Summary
野生 卡诺菌线虫 与许多微生物有关，通常在肠腔内或感染肠道。该协议详细介绍了一种利用dauer角质层的抗性来丰富无法培养的微生物定植于肠道的方法。
Abstract
秀丽隐杆线虫 （C. elegans）已被证明是研究宿主 - 微生物相互作用和微生物组的极好模型，特别是在肠道的背景下。最近，野生 Caenorhabditis 线虫的生态采样发现了各种各样的相关微生物，包括细菌，病毒，真菌和微孢子虫。这些微生物中有许多具有有趣的定植或感染表型，值得进一步研究，但它们通常是不可培养的。该协议提出了一种方法来丰富 秀丽隐杆线虫 和相关线虫中所需的肠道微生物，并减少粘附在角质层上的许多污染微生物的存在。该协议涉及迫使动物进入发育阶段，并使用一系列抗生素和洗涤剂洗涤剂来去除外部污染。由于dauer动物具有保护线虫免受恶劣环境条件的生理变化，因此任何肠道微生物都将受到保护，免受这些条件的影响。但是，为了使富集起作用，当动物发育成dauers时，必须保持感兴趣的微生物。当动物离开dauer阶段时，它们被单独繁殖成单独的线。然后选择F1 群体以寻找所需的微生物或感染表型，并防止可见污染。这些方法将使研究人员能够富集肠腔中无法培养的微生物，这些微生物构成了 秀丽隐杆线虫 和细胞内肠道病原体的天然微生物组的一部分。然后可以研究这些微生物的定植或感染表型及其对宿主适应性的影响。
Introduction
秀 丽隐杆线虫 的遗传模式生物是研究宿主-微生物相互作用的极好的 体内 系统1，2。与其他动物相比，它们具有相对简单的生理学，但是，它们的大部分细胞生物学与哺乳动物基本相似，使其成为生物学研究的良好模型1，3，4。此外，它们是微观的，易于维护，并且在其较短的使用寿命内保持透明。这些特性能够快速研究控制宿主-微生物相互作用的机制，并可视化 体内 感染和遗传柔韧宿主的定植5，6。最后， 秀丽隐杆线虫 对细菌，真菌和病毒感染迅速做出反应，使其成为研究宿主 - 微生物相互作用和肠道微生物组的极好模型7，8，9。
野生秀丽隐杆线虫和其他线虫的采样增加，使得能够研究自由生活线虫的生态学和自然遗传变异10，11。同时，采样还增加了与秀丽隐杆线虫相互作用的天然存在的生物病原体和微生物的发现12，13，14，15，导致建立了许多研究与病毒，细菌，微孢子虫，卵菌或真菌相互作用的宿主 - 微生物模型系统16，17，18，19，20.通常，野生秀丽隐杆线虫存在于腐烂的茎和果实中，通常在温带气候中，并且大多数情况下它们是自我繁殖的21。当这些样本被带入实验室时，野生线虫被分离到克隆种群中，携带一系列相关的微生物群。当发现对线虫Caenorhabditis感兴趣的新微生物时，通常使用易于可视化的表型通过显微镜直接筛查动物的感染或定植。例如，病毒感染可以被可视化为肠道结构的崩解，微孢子虫阶段可以在宿主细胞内以孢子或meronts14，22的形式看到。当发现感兴趣的微生物以供将来研究时，必须将其与野生线虫中发现的其他污染微生物分开，以便可以单独研究。在许多情况下，感兴趣的微生物不能在体外培养，因此必须富集宿主线虫中的微生物。
例如，该协议描述了一种野生 分离的热带衣原体 ，其中含有一种细菌，该细菌定植于线虫的肠腔内，以定向方式粘附在肠上皮细胞上。从表型上讲，细菌沿着肠腔的内侧垂直生长，使其具有鬃毛状的外观，在动物的所有阶段（包括dauer阶段）的标准Normarski显微镜上可见。生长这种野生 热带C. tropicalis 菌株的线虫生长培养基（NGM）板含有与其他微生物的可见污染。该协议旨在减少用于研究这种未知粘附细菌的板上额外的污染微生物生长。线虫被迫进入dauer阶段以保护管腔中的细菌，然后使用一系列洗涤剂进行清洁。之后，通过解剖肠道和PCR扩增16S核糖体DNA进行测序来鉴定未知细菌种类。
总体而言，该协议可以潜在地丰富与野生捕获的线虫相关的任何感兴趣的微生物。之后，研究人员将识别目标微生物，通过显微镜观察体内感染或定植表型，并研究对宿主适应性或宿主 - 微生物相互作用的其他方面的影响。分离和研究与线虫Caenorhabditis线虫相互作用的新型微生物物种可以揭示宿主免疫的遗传机制以及与微生物发病机制和微生物组研究相关的宿主 - 微生物相互作用的新范式。
Protocol
1. 诱导NGM板上野生线虫的dauer形成
- 在获得具有不可培养的感兴趣的微生物的蠕虫后，以OP50-1大肠杆菌为食物来源的标准NGM板上培养野生Caenorhabditis菌株。将线虫在20°C孵育。
注意：生长 线虫Caenorhabditis 的标准温度在15-25°C之间，但应根据经验确定，以防止感兴趣的微生物的损失。 - 将动物板在20°C下饿死4-5天，直到所有OP50-1都被消耗掉，并且大多数已经达到dauer阶段。
注意：Dauers是长寿的幼虫，由于缺乏营养而发育，并具有保护性角质层。
2. 清洗线虫
- 将5 mL M9微盐培养基（42 mM Na2HPO4，22 mM KH2PO4，8.6 mM NaCl，19 mM NH4Cl）加入6cm饥饿蠕虫板中。
- 使用无菌玻璃移液器和灯泡，从板中移出M9和蠕虫，并将其转移到无菌的15 mL离心管中。
- 使用临床离心机，在室温下以1000× g 旋转管中的蠕虫30秒。
- 使用无菌的15 mL移液器，除去并丢弃蠕虫颗粒上方的M9上清液。不要通过在蠕虫上方留下约50μLM9来干扰管底部的活蠕虫。
- 将10毫升M9 + 0.05%的Triton X-100加入同一离心管中，并充分拧紧试管的盖子。
- 在室温下将管子在螺母上孵育20分钟以除去外部微生物。从螺母器中取出管子，以1000 x g 的速度旋转蠕虫30秒。
- 使用无菌移液器，取出并丢弃蠕虫沉淀上方的M9上清液。不要通过在蠕虫上方留下约50μLM9来干扰管底部的活蠕虫。
- 按照步骤 2.5-2.8 再重复三次。
3. 线虫消毒
- 通过加入0.25%SDS（250μL10%SDS），50μg/ mL羧苄青素，25μg/ mL卡那霉素，12.5μg/ mL四环素，100μg/ mL庆大霉素，50μg/ mL链霉素，37.5μg/ mL氯霉素和200μg/ mL头孢噻肟，在10mL M9缓冲液中制备抗生素和SDS溶液（见 材料表）。
- 将含有线虫的管子在抗生素和SDS溶液中孵育在室温下在螺母上过夜。
注意：所有非dauer蠕虫和胚胎都会死亡，但许多dauer蠕虫将在此清洁过程中存活下来。
4. 去除抗生素和SDS溶液
- 在室温下以1000 x g 旋转管中的蠕虫1分钟。使用无菌移液器，从离心管中取出上清液，而不会干扰离心管底部的蠕虫。
- 加入 10 mL M9 + 0.05% Triton X-100，并充分拧紧管盖。在室温下将管在螺母器上孵育20分钟。
- 从螺母器中取出管子，以1000 x g 旋转蠕虫1分钟。按照步骤 4.2-4.3 重复三次。
- 最后一次洗涤后，将蠕虫沉淀在100μL溶液的底部不受干扰，并丢弃其余部分。
5. 繁殖干净的线虫菌株
- 使用无菌玻璃移液器，将100μL上清液和沉淀转移到用OP50-1接种的10cm NGM板的中心。让板干燥，而不会干扰中心的液体。
- 让dauers爬出中心并通过OP50-1草坪5-10分钟。
- 小心地拿起一个dauer，然后将其装在6厘米的NGM种子盘上。总共，至少挑选10个dauers，并将它们装在单独的6厘米NGM板中，用OP50-1播种（总共10个板）。
- 将板在20°C下孵育4-5天，直到dauers生长并且下一代（F1）达到成虫阶段。目视检查所有板上的污染，被视为非OP50-1微生物生长。
- 对于每个干净的板， 通过 Normarski或荧光显微镜验证目标微生物的传播，例如荧光 原位 杂交（FISH）12，具体取决于感兴趣的表型。
6. 微生物种类的肠道解剖和PCR鉴定
- 在20°C下培养动物3-4天，使它们挨饿并减少OP50-1细菌的数量。将5 mL M9培养基加入饥饿蠕虫的板中。
- 使用无菌玻璃移液器和灯泡，从板中移取M9 +蠕虫，并将其转移到无菌的15 mL离心管中。
- 使用临床离心机，在室温下以1000× g 旋转管中的蠕虫30秒。
- 使用无菌的15 mL移液管，从离心管中取出上清液，而不会干扰管底部的活虫。
- 加入10 mL M9 + 0.05%Triton X-100，并将试管在螺母上孵育20分钟以除去外部微生物。重复四次以清洗蠕虫。
- 在最后一次洗涤后，使用无菌移液器尖端，在100μL溶液中除去上清液而不干扰底部的沉淀。
- 使用无菌移液器吸头，将M9和蠕虫转移到未播种的NGM板中，让板干燥，而蠕虫四处爬行20分钟，以帮助从角质层和肠道中去除OP50-1。
- 将250μLM9加入干燥的板中，并使用玻璃移液器将M9 +蠕虫转移到新的未播种的NGM板中。同样，让盘子干燥，让蠕虫爬来爬去20分钟。
- 向板中加入250 μL M9，并将100 μL M9 +蠕虫转移到干净的手表玻璃杯中。
- 使用两根无菌的26 G注射器针头，用一根针将蠕虫压在下面，用另一根针头切断蠕虫，从而斩首线虫。斩首后，肠道（颗粒状）和性腺（透明）从体内自然出来。
- 通过用一根针按住肠并用另一根针切开它来切掉暴露的肠子。
注意：如果可能，请使用Normarski显微镜，FISH或免疫组织化学验证感兴趣的微生物是否仍然存在于被刺穿的肠道中23。 - 将单个解剖的肠转移到含有10μL无菌水的0.5mL PCR管中。重复至少5个含有来自不同动物的肠道的PCR管。
- 将PCR管在-80°C下冷冻至少5分钟。从冰箱中取出PCR管并解冻样品。
- 上下移液几次，将细菌从肠道中分离出来。
- 根据可疑的微生物类型，使用通用引物对对细菌、酵母或微孢子虫的小核糖体亚基的 DNA 序列进行 PCR。
注意：例如，使用通用细菌16S引物的样品方案如 表1所示。 - 使用基于过滤器的DNA清洁和浓缩试剂盒纯化扩增子（ 见材料表）并进行Sanger测序。
Representative Results
从法属圭亚那Nouragues森林的腐烂棕榈树果实中分离出野生C. tropicalis菌株（JU1848）（图1A）24。发现该菌株具有薄微生物，以定向方式定植于肠腔（图1B）。这种微生物很容易通过与菌株JU1848共培养转移到秀丽隐杆线虫菌株N2中，在那里它同样地定植于肠腔。
JU1848在接种了 大肠杆菌 OP50-1的标准NGM板上繁殖，连续几代导致可见的污染，被视为OP50-1草坪内外的各种深色粘液菌落（图2A）。一盘野生JU1848被饿死，迫使动物进入dauer并按照描述进行清洁。将清洁存活的单个dauer动物接种在接种OP50-1的单个6cm NGM板上，并在20°C下生长4天。 观察到多个F1 后代板没有可见的微生物污染（图2B）。经证实，F1 后代在肠腔中仍然含有粘附细菌（见下文）。
按照方案（步骤6.1-6.12）中所述，将干净的JU1848动物洗涤并斩首以分离肠块。 通过 Nomarski显微镜验证解剖肠腔中的粘附细菌（图3）。JU1848腔内的微生物被怀疑是细菌，因此解剖的肠被用作使用通用细菌16S引物，27F和1492R进行PCR的模板。从总共六个单独的解剖肠中， PCR产物通过 Sanger测序，干净的色谱仪显示所有六个序列都是相同的。根据这些序列，这种细菌被确定为α蛋白细菌类中的新物种，但不能被归类为已知的目或属（补充文件1）。
图1：附着细菌在野生 热带C. （A）法属圭亚那Nouragues森林中腐烂的 Euterpe sp. （家族：Arecaceae）棕榈树果实的现场样本图像。（B）菌株JU1848的Nomarski图像，看到数千个长而薄的细菌在宿主肠（lu）的管腔（lu）中形成刷状外观。涂覆在肠道上的细菌（ba）层用括号（[）表示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：在线虫清洁后污染微生物生长丢失。 （A）野生菌株JU1848在接种了 大肠杆菌 OP50-1细菌的标准6 cm NGM板上传播明显的微生物生长。（B）清洁后，来自单个dauer的F1后代的一板在20°C下孵育4天后没有可见的微生物污染 。
图3：在解剖的肠腔中可以看到粘附细菌。 Nomarski图像，一只干净的JU1848动物被斩首，使肠道溢出。定植细菌（ba）用括号（[）表示，并且可见于线虫体（nb）外的肠（内）的腔（lu）。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 试剂 | 浓度 | 量 |
| 27F 底漆 （5'-阿加格特加特加特卡格-3'） | 20 毫米 | 2.5 μL |
| 1492R 底漆 （5'-GGTTACCTTGCGACTT-3'） | 20 毫米 | 2.5 μL |
| 在水中解剖肠道 | 不适用 | 3 μL |
| 10x PCR 缓冲液 | 10 倍 | 5 μL |
| 断续器 | 10 毫米 | 1 μL |
| Taq 聚合酶 | 5 U/μL | 0.5 μL |
| 水 | 不适用 | 35.5 μL |
表1：使用通用细菌引物和解剖肠的PCR实验方案样本。
补充文件 1：来自 6 个解剖的 JU1848 肠的 PCR 衍生的细菌 16S rDNA 序列的肌肉排列。请单击此处下载此文件。
Discussion
该协议描述了使用一系列清洁程序从野生分离的 Caenorhabditis 线虫中分离和鉴定微生物。许多微生物与野生分离的线虫有关，其中一些具有令人兴奋的表型，可用于未来研究宿主 - 微生物相互作用和先天免疫。许多可培养的微生物组和致病细菌已使用体外细菌生长的标准技术从野生 Caenorhabditis 线虫 中 分离出来25，26。然而，并非所有微生物都可以 在体外培养， 因此有必要在野生线虫中富集它们。一些微生物具有抗性孢子阶段，例如微孢子虫，高浓度的SDS可用于杀死大多数细菌和真菌，从而允许孢子的特定富集12。该协议提出了一种富集对SDS和抗生素治疗没有耐药性的不可培养的肠道微生物的方法。
这里介绍的技术利用了由于生理变化而在dauer动物中看到的环境抵抗力，例如角质层的加强，抑制咽部泵动以及用颊塞覆盖口腔27。该协议的关键步骤是用各种抗生素和0.25%SDS孵育过夜。这一步用于杀死所有外部微生物，同时保持内部微生物完好无损。虽然 秀丽隐杆线虫 已被证明可以在SDS浓度高达10%的情况下存活30分钟27，但该协议使用适度但长时间的孵育，不仅可以杀死微生物，还可以进一步将细菌暴露于抗生素中。此外，中等浓度的SDS可以帮助确保来自其他 Caenorhabditis 物种的dauers存活，因为 C. tropicalis 暴露于1%SDS过夜导致所有dauer动物死亡。如果所有Dauers都死亡，则应减少SDS的浓度和/或暴露于SDS的长度。相反，如果F1 生成板在清洁后仍然有可见的污染物，则应增加SDS浓度和孵育时间。
另一个关键步骤是在清洁后隔离单个dauer动物。这一步至关重要，因为并非所有动物在SDS和抗生素治疗后都是干净的。因此，将动物放置在带有OP50-1的10厘米NGM板的中心，并允许径向外爬行。通常最好选择更多的远端动物，因为通过OP50-1的长时间爬行似乎有助于去除附着在角质层上的任何潜在的存活微生物。然而，这导致了方案的限制，因为如果感兴趣的微生物没有以高频率存在于人群中，那么富集它将更具挑战性。在这里，粘附的α蛋白细菌存在于90%-95%的人口中;因此，大多数干净的板都有微生物组细菌。然而，如果感兴趣的微生物在人群中以低得多的频率存在，则可能需要筛选更多的F1 板。
该协议可能用于分离在野生线虫中发现的任何数量的不可培养的微生物。然而，微生物必须位于由dauer角质层保护的组织中，能够在dauer动物中存活，并且在宿主中具有可观察的表型。因此，除了这里描述的α蛋白细菌物种之外，该技术可用于富集肠腔中的其他微生物组细菌，包括不粘附的细菌。此外，该协议还用于富集兼性细胞内细菌Bordetella atropi，其感染线虫Oscheius tipulae28。富集后，发现B. atropi在NGM板上形成菌落，表明一旦去除生长较快的污染物，可能会发现感兴趣的微生物在体外培养。这种技术可能适用于微种人和病毒，包括奥赛病毒，因为这种能力可以丰富细胞内细菌。然而，这些微生物必须能够在进出道尔的过渡中幸存下来。
重要的是要记住，虽然该协议可以在生物安全1级实验室中进行，但必须始终保持无菌技术，以防止进一步的微生物污染。可以根据研究人员的需求更改方案，包括抗生素的类型/浓度，SDS的百分比和/或添加抗真菌药，如制霉菌素。通常，在野生分离线虫中发现的污染微生物的数量可能会有很大差异。在这里，NGM平板上非OP50-1 大肠杆菌 生长的明显损失被用作清洁线虫菌株的读数。但是，可能存在不可培养的污染微生物群体，因此必须进行宏基因组学方法，例如16S rRNA扩增子测序，以查看污染程度26。一旦蠕虫菌株被清除，就可以将其冷冻并储存起来以备将来研究。总体而言，该协议允许研究人员在野生线虫中丰富不可培养的微生物，使他们能够研究对宿主适应性的影响，表征定植或感染的表型，并利用遗传工具来了解宿主 - 微生物相互作用的机制。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
感谢Christian Braendle博士和国家科学研究中心（CNRS）Nouragues Field Station。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| 10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
| BD PrecisionGlide Needle - 26 G | Fisher Scientific | 305115 | |
| Carbenicillin | Millipore-Sigma | C1389-1G | |
| Cefotaxime | Millipore-Sigma | C7039-500mg | |
| Chloramphenicol | Millipore-Sigma | C0378-25G | |
| DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | 11-303C | |
| DreamTaq Polymerase | Fisher Scientific | EP0711 | |
| Gentamycin | Millipore-Sigma | G1264-250mg | |
| Kanamycin | Millipore-Sigma | K1876-1G | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
| Streptomycin | Millipore-Sigma | S6501-50G | |
| Tetracyclin | Millipore-Sigma | T7660-5G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
| Watch glasses | VWR | 470144-850 |
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