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Immunology and Infection

आंतों माइक्रोबायोम बैक्टीरिया के लिए समृद्ध करने के लिए जंगली Caenorhabditis नेमाटोड की चयनात्मक सफाई

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62937
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure

Summary

जंगली केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड कई रोगाणुओं से जुड़े होते हैं, अक्सर आंत लुमेन में या आंत को संक्रमित करते हैं। यह प्रोटोकॉल आंत को उपनिवेशित करने वाले अपरिवर्तनीय रोगाणुओं को समृद्ध करने के लिए एक विधि का विवरण देता है, जो डाउर छल्ली के प्रतिरोध का लाभ उठाता है।

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन और माइक्रोबायोम का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल साबित हुआ है, विशेष रूप से आंतों के संदर्भ में। हाल ही में, जंगली केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड के पारिस्थितिक नमूने ने बैक्टीरिया, वायरस, कवक और माइक्रोस्पोरिडिया सहित संबंधित रोगाणुओं की एक विविध सरणी की खोज की है। इनमें से कई रोगाणुओं में दिलचस्प उपनिवेशीकरण या संक्रमण फेनोटाइप होते हैं जो आगे के अध्ययन की गारंटी देते हैं, लेकिन वे अक्सर अपरिवर्तनीय होते हैं। यह प्रोटोकॉल C. elegans और संबंधित नेमाटोड में वांछित आंतों के रोगाणुओं को समृद्ध करने और छल्ली का पालन करने वाले कई दूषित रोगाणुओं की उपस्थिति को कम करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में जानवरों को विकास के डाउर चरण में मजबूर करना और बाहरी संदूषण को हटाने के लिए एंटीबायोटिक और डिटर्जेंट वॉश की एक श्रृंखला का उपयोग करना शामिल है। जैसा कि डाउर जानवरों में शारीरिक परिवर्तन होते हैं जो नेमाटोड को कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों से बचाते हैं, किसी भी आंतों के रोगाणुओं को इन स्थितियों से संरक्षित किया जाएगा। लेकिन, काम करने के लिए संवर्धन के लिए, ब्याज के माइक्रोब को बनाए रखा जाना चाहिए जब जानवर डाउर में विकसित होते हैं। जब जानवर डाउर चरण छोड़देते हैं, तो उन्हें अकेले ही व्यक्तिगत लाइनों में प्रचारित किया जाता है। F1 आबादी को तब वांछित रोगाणुओं या संक्रमण फेनोटाइप के लिए और दृश्यमान संदूषण के खिलाफ चुना जाता है। ये तरीके शोधकर्ताओं को आंतों के लुमेन में अपरिवर्तनीय रोगाणुओं को समृद्ध करने की अनुमति देंगे, जो सी एलिगन्स और इंट्रासेल्युलर आंतों के रोगजनकों के प्राकृतिक माइक्रोबायोम का हिस्सा बनाते हैं। इन रोगाणुओं को तब उपनिवेशीकरण या संक्रमण फेनोटाइप और मेजबान फिटनेस पर उनके प्रभावों के लिए अध्ययन किया जा सकता है।

Introduction

आनुवांशिक मॉडल जीव C. elegans मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन 1,2 का अध्ययन करने के लिए विवो सिस्टम में एक उत्कृष्ट है। उनके पास अन्य जानवरों की तुलना में अपेक्षाकृत सरल शरीर विज्ञान है, फिर भी, उनके अधिकांश सेल जीव विज्ञान मूल रूप से स्तनधारियों के समान हैं जो उन्हें जैविक अनुसंधान 1,3,4 के लिए एक अच्छा मॉडल बनाते हैं। इसके अतिरिक्त, वे सूक्ष्म हैं, बनाए रखने में आसान हैं, और अपने छोटे जीवनकाल में पारदर्शी रहते हैं। ये गुण मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन को नियंत्रित करने वाले तंत्र में तेजी से अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं और विवो संक्रमण और आनुवंशिक रूप से लचीले मेजबानों के उपनिवेशीकरण के विज़ुअलाइज़ेशन को नियंत्रित करते हैं5,6। अंत में, C. elegans तेजी से बैक्टीरिया, फंगल और वायरल संक्रमणों का जवाब देते हैं, जिससे उन्हें मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन और आंत माइक्रोबायोम 7,8,9 का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाया जाता है।

जंगली सी एलिगन्स और अन्य नेमाटोड के नमूने में वृद्धि ने मुक्त रहने वाले नेमाटोड और प्राकृतिक आनुवंशिक भिन्नता 10,11 की पारिस्थितिकी में अनुसंधान के लिए अनुमति दी है। समवर्ती रूप से, नमूनाकरण ने स्वाभाविक रूप से होने वाले जैविक रोगजनकों और रोगाणुओं की खोज में भी वृद्धि की है जो C. elegans12,13,14,15 के साथ बातचीत करते हैं, जिससे कई मेजबान-माइक्रोब मॉडल सिस्टम की स्थापना होती है जो वायरस, बैक्टीरिया, माइक्रोस्पोरिडिया, ओमीसेट्स, या कवक 16,17,18,19,20 के साथ बातचीत का अध्ययन करते हैं। . आमतौर पर, जंगली सी एलिगन्स सड़ने वाले तनों और फलों में पाए जाते हैं, अक्सर अधिक समशीतोष्ण जलवायु में, और ज्यादातर वे आत्म-पुनरुत्पादक होते हैं21। जब इन नमूनों को प्रयोगशाला में लाया जाता है, तो जंगली नेमाटोड को क्लोनल आबादी में अलग किया जाता है, जिससे संबंधित माइक्रोबायोटा की एक सरणी होती है। केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड में रुचि के नए रोगाणुओं की खोज करते समय, जानवरों को अक्सर आसानी से विज़ुअलाइज़ किए गए फेनोटाइप का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण या उपनिवेशीकरण के लिए सीधे जांच की जाती है। उदाहरण के लिए, वायरल संक्रमण को आंतों की संरचनाओं के विघटन के रूप में देखा जा सकता है, और माइक्रोस्पोरिडियन चरणों को मेजबान कोशिकाओं के अंदर बीजाणुओं या मेरोंट्स 14,22 के रूप में देखा जा सकता है। जब भविष्य की जांच के लिए ब्याज के एक माइक्रोब की खोज की जाती है, तो इसे जंगली नेमाटोड में पाए जाने वाले अन्य दूषित रोगाणुओं से अलग किया जाना चाहिए ताकि इसे अलगाव में अध्ययन किया जा सके। कई मामलों में, ब्याज के माइक्रोब को विट्रो में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, जिससे मेजबान नेमाटोड में माइक्रोब को समृद्ध करना आवश्यक हो जाता है।

उदाहरण के लिए, यह प्रोटोकॉल सी उष्णकटिबंधीय के एक जंगली अलगाव का वर्णन करता है जिसमें एक जीवाणु होता है जो नेमाटोड के आंतों के लुमेन के भीतर उपनिवेश करता है, जो एक दिशात्मक तरीके से आंतों के उपकला कोशिकाओं का पालन करता है। फेनोटाइपिक रूप से, बैक्टीरिया आंतों के लुमेन के आंतरिक पक्षों के साथ लंबवत बढ़ता है, जिससे यह एक ब्रिस्टल जैसी उपस्थिति देता है, जिसे जानवर के सभी चरणों में एक मानक नोर्मर्स्की माइक्रोस्कोप पर कल्पना की जाती है, जिसमें डाउर चरण भी शामिल है। सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेट जिस पर यह जंगली सी उष्णकटिबंधीय तनाव उगाया गया था, अन्य रोगाणुओं के साथ दृश्यमान संदूषण शामिल था। इस प्रोटोकॉल को इस अज्ञात पालन बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए प्लेटों पर अतिरिक्त दूषित माइक्रोबियल विकास को कम करने के लिए विकसित किया गया था। नेमाटोड को लुमेन में बैक्टीरिया की रक्षा के लिए डाउर चरण में मजबूर किया गया था, और फिर धोने की एक श्रृंखला का उपयोग करके साफ किया गया था। इसके बाद, अज्ञात जीवाणु प्रजातियों की पहचान आंतों के विच्छेदन और अनुक्रमण के लिए 16 एस राइबोसोमल डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा की गई थी।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल संभावित रूप से जंगली-पकड़े गए नेमाटोड से जुड़े ब्याज के किसी भी माइक्रोब को समृद्ध कर सकता है। इसके बाद, शोधकर्ता लक्ष्य माइक्रोब की पहचान करेंगे, माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विवो संक्रमण या उपनिवेशीकरण फेनोटाइप में कल्पना करेंगे, और मेजबान फिटनेस या मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के अन्य पहलुओं पर प्रभावों का अध्ययन करेंगे। केनोरहाब्डिटिस नेमाटोड के साथ बातचीत करने वाली उपन्यास माइक्रोबियल प्रजातियों के अलगाव और जांच मेजबान प्रतिरक्षा के आनुवंशिक तंत्र और मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के उपन्यास प्रतिमानों को उजागर कर सकती है जो माइक्रोबियल रोगजनन और माइक्रोबायोम अध्ययनों के लिए प्रासंगिक है।

Protocol

1. एनजीएम प्लेटों पर जंगली नेमाटोड के लिए डाउर गठन को प्रेरित करना

  1. ब्याज के एक unculturable रोगाणु के साथ कीड़े प्राप्त करने के बाद एक खाद्य स्रोत के रूप में OP50-1 ई कोलाई के साथ मानक NGM प्लेटों पर जंगली Caenorhabditis तनाव बढ़ो। 20 डिग्री सेल्सियस पर नेमाटोड को इनक्यूबेट करें।
    नोट: Caenorhabditis सूत्रकृमि विकसित करने के लिए मानक तापमान 15-25 डिग्री सेल्सियस के बीच है, लेकिन ब्याज के रोगाणु के नुकसान को रोकने के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
  2. 4-5 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर जानवरों की प्लेट को भूखा रखें जब तक कि सभी OP50-1 का उपभोग नहीं किया जाता है और अधिकांश डाउर चरण तक पहुंच गए हैं।
    नोट: डाउर्स लंबे समय तक रहने वाले लार्वा हैं जो पोषण की अनुपस्थिति के कारण विकसित होते हैं और सुरक्षात्मक क्यूटिकल्स होते हैं।

2. नेमाटोड को धोना

  1. M9 न्यूनतम लवण मीडिया के 5 mL जोड़ें (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8.6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) भूखे कीड़े की एक 6 सेमी प्लेट के लिए।
  2. एक बाँझ ग्लास पिपेट और बल्ब का उपयोग करके, प्लेट से M9 और कीड़े को पिपेट करें और उन्हें एक बाँझ 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. एक नैदानिक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके, कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 1000 x g पर ट्यूब में कीड़े को नीचे स्पिन करें।
  4. एक बाँझ 15 mL पिपेट का उपयोग करके, निकालें और कीड़े के छर्रे के ऊपर M9 supernatant त्याग. कीड़े के ऊपर M9 के लगभग 50 μL छोड़कर ट्यूब के नीचे जीवित कीड़े परेशान मत करो.
  5. एक ही सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में M9 + ट्राइटन एक्स -100 का 0.05% का 10 mL जोड़ें और ट्यूब की टोपी को पर्याप्त रूप से कसें।
  6. बाहरी रोगाणुओं को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए एक nutator पर ट्यूब incubate। Nutator से ट्यूब निकालें और 30 s के लिए 1000 x g पर कीड़े नीचे स्पिन।
  7. एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके, निकालें और कीड़े के छर्रे के ऊपर M9 supernatant त्याग. कीड़े के ऊपर M9 के लगभग 50 μL छोड़कर ट्यूब के नीचे जीवित कीड़े परेशान मत करो.
  8. का पालन करें और तीन और बार चरणों 2.5-2.8 दोहराएँ।

3. नेमाटोड कीटाणुरहित

  1. 0.25% SDS (10% SDS का 250 μL), कार्बेनिसिलिन के 50 μg/mL, कानामाइसिन के 25 μg/mL, kanamycin के 25 μg/mL, टेट्रासाइक्लिन के 12.5 μg/mL, gentamycin के 100 μg/mL, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 50 μg/mL, 37.5 μg/mL, 37.5 μg/mL of chloramphenicol के 37.5 μg/mL को जोड़कर M9 बफर के 10 mL में एक एंटीबायोटिक और SDS समाधान तैयार करें।
  2. एंटीबायोटिक में नेमाटोड युक्त ट्यूब और रात भर कमरे के तापमान पर एक nutator पर SDS समाधान incubate.
    नोट: सभी गैर-डाउर कीड़े और भ्रूण मर जाएंगे, लेकिन डाउर कीड़े के कई इस सफाई प्रक्रिया से बच जाएंगे।

4. एंटीबायोटिक और एसडीएस समाधान को हटाने

  1. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1000 x g पर ट्यूब में कीड़े नीचे स्पिन। एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके, ट्यूब के नीचे कीड़े को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से supernatant को हटा दें।
  2. M9 + 0.05% Triton X-100 के 10 mL जोड़ें और पर्याप्त रूप से ट्यूब की टोपी कस। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए एक nutator पर ट्यूब incubate.
  3. Nutator से ट्यूब निकालें और 1 मिनट के लिए 1000 x g पर कीड़े नीचे स्पिन। का पालन करें और चरण4.2-4.3 तीन बार दोहराएँ।
  4. अंतिम धोने के बाद, समाधान के 100 μL में नीचे की ओर कीड़े की गोली को अबाधित छोड़ दें और बाकी को छोड़ दें।

5. एक साफ सूत्रकृमि तनाव प्रचार

  1. एक बाँझ ग्लास पिपेट का उपयोग करते हुए, supernatant के 100 μL और गोली को OP50-1 के साथ seeded 10 सेमी NGM प्लेट के केंद्र में स्थानांतरित करें। केंद्र में तरल को परेशान किए बिना प्लेट को सूखने दें।
  2. डाउर को केंद्र से बाहर और OP50-1 लॉन के माध्यम से 5-10 मिनट के लिए क्रॉल करने की अनुमति दें।
  3. ध्यान से एक एकल dauer उठाओ और यह एक 6 सेमी NGM बीज प्लेट पर प्लेट. कुल मिलाकर, कम से कम 10 डाउर चुनें और उन्हें व्यक्तिगत 6 सेमी एनजीएम प्लेटों में प्लेट करें जो OP50-1 (कुल 10 प्लेटें) के साथ सीडेड हैं।
  4. प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि डाउर विकसित नहीं हो जाते हैं और निम्नलिखित पीढ़ी (एफ 1) वयस्क चरण तक पहुंच गई है। नेत्रहीन सभी प्लेटों पर संदूषण के लिए जाँच करें, गैर-OP50-1 माइक्रोबियल विकास के रूप में देखा जाता है।
  5. प्रत्येक साफ प्लेट के लिए, Normarski या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ब्याज के माइक्रोब के प्रसार को सत्यापित करें, जैसे कि फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण (FISH)12, ब्याज के फेनोटाइप के आधार पर।

6. आंतों विच्छेदन और माइक्रोबियल प्रजातियों की पीसीआर पहचान

  1. 3-4 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर जानवरों को उगाएं ताकि उन्हें भूखा रहने और OP50-1 बैक्टीरिया की मात्रा को कम करने की अनुमति मिल सके। भूखे कीड़े की प्लेट में M9 मीडिया के 5 mL जोड़ें।
  2. एक बाँझ ग्लास पिपेट और बल्ब का उपयोग करके, प्लेट से M9 + कीड़े को पिपेट करें और उन्हें एक बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. एक नैदानिक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके, कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 1000 x g पर ट्यूब में कीड़े को नीचे स्पिन करें।
  4. एक बाँझ 15 एमएल पिपेट का उपयोग करके, ट्यूब के नीचे लाइव कीड़े को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से supernatant को हटा दें।
  5. M9 + 0.05% Triton X-100 के 10 mL जोड़ें और बाहरी रोगाणुओं को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए एक nutator पर ट्यूब incubate। कीड़े धोने के लिए चार बार दोहराएं।
  6. अंतिम धोने के बाद, एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके, समाधान के 100 μL में नीचे गोली को परेशान किए बिना supernatant को हटा दें।
  7. एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करते हुए, M9 और कीड़े को एक गैर-वरीयता प्राप्त NGM प्लेट में स्थानांतरित करें और प्लेट को सूखने दें, जबकि कीड़े छल्ली और आंत से OP50-1 को हटाने में मदद करने के लिए 20 मिनट के लिए चारों ओर क्रॉल करते हैं।
  8. सूखे प्लेट में M9 के 250 μL जोड़ें और एक ग्लास पिपेट का उपयोग करने के लिए एक नई गैर वरीयता प्राप्त NGM प्लेट के लिए M9 + कीड़े स्थानांतरित करने के लिए। फिर से, उस प्लेट को सूखने दें और कीड़े को 20 मिनट के लिए चारों ओर क्रॉल करने की अनुमति दें।
  9. प्लेट में M9 के 250 μL जोड़ें और एक साफ घड़ी ग्लास के लिए M9 + कीड़े के 100 μL हस्तांतरण।
  10. दो बाँझ 26 जी सिरिंज सुइयों का उपयोग करते हुए, एक सुई के साथ कीड़े को नीचे पकड़कर और कीड़े को काटने के लिए दूसरी सुई का उपयोग करके नेमाटोड को डीकैपिटेट करें। विच्छेदन के बाद, शरीर से आंत (दानेदार) और गोनाड (पारदर्शी) स्वाभाविक रूप से शरीर से बाहर आ जाएंगे।
  11. एक सुई से आंत को पकड़कर और दूसरे के साथ काट कर उजागर आंत का एक टुकड़ा काट लें।
    नोट: यदि संभव हो, तो सत्यापित करें कि ब्याज का माइक्रोब अभी भी Normarski माइक्रोस्कोपी, FISH, या immunohistochemistry23 का उपयोग करके एवर्टेड आंतों में मौजूद है।
  12. एक एकल विच्छेदित आंत को 0.5 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बाँझ पानी के 10 μL होते हैं। विभिन्न जानवरों से आंतों वाली कम से कम 5 पीसीआर ट्यूबों के लिए दोहराएं।
  13. पीसीआर ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 5 मिनट के लिए फ्रीज करें। फ्रीजर से पीसीआर ट्यूबों को हटा दें और नमूनों को पिघलाएं।
  14. आंत से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए कुछ बार तरल को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  15. बैक्टीरिया, खमीर, या माइक्रोस्पोरिडिया के छोटे राइबोसोमल सबयूनिट के डीएनए अनुक्रम के खिलाफ सार्वभौमिक प्राइमर जोड़े का उपयोग करके पीसीआर का संचालन करें, जो संदिग्ध प्रकार के माइक्रोब पर निर्भर करता है।
    नोट:: उदाहरण के लिए, यूनिवर्सल बैक्टीरियल 16S प्राइमरों का उपयोग कर एक नमूना प्रोटोकॉल तालिका 1 में प्रस्तुत किया गया है।
  16. एक फिल्टर-आधारित डीएनए सफाई और एकाग्रता किट का उपयोग करके एम्प्लीकॉन को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें) और सेंगर अनुक्रमण करें।

Representative Results

एक जंगली सी उष्णकटिबंधीय तनाव (JU1848) फ्रेंच गुयाना (चित्रा 1A) 24 के नौरागस वन में सड़े हुए ताड़ के पेड़ के फलों से अलग किया गया था। इस तनाव में पतले रोगाणु पाए गए जो आंत के लुमेन को दिशात्मक तरीके से उपनिवेशित करते हैं (चित्रा 1 बी)। इस माइक्रोब को आसानी से तनाव JU1848 के साथ सह-संस्कृति के माध्यम से C. elegans स्ट्रेन N2 में स्थानांतरित कर दिया गया था, जहां यह आंत के लुमेन को इसी तरह उपनिवेशित करता था।

कई पीढ़ियों में ई कोलाई OP50-1 के साथ सीड किए गए मानक एनजीएम प्लेटों पर JU1848 के प्रसार के परिणामस्वरूप लगातार दृश्यमान संदूषण होता है, जिसे OP50-1 लॉन (चित्रा 2A) पर और बंद विभिन्न अंधेरे, श्लेष्मा उपनिवेशों के रूप में देखा जाता है। जंगली JU1848 की एक प्लेट को जानवरों को डाउर में मजबूर करने के लिए भूखा रखा गया था और जैसा कि वर्णित किया गया था। एकल डाउर जानवर जो सफाई से बच गए थे, उन्हें अलग-अलग 6 सेमी एनजीएम प्लेटों पर चढ़ाया गया था, जिन्हें OP50-1 के साथ बीज दिया गया था और 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दी गई थी। F1 संतानों की एकाधिक प्लेटों को दृश्यमान माइक्रोबियल संदूषण (चित्रा 2B) के बिना देखा गया था। एफ 1 संतानों को अभी भी आंत के लुमेन में पालन करने वाले बैक्टीरिया को शामिल करने के लिए सत्यापित किया गया था (नीचे देखें)।

स्वच्छ JU1848 जानवरों को धोया गया था और आंतों के टुकड़ों को अलग करने के लिए सिर काट दिया गया था जैसा कि प्रोटोकॉल (चरण 6.1-6.12) में वर्णित है। विच्छेदित आंत के लुमेन में बैक्टीरिया का पालन नोमार्स्की माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) के माध्यम से सत्यापित किया गया था। JU1848 के लुमेन में माइक्रोब को एक जीवाणु होने का संदेह था, इसलिए विच्छेदित आंतों को सार्वभौमिक जीवाणु 16S प्राइमरों, 27F और 1492R का उपयोग करके पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया गया था। कुल छह अलग-अलग विच्छेदित आंतों से, पीसीआर उत्पादों को सेंगर के माध्यम से अनुक्रमित किया गया था, और साफ क्रोमैटोग्राफ से पता चला कि सभी छह अनुक्रम समान थे। इन अनुक्रमों के आधार पर, इस जीवाणु को वर्ग अल्फाप्रोटिओबैक्टीरिया में एक नई प्रजाति के रूप में पहचाना गया था, लेकिन इसे एक ज्ञात क्रम या जीनस (पूरक फ़ाइल 1) में वर्गीकृत नहीं किया जा सकता था।

Figure 1
चित्रा 1: एक जंगली C. tropicalis के लुमेन उपनिवेशीकरण बैक्टीरिया का पालन करना. (A) सड़े हुए यूटरपे एसपी की फील्ड नमूना छवि (परिवार: Arecaceae) फ्रांसीसी गुयाना के नौराग्यूस जंगल में ताड़ के पेड़ के फल। (बी) तनाव JU1848 की नोमार्स्की छवि हजारों लंबे, पतले बैक्टीरिया के साथ देखी जाती है जो मेजबान आंत (में) के लुमेन (लू) में ब्रश जैसी उपस्थिति बनाती है। आंत को कोटिंग करने वाली जीवाणु (बीए) परतों को कोष्ठक ([) के साथ इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: नेमाटोड की सफाई के बाद दूषित माइक्रोबियल विकास खो जाता है। (A) जंगली तनाव JU1848 मानक 6 सेमी NGM प्लेटों पर ध्यान देने योग्य माइक्रोबियल विकास का प्रचार करता है जो E. coli OP50-1 बैक्टीरिया के साथ बीज ति होता है। (बी) सफाई के बाद, एक एकल डाउर से F1 संतान की एक प्लेट 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 4 दिनों के बाद कोई दृश्यमान माइक्रोबियल संदूषण नहीं दिखाती है। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: चिपके हुए बैक्टीरिया को विच्छेदित आंत के लुमेन में देखा जाता है। एक साफ JU1848 जानवर की नोमार्स्की छवि जिसे नष्ट कर दिया गया था ताकि आंतें बाहर निकल जाएं। उपनिवेशीकरण बैक्टीरिया (बीए) को एक ब्रैकेट ([) के साथ इंगित किया जाता है और आंत के एक टुकड़े के लुमेन (लू) में देखा जाता है (में) जो नेमाटोड बॉडी (एनबी) के बाहर होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता राशि
27F प्राइमर (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 20 mM 2.5 μL
1492R प्राइमर (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 20 mM 2.5 μL
पानी में विच्छेदित आंत N/A 3 μL
10x पीसीआर बफर 10x 5 μL
dNTP 10 mM 1 μL
Taq Polymerase 5 U/μL 0.5 μL
पानी N/A 35.5 μL

तालिका 1: यूनिवर्सल बैक्टीरियल प्राइमरों और विच्छेदित आंत का उपयोग करके नमूना पीसीआर प्रोटोकॉल।

अनुपूरक फ़ाइल 1: छह विच्छेदित JU1848 आंतों के PCR से व्युत्पन्न जीवाणु 16S rDNA अनुक्रमों का MUSCLE संरेखण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल सफाई प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला का उपयोग करके जंगली-पृथक केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड से रोगाणुओं के अलगाव और पहचान का वर्णन करता है। कई रोगाणु जंगली-अलग-थलग नेमाटोड से जुड़े होते हैं, और उनमें से कुछ में रोमांचक फेनोटाइप होते हैं जिनका उपयोग मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन और जन्मजात प्रतिरक्षा में भविष्य के अध्ययन के लिए किया जा सकता है। कई कृषि योग्य माइक्रोबायोम और रोगजनक बैक्टीरिया को इन विट्रो बैक्टीरियल विकास 25,26 के लिए मानक तकनीकों का उपयोग करके जंगली केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड से अलग किया गया है। हालांकि, सभी रोगाणुओं को विट्रो में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, और उन्हें जंगली नेमाटोड में समृद्ध करना आवश्यक हो जाता है। कुछ रोगाणुओं में एक प्रतिरोधी बीजाणु चरण होता है, जैसे कि माइक्रोस्पोरिडिया, और एसडीएस की उच्च सांद्रता का उपयोग अधिकांश बैक्टीरिया और कवक को मारने के लिए किया जा सकता है, जिससे बीजाणुओं के विशिष्ट संवर्धन की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल अपरिवर्तनीय आंतों के रोगाणुओं को समृद्ध करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है जो एसडीएस और एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिरोधी नहीं हैं।

यहां प्रस्तुत तकनीक शारीरिक परिवर्तनों जैसे कि छल्ली को मजबूत करने, ग्रसनी पंपिंग को दबाने और मुंह को एक बुक्कल प्लग 27 के साथ कवर करने के कारण डाउर जानवरों में देखे गए पर्यावरणीय प्रतिरोध का लाभ उठाती है। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं और 0.25% एसडीएस के साथ रातोंरात इनक्यूबेशन है। इस चरण का उपयोग आंतरिक रोगाणुओं को बरकरार रखते हुए सभी बाहरी रोगाणुओं को मारने के लिए किया जाता है। जबकि C. elegans dauers को 30 min27 के लिए 10% पर उच्च के रूप में एसडीएस सांद्रता से बचने के लिए प्रदर्शित किया गया है, यह प्रोटोकॉल न केवल रोगाणुओं को मारने के लिए एक मध्यम लेकिन लंबे समय तक इनक्यूबेशन का उपयोग करता है, बल्कि बैक्टीरिया को एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उजागर करता है। इसके अलावा, एसडीएस की एक मध्यम एकाग्रता यह सुनिश्चित करने में मदद कर सकती है कि अन्य केनोरहाबडिटिस प्रजातियों के डाउर्स जीवित रहते हैं, क्योंकि सी. उष्णकटिबंधीय के एक्सपोजर के संपर्क में 1% एसडीएस रातोंरात सभी डाउर जानवरों की मृत्यु हो गई। यदि सभी डाउर मर जाते हैं, तो एसडीएस की एकाग्रता और / या एसडीएस के संपर्क की लंबाई को कम किया जाना चाहिए। इसके विपरीत, यदि F1 पीढ़ी की प्लेटों में अभी भी सफाई के बाद दिखाई देने वाला संदूषण है, तो SDS एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय बढ़ाया जाना चाहिए।

एक और महत्वपूर्ण कदम सफाई के बाद एकल डाउर जानवरों का अलगाव है। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि एसडीएस और एंटीबायोटिक उपचार के बाद सभी जानवर साफ नहीं हैं। इसलिए, जानवरों को OP50-1 के साथ 10 सेमी NGM प्लेट के केंद्र में रखा जाता है और रेडियल रूप से बाहर की ओर क्रॉल करने की अनुमति दी जाती है। अक्सर अधिक डिस्टल जानवरों को चुनना सबसे अच्छा होता है, क्योंकि OP50-1 के माध्यम से विस्तारित रेंगना छल्ली से जुड़े किसी भी संभावित जीवित रोगाणुओं को हटाने में मदद करने के लिए प्रकट होता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल की एक सीमा की ओर जाता है, क्योंकि यह ब्याज के एक माइक्रोब के लिए समृद्ध करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण होगा यदि यह उच्च आवृत्ति पर आबादी में मौजूद नहीं है। यहां, पालन करने वाला अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया आबादी के 90% -95% में मौजूद था; इसलिए, अधिकांश साफ प्लेटों में माइक्रोबायोम बैक्टीरिया था। हालांकि, यदि ब्याज का एक माइक्रोब आबादी में बहुत कम आवृत्ति पर मौजूद है, तो कई और एफ 1 प्लेटों को स्क्रीन करना आवश्यक हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग संभवतः जंगली नेमाटोड में पाए जाने वाले ब्याज के गैर-कृषि योग्य रोगाणुओं की किसी भी संख्या को अलग करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, माइक्रोब को डाउर छल्ली द्वारा संरक्षित ऊतक में होना चाहिए, जो डाउर जानवरों में जीवित रहने में सक्षम है, और मेजबान में एक अवलोकन योग्य फेनोटाइप है। इस प्रकार, इस तकनीक का उपयोग यहां वर्णित अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया प्रजातियों के अलावा आंतों के लुमेन में अन्य माइक्रोबायोम बैक्टीरिया को समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें बैक्टीरिया भी शामिल हैं जो पालन नहीं करते हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग एक संकाय इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया, बोर्डेटेला एट्रोपी के लिए समृद्ध करने के लिए किया गया था, जो नेमाटोड ओशेयस टिपुले 28 को संक्रमित करता है। संवर्धन के बाद, बी एट्रोपी को एनजीएम प्लेटों पर उपनिवेश बनाने के लिए पाया गया था, यह दिखाते हुए कि तेजी से बढ़ते संदूषकों को हटाने के बाद ब्याज के एक माइक्रोब को विट्रो में कृषि योग्य होने की खोज की जा सकती है। यह तकनीक संभवतः माइक्रोस्प्रेडियन और वायरस के लिए काम करेगी, जिसमें ओरसे वायरस भी शामिल है, एक इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को समृद्ध करने की इस क्षमता को देखते हुए। हालांकि, इन रोगाणुओं को डाउर के अंदर और बाहर संक्रमण से बचने में सक्षम होना चाहिए।

यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि जबकि इस प्रोटोकॉल को जैव सुरक्षा स्तर 1 प्रयोगशाला में किया जा सकता है, आगे माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए एक बाँझ तकनीक को बनाए रखा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल को शोधकर्ता की जरूरतों के अनुसार बदला जा सकता है, जिसमें एंटीबायोटिक दवाओं के प्रकार / सांद्रता, एसडीएस का प्रतिशत, और / या एनवाईस्टेटिन जैसे एंटिफंगल के अलावा शामिल हैं। अक्सर, जंगली-अलग सूत्रकृमि में पाए जाने वाले दूषित रोगाणुओं की संख्या नाटकीय रूप से भिन्न हो सकती है। यहां, एनजीएम प्लेटों पर गैर-OP50-1 ई कोलाई विकास के स्पष्ट नुकसान का उपयोग एक साफ सूत्रकृमि तनाव के लिए रीडआउट के रूप में किया गया था। लेकिन, दूषित रोगाणुओं की गैर-कृषि योग्य आबादी मौजूद हो सकती है, इसलिए संदूषण की सीमा को देखने के लिए 16 एस आरआरएनए एम्प्लिकॉन अनुक्रमण जैसे मेटाजीनोमिक्स विधि का संचालन करना आवश्यक है। एक बार जब कीड़े के तनाव को साफ कर दिया जाता है, तो इसे जमे हुए और भविष्य के अध्ययन के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को जंगली नेमाटोड में अपरिवर्तनीय रोगाणुओं को समृद्ध करने की अनुमति देता है, जिससे उन्हें मेजबान फिटनेस पर प्रभावों का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है, उपनिवेशीकरण या संक्रमण के फेनोटाइप को चिह्नित किया जाता है, और मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए आनुवंशिक उपकरणों का लाभ उठाते हैं।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

आप डॉ क्रिश्चियन Braendle और केंद्र Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues फील्ड स्टेशन के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP1356
10% SDS Invitrogen AM9822
BD PrecisionGlide Needle - 26 G Fisher Scientific 305115
Carbenicillin Millipore-Sigma C1389-1G
Cefotaxime Millipore-Sigma C7039-500mg
Chloramphenicol Millipore-Sigma C0378-25G
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research 11-303C
DreamTaq Polymerase Fisher Scientific EP0711
Gentamycin Millipore-Sigma G1264-250mg
Kanamycin Millipore-Sigma K1876-1G
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Streptomycin Millipore-Sigma S6501-50G
Tetracyclin Millipore-Sigma T7660-5G
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Watch glasses VWR 470144-850

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आंतों माइक्रोबायोम बैक्टीरिया के लिए समृद्ध करने के लिए जंगली <em>Caenorhabditis</em> नेमाटोड की चयनात्मक सफाई
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Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria. J. Vis. Exp. (174), e62937, doi:10.3791/62937 (2021).

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