Summary
乳腺上皮細胞と内皮細胞との間のクロストークは、乳癌の進行、腫瘍の増殖、転移に重要な貢献をする。本研究では、スフェロイドは、血管および/またはリンパ内皮細胞と共に乳癌細胞から作られ、乳癌研究のための インビトロ システムとしての適用性を実証した。
Abstract
乳癌は女性の死亡率の主な原因である。乳癌細胞の増殖とその後の転移は、その進行の重要な要因である。MCF-7細胞などの乳がん細胞の単培養を用いて乳癌の増殖促進に関与するメカニズムは鋭意的に研究されているが、腫瘍増殖に密接に関与している血管およびリンパ系内皮細胞などの他の細胞タイプの寄与は、深く調べられていない。細胞間相互作用は、腫瘍の成長と進行において重要な役割を果たす。腫瘍の成長にはネオアン血管新生(血管の発達)が不可欠であるのに対し、リンパ系は癌細胞の移動とその後の転移のポータルとして機能する。最近の研究は、血管およびリンパ系内皮細胞が癌細胞の増殖に大きな影響を与えることができるという証拠を提供する。これらの観察は、より現実的にin vivoで乳癌の成長過程を反映するインビトロモデルを開発する必要性を意味する。さらに、動物研究における制限は、関連するメカニズムをより良く解明するためにex vivoモデルの開発を必要とする。
本稿では、乳癌細胞(エストロゲン受容体陽性MCF-7細胞)と血管および/またはリンパ内皮細胞の両方で構成される乳癌スフェロイドの開発について説明する。このプロトコルは、吊り下げ(ゴールドスタンダードと安価)と96ウェルUボトムプレート(高価)の2つの異なるアプローチを使用してデュアルセルスフェロイドを作成する詳細なステップバイステップアプローチを記述しています。形成されたスフェロイドを繊細に拾い上げ、微視的なサイジングによって成長を監視し、死んだ細胞染色と生きた細胞染色を使用して生存率を評価する方法について詳しく説明します。さらに、スフェロイドの成長パターンを区別するために増殖特異的抗体で切り離し染色するためのスフェロイドを固定する手順が線引く。さらに、トランスフェクションされた細胞を用いてスフェロイドを調製するための詳細と、分子解析のためにRNAを抽出する方法が提供される。結論として、この記事では、乳がん研究のための多細胞スフェロイドを準備するための詳細な手順を提供します。
Introduction
実験のための動物の使用には限界があります。動物実験はヒトの疾患進行を正確に模倣することはできず、動物とヒトは病原体に対して同一の反応を示さない。さらに、動物の苦しみや倫理的問題に対する懸念による動物実験の制限1,2 研究プログラムをますます制約する。 In vitro 動物の使用を回避するためにシステムが広く開発されています。さらに、ヒト細胞の使用は、 in vitro 病態生理学的および治療的調査に関連するモデル。従来の単層(2D)細胞培養は、ある程度ヒト組織を模倣するため広く使用されている。しかし、2D単一培養は人間の器官を模倣することができず、2D単一培養は元の器官の複雑な微小環境を模倣し、模倣する in vivo 状況3,4,5,6.さらに、単層細胞培養では、薬物治療は容易にすべての細胞を破壊/損傷する可能性があります。重要なことに、これらの制限のいくつかは、多層三次元(3D)細胞培養に切り替えることによって克服することができる7,8.実際、3D培養モデルは、細胞の構造、レイアウト、および主要組織における細胞の機能をよりよく反映することが示されています。これらの3D培養は、機能的器官と同様に、様々な細胞株を用いて形成することができる。確かに、3D文化の2つのモデルがあります。1つのモデルは、クラスターを形成し、それらを球体(足場のないモデル)に再編成する集約された細胞の回転楕円体を生成します。第二は、より複雑な構造を有し、器官のミニチュア版と考えられている多臓器特異的細胞の組み合わせで構成されるオルガノイドを生み出す9,10.このため、3D培養システムは、多くの生物学的および臨床的用途を備えた革新的な技術を表しています。したがって、スフェロイドおよびオルガノイドは、再生医療、薬物スクリーニング、および毒物学的研究に関連する疾患モデリングおよび研究に多くの用途を有する6,11,12,13,14,15.3D技術から派生した発がん性スフェロイドは、関連する細胞タイプの形態と表現型を再現し、 in vivo 腫瘍の微小環境、および腫瘍の発達中に作動する細胞通信およびシグナル伝達経路をモデル化する16,17,18.さらに、がん生物学の理解を改善するために、腫瘍スフェロイド/オルガノイドは、潜在的な患者特異的な抗癌療法(個別化)を特定し、その有効性、毒性、および長期的な影響を評価するためにも使用できます。19,20,21,22.球体は、細胞および三次元組織アーキテクチャを維持する能力、模倣する能力のために病態生理学、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを調査する顕著な機会を開いた in vivo 状況、および細胞と細胞の相互作用。しかし、血管/全身性成分の欠如、機能性免疫または神経系などのこのシステムの限界を認識する必要があり、システムは動物モデルと比較して還元主義者のアプローチを表します。実際、動物モデルとは対照的に、3D構造は人体内の生物学の近似のみを提供します。3D法の限界を理解することは、研究者がより大きなスケールで臓器をよりよく表すスフェロイドを生成するためのより洗練された有効なプロセスを設計するのに役立つかもしれません23,24,25.
癌は世界的に主要な死因であり、乳癌は女性26、27、28の中で最も一般的な癌である。乳癌の複雑な微小環境を模倣するために、乳癌スフェロイドは、乳房腫瘍、すなわち上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および/または免疫細胞において顕著な役割を果たす細胞を用いて培養されるべきである。また、乳がんを表すスフェロイドについては、女性ホルモン受容体(エストロゲン/プロゲステロン受容体)の発現、患者腫瘍組織学的状態を保存する能力、および治療に対する応答を模倣する能力も考慮すべきである。研究は、3D共培養系が生体内の一次組織と同様の細胞組織を有し、刺激にリアルタイムで反応する能力を有し、機能的アンドロゲン受容体29、30、31、32を有することを示している。したがって、同様のアプローチは、インビトロで乳房腫瘍を模倣するのに役立つ可能性があります。現在のプロトコルの目的は、乳癌スフェロイドを生成する新しい方法を確立することです。この方法は、エストロゲン受容体陽性MCF-7細胞(上皮細胞の不滅のヒト細胞株)および血管内皮細胞(HUVEC)またはリンパ系内皮細胞(HMVEC-DNeo)を利用して、腫瘍内でこれらの細胞間の相互作用を模倣または密接に反映するモデルを作成する。MCF-7(エストロゲン応答性)および内皮細胞は、本研究においてスフェロイドの開発に用いられてきたが、胸腫瘍質量の約80%を占める線維芽細胞のような他の細胞も、将来的に組み合わせて乳房腫瘍をよりよく発現し、模倣することができる。
例えば、回転楕円体を形成するいくつかの方法があります: 1) 重力33,34を採用する吊り下げ液滴法。2)外部磁石35に曝露された磁気ナノ粒子を用いる磁気浮上法、及び3)低付着プレート36、37に細胞を播種して行うスフェロイドマイクロプレート法。1つの細胞タイプのみを使用する既存の方法に基づいて、本プロトコルは、生体内38、39、40、41における乳癌腫瘍の増殖条件をよりよく模倣するために上皮細胞および内皮細胞を用いて最適化されている。この方法は、低コストで、最小限の機器要件で実験室で簡単に達成することができます。ラボの必要性/目標に基づいて、異なるアプローチがスフェロイドを形成し、これらのスフェロイドから関連する細胞材料を得るために使用されました。この文脈では、DNA、RNA、またはタンパク質解析のために、3Dスフェロイドは、吊り下げドロップ法と内皮細胞と上皮細胞を共培養することによって産生される。しかし、機能研究のために、例えば、短い干渉(siRNA)トランスフェクションおよび/またはホルモン処理後の細胞増殖を監視するために、スフェロイドはU-底板を用いて生成される。
この技術プロトコルの目的は、1)乳癌多細胞型スフェロイドを形成するための詳細なステップバイステップの説明を提供することです, 2) 組織染色のためのサンプルを調製, および 3) RNA, DNA, タンパク質の抽出のための細胞のコレクション.安価な吊り下げ方法と、より高価なU-底板の両方が、スフェロイドを形成するために使用されます。ここでは、細胞増殖、アポトーシス、および上皮細胞および内皮細胞の分布をスフェロイド内で評価するマーカーによる切除とその後の免疫染色のためのスフェロイドを調製(固定)するためのプロトコルが提供される。さらに、このプロトコルは ImageJ ソフトウェアを使用して、組織学的データの完全な段階ごとの分析を示しています。生物学的データの解釈は、実験の種類や使用する抗体によって異なります。固定スフェロイドの切除とセクションのその後の染色は、ルーチン病理実験室(ソフィストラボ:info@sophistolab.ch)
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Protocol
1. 細胞培養
注:無菌条件下での細胞処理を行います。
- ヒトアンビリカル静脈内皮細胞(HUVEC)サブカルチャー
- 75cm2 フラスコにコラーゲン(5μg/cm2)(ラットテール)を室温(RT)または37°Cで2〜3時間、水で洗い流し、フラスコを乾燥させます。
- 成長培地でHUVECを成長させる (EBM-2, 内皮基底培地-2) グルタミン (1x = 2 mM), 抗生物質抗ミキ酸溶液 (AA; ストレプトマイシン100 μg/mL、ペニシリン100 μg/mL、アンホテリシンBの0.025 μg/mL、LSGS(2%v/v FCS、ヒドロコルチゾン1 μg/mL、ヒト表皮成長因子10ng/mL、 10 μg/mLのヘパリン)および10%FCS(胎児子牛血清)を標準的な組織培養条件下(37°C、5%CO2)下で実施した。細胞が70%-80%の合流に達するまで、2日ごとに培地を交換してください。
- 5 mLのHBSS(Ca2+ およびMg2+なし)でサブコンフルエント培養物を洗浄し、3 mLのトリプシン(0.25%をHBSSで希釈(Ca2+ およびMg2+なし)を加える)
メモ:HBSSはPBSに置き換えることもできます。 - 37°Cで2分間培養し(微視的に細胞が切り離され、切り上げられたかどうかを顕微鏡的に確認する)、FCS培地(DMEM-F12またはEBM-2、10%FCS)の6 mLを加えて剥離反応を停止します。
- 細胞懸濁液を250xgでRTで5分間遠心し、上清を捨てる。
- 増殖培地中の細胞を中断し、75cm2フラスコまたは培養皿に種子を入れ。
- ミシガンがん財団-7(MCF-7、ヒト乳腺癌細胞)サブカルチャー
- 成長培地で75cm2フラスコでヒト乳癌細胞株を成長させる(DMEM/F12培地は、市販のグルタミン(1x)を添加し、抗生物質抗抗薬溶液(AA; ストレプトマイシン100μg/mL、ペニシリン100μg/mL、amphotericin Bの0.025 μg/mL、標準的な組織培養条件下でのFCS 10%(37°C、5%CO2)2~3日ごとに培地を変更します。
- HBSSの5 mL(Ca 2+およびMg2+なし)でサブコンフルエント細胞培養物(70%-80%合流)を洗浄し、3 mLのトリプシン(0.5%はHBSSで希釈)を37°Cで37°C(顕微鏡的に細胞が切り離されていることを確認)を加えます。
メモ:HBSSはPBSに置き換えることもできます。 - 8 mLのFCS培地を加えて剥離反応を停止し、遠心分離機を250 x g で5分間RTで5分間加え、上清を捨てます。
- 75 cm2 フラスコまたは培養皿に成長培地とプレートにペレットを懸濁します。
2. スフェロイド形成
- プレート5 x 105 細胞/mL(HUVECおよびMCF-7)を3.5cmの丸い皿に入れ、48時間培養する。
- メッキされた細胞を24時間または所望に応じて処置またはトランスフェクトする。
- 96ウェルU-底板で行う任意のステップ:1 mLのHBSS(Ca2+ およびMg2+)で細胞を洗浄し、青色の染料(0.5 μg/mL)およびMCF-7細胞を使用して、緑色の色素(0.5 μM)を使用してHUVECを染色し、それぞれ37°Cおよび5%COCO に30m-m0m300m300m00の間に入れる。
- 1 mLのHBSS(Ca2+ およびMg2+なし)で細胞を洗浄し、P1000ピペットを使用して各ラウンド皿に酵素剥離試薬1 mL(HUVECの場合は0.25%トリプシン、MCF-7の場合は0.5%トリプシン)を加え、細胞が取り外されるまで2〜5分間インキュベートします。
- 各細胞タイプを5 mLラウンドボトムポリスチレンチューブに別々に集め、P1000ピペットを使用して1mLのFCS培地を1mL加えて酵素反応を止めます。細胞懸濁液を250xgで5分間遠心分離する。
- 慎重に上清を吸引し、ステロイドフリー培地(EBM-2、グルタミン、抗生物質抗抗薬、0.4%FCS sf(炭剥ぎ取り)の1mLで細胞を懸濁させる。
注: ステロイドフリーの媒体は、通常の成長培地に置き換えることができます。. - 希釈した各細胞懸濁液100μLを希釈し、全細胞数を決定し、治療媒体(EBM-2、グルタミン、抗生物質抗ミヒコティック、0.4%FCS sf、車両/治療)を計算して、細胞毎に5 x 103細胞/mLまたは3.4x10細胞/50細胞の細胞懸濁液を得るために必要な量を計算します。
- セル数
- セルカウンターバイアルでDiluent II溶液を使用して 、機能 ボタンと スタート ボタン(セットアップS3)を押して、マシンとフラッシュをオンにします。
- S4をセットアップし、 開始 を押して、新鮮な希釈II溶液でブランクを測定します。
- 希釈II溶液の10 mLで細胞懸濁液の100 μLでシンチレーションバイアルを変更し、サンプルを測定する:セットアップS4と スタートを押す。
- デジタルディスプレイの mL あたりのセル数を確認します。
注:セルカウントは、他の手動または自動システムを使用して行うことができます:ヘモサイトメーターのグリッドライン、光散乱セルカウント技術、電気インピーダンス、細胞染色を使用したイメージングベースのシステム、例えば、トリパンブルー。
- 96ウェルU-底板
- 各細胞懸濁液(5 x 103 細胞/mL)の5mLを調製し、それらを混合して1:1の比率で10mLの最終体積を得る。
- 手動繰り返しピペットを使用して、96ウェルUボトムプレートの各ウェルに100 μLのセルサスペンションをピペットアウトします。
- プレートを標準的な組織培養条件下でインキュベーターに入れ、48時間後にスフェロイドの形成を確認します。
- 任意のステップ:蛍光ステレオ顕微鏡を使用して、スフェロイド(40x)の写真を撮ります。
注:この方法は、48時間後に96個のスフェロイド(1つのスフェロイド/ウェル)を生成し、通常は成長研究に使用されます。
- ハンギングドロップ
- 細胞懸濁液(3.4 x 105 細胞/mL)を1:1の比率で混合し、2mLの最終体積を得る。
- P20ピペットを使用して、10cmペトリ皿の逆蓋に15μL滴の形で細胞混合物を播種します。
- 蓋を滴で反転させ、皿の底部に5mLのベース培地(EBM-2)を加えて、滴の蒸発を避けます。
注: この方法は、48 時間後に 1 つの回転楕円体/ドロップを生成します。蓋を切り替えながら、ドロップがマージされないように、ドロップが互いに十分に離れていることを確認します。必要に応じて10cmペトリ皿を1つ以上使用してください。
- セル数
3. スフェロイド成長研究
- 96ウェルU底板にHUVECとMCF-7細胞混合物(5 x 102 細胞/ウェル)のプレート100 μLをプレートし、インキュベーターに入れます。
- めっき後48時間、反転顕微鏡(ブライトフィールド)でスフェロイド形成を確認します。96時間の文化で写真(治療ごとに少なくとも6枚、40倍)を撮る。
- 画像処理ソフトウェアを使用して画像を開き、画像を300ピクセル/インチに処理し、画像をtiffファイルとして保存します。
- ImageJ ソフトウェアをダウンロードして開きます。[ ファイル ] オプションをクリックし、[ 開く] に進みます。
- バイナリ イメージ (黒と白) を持つには、対象領域を黒の飽和領域に統一して変換します。この場合は、[ イメージ ] オプションを選択 し、[8 ビット|タイプ] を選択します。今、画像は白黒です。
- フリーハンド選択ツールを使用して、回転楕円体の境界線を描画します。
- 対象領域を計算し、オブジェクトまたは前景ピクセルを背景ピクセルから分離するには、しきい値機能を使用します。
- これで、しきい値ポップアップウィンドウが開きます。上のバーは最小しきい値を示します: 値をゼロに設定します。下のバーは最大しきい値を示します:対象領域が完全に赤くなるまでバーを移動します。
注: 色が赤でない場合は、[しきい値] ウィンドウから [ 赤 ] を選択します。 - 分析|に移動[計測値] を設定し、[面積] と [周長] を選択します。
- 対象領域を測定するには、[ 解析] オプションを選択し、[ パーティクルを解析 ]ツールを使用します。[ パーティクルの解析 ] ウィンドウで、[ 計測するサイズ] (0.00003-無限大または 3-無限大)を設定し、[結果を 集計 および 表示] を選択します。次に 、[OK] をクリックします。
- 結果はチャートに表示されます。測定値をスプレッドシートにコピーしてデータを分析します。
注: 領域は合計ピクセル数として計算されます。計算には[合計面積]を使用します。
4. スフェロイド免疫組織化学研究
- サンプル準備
- HUVEC成長培地で96ウェルU-底板にHUVECとMCF-7(5 x 103 細胞/ウェル)の細胞混合物を96時間プレートに入れます。
- P200 μL ピペットのカットチップを使用して、約 50 個のスフェロイドを 1.5 mL チューブに集める。重力でチューブの底に落ち着き、上清を捨てます。
- スフェロイドを4%PFAの500 μLで1時間、RTで固定します。
- 熱板を用いた熱板を3~5分間熱いプレートでPBSで沸騰させ、アガロース粉末を完全に溶解し、60°C程度まで冷却します。
- P1000ピペットでPFAを取り出し、500 μLのPBSでスフェロイドを洗浄し、堆積液を使用します。上清を捨てます。
- 慎重に600 μLのアガロース溶液をスフェロイドを含む1.5 mLチューブに入れ、水平ローターを177 x g の遠心分離機に2分間置きます。
- アガロース溶液の途中に短い文字列を追加して、チューブからプラグを簡単に取り外します。
- 氷上または4°Cでアガロースプラグを固めます。 ペレットの乾燥を避けるために、PBSを500 μLのチューブに加えます。
注:サンプルは、その後の脱水、パラフィン埋め込み、切り離し、顕微鏡スライドへの転送、およびIHC染色(ソフィストラボによって行われる)の準備ができています。
- 画像の取得と処理
- 体型顕微鏡を用いて、スフェロイド切片の画像を取得します。
- 各サンプルの 3 つのイメージを.jpgファイルとして保存します。
- ImageJ ソフトウェアを開きます。JPEG 画像を開き、[ ファイル ] をクリックし、[ 開く] をクリックします。
- [イメージ]オプションで[色と色のデコンボリューション]を選択します。
- カラーデコンボルション 1.7 ウィンドウで H DAB ベクトルを選択すると、3 つの画像が表示されます。
注: カラー 1 はヘマトキシリン染色(青/紫)のみを表し、カラー 2 は DAB 染色(茶色)のみを表します。 カラー 3 は、2 つの染色で画像解析に必要ありません。 - [色 1]ウィンドウを選択し、[しきい値] を設定します|。調整して[しきい値]をクリックします。[しきい値]ウィンドウが表示されます。
- 最小しきい値をゼロに設定したまま、最大しきい値を調整して、真のシグナルに影響を与えることなくバックグラウンド信号を削除します。[ 適用] をクリックします。
- 面積測定
- [ 分析] をクリックし、[ 測定の設定] を選択します。[ 面積]、[平均グレー値]、[最小]および[ 最大グレー]の値 を選択し 、[OK]を クリックして確定します。
- [解析] オプションを使用して核のサイズを測定し、[測定]を選択します。
注: 結果 ウィンドウには、画像の名前(ラベル)、画像のサイズ(面積)、IHC画像の平均ピクセル強度(平均)、および最小および最大グレー値(最小、最大)が表示されます。計算には平均値を使用します。 - 「カラー 2」(および、二重染色がある場合はカラー 3)ウィンドウに対して、手順 4.2.6 ~4.7.1.2 を繰り返します。
- 細胞定量
- [ 処理] をクリックし、 オプション [バイナリ] を選択し、[ 集水域 ] を選択してセルを分離します。
- [解析]に移動し、[パーティクルの解析] をクリックします。[パーティクルを解析]ポップアップ ウィンドウで、特定でないパーティクルを除外するセルのサイズを設定します。次に、[表示] オプションのドロップダウン ボックスをクリックし、[アウトライン] を選択します。次に、[OK] をクリックします。
- 「カラー 2」(および、二重染色がある場合はColor 3)ウィンドウに対して、ステップ 4.2.6~4.2.7 とセル定量手順(セクション 4.2.7.2)を繰り返します。
注: 次の 3 つのウィンドウが表示されます: 1) 要約結果 (セル数、合計面積、平均サイズ、面積と平均の割合)、2) 結果 (カウントされるセルに対応) および 3) 図面ウィンドウ (カウントされるセルの画像を示しています)。
- 面積測定
5. スフェロイドの生きた/死んだ染色
- DMSOでカルセインAMの4 mMストック溶液(染色は緑色の細胞を生きる)と2mMのエチジウムホモジマーをDMSOで調製(死細胞赤を染色する)1.5 mLチューブで。
- EBM-2で1:50希釈したカルセインAMとエチジウムホモジマーの混合物の10 μL/wellを加えるために必要な溶液の量を計算します。
- 染色混合物をスフェロイドに加え、30〜60分間の標準的な組織培養条件下でインキュベーターにプレートを置きます。
- 蛍光ステレオ顕微鏡を用いて画像(40x)を取得します。
6. スフェロイドのタンパク質とRNAの分離
- 細胞タイプあたり3.4 x 105細胞 /mLで細胞懸濁液を調製し、1:1の比率で混合し、10cmペトリ皿の蓋に15μL滴の形でP20ピペットを使用して細胞混合物を播種します。蓋を反転し、96時間の標準的な組織培養条件下でインキュベーターに入れます。
- 5 mL滅菌ポリスチレンピペットを使用して、15 mL ラウンドボトムポリスチレンチューブにスフェロイドを集めるには、PBS の 5~6 mL を使用してください。
注:15 mL円錐形チューブを使用することも可能です。 - 250xgでスメロイド懸濁液を5分間遠心し、上清を慎重に吸引する。
- 500 μL のトリプシン(100%)を加え、P1000 ピペットを使用して上下にピペットを 30 sで分解してスフェロイドを分解し、細胞懸濁液を達成します。
- 10%FCS培地でトリプシンを中和し、チューブを250xgで5分間遠心し、上清を吸引する。
- メーカーのプロトコル(DNAフリーRNA分離用の特定のキット)に従って、300 μLのRNAリシスバッファーを使用して細胞ペレットをリセリングします。
注:リシスバッファーは、RNAを抽出するために、無傷のスフェロイド(トリプシンステップは必要ありません)に直接追加することもできます。ペレット化されたスフェロイドに300μLのリシスバッファーを加え、氷にチューブを入れ、P200ピペットを使用して10回トリチュレートします。続いて、上記のようにRNAを単離する。マトリックス干渉によるRNA回収が低い場合は、スフェロイド解離が必要になることがあります。 - あるいは、タンパク質の分離のためにLysisバッファーの70 μLを使用します。超音波処理により2-4 sの均質化し、BCAアッセイキットを使用してメーカーのプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します。
注:タンパク質の分離のために、ペレット化されたスフェロイドは、超音波処理に続いて、リシスバッファーで直接にlysedすることができます。全タンパク質25 μgを使用して、ウェスタンブロットを実行します。
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Representative Results
上皮および内皮共培養を用いたスフェロイドモデルは、インビトロ実験のために乳房腫瘍のインビボ状態を密接に模倣する必要がある。図1のスキームは、乳癌上皮細胞および血管またはリンパ性内皮細胞を有するスフェロイドを形成するプロトコルを示している(図1)。各細胞タイプは、3.5cmの丸い皿に別々に播種され、成長刺激剤/阻害剤で処理されるか、またはリポフェクトアミンを用いたオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。上皮細胞または内皮細胞のコンフルエント単層は、トリプシン化後に収穫され、洗浄され、1:1の比率で混合される。細胞は、続いて96ウェルUボトムプレート(図1A)または10cm径の丸い培養皿の反転蓋にめっきされ、吊り下げ低下培養を容易にする(図1B)。播種直後、細胞は各ウェルの底部に平らで密な細胞シートとして現れ、その後、時間(24〜48時間)で凝集し、48時間で無傷の回転楕円体を形成します。ゆるやかに形成された細胞凝集体への損傷を防ぐために、プレートは少なくとも24時間妨害されてはならない。
U-底板では、MCF-7細胞の播種は、内皮細胞またはリンパ細胞ではないが、48時間後にスフェロイド形成をもたらした(図2A、B、それぞれ)。また、1:1比でMCF-7プラス内皮細胞またはリンパ細胞を播種すると、スフェロイド形成も生じる(図2C、D、それぞれ)。腫瘍の成長を研究するモデルとしてスフェロイドを検証するために、成長刺激溶液に応答したスフェロイドサイズの時間依存的変化を測定/定量化し、未治療のコントロールと比較した(図2)。図2Eの顕微鏡写真は、MCF-7の代表的な回転楕円体の時間依存性(24-120時間)の逐次成長を示す。図2Fの折れ線グラフは、成長刺激器の有無にかかわらず処理した場合のMCF−7スフェロイドの領域の変化を示す。スフェロイドサイズは5日間で~100μmから~200μmに増加した。さらに、成長刺激剤で処理されたスフェロイドでは増加した増殖速度が認められた(図2F)。長期治療(168時間)はMCF-7の生存率を低下させたため、スフェロイドの中心にある低酸素状態に起因する可能性があり(図3)、3D構造の成長は96時間まで研究された。MCF-7細胞とHUVECで形成されたスフェロイドは、MCF-7単独で形成されたスフェロイドと比較して、168時間で死細胞の数が少ない。
最初の実験では、培養4日後にスフェロイドサイズのわずかな成長しか観察されなかった。これは、スフェロイドを形成するために播種された細胞の数が多いためである可能性があると仮定されました。Uボトム培養プレートでは、スフェロイドの成長は井戸の凹状によって制限されている可能性があります。成長はシードされた細胞の最初の数に依存していたので、異なる細胞数を使用してスフェロイドを形成し、スフェロイドの成長を監視するのに最適な条件をテストし、確立しました。図4に示すように、この知見は、スフェロイド成長研究のために、500個の細胞/ウェルを播種してスフェロイドを形成し、成長変調因子に応答して4〜6日間のスフェロイドの成長をモニタリングするために信頼性が高く、再現可能であることを示唆している。組織学的または免疫組織学的観察に最も適したスフェロイドは、5 x 103細胞/ウェルの播種後4日目に得られた。これと同じ初期濃度を細胞タンパク質またはRNA抽出に使用した。初期細胞濃度を7.5 x 10以上増加させ、3細胞/ウェルを増加させることで、スフェロイド形成が改善されず、細胞が適切に凝集せず、不規則な構造を想定した(図4)。
細胞組成、増殖、アポトーシスの状態を評価するために、乳癌細胞と内皮細胞で形成されたスフェロイドの組織学的切片をH&EおよびKi67(希釈1:300)およびCleaved Caspase-3(希釈1:500)抗体を用いて調べた。最終的なサンプル調製のためのプロセスは、注意/注意と精度が必要です。図5Aは、スフェロイドを集め、断面化用のアガロースに組み込むワークフローを示している。図5B-Cの顕微鏡写真は、一般的に使用されるトランスフェクション剤であるリポフェクトアミンの存在下(図5B)および不存在(図5C)におけるMCF−7スフェロイド形成の違いを示す。組織学的セクションの明視野顕微鏡画像は、2つの細胞タイプの均質な混合物の円形のコンパクトな構造を示す(図5D-G)。スフェロイドの構造とその細胞の形状は、リポフェクタミンの存在下でコントロールオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション後の異常を示さなかった(図5D)。さらに、増殖マーカーKi67を発現する細胞は、スフェロイド中に均一に分布した。しかし、球状球体の表面にも増殖細胞の環が認められた(図5E)。切断カスパーゼ-3染色は、4日間培養した後にアポトーシス細胞を示した(図5F)。組織学的セクションは、特定のマーカーを用いてスフェロイドにおける上皮細胞および内皮細胞の分布を評価するのに有用である。CD31を内皮細胞の特定マーカーとして用い、3D構造内でのそれらの分布を決定することができる。すべての細胞がヘマトキシリン(細胞の核の青色染色)で染色されるので、CD31発現の計算は、治療またはトランスフェクション後の内皮細胞を含むスフェロイドの面積を提供することができる(プロトコルセクション4.2.7.1)。また、二重染色アッセイを行うことにより、さらに多くの情報を持ちることができ、例えば図5Gに示すように、CD31染色は内皮細胞(赤色)およびKi67染色が増殖細胞(褐色)に染まる。プロトコルセクション4.2.7.2に続いて、図5Gは、55%が上皮細胞であり、45%が内皮細胞であり、25%の細胞が増殖していることを明らかにした。
スフェロイドの構造は、生きた色素を用いた細胞の標識に続く免疫蛍光分析を用いて検討することもできる。HUVECおよびMCF-7細胞のコンフルエント2D培養物を、青色(HUVEC)および緑色(MCF-7)染料で別途染色した。続いて、染色した細胞を1:1比で混合し、スフェロイド形成のためにウェルに播種した。染色された蛍光細胞の画像は、播種直後(図6A)および培養3日後に撮影した(図6B)。生細胞と死細胞の割合を評価することを目的として、4日間齢のスフェロイドをカルセインAM(緑色)とエチジウムホモメーマー(赤)で染色した(図6C)。MCF-7とHUVECで形成されたスフェロイドは、凍結細胞のための凍結細胞(10%DMSOおよび10%FCSを添加した成長培地)のための標準的なプロトコルを使用して正常に凍結/保存することができなかった。凍結および解凍されたスフェロイドでは、細胞凝集体の破裂および細胞生存率の増大が明らかであった。 図6D の代表的な画像は、死細胞と生細胞のために染色された新たに解凍されたスフェロイドを示しています。これは、スフェロイドが凍結状態に非常に敏感であることを示しています。
実験条件下で5日間培養した後、分析のために十分なタンパク質(〜3μg/mL)またはRNA(〜60ng/μL)を収集するために約100個のスフェロイドのリシスが必要でした。 図7 は、将来のマイクロアレイアッセイまたはRT-PCRによる分析のために、タンパク質抽出のためのスフェロイドコレクション(吊り滴法で生成される)から細胞ライシスまでのワークフローを表しています。微小アレイ解析のためにスフェロイドで異種細胞集団からRNA/DNAを単離すると、有用な情報が得られます。しかし、主要な細胞特異的機構または細胞間相互作用を同定するために、スフェロイド細胞は、マイクロアレイ解析に使用される特定の細胞からのFACS解析およびRNAを用いて、酵素(トリプシンまたはアキュターゼ)解離後に分離することができる。さらに、抗生物質耐性細胞株(例えば、EGFPおよび/またはピューロマイシン耐性細胞株を使用することによって)は、特定の細胞タイプの細胞相互作用の役割に対処するためにスフェロイドに使用することができる。さらに、遺伝子サイレンシングツールを使用して、細胞を設計して特定の細胞と細胞の相互作用の問題に対処することができます。
図1:スフェロイド形成のワークフロー MCF-7および2D培養におけるHUVECまたはLEC細胞は、別々に増殖し、様々な所望の処置後に採取される。その後、球状体は、細胞間凝集によって3D構造の形成を促進する(A)96ウェルUボトムプレート内の細胞を直接混合することによって生成されるか、または重力によって回転楕円体形成をサポートする(B)吊り下げ培養物を用いて生成される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:経時回転楕円体形成と発達 画像は、MCF-7細胞(パネルA)によるスフェロイドの形成を示し、内皮細胞またはリンパ細胞(HUVEC;;)によるスフェロイド形成の欠如(パネルB))同じ密度でめっきし、MCF-7細胞とHUVECまたはLECを1:1比で混合したスフェロイド形成(パネルC,D)を形成した。また、経時の回転楕円体のサイズの拡大(24時間、48時間、72時間、96時間、120時間)も描かれています。このスフェロイドは、MCF-7とHUVECの混合物から1:1比で形成され、96ウェルU-底板(パネルE)の500細胞/ウェルの密度で播種された(スケールバー= 200 μm、40倍)。折れ線グラフ(パネルF)は、コントロール(CTR)対成長刺激(処置)スフェロイドの時間依存的な成長を示す。回転楕円体の領域を測定し、未処理のスフェロイドと処理されたスフェロイドの間で比較した。結果は、各コントロールと比較して、SEM、***p < 0.001 を表す±。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:スフェロイドの長期培養と生存率 顕微鏡写真は、MCF-7細胞単独で形成されたスフェロイドの細胞生存率を96h(パネルA)および168h(パネルC)で示し、 パネルB と D はMCF-7+HUVEC(1:1比)で作られた球体(パネルB)および168h(パネルD)(パネルD)スケール(バー=100μm)で細胞生存率を示す。細胞はカルセイン(赤、死細胞)およびエチジウムホモジマー(緑、生きた細胞)で染色された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MCF-7プラスHUVECスフェロイドの細胞播種密度と時間依存性成長プロファイル1:1の割合で混合されたHUVECおよびMCF-7細胞は、増加密度(102-104細胞/ウェル)で播種し、24-96時間にわたってスフェロイドの増殖を監視した。顕微鏡の明視野画像(スケールバー= 200 μm、40倍)を撮影し、時間の経過とともにスフェロイドの成長を評価しました。500個の細胞/ウェルの密度で細胞は、スフェロイドの成長を研究するのに最適なサイズを提供しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:断面化と組織染色のためのスフェロイド埋め込みパネルA:ヒューヴェック/MCF-7スフェロイドをアガロースに集め、組み込むためのワークフローを描いた漫画。アガロースプラグにスパロイドを埋め込み、パラフィンブロックの切除後、サンプルを標準的な組織学的染色に使用した。パネルBおよびCは、代表MCF-7プラスHUVECスフェロイドを、それぞれリポフェクトアミン2000なしで、かつ処理した(スケールバー=200μm、40倍)を示す。パネルD-Gは、特定のマーカーで染色されたスフェロイドセクションの代表的な画像を示す。パネルDは、スフェロイド構造を評価するためにヘマトキシリン-エオシンで染色されたスフェロイドを示しています(スケールバー= 100μm)。パネルEでの染色は、Ki67で陽性染色された増殖細胞を描いている。パネルFは、切断カスパーゼ-3(スケールバー=50μm)で陽性染色されたスフェロイド中のアポトーシス細胞を示す。パネルGは、CD31(内皮細胞マーカー)とKi67(増殖マーカー)(スケールバー=100μm)の二重染色を有するスフェロイド切片を示す。スフェロイドの切り離しおよび染色は、ソフィストラボ(info@sophistolab.ch)によって行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:細胞の分布と生存率を示すMCF-7/HUVECスフェロイドの蛍光画像パネルAとBは、青い染料で染色されたHUVECと緑色の色素で染色されたMCF-7細胞を有する代表的なスフェロイドを描いている。スフェロイド内のHUVECおよびMCF-7の局在は、播種後(A)および回転楕円体形成後(B)(スケールバー=250μm)の直後に変動する。パネルC-Dは、カルセイン/エチジウムホモジマーで染色されたスフェロイドを示し、正常培養状態(C)および凍結後(D)(スケールバー=100μm)の3D構造中の生きた(緑色)および死細胞(赤)を同定する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: 生化学的分析用のスフェロイドコレクションの概略図 スフェロイドを収穫するスキームを示す漫画, 分離または放出細胞, タンパク質分析またはRNA抽出のための溶解溶液でそれらを中断. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
2D細胞培養と比較して、革新的な3Dスフェロイド培養技術は、臓器の微小環境、細胞間相互作用、およびイン ビトロでの薬物応答を再構築するためのより優れた強力なツールである。これは、乳がん研究のための多細胞(上皮および内皮)細胞株からのスフェロイドの形成を記述する最初のプロトコルである。このプロトコルは、最大5日間のスフェロイドの回転楕円体3D成長を保証し、スパフィン埋め込み、切除、および組織学的染色後にスフェロイドを検査することができます。興味深いことに、スフェロイド内の細胞要素は、細胞増殖を促進し、増殖およびアポトーシス刺激に応答する受容体を依然として発現する。記載されたプロトコルは、タンパク質またはRNA/DNA分析に十分な生物学的材料を生成する。上記の共培養システムは、実験室の状態で容易に低コストで達成され、将来の適用、特に乳癌治療および薬物感受性検査において有利となり得る。さらに、このプロトコルは、異なる上皮および内皮細胞タイプに適用することができる。
生体内に存在する複雑な組織をインビトロで模倣することは非常に困難です。これは、生体内組織は神経、血管、間葉、免疫細胞30、42を含む多くの相互作用成分からなるからである。このプロトコルの目的は、実際の腫瘍状態に近づくには、2つの異なる細胞タイプを持つ3D共培養システムを使用して、これらの制限のいくつかを克服することです。ここで、スフェロイドは、細胞間相互作用、死細胞によって細胞間空間に放出されるアポトーシス因子に対する感受性、およびスフェロイドの中心にある低酸素状態を含む、内皮細胞またはリンパ球細胞と組み合わせて上皮腫瘍細胞と形成されている。このプロトコルは、増殖因子、シグナル伝達因子、およびホルモンに対する細胞応答の試験のために最適化されており、シグナル伝達カスケードおよび標的遺伝子転写を迅速に活性化し、タンパク質発現および輸送30、31を刺激する。スフェロイドでは、インビボではないが、刺激に対する腫瘍細胞の応答は、迅速かつ頻繁に評価することができる。
本研究では、スフェロイド中の内皮細胞は毛細管状の構造を形成していないようである。内皮細胞は、低密度でメッキすると毛細血管を形成することが示されており、内皮細胞比に対してMCF-7を下げると、スフェロイド内に毛細血管形成が生じる可能性があります。あるいは、特異的マトリックスタンパク質またはマトリゲルの添加は、毛細血管形成を促進し得る。スフェロイドの毛細管状構造の欠如は、MCF-7細胞によって放出される因子が内皮細胞増殖を促進し、その逆もまた同様であるが、MCF-7プラス内皮細胞の利点を薄くしない。このような相互作用は、MCF-7のみで検出されないままになります。
いくつかの研究は、5 x 103細胞/ウェルが球状体43、44、45、46、47を形成するために細胞を播種するのに適切な濃度であったことを示している。しかし、96ウェルU-底板では、この数の細胞は実験条件における回転楕円体の協調成長を制限した。したがって、新しい研究のそれぞれにおいて、新しい細胞タイプごとに、薬物治療後の3D系の成長をモニタリングし、スフェロイドサイズに対する治療の影響を決定することが重要である。
現在のプロトコルの限界は、従来のDMSO法により凍結解凍後に形成されたスフェロイドの培養を継続できないことである。実際、解凍すると、細胞のほとんどは死んでいた。ガラス化は、細胞を生き続けるための代替手段であることが証明されるかもしれない48.
エラーを回避し、整形式のスフェロイドを生成し、維持するために技術的な詳細に注意が必要です。1つの課題は、免疫染色のためのサンプル調製物である(セクション4.1)。1.5mLチューブにスフェロイドをピペット化して移送を容易にするためには、孔の面積がスフェロイド自体よりも大きくなるようなはさみで切り取られたP200先端を使用することが重要である。それ以外の場合、転送によって球が破壊される可能性があります。もう一つの課題は、回転楕円体が試験管の底に落ち着いた後に培地を吸引する方法です。この点で、スプフェロイドの吸引を避けるために真空ポンプの代わりにP1000ピペットを使用する方が良いです。断面用のスフェロイドを準備する上で重要かつ繊細なステップは、ペレット化されたスフェロイドにアガロースを加えることだ。スフェロイドは、アガロースに一度懸濁すると、室温で、アガロースが重合する前に水平遠心を使用してマイクロフュージチューブの底部に素早くペレット化されなければならない。
全体として、MCF-7および内皮細胞から成る2細胞のスフェロイドは、腫瘍内の癌細胞または内皮細胞の成長を促進する細胞と細胞の相互作用およびメカニズムを調査する実行可能な代替手段を提供する。スフェロイドは、腫瘍または癌の成長を標的とする治療薬の有効性を評価するモデルとして役立つ可能性がある。重要なことに、この2細胞モデルは、腫瘍増殖に関連する他の細胞タイプを含むようにさらに即興化することができる。この文脈において、乳房腫瘍質量の80%を構成する線維芽細胞は、MCF−7、内皮細胞、および線維芽細胞スフェロイドを形成するために含まれ得る。さらに、遺伝子サイレンシングおよび遺伝子操作された細胞は、細胞細胞相互作用、ホルモン受容体(エストロゲン/プロゲステロン)、成長因子、腫瘍/癌増殖に対するシグナル伝達経路の役割に対処し、新しい抗癌分子の有効性をテストするために使用することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、がん研究財団/スイス癌連盟がRKDと国立衛生研究所のEKJ助成金DK079307にKFS-4125-02-2017を付与することによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica fully motorized fluorescence stereo microscope | Leica Microsystems | M205 FA | |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
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