå kontaminering af celle- og lameloverfladerne, da dette kan komplicere downstream-behandlingen. Reducer kontakt med flydende iskrystaller ved altid at bruge rent flydende nitrogen (f.eks. filter til fjernelse af flydende is), eliminere unødvendige overførselstrin og om muligt arbejde i et fugtighedskontrolleret miljø.
  5. Monter og klip de dykfrosne gitre i AutoGrids med udskæring og cellerne opad (figur 2A) til efterfølgende kryofluorescensbilleddannelse og FIB-fræsning. For at sikre korrekt justering af prøverne i TEM skal fræseretningen være ortogonal i forhold til kryo-ET-hældningsaksen. Placer derfor retningsmærkerne (f.eks. LASERGRAVERING eller aftagelige markeringsprikker) på AutoGrids før klipning for at hjælpe med denne justering (figur 2A).
  6. Screene gitterkvaliteten (figur 2B) på cryo-FLM og FIB/SEM. Optimer celletætheden, blotting tid og kraft for at få en jævn fordeling af celler og perler. Brug billeddannelse af reflekteret lys på et kryofluorescensmikroskop, eller brug cryo-FIB-SEM til at sikre, at både celler og fiducialperler er tydeligt synlige (figur 2B, hvide pile).
  7. Gentag om nødvendigt stabningen med bedre forhold, f.eks. varierende cellekoncentration og/eller blottingstid. Når der er fundet passende dykparametre, skal du ikke gentage gitterscreening for hver ny runde forsøg.

Figure 2
Figur 2: Screening for egnede gitre ved hjælp af SEM og IB . (A) AutoGrids skal anbringes retningsmærker vinkelret på fræseretningen for at forenkle korrekt belastning i TEM. Celler monteres med forsiden opad i det samlede AutoGrid. (B) Efter nedfrysning inspiceres gitre i SEM for at evaluere og optimere dykningsforholdene: a) Der bør ikke være for mange celler pr. gitter. For HeLa-celler må du for eksempel ikke bruge mere end 1-4 celler / kvadrat. For mindre celler som Saccharomyces cerevisiae (vist her) har klumper på 4-6 celler vist sig nyttige. b) Fiduciale perler (hvide pile) skal være tydeligt synlige, og der bør ikke være for meget buffer omkring cellerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Kryofluorescens lysmikroskopi

  1. For hvert gitter får du et overblik i (widefield) fluorescens og differentialinterferenskontrast (DIC) eller reflekteret tilstand og vælger passende gitterkvadrater med fluorescenssignal. Vælg synsfelter, der indeholder både de relevante celler og et tilstrækkeligt antal fiduciale markører (6-12).
    1. Sørg for, at cellerne og perlerne er jævnt fordelt, ikke for tætte, og mod midten af hver firkant. Vælg kun firkanter, der er tilgængelige for både FIB-SEM- og TEM-instrumentet, derfor de mindst tre firkanter væk fra gitterkanten på 200 maskegitre (figur 3A inden for den røde cirkel).
  2. På hver af de valgte gitterkvadrater erhverves en fluorescerende stak med et fokustrin, der er passende til senere dekonvolution, dvs. <1/2 den aksiale opløsningsgrænse. Hvis det er muligt, skal du bruge NA-mål (High-numerical-Aperture) til at øge fotontællingen og lokaliseringsnøjagtigheden.
    1. I et konfokalmikroskop med NA 0,9-mål erhverves stakke med 300 nm trinstørrelse, idet Nyquist-værdien oversamples. Optag flere farvestakke, hvis det er nødvendigt (figur 2B). Opbevar gitre under lN2 indtil videre brug.
      BEMÆRK: For at bestemme den optimale trinstørrelse skal du vælge de værdier, der beregnes af mikroskopstyringssoftwaren, eller bruge onlineværktøjer9. Kontroller for gennemblødning af signal mellem kanaler, da overdreven gennemblødning er skadelig for samlokaliseringseksperimenter. Nogle kan dog være fordelagtige at korrigere for kromatiske aberrationer i flerfarvede stakke.
  3. Deconvolve stakke ved hjælp af passende software10,11 og re-skive7 dem, hvis en isotrop pixelstørrelse er påkrævet. Dekonvolution - ligesom ved stuetemperatur - renser FLM-signalet og kan forbedre lokaliseringsnøjagtigheden (figur 3C).

Figure 3
Figur 3: Valg af firkanter til FLM-stakanskaffelse og forbedring af data ved dekonvolution. (A) Oversigt over et gitter kastet med gærceller, der udtrykker eGFP-Ede1 (grøn) og mCherry-Atg8 (magenta). Vælg positioner med en god fordeling af perler og celler, men undgå kanterne af gitteret (skraveret rødt). Boksene angiver positioner med gode cellefordelinger, hvor fluorescensstabler blev taget. (B) Maksimal intensitetsprojektion (MIP) af den flerfarvede stak taget på den gulboksede firkant (fra A) efter dekonvolution. Dekonvolution af FLM-stablerne renser uønskede baggrundssignaler betydeligt og hjælper med at lokalisere perler i z mere præcist, som det fremgår af gaussiske tilpasninger før (C) og efter dekonvolution (D) (tilpasninger blev udført i 3DCT og vises for perlen markeret med 1). Billeder viser zoomede MIP-visninger af den røde kanal (excitation: 552 nm, emission: 585-650 nm). Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Fokuseret ionstrålefræsning

  1. Læg gitterene i kryo-FIB-SEM-instrumentet, og brug enten udskærings- og/eller orienteringsmærkerne for at sikre korrekt orientering til senere placering i TEM (figur 2A). Sørg for, at fræseretningen er vinkelret på TEM's hældningsakse.
  2. Brug et gasindsprøjtningssystem (GIS; CpMePtMe3) på de scenepositioner, der er foruddefineret af FIB-SEM-opsætningen for at belægge gitterene med et beskyttende organometallisk lag. Anvend ikke for meget, da dette kan forstyrre lokalisering af fiducialperler i TEM senere. Brug en plasmacoater til at påføre metallisk platin for at reducere prøveopladning.
    BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen tilgængelige indstillinger for GIS-belægning, kan de let findes ved at udføre successive runder med kort belægning (~ 2 s) efterfulgt af FIB-fræsning. Sørg for, at prøven stadig kan skæres med succes ved middelstrømme (~ 100 pA) uden tilsyneladende frynser af det beskyttende organometalliske lag omkring lamelkanterne. Både tid og afstand af GIS-nålen (med hensyn til prøven) er vigtige parametre at overveje. Brug ikke GIS-nålen ved stuetemperatur (dvs. 45 °C), men så kold som muligt for stadig at give en jævn belægning (25-27 °C).
  3. Optag en SEM-gitteroversigt, og udfør en 2D-korrelation med FLM-oversigter for at finde de gitterkvadrater, for hvilke der er registreret fluorescerende stakke. Undersøg begge visninger manuelt, eller brug forskellige softwarepakker 7,10,12 til at finde gitterfirkanterne. Her er fokus på 3D-korrelationsværktøjskassen (3DCT)7, der bruger 3D-stiv kropstransformation med isotropisk skalering mellem visninger. En fremragende gennemgang af 3DCT's funktioner er tilgængelig online13.
    1. Vælg og markér mindst fire tilsvarende positioner, f.eks. landemærker såsom gitterbjælker eller huller i støttefilmen, i både FLM- og SEM-gitteroversigten (højreklik), og beregn transformationen mellem de markerede punkter (korrelat).
    2. Placer derefter markørerne i midten af de tilsvarende gitterfirkanter, som FLM-stakke er erhvervet for, og forudsig deres position i SEM-visningen (korrelat; Figur 4A).
  4. For hvert korreleret gitterkvadrat skal du tage et lavstrømsbillede (≤10 pA) ionstrålebillede (IB) ved den valgte FIB-fræsevinkel (10°-25° for 45° præ-tilt-shuttle). Vælg et synsfelt (dvs. position og forstørrelse), der matcher fluorescensdataene. For 200 maskegitre indsamles fluorescens- og FIB/SEM-data for at indeholde enkelte gitterkvadrater, herunder gitterbjælkerne (se figur 3A og figur 4A).
    BEMÆRK: Fræsning skal udføres i en så lav vinkel som muligt for at undgå at miste signifikant vinkelområde under cryo-ET og for at muliggøre identifikation af et tilstrækkeligt antal fiducialperler. For eksempel: Med en scenehældning på 17°, en shuttle-forhældning på 45° og en FIB-strålehældning på 52° i forhold til styrtdykket er lamelforhældningen 10°, hvilket næsten opfylder det foretrukne vinkelområde på ±60° i TEM ved at vippe fra -50° til +70°, det maksimale for mange TEM-kryoholdere.
  5. Tag et SEM-billede af den samme firkant for at hjælpe med at identificere tilsvarende perler i fluorescens- og ionstrålevisningen.
  6. Udfør registrering af den deconvolved 3D FLM-stak og 2D-ionstrålevisningen for hver position med 3DCT som beskrevet i følgende trin (figur 4B).
    1. Indlæs den tilsvarende skivede 3D FLM-stak og ionstrålevisning (IB) i 3DCT.
      BEMÆRK: Flerfarvede fluorescensdata kan indlæses som op til tre separate enkeltkanalstakfiler.
    2. Vælg 4 fiduciale perler i fluorescensdataene, og højreklik på positionslisten for at bestemme deres 3D-position via Gaussisk tilpasning af signalet i x, y og z. Vælg de tilsvarende perler i IB-billedet, og udfør en indledende 3D-korrelation (korrelat).
    3. Tilføj iterativt flere perler i fluorescensbilledet, finjuster deres 3D-position, og forudsig deres position i IB-visningen for hurtigt at tilføje flere perler til registreringen og for at kontrollere nøjagtigheden af korrelationen. I 3DCT angives RMSE-værdier (root-mean-square error) for at vurdere korrelationskonsistensen7.
      1. Sørg for, at RMSE-værdierne er små og i størrelsesordenen lokaliseringsnøjagtighed (~300 nm). For at bestemme korrelationens nøjagtighed skal du bevidst udelade nogle fiduciale perler, der er tydeligt identificerbare i både fluorescens og ionstråle under registreringstrinnet. Gør dette ved at kontrollere deres forudsagte versus faktiske placering i ionstrålebilledet. Hvis den forudsagte position adskiller sig væsentligt fra den virkelige, gentag den oprindelige korrelation med et nyt sæt fiducials.
        BEMÆRK: Korrelering af 6-8 perler har vist sig tilstrækkelig til nøjagtig registrering af FLM-stablerne og IB-visningerne. Hvis du tilføjer flere fiducials (op til 12-15) over et bredt område af z-værdier (f.eks. ved at vælge perler på gitterbjælken eller i tilstødende firkanter), kan det dog forbedre korrelationens nøjagtighed.
    4. Vælg de målrettede cellulære signaler, tilpas deres 3D-position i FLM-stakken, og anvend transformationen til at forudsige målpositionerne i IB-visningen (figur 4B).
      BEMÆRK: Enhver post på FLM-positionslisten, som ikke har en pendant på IB-listen, vil blive behandlet som et signal, der skal forudsiges.
  7. For hvert korreleret kvadrat overføres forudsagte positioner af de egenskaber, der er af interesse for FIB-SEM-instrumentet, og lamellfræsemønstre placeres (figur 4C). Overfør positioner manuelt (f.eks. ved at måle afstanden til synlige landemærker, såsom celler eller fiducialperler) eller brug automatisering og scripting som implementeret for eksempel i SerialFIB14. Hvis der er flere signaler pr. celle, skal du placere mønstrene for at inkludere så mange interessepunkter (POI'er) som muligt i den samme lamel for at øge gennemløbet.
  8. Først groft, og derefter fint mølle lamellerne til en endelig tykkelse på 150-250 nm. Undgå trin (f.eks. Stressaflastningssnit15), der forårsager sænkning af lamellen og dermed resulterer i bevægelse af det faktiske træk af interesse med hensyn til de tidligere erhvervede FLM-stakke. Brug enten manuelle3 eller automatiserede14,16,17,18 FIB-fræseprocedurer. Med begge metoder skal du sikre dig, at funktionen af interesse forbliver i midten af lamellen ved symmetrisk udtynding fra top og bund.
  9. For at vurdere nøjagtigheden af fræsning for hver lamel skal du udføre den samme registrering som i trin 3.4. Denne gang skal du dog bruge det endelige IB-billede efter FIB-fræsning og kontrollere, om de forudsagte positioner for de interessante funktioner er indeholdt i den endelige lamel. Alternativt kan du overlejre de roterede projektioner af FLM-stakkene, opnået fra 3DCTs output og brugerdefinerede scripts19, med det endelige IB-billede (figur 4C, lille indsats).

Figure 4
Figur 4: 3D-korreleret FIB-fræsningsprocedure . (A) 2D-2D-korrelation af FLM (venstre) og SEM (højre) oversigter over gitteret bruges til at lokalisere gitterkvadraterne, hvor fluorescerende stakke tidligere blev taget. (B) For hvert valgt kvadrat, efter 3D-2D-registrering af tilsvarende fiduciale positioner i 3DCT (farvede kasser), vælges positioner af biologiske egenskaber af interesse i FLM-dataene. Baseret på forudsigelsen af tilsvarende positioner i ionstrålebilledet (røde cirkler) vælges steder til lamelforberedelse. (C) Scanningselektronmikroskopbilleder (SEM) og ionstrålebilleder (IB) bruges til at holde målet centreret under fræsning. Endelige tykkelser på 150-250 nm har vist sig tilstrækkelige til yderligere downstream-behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Korreleret TEM

  1. Indlæs gitterene i TEM, og sørg for, at lamelorienteringen (som tydelig ved udskærings- eller orienteringsmærker) er vinkelret på hældningsaksen.
    BEMÆRK: Mikroskoper fra forskellige producenter kan styres ved hjælp af forskellige software, f.eks. Tomo5, TOM eller SerialEM20. Her er fokus på sidstnævnte.
  2. Få gittermontage og oversigter for hvert gitterkvadrat, der indeholder lameller. Sørg for, at forstørrelses- og eksponeringstiden er egnet til at visualisere fiducialperlerne i TEM-billederne uden væsentligt at øge den samlede elektrondosis. Få TEM-kort (montager) i høj opløsning af hver lameller.
  3. Register og 3D-2D korrelerer FLM-stakken med TEM-gitterkvadratet og lameloversigterne i 3DCT. Brug samme procedure som beskrevet i trin 3.6 ved at vælge tilsvarende perlepositioner i fluorescens- (x, y, z - gaussisk pasform) og transmissionselektronmikroskopbilleder. Vælg derefter interessepositionerne i FLM-kanalerne, og overfør dem til TEM-oversigterne. Brug om nødvendigt en totrinsprocedure, der omfatter en første korrelation mellem FLM og TEM med lav forstørrelse og en anden fra TEM med lav til høj forstørrelse (figur 5).
  4. Overfør positioner enten manuelt (ved at måle afstande til landemærker), registrerings- og kortværktøjerne i SerialEM20 eller ekstern software såsom CorRelator21.
  5. Opsæt og kør vippeserier på korrelerede positioner. Brug en passende forstørrelse, defokusering og total dosis (se materialetabel og tabel 1 for detaljer). Start tiltrækningen ved den forhældning, der bestemmes af lamellen (se også bemærkningen i trin 3.4), og brug et dosissymmetrisk hældningsskema22. Brug enten manuel anskaffelse eller batchanskaffelse.

Figure 5
Figur 5: Lokalisering af korrelerede positioner i TEM. Efter vellykket 3D-korreleret FIB-fræsning og overførsel til transmissionselektronmikroskopet udføres 3D-2D-registrering for hver fræset firkant mellem fiducialperler (farvede kasser) i FLM-stakke og TEM-oversigter for at lokalisere potentielle steder for cryo-ET (røde cirkler). Lamelloversigter med højere forstørrelse (zoom-in) kan derefter erhverves for at konfigurere tomogrammer mere præcist. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Protokollen giver en gennemgang af rørledningen, der bruges til at opdage det EH-domæneholdige og endocytoseprotein 1 (Ede1)-afhængige endocytiske proteinaflejring (END) og dets nedbrydning og fangst i autofagiske legemer8. END er et væske-væske-fasesepareret rum i S. cerevisiae, som buffer en række proteiner involveret i clathrin-medieret endocytose (CME) efter mislykkede endocytiske hændelser. En af hovedkomponenterne er Ede1, som også fungerer som en CME-komponent og som en selektiv autofagireceptor til nedbrydning af dette nye LLPS-rum. Følgelig blev en EGFP-fusion af Ede1 (EGFP-Ede1) under kontrol af alkoholdehydrogenasepromotoren (ADH) anvendt til at visualisere END'er, da Ede1-overekspression interfererer med de tidlige stadier af endocytose og derfor konstitutivt inducerer LLPS.

På et dykfrosset gitter med EGFP-Ede1 overekspression af gærceller og 1 μm fiduciale markører blev fem positioner valgt til FLM-stakerhvervelse i GFP-kanalen (figur 6A; TFS Corrsight; Konfokal tilstand, 300 nm fokustrinstørrelse, 10 μm rækkevidde). Gitteret blev overført til FIB-instrumentet (Quanta 3D FEG), og gitterkvadraterne, for hvilke FLM-stakke var blevet erhvervet, blev identificeret ved at udføre en 2D-2D-korrelation af fluorescens- og SEM-gitteroversigterne (sammenlign trin 3.2).

For hver af de valgte firkanter blev ionstrålebilleder taget ved lav strøm (10 pA, 1200x forstørrelse), og tilsvarende fiduciale positioner blev registreret i 3DCT. Efter udvælgelse af positioner med det biologiske træk af interesse og tilpasning af deres 3D-position inden for FLM-stakken blev den fundne transformation anvendt på formodede END-positioner, og stederne til lamelforberedelse blev valgt (figur 6B). En FIB-stråle hældende 11° i forhold til gitteroverfladen blev anvendt i eksemplerne vist her (45° FIB-shuttle pre-tilt; 18° stage tilt). Interessepositioner blev overført, og FIB-mønstre blev tegnet manuelt (figur 6D) ved at måle afstanden mellem de forudsagte positioner i forhold til fremtrædende vartegn i FIB-billedet (f.eks. huller, isforureninger, fiducialperler). Nøjagtigheden af registreringen blev evalueret ved bevidst at udelade perler, der tydeligt kunne identificeres i FLM- og IB-billedet, og derefter sammenligne deres faktiske og forudsagte positioner i ionstrålebilledet (f.eks. diamant i figur 6B, C). Korrelationen for kvadratet vist i figur 6C viste sig at være nøjagtig (dvs. den forudsagte position af FLM-perlepositioner faldt perfekt sammen med deres tilsvarende IB-placering og 3DCT-rapporterede RMSE-værdier for underpixel til registreringen). Lameller blev således skåret på de forudsagte positioner (Site B) og finfræset til en tykkelse på ~200 nm (endelig mønsterforskydning).

Figure 6
Figur 6: Repræsentative resultater for 3D-korreleret målretning af endocytiske proteinaflejringer (END) i gær. A) SEM-oversigt over nettet før fræsning. De farvede felter angiver gitterfirkanter, for hvilke fluorescensstabler blev taget på forhånd. (B-C) 3D-korrelation i et gitterkvadrat. Efter registrering af flere tilsvarende fiduciale perler (farvede kasser) i FLM-dataene (B, her vist som maksimal intensitetsprojektion) og ionstrålebilledet (C), blev nøjagtigheden af 3D-registreringen verificeret ved at forudsige placeringen af perlen angivet med diamanten. Dernæst blev målsignalets positioner (røde cirkler) forudsagt i ionstrålebilledet for to potentielle fræsesteder. (D) Zoom ind på sted B, der viser de forudsagte positioner for tre målpunkter (røde cirkler) og de indledende fræsemønstre (gule felter). En fjerde fluorescens punctum blev forudsagt at være meget lavere end den anden punktskive og derfor ikke målrettet under fræsning (grå cirkel). Klik her for at se en større version af denne figur.

Efter vellykket FIB-fræsning og overførsel af nettet til kryotransmissionselektronmikroskopet (Titan Krios opererede ved 300 kV og udstyret med en Gatan K2 direkte elektrondetektor og Bioquantum energifilter), blev en gitteroversigt registreret i SerialEM og brugt til at lokalisere firkanter med lameller. For hver lamel blev der indsamlet oversigtsbilleder, og FLM-dataene blev registreret i 3DCT (3D-2D) ved hjælp af tilsvarende fiducialperler. Positioner af de biologiske egenskaber af interesse (figur 7A) blev derefter forudsagt ved hjælp af transformationen beregnet ud fra fiducialperlerne. Lameloversigter optaget ved højere forstørrelse blev syet, og interesseområder korrelerede ved hjælp af tydeligt synlige landemærker (f.eks. fiducialperler). Alternativt kan klassiske CLEM-oversigter produceres i forskellige software10,12.

Baseret på korrelationen blev der fundet fire potentielle steder for tomogramerhvervelse for lamellen vist i figur 7A. Dette omfatter dog også en position, der ikke var målrettet under den 3D-korrelerede FIB-fræsning (sammenlign figur 6D; grå cirkel) og en position blokeret af isforurening (figur 7; grå kasser). Tomogram kunne derfor kun registreres for to positioner (figur 7B). Samlet set blev der opnået en korrelationssucces på ~ 75%, dvs. lameller, der overlevede overførslen til TEM- og END-strukturerne på de forudsagte steder (12 korrelerede steder). Efter tomogramrekonstruktion, segmentering og skabelonmatchning kan individuelle END-strukturer visualiseres inden for deres oprindelige kontekst (figur 7C, D). Dette inkluderer det fenestrerede endoplasmatiske retikulum (ER), der omgiver END, lipiddråber, der lejlighedsvis kommer i kontakt, og ribosomer, der er udelukket fra LLPS-rummet. Samlet set viser dette, hvordan 3D-korreleret FIB-fræsning kan give information på molekylært niveau om sjældne biologiske processer fra intakte celler.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative resultater til visualisering af END med cryo-ET. (A) TEM-oversigten med lav forstørrelse for fræsestedet vist i figur 6 kan let korreleres med FLM-projektionen med maksimal intensitet (figur 6B) for at lokalisere biologiske karakteristika af interesse (røde kryds). (B) I et andet trin kan en visning med højere forstørrelse (syet) korreleres, og positioner til tomogramoptagelse (gule bokse) oprettes. Placeringer som følge af signalet uden for planet (grå boks, sammenlign figur 6D) blev ignoreret. (C-D) Ved hjælp af denne 3D-korrelative FIB-tilgang kan den endocytiske proteinaflejring (END) visualiseres i sit oprindelige miljø. Strukturer såsom det endoplasmatiske retikulum (ER), ribosomer, membraner og lipiddråber kan identificeres og visualiseres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Indstillinger for plasmarenser
Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG: Indstilling af radiofrekvens: "HI", 30 s; N2 plasma
Indstillinger for stempel
TFS Vitrobot Mk IV: 100% fugtighed; blotforce = 8; blottime = 10 s; ventetid 0 s; (dette burde fungere for de fleste suspensions- og klæbende celler)
FIB GIS-positioner og -tidspunkter
Quanta 3D FEG: Tilt = 0, Rotation = -180, Z-position = 13,5, Temperatursætpunkt =26,15°, Tid = 8 s
TFS Scios: Tilt = 0, Rotation = -180, Z-position = 9,8, Temperatursætpunkt = 28° C, Tid = 7 s
TFS Aquilos 1: Software foruddefineret position, temperatur setpoint = 28°, tid = 7 s
TFS Aquilos 2: Software foruddefineret position, temperatur setpunkt = 28°, tid = 7 s
FIB Sputter Coater-indstillinger
Beslutningsdygtighed: I kvorumsforberedelseskammeret: 10 mA, 40 s
TFS Scios: 10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s
TFS Aquilos 1: 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
TFS Aquilos 2: 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
Tomogram erhvervelse
Titan Krios Gi2 K2 kamera, Gatan Bioquantum energifilter
20 eV slids; dosissymmetrisk hældningsskema (Hagen) med 2° trin; Start ved +10° (lamellen før vip!) til +70°og -50°
Titan Krios Gi4 Falcon 4; Selectris X energifilter
10 eV slids; dosissymmetrisk hældningsskema (Hagen) med 2° trin; Start ved +10° (lamel før vip!) til +70° og -50°
FLM-opkøb
Corrsight (konfokal tilstand) Formål: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0,9 NA Pol; Stack erhvervelse parametre: x-y pixelstørrelse = 161.25 nm, z trin størrelse = 300 nm.
Leica SP8 kryo-konfokal Formål: Leica HCX PL APO 50x / 0,90 CLEM; Stack erhvervelse parametre: x-y pixelstørrelse = 84 nm, z trin størrelse = 300 nm.

Tabel 1: Liste over testet udstyr og foreslåede indstillinger.

Discussion

1. Kritiske trin i protokollen

Optimering af cellekultur og gitterdykkende parametre er grundlæggende for denne arbejdsgang. I begyndelsen af et projekt er det værd at investere tid i at optimere taggingstrategier, fordelingen af celler og fiduciale perler og teste forskellige gitterforberedelses- og blottingparametre. Arbejde med en optimalt dykfrosset prøve vil betydeligt lette downstream-behandlingen.

Som for ethvert TEM-eksperiment kræves glasagtige prøver. For store pattedyrceller som HeLa foretrækkes 1-2 celler pr. gitterkvadrat, men celler kan stadig være glasagtige ved højere densitet. Eventuelt kan vitrifikation forbedres i pattedyrceller (f.eks. HEK293, HeLa) ved at inkubere dem med 2,5-10% (v / v) glycerol tilsat til dyrkningsmediet 10 minutter, før de falder23. Hvis det er muligt, kan gittermønstre bruges til at sikre perfekt placering og fordeling af cellerne og derved forbedre vitrifikation og senere korrelation24.

Mens specifikke celler kan vælges under arbejdsgangen, vil for få celler, der viser det biologiske træk af interesse, reducere den samlede gennemstrømning betydeligt. For at forbedre korrelationen i POI-positive celler bør der anvendes tilstrækkeligt lyse fluoroforer. Dette er især vigtigt på endogene ekspressionsniveauer. Vi fandt ud af, at mVenus under kryo-forhold ofte klarede sig bedre end EGFP på grund af dens øgede lysstyrke25 og det hypsokromiske skift, hvilket holder den velegnet til standard GFP-filteropsætninger under kryo-forhold26. For ikke-punktlignende målstrukturer bør afvejningen mellem bølgelængde og lokaliseringsnøjagtighed (Abbe-diffraktionsgrænse) også overvejes.

Effektiv 3D-korrelation kræver også, at elnettet er mekanisk stabilt og håndteres med stor omhu. Mens standard guld- eller kobbergitter med kulstofstøtte kan anvendes, kan succesraten øges betydeligt ved at bruge mere stive SiO2-film afhængigt af projektet. Det er dog endnu ikke endeligt bestemt, om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchende termiske ekspansionskoefficienter (substrat vs. film) for at reducere kryorynker27 er den mest afgørende faktor for vellykket 3D-korrelation. Desuden kan der anvendes polydimethylsiloxanovertrukne skåle til opsamling af skrøbelige Au-riste5.

Ud over at sikre prøvestabilitet er et omhyggeligt valg af FLM-billeddannelsesparametre nødvendigt for at opnå fluorescensstakke af høj kvalitet, der er egnede til optimal målretning under FIB-fræsning. I denne henseende anbefales det også at teste forskellige denoising28 eller dekonvolutionsteknikker på FLM-dataene, da det kan forbedre lokaliseringen af fiducials og cellulære signaler betydeligt. Når fluorescenssignalet korreleres til FIB-SEM-billeder, er en god prøveudtagning af fiduciale perler vigtig. De skal være godt fordelt omkring cellerne og muligvis i forskellige z-højder. Det er også god praksis at validere konsistensen af korrelationen ved at kontrollere de forudsagte vs. faktiske positioner af perler, der bevidst blev udeladt af fiducialmodellen, men klart kan korreleres med øjet. 3DCTs RMSE-værdier bør også altid tages i betragtning for at kontrollere registreringskonsistensen.

Da aflejring af formalet materiale og restvand fra FIB-SEM-kammeret (dvs. rekontaminering) øger den effektive lameltykkelse ved at tilføje amorft materiale til begge sider af det, reducerer opbevaring af finmalede lameller i mikroskopet i længere tid generelt TEM-datakvaliteten på grund af yderligere elektronspredningshændelser. Derfor udføres fræsning oftest i to trin: Først fræses alle positioner groft (dvs. til ca. 800 nm) og derefter fint (til ~ 150-250 nm), og gitteret aflæses straks, efter at den sidste lamel er afsluttet. Bedre korrelationssucces kan dog opnås ved at behandle de interessante positioner på en stedlig måde og dermed udføre grov og fin fræsning på de samme lameller direkte efter hinanden, da dette ikke giver tid til bøjning eller deformation. Dette reducerer dog det maksimale antal lameller, der kan produceres pr. gitter, afhængigt af systemets rekontamineringshastighed. For en hastighed på 20 nm / h produceres 4-6 lameller inden for 1-1,5 timer.

Bevægelse af hele gitteret eller de grovfræsede lameller >300 nm vil resultere i dårlig eller mislykket korrelation (se også begrænsninger, der diskuteres nedenfor). Det bør derfor kontrolleres regelmæssigt, f.eks. ved at sammenligne IB-billeder før, under og efter FIB-fræsning. Steder, der viser betydelig bevægelse (>300 nm), skal kasseres. Optimer prøveforberedelsen (dvs. valg af gittertype, celletæthed og dykparametre; se protokolafsnit 1) og fræsningsstrategi for at undgå disse bevægelser. Lamelbøjning kan reduceres betydeligt ved fræsning på stedet som beskrevet i trin 3.6 og reduktion af lamelbredden. Som tidligere nævnt, mens stressaflastningssnit15 er designet til at reducere lamelbøjning, resulterer de ofte i en samordnet bevægelse af den afkoblede lamel og derved effektivt forhindrer korrelation. Integrerede FLM-systemer kan bruges til at løse dette problem.

2. Ændringer og fejlfinding af metoden

Det anbefales stærkt at udføre en grundig karakterisering af prøven i levende cellebilleddannelse, før du går til kryo-betingelser. Optimering af celleprøver, behandlingsordninger og viden om, hvilken slags signal man kan forvente, før man går ind i cryo-workflowet, kan forbedre succesraten betydeligt.

I arbejdsgangen, der præsenteres her, bruges et enkeltstående fluorescensmikroskop med et kryo-trin til at afbilde prøverne efterfulgt af en overførsel af gitterene til det fokuserede ionstrålemikroskop. Det er imidlertid blevet testet på systemer, hvor et fluorescensmikroskop er integreret i FIB-SEM-kammeret, og derfor kræves der ingen prøveoverførsel for at erhverve fluorescensbilleder 29,30,31. Ved hjælp af sådanne integrerede systemer kan interessepositioner afbildes under og efter FIB-fræsning for at kontrollere tilstedeværelsen af målfluorescenssignalet uden at øge risikoen for kontaminering af de endelige lameller. Det er dog vigtigt at huske de optiske parametre for de anvendte mikroskoper, da f.eks. et lavt NA-mål vil begrænse den præcision, hvormed fiduciale perler og målsignaler kan lokaliseres. Ikke desto mindre vil integrerede FLM-opsætninger også hjælpe med bedre at håndtere små deformationer af net og lameller, da FLM-stakke løbende kan opdateres og sammenlignes med opdaterede SEM- og IB-visninger.

Som et alternativ til fluorescensbilleddannelse af lamellen mellem FIB-fræsning og TEM-dataindsamling kan post-TEM-korrelation bruges til at verificere korrekt placering og fræsning af lamellerne 5,6.

Under alle trin i den korrelative arbejdsgang, men især under TEM, anbefales det at oprette en overlejring af de projicerede fluorescensdata på FIB-SEM/TEM-billederne. Sådanne klassiske CLEM-synspunkter hjælper med at forstå mere intuitivt, hvilken del af cellerne der er indeholdt i lamellerne. Dette tjener også som en nyttig sanity check for at verificere nøjagtigheden af korrelationen.

3. Metodens begrænsninger

Den 3D-korrelerede FIB-tilgang kræver prøver, der kan leveres med fiduciale perler. Derfor er denne metode i øjeblikket begrænset til dykfrosne gitre. For højtryksfrosne (HPF) (væv) prøver kan der i øjeblikket kun udføres 2D-2D-korrelationer. Potentielt kan interne fiduciale markører (f.eks. Organeller, farvede lipiddråber) være en løsning på dette problem32,33. Den endelige korrelationssuccesrate afhænger af mange faktorer, herunder prøvekvaliteten, fluorescensmikroskopiopsætningen, lameltykkelsen og størrelsen af den målrettede struktur. Korrelationsnøjagtigheden ved hjælp af den beskrevne 3D-registreringsmetode anslås at ligge i området 200-300 nm på det endelige IB-billede, hvilket stort set svarer til den typiske tykkelse af FIB-fræsede lameller7. Derfor vil cellulære strukturer, der er meget mindre end dette, være svære at målrette mod i øjeblikket. Derudover reducerer overdreven bevægelse på fræsestedet (>300 nm) også nøjagtigheden af korrelationen, et problem, der potentielt kan løses med FLM-opsætninger integreret i FIB/SEM-instrumenter. Lameller, der udviser stærk deformation eller bøjning under fræsning, bør under alle omstændigheder udelukkes fra downstream-arbejdsgangen.

Samlet set er kryofluorescensbilleddannelse i øjeblikket begrænset af Abbe-diffraktionskriteriet. Med mere rutinemæssig anvendelse (og kommercialisering) af superopløste cryo-FLM-metoder kan mere nøjagtig målretning af cellulære strukturer blive mulig, især når den integreres i FIB / SEM til on-the-fly drift.

4. Metodens betydning

Især sammenlignet med ikke-målrettede og postkorrelationsteknikker gør den 3D-korrelerede FIB-fræsningsmetode det muligt at vælge passende positioner før det tids- og ressourcekrævende TEM-trin. Det muliggør dermed mere effektiv dataindsamling og projektplanlægning. Desuden tilføjer de korrelerede fluorescensdata et lag af information, der kan være afgørende for fortolkningen af tomogrammerne og for at integrere cryo-ET-resultaterne i projekter i flere skalaer, især når det drejer sig om ikke-strukturerede proteinsamlinger eller dem, der er for små til skabelonmatchning og subtomogramgennemsnit.

5. Betydning og potentielle fremtidige anvendelser

I kombination med avancerede arbejdsgange såsom kryoløft ud af HPF-prøver 34,35, kryo-FIB-SEM volumen 36 og superopløsningsfluorescensbilleddannelse26,37,38,39 giver 3D-målrettet lamelpræparation udsigt til ikke kun at dissekere biologiske processer i isolerede celler, men også at gøre vævs- og patientprøver tilgængelige for FIB-fræsning og kryo-elektrontomografi. Som sådan vil det muliggøre dissektion af patologiske processer i høj opløsning og dermed være en integreret byggesten mod en biopsi på nanoskala.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Inga Wolf for at understøtte IT-infrastrukturen, Florian Beck for beregningsstøtte og Oda H. Schiøtz for den kritiske læsning af manuskriptet. Finansieringen blev delvist ydet gennem et Alexander von Humboldt returners stipendium til Philipp S. Erdmann og et EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 til Florian Wilfling. Anna Bieber blev støttet af et Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autogrids Thermo Fisher Scientific / Homemade 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)
C-rings Thermo Fisher Scientific 1036171
Corrsight with cryo module Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 1
Dynabeads MyOne COOH Thermo Fisher Scientific 65011 recommended 1 µm fiducial beads
EM Grids R1/4 SiO2 Quantifoil N1-S13nAu20-01
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific Camera/Filter Alternative 1
FIB Aquilos 1 Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 1
FIB Aquilos 2 Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 2
FIB Quanta 3D FEG Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 3
FIB Scios Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 4
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 Gatan Camera/Filter Alternative 2
Leica TCS SP8 with cryo module Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 2
Plasma Cleaner PDC-3XG Harrick
Teflon Sheet (0.25 mm) plastx24.de 11645 Cut to same dimensions as filter paper
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 Thermo Fisher Scientific TEM Alternative 1
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 Thermo Fisher Scientific TEM Alternative 2
THUNDER Imager  EM Cryo CLEM Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 3
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific alternativevly, use manaual plunger
Whatman filter paper Sigma Aldrich 10311807 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beck, M., Baumeister, W. Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).
  2. Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
  3. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  4. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  5. Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells. Methods in Cell Biology. 162, Elsevier Inc. 273-302 (2021).
  6. Klein, S., et al. Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies. Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).
  7. Arnold, J., et al. Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  8. Wilfling, F., et al. A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits. Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).
  9. Scientific volume imaging, Nyquist calculator. , Available from: https://svi.nl/NyquistCalculator (2021).
  10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Huygens Professional version 19.04. , Scientific Volume Imaging. The Netherlands. Available from: http://svi.nl (2021).
  12. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  13. Arnold, J. 3DCT. , Available from: https://3dct.semper.space/ (2021).
  14. Klumpe, S., et al. A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows. bioRxiv. , 444745 (2021).
  15. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 0-3 (2019).
  16. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  17. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. bioRxiv. , 963033 (2020).
  18. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, e52286 (2020).
  19. Fung, H. K. H. tools3dct. , Available from: https://github.com/hermankhfung/tools3dct (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  21. Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
  22. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  23. Bäuerlein, F. J. B., et al. In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions. Cell. 171 (1), 179-187 (2017).
  24. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  25. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  26. Kaufmann, R., et al. Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions. Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).
  27. Booy, F. P., Pawley, J. B. Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature. Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).
  28. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-Learning denoising from single noisy images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).
  29. Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. eLife. 8, 1-15 (2019).
  30. Delmic METEOR. , Available from: https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor (2021).
  31. T. F. Scientific. iFLM. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf (2021).
  32. Mahamid, J., et al. Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).
  33. Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging. iScience. 24 (7), 102714 (2021).
  34. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).
  35. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  36. Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
  37. Liu, B., et al. Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context. Scientific Reports. 5, 13017 (2015).
  38. Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision. SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).
  39. Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 176 kryo-elektrontomografi kryofokuseret ionstrålefræsning in situ strukturel biologi
Prøveforberedelse ved 3D-korrelativfokuseret ionstrålefræsning til kryo-elektrontomografi med høj opløsning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, … More

Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (176), e62886, doi:10.3791/62886 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter