Summary
Här presenterar vi en pipeline för 3D-korrelativ fokuserad jonstrålefräsning för att vägleda beredningen av cellulära prover för kryoelektrontomografi. 3D-positionen för fluorescerande märkta proteiner av intresse bestäms först med kryofluorescensmikroskopi och riktas sedan mot malning. Protokollet är lämpligt för däggdjurs-, jäst- och bakterieceller.
Abstract
Kryoelektrontomografi (kryo-ET) har blivit den bästa metoden för att undersöka cellulära ultrastrukturer och molekylära komplex i deras ursprungliga, frusna hydratiserade tillstånd. Kryo-ET kräver dock att proverna är tillräckligt tunna för att inte sprida eller blockera den infallande elektronstrålen. För tjocka cellprover kan detta uppnås genom kryofokuserad jonstrålefräsning (FIB). Detta protokoll beskriver hur man riktar in sig på specifika cellulära platser under FIB-fräsning med hjälp av en 3D-korrelativ metod, som kombinerar tredimensionella fluorescensmikroskopidata med information från FIB-svepelektronmikroskopet. Med hjälp av denna teknik kan sällsynta cellulära händelser och strukturer riktas med hög noggrannhet och visualiseras med molekylär upplösning med hjälp av kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM).
Introduction
Fokuserad jonstrålefräsning gör det möjligt att framställa tunna biologiska prover från kryofixerade prover utan de problem som vanligtvis förknippas med mekaniska snittar som knivmärken och kompressionsartefakter1. I kombination med kryoelektrontomografi möjliggör FIB-fräsning högupplösta biologiska studier av cellulär morfologi och bestämning av strukturen hos makromolekylära komplex direkt inifrån celler med subnanometerupplösning 2,3,4. Medan rikliga arter, såsom ribosomer, lätt hittas i slumpmässigt skurna FIB-lameller, är många cellulära processer beroende av samlokalisering av flera komplex eller är lokaliserade till specifika platser i cellen. Följaktligen krävs effektiv målinriktning för att inte förlora den biologiska egenskapen av intresse under malningsprocessen och begränsas till slumpmässiga träffar. Ett korrelerat tillvägagångssätt som kombinerar data från svepelektronmikroskopet (SEM)-FIB och ett kryofluorescensljusmikroskop (FLM) är därför nödvändigt. Även om det är möjligt att utelämna den initiala korrelationen och kombinera FLM- och cryo-ET-data först efter TEM-insamling5,6, möjliggör fluorescensstyrd fokuserad jonstrålefräsning ett exakt val av fräsområdet i förväg, vilket resulterar i effektivare datainsamling. Sedan dess idé7 har tillämpningen av 3D-korrelerad FIB-fräsning i biologiska studier varit begränsad tills vi nyligen rapporterade att vi identifierat ett nytt vätske-vätskefasseparerat (LLPS) fack i jäst med hjälp av denna teknik8.
Här beskrivs ett generaliserat 3D-kryokorrelerat ljus- och elektronmikroskopiprotokoll (CLEM), som kan användas för att studera ett brett utbud av prover, allt från bakterier till jäst- och däggdjursceller. Även om experimenten utfördes med en viss uppsättning instrument, är de enskilda stegen inte bundna till specifik hårdvara och kan enkelt överföras till andra system som en förlängning av befintliga protokoll 3,5. En lista över testad utrustning och föreslagna inställningar finns i materialtabellen och tabell 1. De fyra nyckelstegen i pipelinen är (1) provberedning, (2) lokalisering av intressanta egenskaper genom kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korrelerad fokuserad jonstrålefräsning och (4) lokalisering av de riktade strukturerna för kryo-ET-datainsamling på lamellerna i kryotransmissionselektronmikroskopet (figur 1).
Protocol
Bild 1: Sammanfattning av arbetsflödet med ett urval av kritiska steg. Hela protokollet är uppdelat i fyra steg beroende på vilken utrustning som används: Provberedning, inklusive doppfrysning, kryofluorescensmikroskopi, kryofokuserad jonstrålefräsning och kryoelektronmikroskopi. För varje steg markeras flera viktiga punkter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Cellodling och djupfrysning av galler
- Odla valfria celler och optimera märknings- och behandlingsstrategier vid rumstemperatur innan du går vidare till kryoexperiment. Mål av intresse märks antingen med fluorescerande proteinfusioner eller levande färgning (t.ex. Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, levande antikroppsfärgning, etc.). Om behandling med kemiska eller biologiska medel (små molekyler, specialmedia, siRNA, etc.) behövs för att undersöka den biologiska processen av intresse, optimera förhållandena (t.ex. tid, koncentration) med hjälp av FLM-avbildning av levande celler.
- Se till att de intressanta platserna kan lokaliseras framgångsrikt ovanför bakgrunden i ett tillräckligt antal celler med hjälp av avbildningsinställningar som matchar senare kryoförhållanden så nära som möjligt (dvs. NA, exponeringstid, etc.).
- Val och beredning av galler
- Välj rutnät med hålstorlek och avstånd som är lämpliga för cellerna och de fiduciella markörer som används (se steg 1.3.1). Använd inte kontinuerlig film utan hål eftersom detta kan resultera i för mycket kvarvarande buffert efter blotting och därmed minska förglasningseffektiviteten och försvåra upptäckten av fiduciella pärlor. För långvarig kontakt mellan cellerna och gallren, se till att gallerstödet och filmmaterialet är biokompatibla.
- Plasmarengör kryo-EM-gallren för att göra dem mer hydrofila. För användning i vidhäftande cellodling, sterilisera gallren efter plasmarengöring med UV-strålning i 20 minuter i en laminär flödeshuv. Alternativt kan galler förbehandlas med föreningar som hjälper till med cellvidhäftning, såsom poly-L-lysin eller konkanavalin A, enligt beskrivningen nedan.
OBS: I allmänhet har följande rutnäts-/provkombinationer framgångsrikt använts i det korrelativa kryo-FIB-arbetsflödet: Jäst: Cu eller Au, 200 mesh, R1/4 kol eller SiO2-film , eventuellt belagd med concanavalin A; Escherichia coli: Cu eller Au, 200 mesh, R1/4 kol eller SiO2 film; Chlamydomonas reinhardtii: Cu eller Au, 200 mesh, R1/2 eller R1/4 kol eller SiO2 film; HeLa: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2-film , belagd med poly-L-lysin; HEK293: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2 film, belagd med poly-L-lysin. - Konkanavalin En beläggning för att förbättra fästet av jästceller:
- Bered en beläggningslösning av 1 mg/ml konkanavalin A i 10 mM HEPES-buffert med 100 μM CaCl2, pH 8,5. Placera en droppe (50 μL) av beläggningslösningen och två droppar destillerat vatten separat på en bit paraffinfilm.
- Plocka upp det plasmarengjorda gallret med omvänd pincett och sätt försiktigt in det i droppen av beläggningslösningen, undvik rörelser vinkelrätt mot gallret för att förhindra skador på filmen.
- Efter ~5 s inkubation, tvätta gallret två gånger genom att sätta in det i vattendropparna på liknande sätt. Torka slutligen bort överflödig vätska genom att applicera ett filterpapper på baksidan av gallret och låt gallret torka helt innan du släpper det från pincetten. Använd de torkade gallren för djupfrysning.
- Poly-L-lysinbeläggning för suspensionsodling och vidhäftande celler:
- Bered en beläggningslösning av 1 mg/ml poly-L-lysin i 0,1 M natriumboratbuffert, pH 8,5.
- Placera plasmarengjorda galler i en lämplig skål för cellodling och sterilisera i 20 minuter med UV-strålning.
- Tillsätt försiktigt så mycket beläggningslösning att alla galler täcks och inkuberas vid 37 °C i minst 2 timmar. Aspirera vätskan och tvätta försiktigt gallren två gånger med PBS innan du sår cellerna till önskad koncentration.
- Beredning av celler och fiduciella pärlor
OBS: Fiduciella pärlor krävs för 3D-registrering av fluorescensdata med bilder tagna i FIB/SEM-mikroskopet för att möjliggöra 3D-korrelativ FIB-fräsning.- Välj pärlor som känns igen i alla avbildningsmodaliteter, dvs. FLM, SEM och IB (rekommenderad diameter 0,5-1 μm), men se till att dessa inte överglänser den cellulära målstrukturen under fluorescensavbildning för att göra det lättare att skilja pärlorna och den biologiska egenskapen av intresse. Avlägsna cytotoxiska konserveringsmedel i fiduciella pärlor (t.ex. NaN3) enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: För att lättare kunna skilja mellan de biologiska egenskaperna av intresse och de fiduciala egenskaperna är det användbart om fluorescensemissionsspektra endast delvis överlappar varandra så att signaler kan särskiljas baserat på intensitetsskillnader i FLM-kanalerna. - Om suspensionsodling används, odla cellerna till en lämplig densitet (t.ex. jäst OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii 1500 celler/μL) och utför de behandlingar som krävs för experimentet, t.ex. byte av medium, tillsats av kemikalier, svält osv. Fäst de plasmarengjorda gallren på pincetten enligt vad som krävs för dykmetoden (manuell/automatisk) och applicera 4 μL av cellsuspensionen blandad med ~1 x 105 pärlor/μL fiducial pärlsuspension på filmsidan av gallren.
OBS: Bestäm den optimala utspädningen av celler och fiducialer i titreringsexperiment (t.ex. genom att kontrollera kryo-FLM eller FIB/SEM, se nedan). För de flesta celler som odlas i suspension har dock en slutlig koncentration på ~1 x 105 pärlor/μL av de fiduciella 1 μm pärlorna (1:20 spädning från lager; se materialtabell för detaljer) visat sig vara en bra utgångspunkt. - Om vidhäftande kultur används, plasmarengör och sterilisera gallren med UV-strålning för aseptisk odling. Täck vid behov galler med föreningar som hjälper cellvidhäftningen (t.ex. poly-l-lysin, fibronektin, laminin; se steg 1.2.2). Frö och odla celler på gallren i vanliga odlingsskålar eller skålar med underavdelningar för galler.
- Behandla proverna efter behov för experimentet och håll cellerna under optimala förhållanden fram till djupfrysning (t.ex. 37 °C/5 % CO2 för HEK/HeLa). Ta försiktigt bort gallren från odlingsskålen och fäst dem på den nedsänkta pincetten. Applicera 4 μl av odlingsmediet blandat med fiducialer (1 x 105 pärlor/μl för 1 μm fiducialer) på den cellbärande sidan.
- Välj pärlor som känns igen i alla avbildningsmodaliteter, dvs. FLM, SEM och IB (rekommenderad diameter 0,5-1 μm), men se till att dessa inte överglänser den cellulära målstrukturen under fluorescensavbildning för att göra det lättare att skilja pärlorna och den biologiska egenskapen av intresse. Avlägsna cytotoxiska konserveringsmedel i fiduciella pärlor (t.ex. NaN3) enligt tillverkarens anvisningar.
- Djupfrys cellerna med antingen en manuell eller en automatiserad frysprocedur. Om möjligt, torka endast gallret från den sida som är motsatt cellerna för att förhindra mekanisk skada på cellerna (figur 2A). På tvåarmade automatiserade dyksystem, uppnå detta genom att placera ett ark av polytetrafluoreten (t.ex. teflon) istället för läskpapper på dynan vänd mot cellerna. Överför gallren till förvaringslådor och förvara dem i flytande kväve (lN2) tills de ska användas.
VARNING: lN2 och andra kryogener kan orsaka allvarliga skador på ögon och hud. Använd personlig skyddsutrustning (PPE) och arbeta endast i ett välventilerat utrymme för att undvika uppbyggnad av farligaN2-koncentrationer .
OBS: Alla efterföljande steg bör bäst utföras i vätskefasen av lN2 för att undvika kontaminering av cell- och lamellytorna, eftersom detta kan komplicera nedströmsbearbetningen. Minska kontakten med flytande iskristaller genom att alltid använda rent flytande kväve (t.ex. filter för att ta bort flytande is), eliminera onödiga överföringssteg och, om möjligt, arbeta i en fuktkontrollerad miljö. - Montera och kläm fast de dykfrysta gallren i AutoGrids med utskärning och cellerna uppåt (Figur 2A) för efterföljande kryofluorescensavbildning och FIB-fräsning. För att säkerställa korrekt inriktning av proverna i TEM måste fräsriktningen vara ortogonal mot kryo-ET-lutningsaxeln. Placera därför orienteringsmarkeringarna (t.ex. LASER-gravyr eller borttagbara markörprickar) på AutoGrids innan du klipper för att hjälpa till med denna justering (Figur 2A).
- Screena gallerkvaliteten (Figur 2B) på cryo-FLM och FIB/SEM. Optimera celltätheten, blottningstiden och kraften för att få en jämn fördelning av celler och pärlor. Använd avbildning av reflekterat ljus på ett kryofluorescensmikroskop eller använd kryo-FIB-SEM för att se till att både celler och fiduciella pärlor är tydligt synliga (figur 2B, vita pilar).
- Upprepa vid behov nedsänkningen med bättre förhållanden, t.ex. varierande cellkoncentration och/eller blottingtid. När lämpliga dykparametrar har hittats, upprepa inte rutnätsscreening för varje ny omgång experiment.
Figur 2: Siktning av lämpliga galler med hjälp av SEM och IB . (A) Orienteringsmarkeringar bör placeras på AutoGrids vinkelrätt mot fräsriktningen för att förenkla korrekt lastning i TEM. Cellerna monteras uppåt i det monterade AutoGrid. (B) Efter nedfrysning inspekteras galler i SEM för att utvärdera och optimera dykförhållandena: a) Det bör inte finnas för många celler per galler. För HeLa-celler, till exempel, använd inte mer än 1-4 celler/kvadrat. För mindre celler som Saccharomyces cerevisiae (visas här) har klumpar med 4-6 celler visat sig vara användbara. b) Fiduciella pärlor (vita pilar) ska vara tydligt synliga och det ska inte finnas för mycket buffert runt cellerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Kryofluorescensmikroskopi
- För varje rutnät, skaffa en översikt i (bredfälts) fluorescens och differentiell interferenskontrast (DIC) eller reflekterat läge och välj lämpliga rutnätsrutor med fluorescenssignal. Välj synfält som innehåller både de celler som är av intresse och ett tillräckligt antal fiduciella markörer (6-12).
- Se till att cellerna och pärlorna är jämnt fördelade, inte för täta och mot mitten av varje ruta. Välj endast rutor som är tillgängliga för både FIB-SEM- och TEM-instrumentet, alltså de som är minst tre rutor från rutnätskanten på 200 masknät (figur 3A, inuti den röda cirkeln).
- På var och en av de valda rutnätsrutorna, skaffa en fluorescerande stapel med ett fokussteg som är lämpligt för senare dekonvolution, dvs <1/2 den axiella upplösningsgränsen. Använd om möjligt objektiv med stor numerisk bländare (NA) för att öka antalet fotoner och lokaliseringsnoggrannheten.
- I ett konfokalmikroskop med NA 0,9-objektiv, skaffa stackar med 300 nm stegstorlek och översampla Nyquist-värdet. Spela in flera färgstaplar om det behövs (Figur 2B). Förvara galler under lN2 tills vidare användning.
OBS: För att bestämma den optimala stegstorleken, välj de värden som beräknas av mikroskopkontrollprogramvaran eller använd onlineverktyg9. Kontrollera om signalen blöder igenom mellan kanalerna eftersom överdriven genomblödning är skadlig för samlokaliseringsexperiment. Vissa kan dock vara fördelaktiga att korrigera för kromatiska aberrationer i flerfärgsstaplar.
- I ett konfokalmikroskop med NA 0,9-objektiv, skaffa stackar med 300 nm stegstorlek och översampla Nyquist-värdet. Spela in flera färgstaplar om det behövs (Figur 2B). Förvara galler under lN2 tills vidare användning.
- Dekonvolvera staplar med lämplig programvara10,11 och dela om7 dem om en isotrop pixelstorlek krävs. Dekonvolution – precis som vid rumstemperatur – rensar upp FLM-signalen och kan förbättra lokaliseringsnoggrannheten (Figur 3C).
Figur 3: Välja kvadrater för FLM-stackförvärv och förbättring av data genom dekonvolution. (A) Översikt över ett rutnät doppat med jästceller som uttrycker eGFP-Ede1 (grön) och mCherry-Atg8 (magenta). Välj positioner med en bra fördelning av pärlor och celler, men undvik rutnätets kanter (skuggade röda). Rutorna indikerar positioner med bra cellfördelningar där fluorescensstackar togs. (B) Maximal intensitetsprojektion (MIP) av flerfärgsstapeln tagen på den gula rutan (från A) efter dekonvolution. Dekonvolution av FLM-staplarna rensar avsevärt bort oönskade bakgrundssignaler och hjälper till att lokalisera pärlor i z mer exakt, vilket framgår av gaussiska passningar före (C) och efter dekonvolution (D) (passningar utfördes i 3DCT och visas för pärlan markerad med 1). Bilderna visar inzoomade MIP-vyer av den röda kanalen (excitation: 552 nm, emission: 585-650 nm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Fräsning med fokuserad jonstråle
- Ladda gallren i kryo-FIB-SEM-instrumentet och använd antingen utskärnings- och/eller orienteringsmärkena för att säkerställa korrekt orientering för senare placering i TEM (figur 2A). Se till att fräsriktningen är vinkelrät mot lutningsaxeln på TEM.
- Använd ett gasinsprutningssystem (GIS; CpMePtMe3) vid de scenpositioner som är fördefinierade av FIB-SEM-inställningen för att belägga gallren med ett skyddande organometalliskt skikt. Applicera inte för mycket, eftersom det kan störa lokaliseringen av fiduciella pärlor i TEM senare. Använd en plasmabestrykare för att applicera metallisk platina för att minska provladdningen.
OBS: Om det inte finns några inställningar för GIS-beläggning kan de enkelt hittas genom att utföra successiva omgångar med kort beläggning (~2 s), följt av FIB-fräsning. Se till att provet fortfarande kan skäras framgångsrikt vid medelströmmar (~100 pA) utan uppenbar kantning av det skyddande organometalliska skiktet runt lamellkanterna. Både tid och avstånd för GIS-nålen (med avseende på provet) är viktiga parametrar att ta hänsyn till. Använd inte GIS-nålen vid rumstemperatur (t.ex. 45 °C), utan så kallt som möjligt för att fortfarande ge en jämn beläggning (25-27 °C). - Spela in en översikt över SEM-rutnät och utför en 2D-korrelation med FLM-översikter för att hitta rutnätsrutorna för vilka fluorescerande staplar har registrerats. Inspektera båda vyerna manuellt eller använd olika programvarupaket 7,10,12 för att hitta rutnätsrutorna. Här ligger fokus på 3D-korrelationsverktygslådan (3DCT)7, som använder 3D-stel kroppstransformation med isotrop skalning mellan vyer. En utmärkt genomgång av 3DCTs funktioner finns tillgänglig online13.
- Välj och markera minst fyra motsvarande positioner, t.ex. landmärken som rutnätsstänger eller hål i stödfilmen, i både FLM- och SEM-rutnätsöversikten (högerklicka) och beräkna transformationen mellan de markerade punkterna (korrelera).
- Placera sedan markörerna i mitten av motsvarande rutnätsrutor för vilka FLM-staplar har hämtats och förutsäg deras position i SEM-vyn (korrelera; Figur 4A).
- För varje korrelerad rutnätsruta, ta en bild av jonstrålen (IB) med låg ström (≤10 pA) vid den FIB-fräsvinkel du vill ha (10°-25° för 45° förlutningsskyttel). Välj ett synfält (t.ex. position och förstoring) som matchar fluorescensdata. För rutnät med 200 maskor, hämta fluorescens- och FIB/SEM-data så att de innehåller enkla rutnätsrutor, inklusive rutnätsstaplarna (se figur 3A och figur 4A).
OBS: Fräsning bör utföras i en så grund vinkel som möjligt för att undvika att förlora betydande vinkelområde under kryo-ET och för att möjliggöra identifiering av ett tillräckligt antal fiduciella pärlor. Till exempel: med en steglutning på 17°, en skyttelförlutning på 45° och en FIB-strållutning på 52° i förhållande till lodet är lamellförlutningen 10°, vilket nätt och jämnt uppfyller det föredragna vinkelområdet på ±60° i TEM genom att luta från -50° till +70°, maximalt för många TEM-kryohållare. - Ta en SEM-bild av samma kvadrat för att hjälpa till med identifieringen av motsvarande pärlor i fluorescens- och jonstrålevyn.
- Utför registrering av den dekonvolverade 3D FLM-stacken och 2D-jonstrålen view för varje position med 3DCT enligt beskrivningen i följande (figur 4B) steg.
- Ladda motsvarande omskivade 3D FLM-stack och jonstråle (IB) view i 3DCT.
OBS: Fluorescensdata i flera färger kan laddas som upp till tre separata enkanalsstackfiler. - Välj 4 fiduciella pärlor i fluorescensdata och högerklicka på positionslistan för att bestämma deras 3D-position via Gaussisk anpassning av signalen i x, y och z. Välj motsvarande pärlor i IB-bilden och utför en initial 3D-korrelation (korrelat).
- Iterativt lägga till fler pärlor i fluorescensbilden, förfina deras 3D-position och förutsäga deras position i IB-vyn för att snabbt lägga till fler pärlor i registreringen och för att kontrollera noggrannheten i korrelationen. I 3DCT tillhandahålls RMSE-värden (root-mean-square error) för att bedöma korrelationskonsistensen7.
- Se till att RMSE-värdena är små och i storleksordningen för lokaliseringsnoggrannheten (~300 nm). För att bestämma noggrannheten i korrelationen, utelämna några fiduciella pärlor som är tydligt identifierbara i både fluorescens och jonstråle avsiktligt under registreringssteget. Gör detta genom att kontrollera deras förutspådda kontra faktiska plats i jonstrålebilden. Om den förutspådda positionen skiljer sig avsevärt från den verkliga, upprepa den initiala korrelationen med en ny uppsättning fiducialer.
OBS: Korrelering av 6-8 pärlor har visat sig vara tillräckligt för korrekt registrering av FLM-staplarna och IB-vyerna. Att lägga till fler fiducialer (upp till 12-15) över ett brett spektrum av z-värden (t.ex. genom att välja pärlor på rutnätsfältet eller i angränsande rutor) kan dock förbättra noggrannheten i korrelationen.
- Se till att RMSE-värdena är små och i storleksordningen för lokaliseringsnoggrannheten (~300 nm). För att bestämma noggrannheten i korrelationen, utelämna några fiduciella pärlor som är tydligt identifierbara i både fluorescens och jonstråle avsiktligt under registreringssteget. Gör detta genom att kontrollera deras förutspådda kontra faktiska plats i jonstrålebilden. Om den förutspådda positionen skiljer sig avsevärt från den verkliga, upprepa den initiala korrelationen med en ny uppsättning fiducialer.
- Välj de riktade cellulära signalerna, passa in deras 3D-position i FLM-stacken och använd transformationen för att förutsäga målpositionerna i IB-vyn (figur 4B).
OBS: Alla poster i FLM-positionslistan, som inte har en motsvarighet i IB-listan, kommer att behandlas som en signal som ska förutsägas.
- Ladda motsvarande omskivade 3D FLM-stack och jonstråle (IB) view i 3DCT.
- För varje korrelerad kvadrat, överför förutspådda positioner för de egenskaper som är av intresse till FIB-SEM-instrumentet och placera lamellfräsmönster (figur 4C). Överför positioner manuellt (t.ex. genom att mäta avståndet till synliga landmärken, t.ex. celler eller fiduciella pärlor) eller använd automatisering och skript som implementerats, till exempel i SerialFIB14. Om det finns flera signaler per cell placerar du mönstren så att de innehåller så många intressepunkter (POI) som möjligt i samma lamell för att öka dataflödet.
- Först grovfräs och sedan finfräs lamellerna till en slutlig tjocklek på 150-250 nm. Undvik steg (t.ex. spänningsavlastningsskärningar15) som orsakar att lamellerna sjunker och därmed resulterar i rörelse av den faktiska egenskapen av intresse med avseende på de tidigare förvärvade FLM-stackarna. Använd antingen manuell3 eller automatiserad14,16,17,18 FIB-fräsning. Med båda metoderna, se till att funktionen av intresse förblir i mitten av lamellen genom att symmetriskt tunna ut den uppifrån och ned.
- För att utvärdera noggrannheten i fräsningen för varje lamell, utför samma registrering som i steg 3.4. Men den här gången använder du den slutliga IB-bilden efter FIB-fräsning och kontrollerar om de förutsagda positionerna för de intressanta funktionerna finns i den slutliga lamellen. Alternativt kan du täcka över de roterade projektionerna av FLM-stackarna, erhållna från 3DCT:s utdata och anpassade skript19, med den slutliga IB-bilden (figur 4C, liten infogning).
Figur 4: 3D-korrelativ FIB-fräsning . (A) 2D-2D-korrelation av FLM (vänster) och SEM (höger) översikter av rutnätet används för att lokalisera rutnätsrutorna på vilka fluorescerande staplar togs tidigare. (B) För varje vald ruta, efter 3D-2D-registrering av motsvarande fiduciella positioner i 3DCT (färgade rutor), väljs positioner för biologiska egenskaper av intresse i FLM-data. Baserat på förutsägelsen av motsvarande positioner i jonstrålebilden (röda cirklar) väljs platser för lamellberedning. (C) Svepelektronmikroskop (SEM) och jonstrålebilder (IB) används för att hålla målet centrerat under fräsning. Sluttjocklekar på 150-250 nm har visat sig vara tillräckliga för vidare nedströmsbearbetning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Korrelativ TEM
- Ladda gallren i TEM och se till att lamellorienteringen (som framgår av utskärningar eller orienteringsmärken) är vinkelrät mot lutningsaxeln.
OBS: Mikroskop från olika tillverkare kan styras med olika programvaror, t.ex. Tomo5, Tom eller SerialEM20. Här ligger fokus på det sistnämnda. - Få rutnätsmontage och översikter för varje rutnätsruta som innehåller lameller. Se till att förstoringen och exponeringstiden är lämplig för att visualisera de fiduciella pärlorna i TEM-bilderna utan att avsevärt öka den totala elektrondosen. Skaffa högupplösta TEM-kartor (montage) av varje lamell.
- Register och 3D-2D korrelerar FLM-stacken med TEM-rutnätskvadraten och lamellöversikterna i 3DCT. Använd samma procedur som beskrivs i steg 3.6 genom att välja motsvarande pärlpositioner i fluorescens- (x, y, z - gaussisk passform) och transmissionselektronmikroskopbilder. Välj sedan de intressanta positionerna i FLM-kanalerna och överför dem till TEM-översikterna. Använd vid behov en tvåstegsprocedur som omfattar en första korrelation mellan FLM och låg förstoring TEM, och en andra från låg till hög förstoring TEM (figur 5).
- Överför positioner antingen manuellt (genom att mäta avstånd till landmärken), registrerings- och kartverktygen som finns i SerialEM20 eller extern programvara som CorRelator21.
- Ställ in och kör tilt-serier på korrelerade positioner. Använd lämplig förstoring, oskärpa och total dos (se materialtabell och tabell 1 för mer information). Starta exponeringen vid den förlutning som bestäms av lamellen (se även anmärkningen i steg 3.4) och använd ett dossymmetriskt lutningsschema22. Använd antingen manuell eller batchinhämtning.
Figur 5: Lokalisering av korrelerade positioner i TEM. Efter framgångsrik 3D-korrelativ FIB-fräsning och överföring till transmissionselektronmikroskopet utförs 3D-2D-registrering för varje fräst kvadrat mellan fiduciella pärlor (färgade lådor) i FLM-stackar och TEM-översikter för att lokalisera potentiella platser för kryo-ET (röda cirklar). Lamellöversikter med högre förstoring (inzoomning) kan sedan erhållas för att ställa in tomogram mer exakt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Protokollet ger en genomgång av den pipeline som används för att upptäcka den EH-domäninnehållande och endocytosprotein 1 (Ede1)-beroende endocytiska proteinavlagringen (END) och dess nedbrytning och infångning i autofagiska kroppar8. END är ett vätske-vätskefasseparerat fack i S. cerevisiae, som buffrar en mängd olika proteiner som är involverade i klatrinmedierad endocytos (CME) efter misslyckade endocytiska händelser. En av dess huvudkomponenter är Ede1, som fungerar som en CME-komponent och som en selektiv autofagireceptor för nedbrytningen av detta nya LLPS-fack. Följaktligen användes en EGFP-fusion av Ede1 (EGFP-Ede1) under kontroll av promotorn för alkoholdehydrogenas (ADH) för att visualisera ENDs eftersom Ede1-överuttryck interfererar med de tidiga stadierna av endocytos och därför konstitutivt inducerar LLPS.
På ett djupfryst rutnät med EGFP-Ede1 överuttryckande jästceller och 1 μm fiduciella markörer valdes fem positioner för FLM-stackförvärv i GFP-kanalen (Figur 6A; TFS Corrsight; konfokalt läge, 300 nm fokusstegstorlek, 10 μm räckvidd). Rutnätet överfördes till FIB-instrumentet (Quanta 3D FEG), och rutnätsrutorna för vilka FLM-stackar hade förvärvats identifierades genom att utföra en 2D-2D-korrelation mellan fluorescens- och SEM-rutnätsöversikterna (jämför steg 3.2).
För var och en av de valda kvadraterna togs jonstrålebilder med låg ström (10 pA, 1200x förstoring), och motsvarande fiduciella positioner registrerades i 3DCT. Efter att ha valt positioner med den biologiska egenskapen av intresse och passat in deras 3D-position i FLM-stacken, applicerades den funna transformationen på förmodade END-positioner, och platserna för lamellpreparering valdes ut (Figur 6B). En FIB-stråle som lutar 11° i förhållande till gallerytan användes i exemplen som visas här (45° FIB-skyttelförlutning; 18° steglutning). Positioner av intresse överfördes och FIB-mönster ritades manuellt (figur 6D) genom att mäta avståndet mellan de förutsagda positionerna i förhållande till framträdande landmärken i FIB-bilden (t.ex. hål, isföroreningar, fiduciella pärlor). Noggrannheten i registreringen utvärderades genom att avsiktligt utelämna pärlor som tydligt kunde identifieras i FLM- och IB-bilden, och sedan jämföra deras faktiska och förutsagda positioner i jonstrålevyn (t.ex. diamant i figur 6B,C). Korrelationen för kvadraten som visas i figur 6C visade sig vara korrekt (dvs. den förutsagda positionen för FLM-pärlans positioner sammanföll perfekt med deras motsvarande IB-placering och 3DCT-rapporterade subpixel RMSE-värden för registreringen). Således skars lameller vid de förutspådda positionerna (plats B) och finfrästes till en tjocklek av ~200 nm (slutlig mönsterförskjutning).
Figur 6: Representativa resultat för 3D-korrelativ målsökning av endocytiska proteinavlagringar (END) i jäst. (A) SEM-översikt över gallret före fräsning. De färgade rutorna visar rutnätsrutor för vilka fluorescensstaplar togs i förväg. (B-C) 3D-korrelation i en rutnätskvadrat. Efter att ha registrerat flera motsvarande fiduciella pärlor (färgade rutor) i FLM-data (B, visas här som maximal intensitetsprojektion) och jonstrålebilden (C), verifierades noggrannheten i 3D-registreringen genom att förutsäga positionen för pärlan som indikeras med diamanten. Därefter förutspåddes positionerna för målsignalen (röda cirklar) i jonstrålevyn för två potentiella fräsplatser. (D) Zoomning av område B som visar de förutsagda positionerna för tre målpunktering (röda cirklar) och de initiala fräsmönstren (gula rutor). En fjärde fluorescenspunctum förutspåddes vara mycket lägre än den andra puncta och därför inte riktad under fräsning (grå cirkel). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Efter framgångsrik FIB-fräsning och överföring av nätet till kryotransmissionselektronmikroskopet (Titan Krios arbetade på 300 kV och var utrustad med en Gatan K2 direktelektrondetektor och Bioquantum-energifilter) spelades en rutnätsöversikt in i SerialEM och användes för att lokalisera rutor med lameller. För varje lamell togs översiktsbilder och FLM-data registrerades i 3DCT (3D-2D) med hjälp av motsvarande fiduciala pärlor. Positionerna för de biologiska egenskaperna av intresse (Figur 7A) förutspåddes sedan med hjälp av transformationen beräknad från de fiduciella pärlorna. Lamellöversikter som spelades in vid högre förstoring syddes och intressanta platser korrelerades med hjälp av tydligt synliga landmärken (t.ex. fiduciella pärlor). Alternativt kan klassiska CLEM-översikter produceras i olika programvaror10,12.
Baserat på korrelationen hittades fyra potentiella platser för tomograminsamling för lamellerna som visas i figur 7A. Detta inkluderar dock även en position som inte var riktad under den 3D-korrelerade FIB-fräsningen (jämför figur 6D; grå cirkel) och en position blockerad av iskontaminering (figur 7; grå rutor). Följaktligen kunde tomogram endast registreras för två positioner (figur 7B). Sammantaget uppnåddes en korrelationsframgång på ~75%, dvs. lameller som överlevde överföringen till TEM- och END-strukturerna hittades på de förutspådda platserna (12 korrelerade platser). Efter tomogramrekonstruktion, segmentering och mallmatchning kan enskilda END-strukturer visualiseras i sitt ursprungliga sammanhang (Figur 7C,D). Detta inkluderar det fenestrerade endoplasmatiska nätverket (ER) som omger END, lipiddroppar som ibland kommer i kontakt och ribosomer, som utesluts från LLPS-facket. Sammantaget visar detta hur 3D-korrelativ FIB-fräsning kan ge information på molekylär nivå om sällsynta biologiska processer från intakta celler.
Figur 7: Representativa resultat för visualisering av END med kryo-ET. (A) Den lågförstorade TEM-översikten över fräsplatsen som visas i figur 6 kan lätt korreleras med FLM:s maximala intensitetsprojektion (figur 6B) för att lokalisera biologiska egenskaper av intresse (röda kors). (B) I ett andra steg kan en vy med högre förstoring (sydd) korreleras, och positioner för tomogramtagning (gula rutor) ställs in. Platser som var ett resultat av signalen utanför planet (grå ruta, jämför figur 6D) ignorerades. (C-D) Med hjälp av denna 3D-korrelativa FIB-metod kan den endocytiska proteinavlagringen (END) visualiseras i sin naturliga miljö. Strukturer som det endoplasmatiska nätverket (ER), ribosomer, membran och lipiddroppar kan identifieras och visualiseras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Inställningar för Plasma Cleaner | |||
| Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG : | Radiofrekvensinställning: "HI", 30 s; N2-plasma | ||
| Inställningar för kolv | |||
| TFS Vitrobot Mk IV: | 100% luftfuktighet; blotforce = 8; blottime = 10 s; väntetid 0 s; (detta bör fungera för de flesta suspensions- och vidhäftande celler) | ||
| FIB GIS-positioner och tider | |||
| Quanta 3D FEG: | Lutning = 0, Rotation = -180, Z-position = 13.5, Temperaturbörvärde =26.15°, Tid = 8 s | ||
| TFS Scios: | Lutning = 0, Rotation = -180, Z-position = 9,8, Temperaturbörvärde =28°C, Tid = 7 s | ||
| TFS Aquilos 1: | Fördefinierad position för programvara, temperaturbörvärde = 28°, tid = 7 s | ||
| TFS Aquilos 2: | Fördefinierad position för programvara, temperaturbörvärde = 28°, tid = 7 s | ||
| FIB Sputter Coater-inställningar | |||
| System för beslutförhet: | I kvorumförberedelsekammaren: 10 mA, 40 s | ||
| TFS Scios: | 10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s | ||
| TFS Aquilos 1: | 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| TFS Aquilos 2: | 1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| Förvärv av tomogram | |||
| Titan Krios Gi2 | K2 kamera, Gatan Bioquantum energifilter | ||
| 20 eV slits; dossymmetriskt lutningsschema (Hagen) med 2° steg; Börja vid +10° (lamellförlutning!) till +70° och -50° | |||
| Titan Krios Gi4 | Falk 4; Selectris X energifilter | ||
| 10 eV slits; dossymmetriskt lutningsschema (Hagen) med 2° steg; Börja vid +10° (lamellförlutning!) till +70° och -50° | |||
| FLM-förvärv | |||
| Corrsight (konfokalt läge) | Mål: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; Stackförvärvsparametrar: x-y pixelstorlek = 161,25 nm, z-stegstorlek = 300 nm. | ||
| Leica SP8 kryokonfokal | Mål: Leica HCX PL APO 50x / 0,90 CLEM; Stackförvärvsparametrar: x-y pixelstorlek = 84 nm, z-stegstorlek = 300 nm. | ||
Tabell 1: Lista över testad utrustning och föreslagna inställningar.
Discussion
1. Kritiska steg i protokollet
Optimering av cellodling och rutnätsdoppningsparametrar är grundläggande för detta arbetsflöde. I början av ett projekt är det värt att investera tid för att optimera märkningsstrategier, fördelningen av celler och fiduciella pärlor och testa olika rutnätsberednings- och blottningsparametrar. Att arbeta med ett optimalt djupfryst prov kommer att underlätta bearbetningen nedströms avsevärt.
Som för alla TEM-experiment krävs glaskroppsprover. För stora däggdjursceller som HeLa är 1-2 celler per rutnätsruta att föredra, men cellerna kan fortfarande vara glasaktiga vid högre densitet. Alternativt kan vitrifiering förbättras i däggdjursceller (t.ex. HEK293, HeLa) genom att inkubera dem med 2,5-10 % (v/v) glycerol tillsatt till odlingsmediet 10 minuter före nedsänkning23. Om det finns tillgängligt kan rutnätsmönster användas för att säkerställa perfekt placering och fördelning av cellerna, vilket förbättrar vitrifiering och senare korrelation24.
Specifika celler kan väljas under arbetsflödet, men för få celler som visar den biologiska funktionen av intresse kommer att minska det totala dataflödet avsevärt. För att förbättra korrelationen i POI-positiva celler bör tillräckligt ljusa fluoroforer användas. Detta är särskilt viktigt vid endogena uttrycksnivåer. Vi fann att mVenus under kryoförhållanden ofta presterade bättre än EGFP på grund av dess ökade ljusstyrka25 och den hypsokroma förskjutningen, vilket gör den lämplig för vanliga GFP-filteruppsättningar under kryoförhållanden26. För icke-punktliknande målstrukturer bör avvägningen mellan våglängd och lokaliseringsnoggrannhet (Abbe-diffraktionsgräns) också övervägas.
Effektiv 3D-korrelation kräver också att näten är mekaniskt stabila och hanteras med stor försiktighet. Medan vanliga guld- eller kopparnät med kolstöd kan användas, kan framgångsgraden ökas avsevärt genom att använda styvare SiO2-filmer beroende på projektet. Det har dock ännu inte slutgiltigt fastställts om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchande termiska expansionskoefficienter (substrat kontra film) för att minska kryoskrynkling27, är den mest avgörande faktorn för framgångsrik 3D-korrelation. Dessutom, för att plocka upp ömtåliga Au-galler, kan polydimetylsiloxanbelagda skålar användas5.
Förutom att säkerställa provstabiliteten är ett noggrant val av FLM-avbildningsparametrar nödvändigt för att erhålla fluorescensstackar av hög kvalitet som är lämpliga för optimal inriktning under FIB-fräsning. I detta avseende rekommenderas också att testa olika denoising28 - eller deconvolution-tekniker på FLM-data, eftersom det avsevärt kan förbättra lokaliseringen av fiduciala och cellulära signaler. När man korrelerar fluorescenssignalen till FIB-SEM-bilder är det viktigt med ett bra urval av fiduciella pärlor. De ska vara väl fördelade runt cellerna och eventuellt på olika z-höjder. Det är också god praxis att validera korrelationens konsistens genom att kontrollera de förutsagda kontra faktiska positionerna för pärlor som avsiktligt utelämnades från den fiduciella modellen men som tydligt kan korreleras med ögat. 3DCT:s RMSE-värden bör också alltid beaktas för att kontrollera registreringskonsistensen.
Eftersom deponeringen av malet material och restvatten från FIB-SEM-kammaren (dvs. återkontaminering) ökar den effektiva lamelltjockleken genom att tillsätta amorft material på båda sidor av den, minskar finmalda lameller i mikroskopet under en längre tid i allmänhet TEM-datakvaliteten på grund av ytterligare elektronspridningshändelser. Följaktligen utförs fräsning oftast i två steg: först fräses alla positioner grovt (dvs. till cirka 800 nm) och sedan fint (till ~150-250 nm), och gallret lossas omedelbart efter att den sista lamellen har slutförts. Bättre korrelationsframgång kan dock uppnås genom att bearbeta de intressanta positionerna på ett platsvis sätt, och därmed utföra grov- och finfräsning på samma lamell direkt efter varandra eftersom detta inte lämnar någon tid för böjning eller deformation. Detta minskar dock det maximala antalet lameller som kan produceras per galler beroende på systemets återkontamineringshastighet. För en hastighet på 20 nm/h produceras 4-6 lameller inom 1-1,5 h.
Förflyttning av hela gallret eller de grovfrästa lamellerna >300 nm kommer att resultera i dålig eller misslyckad korrelation (se även begränsningar som diskuteras nedan). Den bör därför kontrolleras regelbundet, t.ex. genom att jämföra IB-bilder före, under och efter FIB-fräsning. Platser som visar betydande rörelse (>300 nm) bör kasseras. Optimera provberedningen (dvs. val av rutnätstyp, celldensitet och dykparametrar; se protokollavsnitt 1) och frässtrategi för att undvika dessa rörelser. Lamellböjning kan minskas avsevärt genom platsvis fräsning enligt beskrivningen i steg 3.6 och genom att minska lamellbredden. Som tidigare nämnts, även om spänningsavlastningsskärningar15 har utformats för att minska lamellböjning, resulterar de ofta i en samordnad rörelse av den frikopplade lamellen, vilket effektivt förhindrar korrelation. Integrerade FLM-system kan användas för att lösa detta problem.
2. Modifieringar och problem med metoden
Det rekommenderas starkt att utföra en grundlig karakterisering av provet i levande cellavbildning innan du går till kryoförhållanden. Att optimera cellproverna, behandlingsscheman och veta vilken typ av signal man kan förvänta sig innan man går in i kryoarbetsflödet kan avsevärt förbättra dess framgångsfrekvens.
I arbetsflödet som presenteras här används ett fristående fluorescensmikroskop med ett kryosteg för att avbilda proverna, följt av en överföring av rutnäten till det fokuserade jonstrålemikroskopet. Det har dock testats på system där ett fluorescensmikroskop är integrerat i FIB-SEM-kammaren, och därför krävs ingen provöverföring för att ta fluorescensbilder 29,30,31. Med hjälp av sådana integrerade system kan intressanta positioner avbildas under och efter FIB-fräsning för att kontrollera närvaron av målfluorescenssignalen utan att öka risken för kontaminering av de slutliga lamellerna. Det är dock viktigt att komma ihåg de optiska parametrarna för de använda mikroskopen, eftersom t.ex. ett lågt NA-objektiv kommer att begränsa precisionen med vilken fiduciella pärlor och målsignaler kan lokaliseras. Icke desto mindre kommer integrerade FLM-inställningar att hjälpa till att bättre hantera små deformationer av galler och lameller, eftersom FLM-stackar kontinuerligt kan uppdateras och jämföras med uppdaterade SEM- och IB-vyer.
Som ett alternativ till fluorescensavbildning av lamellerna mellan FIB-fräsning och TEM-datainsamling kan post-TEM-korrelation användas för att verifiera korrekt placering och fräsning av lamellerna 5,6.
Under alla steg i det korrelativa arbetsflödet, men särskilt under TEM, rekommenderas att du skapar en överlagring av projicerade fluorescensdata på FIB-SEM/TEM-bilderna. Sådana klassiska CLEM-vyer hjälper till att mer intuitivt förstå vilken del av cellerna som finns i lamellerna. Detta fungerar också som en användbar rimlighetskontroll för att verifiera korrelationens noggrannhet.
3. Metodens begränsningar
Den 3D-korrelativa FIB-metoden kräver prover som kan förses med fiduciella pärlor. Följaktligen är denna metod för närvarande begränsad till dykfrysta galler. För högtrycksfrysta (HPF) vävnadsprover, för närvarande, kan endast 2D-2D-korrelationer utföras. Potentiellt kan interna fiduciella markörer (t.ex. organeller, färgade lipiddroppar) vara en lösning på detta problem32,33. Den slutliga korrelationsframgångsfrekvensen beror på många faktorer, inklusive provkvaliteten, fluorescensmikroskopiinställningen, lamelltjockleken och storleken på den riktade strukturen. Korrelationsnoggrannheten med den beskrivna 3D-registreringsmetoden uppskattas till intervallet 200-300 nm på den slutliga IB-bilden, vilket ungefär motsvarar den typiska tjockleken på FIB-frästa lameller7. Följaktligen kommer cellulära strukturer som är mycket mindre än detta att vara svåra att rikta in sig på för närvarande. Dessutom minskar överdriven rörelse vid fräsplatsen (>300 nm) också noggrannheten i korrelationen, ett problem som potentiellt kan åtgärdas med FLM-inställningar integrerade i FIB/SEM-instrument. Lameller som uppvisar stark deformation eller böjning under fräsning bör i vilket fall som helst uteslutas från arbetsflödet nedströms.
Sammantaget är kryofluorescensavbildning för närvarande begränsad av Abbe-diffraktionskriteriet. Med mer rutinmässig tillämpning (och kommersialisering) av superupplösta kryo-FLM-metoder kan mer exakt inriktning av cellulära strukturer bli möjlig, särskilt när den integreras i FIB/SEM för drift i farten.
4. Metodens betydelse
Speciellt i jämförelse med icke-mål- och postkorrelationstekniker gör den 3D-korrelerade FIB-fräsningsmetoden det möjligt att välja lämpliga positioner före det tids- och resurskrävande TEM-steget. Det möjliggör därmed effektivare datainsamling och projektplanering. Dessutom lägger korrelerade fluorescensdata till ett lager av information som kan vara avgörande för att tolka tomogrammen och för att integrera kryo-ET-resultaten i flerskaliga projekt, särskilt när det handlar om icke-strukturerade proteinsammansättningar eller de som är för små för mallmatchning och subtomogrammedelvärde.
5. Betydelse och potentiella framtida tillämpningar
I kombination med avancerade arbetsflöden som kryolyft ur HPF-prover 34,35, kryo-FIB-SEM-volym 36 och superupplöst fluorescensavbildning26,37,38,39, erbjuder 3D-riktad lamellberedning möjligheten att inte bara dissekera biologiska processer i isolerade celler utan också att göra vävnads- och patientprover tillgängliga för FIB-fräsning och kryoelektrontomografi. Som sådan kommer det att möjliggöra dissektion av patologiska processer med hög upplösning och därmed vara en integrerad byggsten mot en biopsi på nanoskala.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Inga Wolf för stöd till IT-infrastrukturen, Florian Beck för beräkningsstöd och Oda H. Schiøtz för den kritiska läsningen av manuskriptet. Finansieringen tillhandahölls delvis genom ett Alexander von Humboldt-återvändarstipendium till Philipp S. Erdmann och ett EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 till Florian Wilfling. Anna Bieber fick stöd av ett Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
| C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
| Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
| Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
| EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
| Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
| FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
| FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
| K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
| Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
| Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
| Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
| THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
| Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |
References
- Beck, M., Baumeister, W. Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).
- Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).
- Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
- Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells. Methods in Cell Biology. 162, Elsevier Inc. 273-302 (2021).
- Klein, S., et al. Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies. Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).
- Arnold, J., et al. Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
- Wilfling, F., et al. A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits. Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).
- Scientific volume imaging, Nyquist calculator. , Available from: https://svi.nl/NyquistCalculator (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Huygens Professional version 19.04. , Scientific Volume Imaging. The Netherlands. Available from: http://svi.nl (2021).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Arnold, J. 3DCT. , Available from: https://3dct.semper.space/ (2021).
- Klumpe, S., et al. A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows. bioRxiv. , 444745 (2021).
- Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 0-3 (2019).
- Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
- Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. bioRxiv. , 963033 (2020).
- Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, e52286 (2020).
- Fung, H. K. H. tools3dct. , Available from: https://github.com/hermankhfung/tools3dct (2021).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- Bäuerlein, F. J. B., et al. In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions. Cell. 171 (1), 179-187 (2017).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kaufmann, R., et al. Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions. Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).
- Booy, F. P., Pawley, J. B. Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature. Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).
- Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-Learning denoising from single noisy images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).
- Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. eLife. 8, 1-15 (2019).
- Delmic METEOR. , Available from: https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor (2021).
- T. F. Scientific. iFLM. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf (2021).
- Mahamid, J., et al. Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).
- Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging. iScience. 24 (7), 102714 (2021).
- Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).
- Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
- Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
- Liu, B., et al. Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context. Scientific Reports. 5, 13017 (2015).
- Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision. SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).
- Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
